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2.  Material und Methoden

Die verwendeten Laborchemikalien wurden, wenn nicht besonders im Text erwähnt, von Sigma (St.Louis, Missouri) in der reinsten verfügbaren Form bezogen. Rauhe Mikrosomen wurden wie beschrieben hergestellt (Walter und Blobel, 1983).

2.1. Herstellung des Eiextraktes

Der Eiextrakt wurde weitgehend wie beschrieben hergestellt (Newmeyer und Wilson, 1991; Murray, 1991). Zehn X.laevis werden je 50 Einheiten ”pregnent mare serum gonadotropin” subkutan injiziert. 3 bis 10 Tage später werden 70 Einheiten ”human chorionic gonadotropin” (Sigma) subkutan injiziert und die Frösche in 6l-Tanks mit 2l MMR-Puffer (5 mM Hepes/NaOH pH 7.7, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA) gesetzt. 20-24 Stunden später werden die Eier entnommen, schlechte Eier aussortiert, die guten vereinigt und zweimal mit je 1l 2% Cystein, pH 7.7, über einen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten die gelartige Hülle der Eier entfernt. Die Eier werden mehrfach mit insgesamt 4l 0.2 M NaCl gewaschen und danach mehrfach mit insgesamt 2l eiskaltem MWB (Membranen-Wasch-Puffer: 50 mM Hepes pH 7.7, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 250 mM Saccharose, 2 mM DTT oder 7 mM β-Mercaptoethanol). Ab hier werden alle Schritte auf Eis durchgeführt. Die Eier werden mit einer Pasteurpipette mit weiter Öffnung in 3 bis 4 SW28 Zentrifugen-Gefäße (Beckman, Fullerton, California) überführt, in denen 5ml MWB mit Cytochalasin B (10μg/ml), Cycloheximid (50μg/ml) und Proteaseinhibitoren (PI: Leupeptin 10μg/ml, Chymostatin 5μg/ml, Elastatinal 2.5μg/ml, PepstatinA 1μg/ml, Aprotinin (10μg/ml)) vorgelegt sind. Überschüssiger Puffer wird abgenommen und die Eier durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 10000 rpm, 4°C in einem HB4-Rotor (Sorvall, DuPont Company, Wilmington, Delaware) aufgeschlossen. Der Eiextrakt wird durch seitliches Anstechen der Zentrifugengefäße mit einer Spritze zwischen einer gelben Dotterschicht am oberen Ende und dem Pigmentpellet am unteren Ende entfernt (insgesamt etwa 30-50ml). Dieser Eiextrakt ist strohfarben und wird mit 2 mM DTT oder 7 mM β-Mercaptoethanol, [Seite 24↓]Cytochalasin B (10μg/ml), Cycloheximid (50μg/ml) und Proteaseinhibitoren (PI, siehe oben) versetzt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert wird oder weiter in Membranen und Cytosol fraktioniert.

2.2. Herstellung von Membranfraktionen und Cytosol aus dem Eiextrakt

Der Extrakt wird in SW40-Zentrifugengefäße (Beckman) überführt und in einem SW40 Rotor für 1h bei 40000rpm, 2°C zentrifugiert. Dabei pelletiert eine schwere Membranfraktion und im Überstand befindet sich das Cytosol und eine leichte Membranfraktion. Der Überstand wird mit einer Pipette abgenommen und im 100.4 Rotor (Beckman) für 1.5 hrs bei 100000 rpm, 2°C zentrifugiert. Danach befindet sich im Überstand weitgehend membranfreies Cytosol (15-25ml), das in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C für mehrere Monate gelagert werden kann. Das Pellet besteht aus einem lockeren Membranpellet (leichte Membranfraktion) und einem festen, gelblich, klaren Ribosomenpellet. Das Membranpellet wird mit einer Pipette abgenommen, in 10 Volumen MWB mit PI resuspendiert und im 100.4 Rotor für 10 Minuten bei 75000 rpm, 2°C zentrifugiert. Das nun feste Membranpellet wird nochmals in der gleichen Menge MWB mit PI wie vorher resuspendiert und zentrifugiert. Dieses Pellet wird in dem ursprünglichen Volumen der leichten Membranfraktion (etwa 3-5ml) in MWB mit PI resuspendiert und in kleinen Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Pellet der schweren Membranfraktion wird in 20 Volumen MWB mit PI resuspendiert, auf ein 7 ml Kissen aus MWB plus 250 mM Saccharose in einem SW28-Zentrifugengefäß gegeben und und in einem SW28 Rotor (Beckman) für 15 Minuten bei 20000 rpm, 2°C zentrifugiert. Das Pellet wird in einem Volumen (etwa 0.5ml) MWB mit PI resuspendiert und in kleinen Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren.

2.3. Herstellung von meiotischen Membranen und Cytosol

Die Eier werden bis einschließlich dem Waschen mit 0.2M NaCl so behandelt wie in 2.1. beschrieben. Danach werden sie in 2l EB-Puffer (80 mM β-Glycerophosphat pH 7.4, 20 [Seite 25↓]mM EGTA, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT) gewaschen und mit einem Volumen EB-Puffer mit 0.5 mM ATPγS und PI in einem Dounce-Homogenisator aufgeschlossen (Pfaller und Newport, 1995). β-Glycerophosphat ist ein allgemeiner Phosphatase-Inhibitor und mit ATPγS können Proteine stabil phosphoryliert werden. Beides dient dazu, den meiotischen Zustand des Extraktes zu erhalten. Die homogenisierten Eier werden für 10 Minuten bei 10000rpm, 2°C in einem SS34 Rotor (Sorvall) zentrifugiert. Der Überstand ist der meiotische Eiextrakt und kann in flüssigem Stickstoff weggefroren werden. Um eine Membranfraktion und Cytosol zu erhalten, wird der Extrakt für zwei Stunden, 40000rpm, 2°C im SW40 Rotor zentrifugiert. Im Überstand befindet sich nun das meiotische Cytosol, das wie üblich eingefroren werden kann. Die obere Schicht des Pellets enthält die Membranen, die wahrscheinlich der leichten Membranfraktion von 2.2. entsprechen. Sie kann vorsichtig mit einer Pipette, deren Spitze eine große Öffnung besitzt, abgenommen werden und in 10 Volumen EB-Puffer mit PI resuspendiert werden. Nach Zentrifugation für 30 Minuten bei 50000 rpm, 2°C im Ti50.2 Rotor wird das Membranpellet in einem kleinen Volumen EB-Puffer mit PI resuspendiert und in kleinen Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren.

2.4. Herstellung von mitotischem Extrakt sowie mitotischen Membranen und Cytosol

Zur Herstellung des mitotischen Extraktes wird zu Interphasen Extrakt 0.1mg/ml Cyclin B gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Cyclin B besitzt eine C-terminale Deletion und wird deshalb nicht ubiquitiniert und durch das Proteasom abgebaut (Holloway et al., 1993). Es wurde als Fusionprotein mit der Glutathion-S-Transferase (GST-Cyclin B) in Escherichia coli exprimiert und mit Hilfe von Glutathion-Agarose (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) gereinigt. Das in dieser Arbeit verwendete Cyclin B wurde freundlicherweise von M. Rolls und P. Stein zur Verfügung gestellt. Zur Kontrolle des mitotischen Zustandes wurden vor und nach der Reaktion jeweils 1μl zur Bestimmung der Histon H1-Kinaseaktivität abgenommen. Zur Herstellung einer Membranfraktion und einer cytosolischen Fraktion aus dem mitotischen Extrakt wurden 500μl mitotischer Extrakt für 10 Minuten bei 75000rpm, 2°C im 100.3-Rotor zentrifugiert und der Überstand (bestehend aus Cytosol und einem Teil der Membranen) [Seite 26↓]für 30 Minuten, 75000rpm, 2°C im 100.3 Rotor zentrifugiert. Im Überstand befindet sich das Cytosol, das wie üblich eingefroren werden kann. Das Pellet besteht aus einem lockeren Membranenpellet und einem festen, gelblich-klaren Ribosomenpellet. Das Membranenpellet wird in 1ml MWB resuspendiert und für 10 Minuten bei 75000rpm, 2°C im 100.3-Rotor zentrifugiert. Das erhaltene Membranpellet wird in einem kleinen Volumen MWB resuspendiert und wie üblich eingefroren.

2.5. Bestimmung der Histon H1-Kinaseaktivität

1μl der zu bestimmenden Probe werden mit 10μl EB-Puffer gemischt und können bis zur H1-Kinase Bestimmung eingefroren gelagert werden. Für die eigentliche Reaktion werden 6μl eines H1-Kinase Reaktionsansatzes, der 0.5mg/ml Histon H1 (Promega, Madison, Wisconsin), 50μM ATP, 0.2μCi/μl [γ32P]-ATP (Amersham, Arlington Heights, Illinois), 0.1% NP-40 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), und PI in EB-Puffer enthält, zu den 10μl der zu bestimmenden Probe gegeben, für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch die Zugabe von 40μl SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und die Phosphorylierung des Histons H1 mit Hilfe eines ”Phosphorimagers” (BAS1000, Fuji) quantifiziert.

2.6. Präparation von Spermien-Chromatin

Die Präparation von Spermien-Chromatin folgt genau dem Protokoll von A. Murray, 1991. Sechs männliche X.laevis werden etwa eine Woche vor der Präparation subkutan mit 50 Einheiten ”human chorionic gonadotropin” gespritzt. Eine Woche später werden sie durch 2.5 g/l Tricain(3-aminobenzoesäure-ethylester) im Wasser getötet, der Testis entfernt, mit 50 ml HSP-Puffer (250 mM Saccharose, 15 mM Hepes pH 7.4, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM Spermidin, 0.2 mM Spermin, 10μg/ml Leupeptin, 0.3mM PMSF) gewaschen, und in 30 ml desselben Puffers durch Reiben zwischen den [Seite 27↓]aufgerauhten Flächen zweier Objektträger aufgeschlossen. Die freigesetzten Spermien werden durch grobmaschiges Tuch filtriert, um Bindegewebe und Blutgefäße zu entfernen, und für 10 Minuten bei 2000 rpm, 2°C in einem 50ml Zentrifugengefäß, das unten spitz zuläuft, zentrifugiert. Die Spermien befinden sich im Pellet und wurden nochmals resuspendiert und zentrifugiert. Anschließend werden die Spermien in 4ml HSP-Puffer resuspendiert und zum Entfernen der Zellmembranen und Kernhülle 200μl 10mg/ml Lysolecithin zugegeben. Nach 5-10 Minuten der Inkubation auf Eis werden 20-30 ml HSP-Puffer mit 3% BSA zum Binden des Detergens zu der Reaktion gegeben und das Spermien-Chromatin für 10 Minuten bei 2000 rpm, 2°C zentrifugiert. Das Pellet wird in 20ml HSP-Puffer mit 0.3% BSA resuspendiert und wiederum abzentrifugiert. Anschließend wird das Chromatin in 2-3ml HSP-Puffer mit 0.3% BSA und 30% Glycerin resuspendiert, in kleinen Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.

2.7. Bildung von Zellkernen im Xenopus in vitro System

Zur Bildung von Zellkernen wurden 0.3μl Spermien-Chromatin, 10μl Eiextrakt und 0.5μl eines Energie-regenerierenden Systems (Endkonzentrationen: 1 mM ATP, 0.5 mM GTP, 20 mM Creatinphosphat, 0.1 mg/ml Creatinkinase, alle bezogen bei Boehringer Mannheim) durch mehrmaliges Pipettieren miteinander vermischt und für die in den Abbildungen angegebenen Zeiten bei Raumtemperatur inkubiert. Wurde anstelle des Extraktes Cytosol mit den leichten und schweren Membranen verwendet, so wurden 10μl Cytosol verwendet und die Mengen der Membranen für jede Präparation titriert, so daß sich möglichst viele, große Zellkerne bildeten. Optimale Mengenverhältnisse der Membranen lagen in der Regel bei 1μl der leichten Membranen und 0.3μl der schweren Membranen auf 10μl Cytosol. Im vereinfachten System zur Kernbildung wurden nur Cytosol und leichte Membranen verwendet. Auch hier wurde für jede Präparation der leichten Membranen die optimale Menge an Membranen bestimmt, bei der sich die meisten Zellkerne mit einer geschlossen Kernhülle nach 60 Minuten Inkubation bildeten. Die vereinfachte Kernbildungsreaktion enthielt außerdem 2mg/ml Polyglutamat (80 kDa [Seite 28↓]durchschnittliches Molekulargewicht, Sigma) zur Dekondensation des Chromatins. Wurde die Kernbildungsreaktionen ohne Cytosol durchgeführt, wurde es durch die gleiche Menge MWB ersetzt.

Nach unterschiedlichen Zeiten wurden 1-2μl der Reaktion mit 1-2μl einer Färbelösung (10μg/ml Hoechst 33258, 20μg/ml 3,3’-dihexadecyloxacarbocyanin perchlorat (DHCC, Molecular Probes, Eugene, Oregon) in MWB) gemischt und mit einem ”Axioplan 2” Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss, Jena) beobachtet. Zur Dokumentation wurden Bilder mit einer angeschlossen digitalen Kamera (Sony, Modell DCX-370-MD) und einem PC mit der ”Northern Exposure” Software aufgenommen. Alternativ wurden mit einer angeschlossenen Kamera Fotos aufgenommen und die Filmnegative mit einem Dia-Scanner (Sprint Scan 35, Polaroid) digitalisiert. Die so gespeicherten Bilder wurden mit Hilfe der CANVAS-Software arrangiert und mit einem Videoprinter (Fujix, Fuji) gedruckt.

Um die hochwertigen Bilder der Abbildungen 7 bis 11 zu erhalten, wurde eine hochauflösende, auf -25°C gekühlte CCD-Kamera (Applied Precision Inc., Issaquah, Washington) an einem invertierten Axiovert S100TV-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) verwendet. Bilder wurden in 0.2μm Schritten senkrecht zur Focussierungsebene aufgenommen und mit Hilfe der Delta Vision®-Software auf einem O2-Computer (Silicon Graphics, Californien) aufgearbeitet. Für die Bildverarbeitung war es notwendig, daß sich die Zellkerne während der Aufnahme nicht bewegten.

2.8. Bindung von Membranvesikeln an das dekondensierte Chromatin

Die Bindungsreaktion wurde ohne Cytosol und in Gegenwart von GTPγS durchgeführt, um die Bildung einer Kernhülle zu verhindern. Die Reaktion enthielt 0.3μl Spermien-Chromatin in 10μl MWB, ein Energie-regenerierendes System, 1mM GTPγS, 2mg/ml Polyglutamat (mittleres Molekulargewicht 80kDa) sowie 1μl der leichten oder schweren Membranfraktion. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Membranen mit 0.1% Octadecyl-Rhodamin in MWB gefärbt und im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert.


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2.9.  ER-Bildung im Xenopus in vitro System

Zur Bildung des ER wurden in der Regel 10μl Cytosol mit 1μl der leichten Membranen und 0.5μl des Energie-regenerierenden Systems gemischt und für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß inkubiert. Danach wurde 1μl der Reaktion vorsichtig in 2μl Färbelösung, 0.1% (v/v) Octadecyl-Rhodamin oder mit 20μg/ml 3,3’-dihexadecyloxacarbocyanin perchlorat, DHCC, (beide Molecular Probes; Terasaki, 1989) in MWB, auf einem Objektträger gegeben und im Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet. Der Reaktionsansatz durfe nicht stark mit der Färbelösung gemischt werden, da sonst die Netzwerke zerstört wurden. Die beiden verwendeten hydrophoben, fluoreszierenden Farbstoffe geben identische Ergebnisse. Um die Netzwerke auf der Oberfläche eines Objektträgers anhaften zu lassen, wurden in die Vertiefung eines Objektträgers (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, Californien) 20μl 5% BSA in MWB für 5-10 Minuten gegeben, um die Glasoberfläche mit BSA zu beschichten, und anschließend 5-10μl einer ER-Bildungsreaktion in die Vertiefung gegeben. Nach 30-60 Minuten der Inkubation in einer abgeschlossen Kammer mit hoher Luftfeuchtigkeit wurden die anhaftenden Membrannetzwerke zweimal mit 150μl MWB gewaschen, mit 10μl der oben angegebenen Färbelösung für 10 Sekunden gefärbt und nach zweimaligem Waschen mit 150μl MWB im Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Nach dem Waschen sind die anhaftenden Membrannetzwerke noch für 5-15 Minuten stabil, danach zerfallen die Membrantubuli zu Membranvesikeln.


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2.10.  Manipulationen der ER-Bildung

Zur Depletion von ATP wurden Hexokinase (0.2 Einheiten/μl, Boehringer), und Glukose (50mM) zur ER-Bildungsreaktion gegeben. GTPγS (Boehringer) wurde in einer Konzentration von 1mM eingesetzt.

Zur NEM-Behandlung des Cytosols wurde NEM frisch in Wasser gelöst (100mM) und in einer Konzentration von 10mM eingesetzt. Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis wurde nicht umgesetztes NEM für 30 Minuten mit 20mM DTT inaktiviert und das Cytosol in der ER-Bildung eingesetzt. Die Membranen wurden 15 Minuten auf Eis mit 5mM NEM behandelt. Danach wurde 10mM DTT zugegeben, 15 Minuten auf Eis inkubiert, die Membranen pelletiert (10 Minuten, 100000rpm, 2°C, 100.3-Rotor, Beckman) und im Ausgangsvolumen in MWB resuspendiert. Als Kontrolle wurde NEM vor der Zugabe zu den Membranen mit DTT inaktiviert.

Zur Trypsin-Behandlung wurden 10μl Membranen in 100μl MWB mit 1mg/ml oder 0.01mg/ml Trypsin (Sigma) oder als Kontrolle ohne Trypsin für 30 Minuten auf Eis behandelt und die Protease durch Zugabe von 1ml 1mM PMSF in MWB für 10 Minuten auf Eis inaktiviert. Nach Sedimentation der Membranen für 10 Minuten bei 75000rpm, 2°C im 100.3-Rotor wurden die Membranen im Ausgangsvolumen MWB resuspendiert und in der ER-Bildung eingesetzt. Zur Proteinase K Behandlung nach der Bildung der Membrannetzwerke wurde zur Färbelösung 1.5mg/ml Proteinase K (Boehringer) gegeben und wie üblich zu 2μl dieser Lösung 1μl einer ER-Bildungsreaktion gegeben und nach 5-15 Minuten im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert.

Calcium wurde wurde als CaCl2 in einer Konzentration von bis zu 1mM in der ER-Bildungsreaktion eingesetzt. Bei der nachträglichen Zugabe von CaCl2 wurde es in einer Konzentration von 2mM in die Färbelösung gegeben, und wie üblich zu 2μl dieser [Seite 31↓]Lösung 1μl einer ER-Bildungsreaktion gegeben und im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert.

Um Mikrotubuli bei der ER-Bildung zu analysieren, wurden 0.2mg/ml Rhodamin-markiertes Tubulin (Molecular Probes; Hyman et al., 1991) und 20μM Taxol (Molecular Probes) zu der ER-Bildungsreaktion gegeben und die Reaktion für 45 Minuten auf einem Objektträger durchgeführt. Der Waschpuffer enthielt ebenfalls 20μM Taxol, um die gebildeten Mikrotubuli zu stabilisieren. Die Membranen wurden mit 20μg/ml 3,3’-dihexadecyloxacarbocyanin perchlorat gefärbt. Anschließend wurden die Mikrotubuli im Rhodamin-Kanal und die Membranen im Fluorescin-Kanal des Fluoreszenz-Mikrokops analysiert.

Zur Verhinderung der Bildung von Mikrotubuli wurden Nocodazol (bis zu 0.2mg/ml, Stammlösung 10mg/ml in DMSO), Colchincin (bis zu 100μM, Stammlösung 5mM in DMSO) oder Vinblastin (bis zu 200μM, Stammlösung 10mM in Wasser) zu einer ER-Bildungsreaktion gegeben.

Zur Verhinderung der Bildung von Actinfilamenten wurde Latrunculin A (Molecular Probes) bis zu einer Konzentration von 200μM (Stammlösung 20mM in DMSO) zur Reaktion gegeben.

2.11. Tubulin-Depletion des Cytosols

Tubulin wurde auf zwei verschiedene Methoden aus dem Cytosol depletiert. In der ersten wurde die Polymerisation des freien Tubulins durch die Zugabe kurzer Mikrotubuli und Taxol stimuliert. Die Mikrotubuli wurden anschließend durch Zentrifugation vom Cytosol abgetrennt. Die verwendeten kurzen Mikrotubli mit einer durchschnittlichen Länge von 2μm wurden durch Inkubation von 5mg/ml Tubulin (Cytoskeleton Inc., Denver, Colorado), 1mM GTP, 30% Glycerin in BRB80 für 10 Minuten bei 35°Celsius erhalten und können nach Zugabe von 20μM Taxol bei Raumtemperatur für etwa 2 Wochen gelagert werden. BRB80-Puffer besteht aus 80mM PIPES (Piperazine-N,N’-bis[2-ethansulfonsäure]) pH 6.8, 1mM MgCl2, 1mM EGTA. Zu 100μl Cytosol wurden [Seite 32↓]1μl der 2μm-langen Mikrotubuli, 1mM Mg2+ /GTP, 5μM Taxol und ein energieregenerierendes System gegeben und für 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Nach 5 Minuten wurden weitere 15μM Taxol zugegeben und für 25 Minuten bei 25°C inkubiert. Anschließend wurden die polymerisierten Mikrotubuli für 20 Minuten bei 75000rpm, 22°C im 100.3-Rotor abzentrifugiert und das Tubulin-depletierte Cytosol im Überstand erhalten. Die zweite Methode der Tubulin-Depletion macht sich zunutze, daß Tubulin mit Vinblastin kristalline Aggregate bildet, die vom restlichen Cytosol durch Zentrifugation abgetrennt werden können (Palacek et al., 1982). Es wurden 50μl Cytosol mit 100μM Vinblastin für 30 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend für 20 Minuten bei 75000rpm, 2°C im 100.3-Rotor zentrifugiert und das Tubulin-depletierte Cytosol aus dem Überstand abgenommen. Die Tubulin-Depletion des Cytosols wurde im ”Western Blot” quantifiziert. Mit der ersten Methode werden 90-95% des Tubulins aus dem Cytosol entfernt, mit der zweiten Methode mehr als 95%.

2.12. Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Zur Immunfluoreszenz wurden die Membrannetzwerke auf der Oberfläche eines Objektträgers gebildet und danach mit 1% Glutaraldehyd in MWB ohne DTT für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Antikörper gegen das ER-Markerprotein Trap α (Görlich et al., 1989) und der monoklonale Antikörper Mab414 (BAbCo, Berkeley, California) gegen Kernporenproteine wurden 1:50 eingesetzt. Rhodamin-gekoppeltes ConcanavalinA (ConA) und ”Oregon-Grün”-gekoppeltes ”Wheat germ agglutinin” (WGA) (beide Molecular Probes) wurden in einer Konzentration von 0.1mg/ml eingesetzt. Bei dieser Konzentration werden ER und Golgi-Apparat von Zellkulturzellen etwa gleich stark markiert (Daten nicht gezeigt). Um die Intensität der Fluoreszenz durch ConA und WGA zu vergleichen, wurden Bilder mit gleichen Einstellungen am Mikroskop aufgenommen und identisch bearbeitet.

2.13. Elektronenmikroskopie

Zur Analyse der leichten und schweren Membranen wurden je 5μl der Membranen mit 1ml 1% Glutaraldehyd in MWB ohne Saccharose und DTT für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, daraufhin für 5 Minuten bei 14000rpm, 2°C in einer [Seite 33↓]Tischzentrifuge (Eppendort, Hamburg) zentrifugiert und die Membranen im Pellet viermal mit 1ml 100mM Hepes, pH 7.7, gewaschen. Das Pellet wurde weiter mit 1% OsO4 behandelt und in Epon/Araldite eingebettet. Die Dünnschnitte wurden mit Uranylacetat und Bleiacetat gefärbt und und in einem Elektronenmikroskop (JOEL, 1200EX) analysiert.

Um die Bildung von Zellkernen mittels Dünnschnitt und Negativkontrastierung zu verfolgen, wurden 100μl einer Kernbildungsreaktion 15 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend mit 1ml 50mM Hepes, pH 7.4, 1mM EGTA, 50mM KCl, 2mM Magnesiumacetat, 125mM Saccharose, 1% Glutaraldehyd für eine Stunde auf Eis fixiert. Die fixierten Kerne wurden 1 Minute bei 5000rpm (4500g), 2°C in einem ”swing out” Rotor (Nr.11133, Sigma) pelletiert und das Pellet viermal mit 1ml 200mM Hepes, pH 7.4, gewaschen. Das Pellet wurde weiter wie oben behandelt und analysiert.

Um die Bildung der Membrannetzwerke mittels Negativkontrastierung zu verfolgen, wurden 10μl einer ER-Bildungsreaktion auf einem mit Nitrocellulose beschichteten Träger gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer abgeschlossenen Kammer mit hoher Luftfeuchtigkeit inkubiert. Der Träger wurde anschließend kurz in MWB ohne Saccharose und DTT gewaschen, daraufhin für 15 Minuten in MWB mit 1% Glutaraldehyd fixiert, und nach erneutem Waschen in 200mM Hepes, pH 7.6, mit Uranylacetat gefärbt.

2.14. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot

Proteine wurden für 15 Minuten in SDS-Probenpuffer (4% SDS (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), 135mM Tris pH 8-10, 20% Glycerin, etwas Bromphenolblau) bei 70°C gelöst und durch eindimensionale Gelelektrophorese (Laemmli, 1970) bei 50-70mA aufgetrennt. Es wurden Gele mit einer Acrylamid-Konzentration im Trenngel von 10% oder Gradientengele mit einer Konzentration von 7.5-17.5% Acrylamid verwendet. Nach dem Lauf wurden die Proteine in 10% Essigsäure, 40% Methanol, 0.1% (w/v) Coomassie Brillant Blau G250 gefärbt, in demselben Puffer ohne Coomassie entfärbt und mit einer digitalen Kamera (Nikon, Melville, New York) und zugehöriger Software aufgenommen.


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Beim Western Blot wurden die Gele nach der SDS-PAGE kurz in Transferpuffer (192mM Glycin, 25mM Tris-Base, pH8.3, 0.1% SDS, 20% Methanol (Fisher Scientific)) gelegt und anschließend im ”semi-dry”-Verfahren zwischen 8 Lagen Filterpapier mit 2mA/cm2 für eine Stunde auf eine Nitrocellulose-Membran (Schleicher und Schuell, Keene, New Hampshire) transferiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde in TBT-Puffer (50mM Tris, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween20) mit 5% (w/v) Trockenmilch für 15 Minuten inkubiert, gefolgt von dem jeweiligen ersten Antikörper in demselben Puffer. In dieser Arbeit wurden Antikörper gegen die α-Untereinheit von Tubulin (DM1α, Sigma), Sec61α (Görlich et al., 1992), Trap α und β (Görlich et al., 1989) und die 12kDa Untereinheit der Signalpeptidase, SP12 (Kalies et al., 1997) im Western Blot verwendet. Der zweite Antikörper war ein Peroxidase-gekoppelter Anti-Kaninchen oder Anti-Maus Antikörper und wurde mittels verstärkter Chemielumineszenz, ECL (Amersham), detektiert. Zur Bestimmung der Depletion von Tubulin wurde ein radioaktiv markierter zweiter Antikörper verwendet, der mit Hilfe eines ”Phosphorimagers” quantifiziert wurde.

2.15. Fraktionierung des Cytosols

Zur Fraktionierung des Cytosols durch Anionen-Austauscherchromatographie wurden 5ml Cytosol direkt vor der Fraktionierung mit 10 Volumen MWB verdünnt und eine Stunde bei 50000rpm, 2°C im Ti50.2-Rotor (Beckman) zentrifugiert. Der Überstand wurde an eine Säule mit 10ml ”DEAE-Sepharose fast flow” (Pharmacia) gebunden und die gebundenen Proteine schrittweise mit MWB + 100mM Kaliumacetat, MWB + 200mM Kaliumacetat und MWB + 500mM Kaliumacetat eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden mit MWB ohne Kaliumacetat auf eine Endkonzentration von 100mM Kaliumacetat verdünnt und alle Fraktionen durch Ultrafiltration (Centriprep 10, Millipore, Bedford, Massachusetts) aufkonzentriert.

Bei der Gelfiltration wurde 1ml Cytosol direkt vor dem Auftragen auf die Säule für 30 Minuten bei 75000rpm, 2°C im 100.3-Rotor (Beckman) zentrifugiert, um durch das Einfrieren entstandene Aggregate abzutrennen. Der Überstand wurde auf einer Superose12 Gelfitrationssäule (Pharmacia) in Laufpuffer (25mM Hepes pH 7.6, 150mM Kaliumacetat, 2mM Magnesiumacetat) aufgetrennt, und die erhaltenen 1ml-Fraktionen [Seite 35↓]durch Ultrafiltration (Microcon10, Millipore) konzentriert. Die aufkonzentrierten Fraktionen wurden wie das Cytosol in der ER-Bildungsreaktion getestet, und konnten wie dieses in Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert werden.


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12.02.2004