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3.  Ergebnisse

3.1. Die Bildung der Zellkernhülle in vitro

3.1.1. Die Zellkernbildung im Xenopus Eiextrakt

Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Etablierung eines in vitro Systems zur Bildung von Zellkernen, das den Extrakt der Eier von X.laevis benutzt. Wird der Eiextrakt mit Spermien-Chromatin von X.laevis für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so bilden sich Zellkerne, die in Größe und Form den in vivo gebildeten Zellkernen ähneln. Wie diese besitzen sie eine innere und äußere Kernmembran, Kernporen und eine Kernlamina und sind zu Kernimport und semi-konservativer DNA-Replikation in der Lage (Wilson und Wiese, 1996). Die Bildung der Zellkerne kann im Fluoreszenz-Mikroskop verfolgt werden (Abb. 2). Dazu wird die DNA des Spermien-Chromatins mit bis-Benzimid (”Hoechst”) gefärbt und die Membranen werden mit einem hydrophoben, fluoreszierenden Farbstoff sichtbar gemacht. Die Kernhülle ist außerdem im Phasenkontrast-Bild zu sehen.

Zu Beginn der Reaktion (Abb. 2, 0 Minuten) ist das Spermien-Chromatin noch stark kondensiert. Jedes S-förmige Chromatin enthält den haploiden Chromosomensatz eines Spermien-Zellkerns. Wenige Minuten später ist es bereits dekondensiert und gebundene Membranvesikel sind als diffuse, rauhe Umrandung des Chromatins zu erkennen (Abb. 2, 5 Minuten). Nach 20 Minuten sind die gebundenen Membranvesikel bereits zum Großteil miteinander fusioniert. Dies kann an der scharfen, von der abgeflachten Kernhülle

hervorgerufenen Linie um das Chromatin im Phasenkontrast-Bild und im Fluoreszenz-Zellkerne wurden durch Inkubation eines Eiextraktes mit Spermien-Chromatin und einem Energie-regenerierenden System erhalten. Nach verschiedenen Zeiten der Inkubation (0, 5, 20 und 60 Minuten) wurde ein Aliquot der Reaktion mit einer Färbelösung vermischt und im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert. Die DNA wurde mit Hoechst gefärbt (linke Spalte, ”DNA”) und die Membranen mit DHCC, einem hydrophoben, fluoreszierenden Farbstoff (mittlere Spalte, ”Membranen”). In der rechten Spalte sind die sich bildenden [Seite 37↓]Zellkerne im Phasenkontrastbild zu sehen (rechte Spalte, ”Phase”). Maßstab für alle Bilder: 20μm.


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Abb. 2: Die Bildung von Zellkernen im Xenopus Eiextrakt


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Bild, nach Anfärben der Membranen mit dem hydrophoben, fluoreszierenden Farbstoff, erkannt werden (Abb. 2, 20 Minuten). Der sich bildende Zellkern fängt an, sich abzurunden. Nach 60 Minuten sind die Zellkerne kugelförmig und die geschlossene Kernhülle ist als scharfe Linie zu erkennen (Abb.2, 60 Minuten).

3.1.2. Fraktionierung des Eiextraktes in Cytosol und Membranfraktionen

Um den Prozeß der Bildung der Kernhülle biochemisch besser zugänglich zu machen, wurde der Eiextrakt in eine cytosolische und zwei Membranfraktionen getrennt (siehe Material und Methoden). Die beiden Membranfraktionen unterscheiden sich durch ihre Dichte und werden deshalb als ”leichte” und ”schwere” Membranen bezeichnet.

Wie in der Einleitung beschrieben, kann die Zellkernbildung im Xenopus in vitro System in eine Bindungsreaktion, bei der Membranvesikel an das dekondensierte Spermien-Chromatin binden, und einen darauffolgenden Fusionsschritt, bei dem die Chromatin-gebundenen Membranvesikel miteinander fusionieren und so die Kernhülle bilden, getrennt werden (Newport und Dunphy, 1992).

Die leichte und schwere Membranfraktion wurden zuerst auf ihre Fähigkeit getestet, an Chromatin zu binden (Abb. 3A). Das Spermien-Chromatin wurde durch Polyglutamat dekondensiert und die Bindungsreaktion ohne Cytosol und in Gegenwart von GTPγS durchgeführt, damit sich keine Kernhülle bildet. Dabei zeigte sich, daß nur Membranvesikel aus der leichten Membranfraktion an das Chromatin binden können (Abb. 3A). Als nächstes wurde untersucht, ob mit dem fraktionierten Extrakt, d.h. mit der cytosolischen Fraktion und beiden Membranfraktionen die Bildung großer Zellkerne rekonstituiert werden kann. Abb. 3B zeigt, daß große Zellkerne gebildet werden, wenn alle drei Fraktionen zusammengegeben werden. Die leichten Membranen bilden zusammen mit dem Cytosol nur kleine Zellkerne, während die schweren Membranen zusammen mit dem Cytosol keine Zellkerne bilden (Abb.3B und Daten nicht gezeigt).


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Da sich die leichten und schweren Membranen in ihrem Verhalten bei der Kernbildung unterscheiden, wurde ihre Zusammensetzung näher charakterisiert (Abb. 4). Beide Membranfraktionen wurden im ”Westernblot” mit Antikörpern gegen Markerproteine des ER getestet. Nur die leichten Membranen reagieren mit Antikörpern gegen diverse Markerproeine des ER (Abb. 4A). Für Proteine der inneren Kernmembran, des Golgi- Apparates oder der Plasmamembran standen keine Antikörper zur Verfügung. Im elektronenmikroskopischen Bild nach Dünnschnitt und Negativkontrastierung stellt sich die leichte Membranfraktion als eine relativ homogene Vesikelpopulation mit Vesikel-Durchmessern zwischen 100nm und 200nm dar (Abb. 4B). Die schwere Membranfraktion enthält überwiegend Mitochondrien und nur wenige kleine Vesikel (Abb. 4B).


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Abb. 3: Chromatinbindung und Kernbildung mit den leichten und schweren Membranen


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Es ist offen, wie die schweren Membranen, die nicht an das Chromatin binden und folglich auch allein mit dem Cytosol keine Zellkerne bilden können, an der Bildung großer Zellkerne beteiligt sind. Denkbar ist, daß Membranvesikel der schweren Membranfraktion mit der äußeren Kernmembran der kleinen Zellkerne fusionieren, und so die Vergrößerung der Kernhülle ermöglichen. Der Effekt könnte aber auch indirekt zum Beispiel von den Mitochondrien der schweren Membranfraktion verursacht sein.

3.1.3. Ein vereinfachtes in vitro System der Zellkernbildung

Die Trennung des Extraktes in Cytosol und Membranfraktionen ist eine Voraussetzung für die Identifizierung cytosolischer Proteine, die an der Bildung der Kernhülle beteiligt sind, durch Fraktionierung des Cytosols. An der bisher beschriebenen Bildung großer Zellkerne sind viele cytosolische Proteine beteiligt, die nur indirekt etwas mit der Bildung der Kernhülle zu tun haben. Die Dekondensation des Chromatins und die Assemblierung von Nukleosomen erfolgt durch Nucleoplasmin und andere cytosolische Proteine. Der Kernimport, der für die Bildung großer Zellkerne notwendig ist, benötigt eine Reihe bekannter cytosolischer Faktoren. Bisher sind keine cytosolischen Proteine bekannt, die direkt an der Bildung der Kernhülle aus den Chromatin-gebundenen Membranvesikeln beteiligt sind. Da es für die Fraktionierung des Cytosols von Vorteil ist, wenn der untersuchte Prozeß nur einen oder wenige Faktor(en) aus dem Cytosol benötigt, haben wir versucht, die Kernbildungsreaktion zu vereinfachen.

Um die Dekondensation des Chromatins unabhängig vom Cytosol zu machen, wurde Polyglutamat zu der Kernbildungsreaktion gegeben. Polyglutamat allein ist ausreichend,


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um die für die Kernbildung notwendige Dekondensation des Chromatins zu bewirken. Außerdem wurde die schwere Membranfraktion aus der Reaktion weggelassen. Dies führt dazu, daß die in diesem System gebildeten Kerne klein bleiben, die zylindrische Form des dekondensierten Chromatins behalten und ihre Bildung deshalb wahrscheinlich unabhängig vom Kernimport ist.


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Abb. 4: Analyse der leichten und schweren Membranfunktionen


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Die vereinfachte Kernbildungsreaktion enthält somit Spermien-Chromatin, die leichte Membranfraktion, Cytosol, ein Energie-regenerierendes System und Polyglutamat (Abb. 5). Nach 100-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur haben die in diesem System gebildeten Zellkerne eine kontinuierliche Kernhülle, die im Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Bild an der scharfen Linie erkennbar ist (Abb. 5A, ”Phase” und ”Membranen”, 100 Minuten). Das elektronenmikroskopische Bild nach Dünnschnitt und Negativkontrastierung zeigt, daß die Kernhülle zu diesem Zeitpunkt aus einer inneren und äußeren Kernmembran besteht (Abb. 5B). Nach 10 Minuten und 30 Minuten der Inkubation sind bereits Membranvesikel gebunden, aber sie erscheinen im Phasenkontrast- und Fluoreszenzbild noch als ”rauher” Rand um das Chromatin, was darauf hindeutet, daß die Membranvesikel zum Großteil noch nicht miteinander fusioniert sind (Abb. 5A). Die Bildung einer geschlossenen Kernhülle dauert in der vereinfachten Kernbildungsreaktion also länger also bei der Verwendung des kompletten Eiextraktes (vergleiche z.B. Abb. 5A, ”30 Minuten” mit Abb. 2, ”20 Minuten”).

Als nächstes wurde überprüft, ob die vereinfachte Kernbildungsreaktion abhängig von Cytosol ist (Abb. 6). Ohne Cytosol dekondensiert das Spermien-Chromatin durch das Polyglutamat und Membranvesikel können binden (Abb. 6B). Im Gegensatz zu einer Kontrollreaktion mit Cytosol bildet sich keine kontinuierliche Kernhülle (vergleiche Abb. 6B und 6C). Im Fluoreszenz-Mikroskop erscheinen die gebunden Membranen als rauher Rand um das Chromatin. Die Abbildung zeigt außerdem eine Kontrollreaktion ohne Membranen, bei der sich keine Zellkerne bilden (Abb. 6A). Eine oder mehrere cytosolische Aktivitäten sind also für die Bildung der Zellkernhülle in diesem vereinfachten in vitro System notwendig.

Eine hilfreiche Eigenschaft der vereinfachten Kernbildungsreaktion ist, daß das Cytosol relativ verdünnt eingesetzt werden kann. Eine eindeutige Kernhülle war noch sichtbar, wenn das Cytosol von 80% auf etwa 25% des Reaktionsvolumens verringert wurde (Daten


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Abb. 5: Die Bildung von Zellkernen im vereinfachten Kernbildungssystem

[Seite 47↓](A) Zellkerne wurden durch Inkubation von Spermien-Chromatin, Cytosol, leichten Membranen, Polyglutamat und einem Energie-regenerierenden System erhalten. Nach den angegebenen Zeiten wurden Aliquots abgenommen und die DNA und die Membranhülle wie in Abb. 2 im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert. Maßstab: 20μm.


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Abb. 6: : Die Bildung von Zell kernen im vereinfachten Kernbildungssytem benötigt Cytosol

Die vereinfachte Kernbildungsreaktion erfüllt also eine Reihe von Voraussetzungen, die für die Identifizierung der an der Bildung der Kernhülle beteiligten cytosolischen Aktivität(en) nützlich sind: Sie stellt keine überflüssigen Anforderungen an das Cytosol, wie die Dekondensation des Chromatins oder den Kernimport, sie ist gut reproduzierbar und das Cytosol kann relativ verdünnt eingesetzt werden.


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nicht gezeigt); um große Zellkerne zusammen mit der schweren Membranfraktion zu erhalten, muß das Cytosol mehr als etwa 75% des Reaktionsvolumens ausmachen. Die Verdünnung des Cytosols, bei der sich noch deutlich Kernhüllen bilden können, kann als Maß für die Konzentration der cytosolischen Aktivität(en) dienen. Eine weiterer Vorteil ist die bessere Reproduzierbarkeit des vereinfachten Systems. Während alle getesteten Präparationen von Cytosolen und leichten Membranen in der vereinfachten Kernbildungsreaktion aktiv waren, bildeten nur etwa die Hälfte davon große Zellkerne in Gegenwart der schweren Membranfraktion.

Die vereinfachte Kernbildungsreaktion erfüllt also eine Reihe von Voraussetzungen, die für die Identifizierung der an der Bildung der Kernhülle beteiligten cytosolischen Aktivität(en) nützlich sind: Sie stellt keine überflüssigen Anforderungen an das Cytosol, wie die Dekondensation des Chromatins oder den Kernimport, sie ist gut reproduzierbar und das Cytosol kann relativ verdünnt eingesetzt werden.

3.1.4. Ein neuer Schritt bei der Bildung der Zellkernhülle

In den bisherigen Experimenten ist der Unterschied zwischen Chromatin-gebundenen Membranvesikeln und einer kontinuierlichen Kernhülle relativ gut ersichtlich. Genauere Details als eine diffuse, rauhe Umrandung um das Chromatin in dem einen Fall und eine scharfe Linie in dem anderen Fall sind jedoch schwer zu erkennen. Um die Bildung der Kernhülle genauer verfolgen zu können, wurde im folgenden eine hochauflösende CCD-Kamera zur Bildaufnahme verwendet und die Qualität der erhaltenen Bilder durch anschließende Bildverarbeitung weiter verbessert. Mit Hilfe der Bildverarbeitung werden zum einen Unschärfen des Bildes herausgerechnet, die durch die Mikroskopoptik entstehen. Zum anderen können Bilder eines sich bildenden Zellkerns, die in Fokussierungsebenen mit einem Abstand von 0.2μm aufgenommen wurden, zu einem dreidimensional erscheinenden Bild des Objektes rekonstruiert werden. Durch den Einsatz dieser Technik konnte die Bildung der Zellkernhülle im vereinfachten Kernbildungssystem sehr gut verfolgt und ein neuer Schritt bei der Bildung der Kernhülle identifiziert werden.


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Die Abbildungen 7 bis 11 zeigen die Bilder von der Entstehung einer Kernhülle in der vereinfachten Kernbildungsreaktion, die mit Hilfe der hochauflösenden Kamera und anschließender Bildverarbeitung erhalten wurden. Nach zehn Minuten sieht man Membranen in Form von kleinen Flächen auf der Chromatinoberfläche (Abb.7, Pfeile). Die kleinen Flächen sind zum Teil durch tubuläre Membranstrukturen verbunden. Die Abbildungen 7A und 7B zeigen Aufnahmen in unterschiedlichen Fokussierungsebenen desselben Objektes, die in ihrer Qualität bereits durch Bildverarbeitung verbessert sind. Die Abb. 7C stellt eine dreidimensionale Rekonstruktion vieler solcher Bilder desselben Objektes dar. Abb. 7D und 7E zeigen weitere Beispiele der Kernhüllenbildung nach zehn Minuten. Nach 30 Minuten ist die Bildung der Kernhülle bereits weiter fortgeschritten (Abb. 8). Größere, flache Membranschichten bedecken die Oberfläche des Chromatins wie ein Flickenteppich. Wiederum zeigen Abb. 8A und 8B Aufnahmen desselben Objektes in zwei unterschiedlichen Fokussierungsebenen und Abb. 8C stellt das aus vielen solcher Bilder rekonstruierte dreidimensionale Bild dar. Nach 60 Minuten haben einige der Kerne eine kontinuierliche Membranhülle geformt (Abb. 9A, B, C). Wurde die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel bei der Kernbildungsreaktion durch GTPγS verhindert, so ist die Chromatinoberfläche mit kleinen Strukturen bedeckt, die unfusionierte Membranvesikel darstellen und im Querschnitt das Chromatin wie ein feiner Saum umgeben (Abb. 10A, B, C). Wurde die Kernbildungsreaktion ohne Cytosol durchgeführt, so sind Membranvesikel von einigen Mikrometern Durchmesser an das Chromatin gebunden (Abb. 11). Die großen Membranvesikel in Abb. 11 sind wahrscheinlich durch die Fusion der in Abb. 10 zu sehenden kleinen, Chromatin-gebundenen Membranvesikel miteinander entstanden. Die Fusion benötigt demnach keine cytosolischen Faktoren. Ohne

Die Bildung von Zellkernen im vereinfachten Kernbildungssystem wurde mit einer hochauflösenden Kamera verfolgt. Nach 10-minütiger Inkubation wurde ein Aliquot der Reaktion mit einer Färbelösung, die Octadecyl-Rhodamin als hydrophoben, fluoreszierenden Farbstoff enthielt, vermischt und im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert. Bilder eines einzelnen sich bildenden Zellkerns wurden in 0,2μm Schritten senkrecht zur Fokussierungsebene aufgenommen. Zwei solcher Bilder sind in (A) und (B) gezeigt. Aus [Seite 51↓]allen Bildern eines Objektes wurde ein dreidimensional erscheinendes Bild rekonstruiert (C). Weitere Beispiele hierfür sind in (D) und (E) zu sehen. Auf der Oberfläche des Chromatins sind die abgeflachten Chromatin-gebundenen Membranvesikel als kleine Flächen zu erkennen (Pfeile). Maßstab: 10μm.

Die Kernbildung wurde wie in Abb. 7 analysiert. Aus den Bildern eines Objektes (A und B) wurde wiederum ein dreidimensional erscheinendes Bild erhalten (C). Weitere Beispiele sind in (D) und (E) zu sehen. In (A) ist die sich formende Kernhülle als unterbrochenen Linie zu erkennen. Der Pfeil in (C) deutet auf eine noch unbedeckte Stelle der Chromatinoberfläche, der Pfeil in (D) zeigt eine Membran-bedeckte Stelle. Maßstab: 10μm.


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Abb. 7: Die Bildung der Kernhülle nach 10-minütiger Inkubation im vereinfachten Kernbildungssystem


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Abb. 8: Die Bildung der Kernhülle nach 30-minütiger Inkubation im vereinfachten Kernbildungssystem


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Abb. 9: Nach 60-minütiger Inkubation haben einige Zellkerne eine kontinuierliche Kernhülle geformt

Abb. 10: In Gegenwart von GTPγS sind kleine Membranvesikel an das Chromatin gebunden
Abb. 11: Ohne Cytosol binden und fusionieren die Membranvesikel miteinander, aber flachen nicht auf der Oberseite des Chromatins ab.


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Cytosol liegen diese Membranvesikel jedoch nicht flach auf Oberfläche des Chromatins, sondern bleiben kugelförmig. Die großen Chromatin-gebundenen Membranvesikel können keine Kernhülle bilden. Eine Aktivität des Cytosols bewirkt also, daß die miteinander fusionierenden Chromatin-gebundenen Membranvesikel auf der Oberfläche des Chromatins abflachen und in der Folge eine kontinuierliche Hülle um das Chromatin bilden können. Diese neue Aktivität könnte auch für den relativ gleichmäßigen Abstand der inneren und äußeren Kernmembran der Zellkerne verantwortlich sein.

Bei der Bildung der Kernhülle können demzufolge drei Schritte unterschieden werden: 1. Die Bindung von Membranvesikeln an das Chromatin, die weder Energie noch Cytosol benötigt. 2. Die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel, die Energie in Form von ATP und GTP benötigt, jedoch kein Cytosol. 3. Das Abflachen der fusionierenden Membranvesikel, das cytosolische Faktoren benötigt.

3.1.5. Erste Fraktionierung der für das Abflachen der Kernhülle notwendigen cytosolischen Aktivitäten

Für die Fraktionierung der für das Abflachen der Kernhülle notwendigen cytosolischen Faktoren ist es von Vorteil, daß die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel Cytosol-unabhängig ist. Da die an der Fusion beteiligten Proteine nicht vom Cytosol bereitgestellt werden müssen, sollten sie nicht als notwendige Faktoren bei der Fraktionierung auftauchen.

Das Cytosol wurde durch Anionenaustauscher-Chromatographie mit DEAE-Sepharose fraktioniert, indem cytosolische Proteine bei einer Salzkonzentration von 50mM Kaliumacetat gebunden wurden, und anschließend schrittweise mit 150 mM Kaliumacetat (Fraktion D1), 250mM Kaliumacetat (D2) und 500mM Kaliumacetat (D3) eluiert wurden. Die Proteine der Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und in der vereinfachten Kernbildungsreaktion getestet (Abb. 12A, B). Während mit der Durchlauf-Fraktion (DL) und den Fraktionen D2 und D3 große, kugelförmige Membranvesikel am [Seite 57↓]Chromatin gebunden waren, wie in Abwesenheit von Cytosol, bildete sich mit der Fraktion D1 eine abgeflachte Kernhülle, die als scharfe Linie sichtbar ist. Ein Unterschied zur Kernbildung mit unfraktioniertem Cytosol ist, daß weniger Kerne eine kontinuierliche Membranhülle aufweisen. Dies konnte nicht durch die Zugabe einer der anderen Fraktionen zur D1-Fraktion verändert werden. Möglicherweise liegen die cytosolischen Aktivitäten für das Abflachen der Kernhülle in den DEAE-Fraktionen verdünnter vor als im Ausgangs-Cytosol. Natürlich ist es offen, ob die D1-Fraktion eine oder mehrere Aktivitäten enthält. Hierfür sind weitere Fraktionierungsschritte notwendig.

3.2. Bildung des Endoplasmatischen Reticulums in vitro

3.2.1. Ein in vitro System zur Bildung polygoner Membrannetzwerke

Werden dieselben ”leichten” Membranen, die in der Lage sind, Zellkernhüllen zu bilden, mit Cytosol und einem Energie-regenerierenden System für 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, so bildet ein Großteil der Membranen dünne Tubuli, die ein ausgedehntes Membrannetzwerk bilden. Die Membrantubuli können durch sehr vorsichtiges Vermischen mit einem fluoreszierenden, hydrophoben Farbstoff im Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar gemacht werden (Abb. 13B, rechtes Farbbild). Ein Teil der Membranen formt große, runde Vesikel oder scheint in Aggregaten vorzuliegen.

Die Bildung dieser Membrannetzwerke findet nicht nur mit der Membran- und Cytosolfraktion statt, sondern auch, wenn stattdessen der Eiextrakt mit einem Energie-regenerierenden System inkubiert wird. Die Membrannetzwerke sind jedoch schwer zu sehen, da der Großteil der Membranen des Extraktes keine Membrannetzwerke bildet (Daten nicht gezeigt).


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Abb. 12: Fraktionierung der für das Abflachen der Chromatin-gebundenen Membranvesikel notwendigen cytosolischen Aktivität

(A) Cytosol wurde durch Anionenaustauscher-Chromatographie mit einer DEAE-Säule aufgetrennt. Cytosolische Proteine wurden bei 50mM Kaliumacetat gebunden und schrittweise eluiert. Die erhalten Fraktionen, DL (Durchlauf), D1 ( mit 150mM Kaliumacetat eluiert), D2 (250mM Kaliumacetat), D3 (500mM Kaliumacetat), wurden durch SDS-PAGE und Färben mit ”Coomassie Blau” analysiert. Die linke Bahn zeigt die Proteine des Ausgangs-Cytosols. An der rechten Seite sind die Positionen und Molekulargewichte von Markerproteinen (in kDa) angegeben.


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Um die Membrannetzwerke besser sichtbar zu machen, wurde versucht, sie auf der Glasoberfläche eines Objektträgers anhaften zu lassen. In der Tat reicht es aus, einen Reaktionsansatz von 10μl auf einen Objektträger mit einer leichten Vertiefung mit einem Durchmesser von etwa 1cm zu pipettieren und 30-60 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren, um Membrannetzwerke stabil auf der Glasoberfläche gebunden zu erhalten. Ungebundene Membranen und freier fluoreszierender Farbstoff können anschließend leicht weggewaschen werden. Die Membranen liegen auf der Glasoberfläche in einer Fokussierungsebene des Fluoreszenz-Mikroskops und sind weniger beweglich als in Lösung. Insgesamt wurden so klare Bilder von ausgedehnten, polygonalen Membrannetzwerken, sowohl mit dem Extrakt als auch mit den leichten Membranen und dem Cytosol, erhalten (Abb. 13A, B; Schwarz-Weiß-Bilder der linken Spalte). Im folgenden wird zu einem Experiment oft sowohl ein Gesamtbild der Membranen, das einfach durch vorsichtiges Mischen einer ER-Bildungsreaktion mit dem fluoreszierenden Farbstoff erhalten wird (Farbbilder), als auch ein Bild von Membrannetzwerken, die auf der Glasoberfläche eines Objektträgers anhaften, gezeigt (Schwarz-Weiß-Bilder).

Die Membrantubuli sind gradlinig und haben eine Länge von einigen Mikrometern bevor sie einen Knotenpunkt erreichen, an dem 3 oder selten 4 Membrantubuli zusammentreffen (Abb. 13A). Die Membrantubuli sind meist nicht über ihre ganze Länge an die Glasoberfläche gebunden, sondern nur an einzelnen Punkten, zwischen denen die Membrantubuli kleine Bewegungen ausführen können. Die auf der Glasoberfläche anhaftenden Netzwerke sind nach dem Waschen im Puffer für 5-15 Minuten stabil. Danach zerfallen die Membrantubuli in Vesikel (nicht gezeigt). Dies könnte darauf hindeuten, daß die Membrantubuli nicht der energetisch günstigste Zustand für die Membranen sind, der sich spontan bilden könnte und danach stabil sein sollte. Im Fluoreszenz-Mikroskop haben


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Abb. 13: In vitro Bildung der polygonalen Membrannetzwerke


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Abb. 14: Elektronenmikroskopische Analyse der Membrannetzwerke


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die Membrantubuli einen Durchmesser, der kleiner oder gleich der kleinsten, auflösbaren Länge von etwa 200nm ist.

Um ein genaueres Bild der Membrannetzwerke zu erhalten, wurden sie im Elektronenmikroskop analysiert. Hierfür wurden die Membrannetzwerke auf Trägern für die Elektronenmikroskopie gebildet und nach Fixierung mit Glutaraldehyd durch Negativkontrastierung mit Uranylacetat sichtbar gemacht. Unter diesen Bedingungen werden verzweigte Membrantubuli erhalten, die im elektronenmikroskopischen Bild einen Durchmesser von etwa 100nm haben (Abb. 14A).

3.2.2. ER-Membranen sind Bestandteil der polygonen Membrannetzwerke

Die in diesem System gebildeten polygonen Membrannetzwerke haben eine verblüffende Ähnlichkeit mit den Membranstrukturen des peripheren ER in Zellen (vergleiche zum Beispiel Abb. 13A mit Abb. 1A). Aus den Untersuchungen zur Kernbildung ist außerdem bekannt, daß die leichten Membranen Proteine des ER enthalten (siehe Abb. 4A).

Um zu prüfen, ob die Netzwerke aus Membranen des ER gebildet sind, wurden die Membrannetzwerke wie üblich auf der Glasoberfläche eines Objektträgers gebildet, dann mit Glutaraldehyd fixiert, und in der Immunfluoreszenz mit einem Antikörper gegen das ER-Markerprotein TRAPα analysiert (Abb. 15A). Tatsächlich sind so dieselben polygonen Membrannetzwerke sichtbar, wie durch einfaches Anfärben der Membranen mit dem hydrophoben Fluoreszenzfarbstoff. Der Antikörper gegen TRAPα markiert die Netzwerke spezifisch, da in Gegenwart des Peptids, gegen das der Antikörper gerichtet ist, keine Netzwerke sichtbar sind (Abb.15A). Dies bedeutet, daß ein Teil der Membranen im Netzwerk aus ER-Membranen gebildet wird. Durch die Fixierungsprozedur sind die Membrannetzwerke nicht so gut erhalten, wie bei der sofortigen Betrachung im Fluoreszenz-Mikroskop (vergleiche z.B. Abb. 15A mit 13B, linkes Bild).


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Viele Proteine des ER besitzen Oligosaccharid-Seitenketten, an die das Lectin Concanavalin A (ConA) gut bindet, während viele Proteine des Golgi-Apparates Oligosaccharid-Seitenketten besitzen, die von dem Lectin ”Wheat germ agglutinin” (WGA) erkannt werden. Dementsprechend markieren diese mit fluoreszierenden Gruppen modifizierten Lectine in fixierten und permeabilisierten Zellkulturzellen das ER beziehungsweise den Golgi-Apparat (Daten nicht gezeigt). Beide Lectine, modifiziert mit unterschiedlichen fluoreszierenden Gruppen, wurden zu den fixierten und permeabilisierten Membrannetzwerken gegeben und im Fluoreszenz-Mikroskop analysiert (Abb. 15B). Mit ConA zeigen sich dieselben Membrannetzwerke, die mit dem hydrophoben Fluoreszenzfarbstoff zu sehen sind, während mit WGA die Membranstrukturen praktisch nicht markiert werden.

Die Membrannetzwerke wurden außerdem mit einem monoklonalen Antikörper, Mab 414, getestet, der mehrere Kernporenproteine erkennt (Meier et al., 1995). Diese Kernporenproteine liegen im Eiextrakt in der cytosolischen Fraktion vor und werden bei der Assemblierung der Kernpore aus dem Cytosol rekrutiert. In vielen Eizellen und sich schnell teilenden Zellen liegen Kernporen in besonderen Strukturen vor, den sogenannten ”Annulate Lamellae” (Kessel, 1992). ”Annulate Lamellae” sind im Cytosol vorliegende Stapel abgeflachter Membranen der Kernhülle mit Kernporen, jedoch ohne eine Kernlamina. Sie stellen möglicherweise eine Speicherform für Komponenten der Kernhülle dar. Obwohl dieser Antikörper sehr klar die Kernhülle von im Xenopus-System gebildeten Zellkernen markiert (Abb. 15C, Einfügung im rechten Bild), reagiert er nicht mit Proteinen der Membrannetzwerke (Abb. 15C). Diese besitzen also keine Kernporen.

Die in diesem in vitro System assemblierten Membrannetzwerke bestehen aus Membranen des ER, und nicht oder nur zu einem geringen Anteil aus Membranen des Golgi-Apparates. Es wird daher angenommen, daß die Bildung der Membrannetzwerke in diesem in vitro System die Bildung des ER in eukaryontischen Zellen widerspiegelt.


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Abb. 15: ER-Membranen sind Bestandteil der Membrannetzwerke

Die Membrannetzwerke wurden wie üblich auf einem Objektträger gebildet, anschließend fixiert und mit verschiedenen Antikörpern oder Lectinen markiert.
(A) Antikörper gegen des ER-Markerprotein TRAPα markieren spezifisch die Membrannetzwerke, da diese nicht markiert sind, wenn die Immunfluoreszenz in Gegenwart des Peptides, gegen das der Antikörper gerichtet ist, durchgeführt wurden.
(B) Die Membrannetzwerke wurden gleichzeitig mit dem Rhodamin-markierten Lectin Concanavalin A (ConA) und ”Oregon-Grün”-markiertem ”Wheat germ agglutinin” (WGA) inkubiert, um ER-Membranen (ConA) und Golgi-Membranen (WGA) zu detektieren. Die beiden Bilder zeigen denselben Bildausschnitt.
(C) Die Membrannetzwerke wurden mit einem Antikörpern gegen Kernporenproteine (Mab 414) inkubiert, um Kernporen und ”Annulate Lamellae” zu detektieren (rechtes Bild). Gleichzeitig wurden die Membrannetzwerke mit einem Antikörper gegen das ER-Markerprotein TRAPα markiert (linkes Bild). Die beiden Bilder zeigen denselben Bildausschnitt. Das kleine, eingefügte Bild zeigt in einer Positivkontrolle, daß Mab 414 die Kernhülle von Zellkernen, die im Xenopus System gebildet wurden, deutlich markiert.
Maßstab für alle Bilder (außer dem eingefügten Bild in C): 10μm.


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3.2.3.  Charakterisierung der ER-Bildung in vitro

Zu Beginn der Reaktion liegen die Membranen als homogene Vesikelpopulation mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 100nm bis 200nm vor (Abb. 4B). Wie können aus diesen kleinen Membranvesikeln ausgedehnte, polygone Membrannetzwerke entstehen? In jedem Fall müssen die Membranvesikel miteinander fusionieren. Daher sollten Bedingungen, die die Fusion der Membranvesikel verhindern, auch die Bildung der Membrannetzwerke verhindern.

Die ER-Bildung ist Cytosol-, Temperatur- und Energie-abhängig. Bei Inkubation der ER-Bildungsreaktion auf Eis liegen die Membranen, genauso wie am Beginn der Reaktion, in Form kleiner Vesikel vor, die im Fluoreszenz-Mikroskop nach Anfärben als homogene Fläche erscheinen (Abb. 13 D).

Wird das Cytosol durch Puffer ersetzt, so bilden sich keine Membrannetzwerke, sondern sehr große, meist kugelförmige Membranvesikel mit Durchmessern von mehreren Mikrometern (Abb. 13C und 14B). Die großen Membranvesikel müssen durch die Fusion der kleinen Membranvesikel miteinander entstehen. Dies bedeutet, daß alle Proteine, die für die Fusion der Membranvesikel notwendig sind, sich zumindest zum Teil in der leichten Membranfraktion befinden. In Übereinstimmung damit ist auch die bereits erwähnte homotypische Fusion von ER-Vesikeln aus S.cerevisiae in einem in vitro System unabhängig von Cytosol. Das überraschende Ergebnis ist, daß die Fusion der kleinen Membranvesikel allein nicht ausreicht, um die Membrantubuli zu bilden. Vielmehr wird dazu eine Aktivität aus dem Cytosol benötigt. Wird Cytosol nach der Bildung der großen Membranvesikel zu der Reaktion gegeben, so bilden diese keine Membrannetzwerke mehr (Daten nicht gezeigt). Das Cytosol muß also während der Fusion der Membranvesikel anwesend sein, damit sich die Membrantubuli und Membrannetzwerke bilden können.

Die ER-Bildung wird verhindert, wenn ATP in dem Reaktionsansatz durch die Zugabe von Hexokinase und Glukose in ADP und Glukose 6-Phosphat umgesetzt wird [Seite 69↓](Abb.16A). Ohne ATP werden auch keine großen Membranvesikel gebildet. Dies ist in Übereinstimmung mit der ATP-Abhängigkeit anderer zellulärer Membran-Fusionsreaktionen. Eine Kontrollreaktion nur mit Hexokinase hat keinen Einfluß auf die ER-Bildung (Abb. 16B).

Abb. 16: Die Bildung der Membrannetzwerke benötigt ATP und ist durch GTPgS hemmbar.


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Von GTPγS ist bekannt, daß es Membranfusionen, zum Beispiel beim Vesikeltransport entlang des sekretorischen Transportweges und bei der Zellkernbildung in dem Xenopus in vitro System, verhindert. Abb. 16C zeigt, daß GTPγS auch die Bildung der Membrannetzwerke verhindert. Da auch keine großen Membranvesikel entstehen, verhindert GTPγS die Fusion der kleinen Membranvesikel und damit auch die Netzwerkbildung.

Werden die leichten Membranen mit NEM behandelt, bilden sie keine Netzwerke und keine großen Membranvesikel (Abb. 17B). Dies kann dadurch erklärt werden, daß NEM ein NSF-ähnliches Protein der Membran inaktiviert, das für die Fusion der Membranvesikel und somit für die ER-Bildung notwendig ist. Die NEM-Behandlung des Cytosols verhindert die Netzwerkbildung nicht (Abb. 17A).

Werden die Membranen mit Trypsin behandelt und nach Entfernen des Trypsins in der ER-Bildungsreaktion eingesetzt, so bilden sich keine Netzwerke. Stattdessen sind bei geringer Trypsin-Konzentration Membranaggregate zu sehen und bei hoher Konzentration erscheinen die Membranvesikel nach der Inkubation als homogen gefärbte Fläche wie zu Beginn der Reaktion (Abb. 17C). Eine Protease-sensitive Komponente der Membran ist also für die Fusion der Membranvesikel und der Bildung der Membrannetzwerke notwendig.

Zwei Vorgänge können somit bei der ER-Bildung unterschieden werden. Zum einen fusionieren die kleinen Membranvesikel miteinander in einer Reaktion, die ATP und GTP benötigt und an der NEM- und Protease-sensitive Komponenten der Membran beteiligt sind. Zum anderen ist eine cytosolische Aktivität dafür verantwortlich, daß durch die Fusion nicht einfach größere, kugelförmige Membranvesikel entstehen, sondern dünne Membrantubuli, die polygone Membrannetzwerke bilden.


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Abb. 17: Die Bildung der Membrannetzwerke ist durch die Behandlung der Membranen mit NEM oder Trypsin hemmbar

Das Cytosol (A) oder die leichten Membranen (B) wurden mit NEM behandelt und nach Inaktivierung von NEM durch DTT in der ER-Bildungsreaktion getestet.


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3.2.4.  Ca2+ verhindert die ER-Bildung in vitro

Werden Zellkulturzellen mit einem Calcium-Ionophor in Gegenwart von 1mM CaCl2 im Zellkulturmedium behandelt, so fragmentiert das ER in Vesikel (Koch et al., 1988; Subramanian und Meyer, 1997). Daher wurde der Einfluß von Ca2+ auf die Netzwerkbildung in dem in dieser Arbeit etablierten in vitro System getestet. Wird CaCl2 in einer Konzentration von 1 mM zur Reaktion gegeben, so wird die Bildung der Membrannetzwerke stark gehemmt. Stattdessen bilden sich große Membranvesikel und Membranaggregate (Abb. 18A). Eine Calcium-Konzentration von 0.1mM Ca2+ hat bereits keine erkennbare Wirkung mehr (Daten nicht gezeigt). Wird Ca2+ nach der Bildung der Membrannetzwerke vorsichtig zugegeben, so vergrößern die dünnen Membrantubuli ihren Durchmesser deutlich (Abb. 18B). Eine Fragmentierung, wie sie in vivo beobachtet wird, ist nicht zu erkennen.

3.2.5. ER-Bildung unter mitotischen Bedingungen

Das ER fragmentiert in der Mitose zu einem unterschiedlichem Ausmaß, je nachdem welches Gewebe oder welche Zellinien in Zellkultur untersucht werden (siehe Einleitung). Einerseits kann die Fragmentierung zur kompletten Deassemblierung des ER führen, andererseits kann das ER in der Mitose als Netzwerk intakt bleiben. Warum es diese gewebe- und zellspezifischen Unterschiede gibt, ist unbekannt. Im folgenden wurde daher die ER-Bildung in vitro unter mitotischen Bedingungen untersucht. Das Xenopus in vitro


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Abb. 18: Ca2+ hemmt die ER-Bildung. Die Zubabe von Ca2+ zu bereits gebildeten Membrannetzwerken führt zu einer Vergrößerung des Durchmessers der Membrantubuli, ähnlich wie die nachträgliche Zugabe von Proteinase K


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System erlaubt eine einfache Manipulation des Zellzyklus-Stadiums des Extraktes. Zwei verschiedene Arten mitotischer Extrakte und der hieraus hergestellten mitotischen Cytosole und Membranen wurden verwendet. Durch die Zugabe von Cyclin B zu einem Eiextrakt, der sich in der Interphase befindet, geht der Extrakt in einen mitotischen Zustand über. Bei der zweiten Methode wird genaugenommen ein Extrakt in einem meiotischen Zustand erhalten. Dieser meiotische Zustand zeigt viele Eigenschaften eines mitotischen Zustandes und wurde in zahlreichen Untersuchungen mit diesem gleichgesetzt (Pfaller et. al., 1991; Shamu und Murray, 1992). Vor der Befruchtung befindet sich das Ei in der Metaphase der Meiose II. Werden beim Aufschluß der Eier keine besonderen Vorkehrungen getroffen, so erhält man einen Eiextrakt, der vom meiotischen Zustand in den Interphasen-Zustand übergegangen ist. Der meiotische Zustand kann jedoch bei der Präparation des Eiextraktes erhalten werden, wenn der Aufschluß in einem Puffer mit Phosphataseinhibitoren und EGTA zum Chelatieren von Calciumionen erfolgt. Bei beiden Herstellungsmethoden kann der Eiextrakt in Membranen und Cytosol getrennt werden.

Zunächst wurde der mit Cyclin B hergestellte mitotische Extrakt in dem in vitro System zur ER-Bildung getestet. Dazu wurde Cyclin B zu einem Eiextrakt gegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Zeit ist ausreichend, um den Extrakt in einen mitotischen Zustand zu überführen. Der mitotische Zustand kann einfach durch den Anstieg in der Histon H1-Kinaseaktivität des Extraktes gemessen werden. Die Histon H1-Kinaseaktivität kann wiederum überwiegend auf die Aktivierung der CDC2/Cyclin B-Kinase zurückgeführt werden. Daraufhin wurden bereits gebildete Membrannetzwerke durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren zerstört (Daten nicht gezeigt) und die Reaktion wie üblich auf einem Objektträger durchgeführt. Die Abb. 19A zeigt, daß sich unter diesen


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Abb. 19: Die ER-Bildung ist in einem mit Cyclin B hergestellten mitotischen Extrakt verringert

(A) Ein mitotischer Extrakt wurde durch Inkubation von Interphasen-Extrakt mit Cyclin B hergestellt und anschließend wie in Abb. 13 in der ER-Bildungsreaktion getestet.


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Bedingungen Membrannetzwerke bilden. Während jedoch beim Interphasen-Extrakt meist 50-100% der Fläche des Objektträgers mit den Netzwerken bedeckt waren, waren dies in dem mitotischen Extrakt meist weniger als 5-10% der Fläche (Daten nicht gezeigt). Außerdem waren die unter diesen Bedingungen gebildeten Membrannetzwerke überwiegend grobmaschiger als die mit Interphasen-Eiextrakt gebildeten Netzwerke. Obwohl also Membrannetzwerke in dem mitotischen Extrakt gebildet werden, ist ihre Bildung deutlich verringert gegenüber einem Interphasen-Eiextrakt. Das Cytosol und die leichte Membranfraktion, die aus dem mitotischen Eiextrakt durch Zentrifugation hergestellt wurden, verhielten sich ähnlich (Abb. 19C, D). Im Gesamtbild einer ER-Bildungsreaktion mit mitotischen Membranen und Cytosol ist die geringe Bildung von Membrantubuli mit mitotischem Cytosol und Membranen gut zu erkennen (Abb. 19D, vergleiche zum Beispiel mit Abb. 13B, rechtes Bild).

Der mitotische Zustand des Extraktes wurde zum Zeitpunkt der Beobachtung der Membrannetzwerke durch die Bestimmung der Histon H1-Kinaseaktivität des Ansatzes kontrolliert (Abb.19E). Die Histon H1-Kinaseaktivität lag 30 bis 40-fach über der Aktivität des Interphasen-Extraktes, vergleichbar mit veröffentlichten Ergebnissen (Murray, 1991). Dies ist eine deutlich höhere Stimulation der Histon H1-Kinaseaktivität, als die 10-15fache Stimulation, die unter physiologischeren Bedingungen in der Mitose beobachtet wird (Shamu und Murray, 1992). In Kontrollexperimenten mit diesem mitotischen Extrakt wurde gezeigt, daß er im Gegensatz zu demselben Extrakt ohne Cyclin B keine Zellkerne zu bilden vermag (Abb. 21A, B).

Als nächstes wurden Cytosol und Membranen aus einem Extrakt verwendet, dessen meiotischer Zustand bei der Präparation aufrechterhalten wurde. Überraschenderweise wurden in diesem Fall ausgedehnte Membrannetzwerke wie in einem Interphasen-Zustand gebildet (Abb. 20A).Die Histon H1-Kinaseaktivität war 13 bis 20-fach so hoch wie in Membranen und Cytosol in der Interphase (Abb. 20F). Dieses meiotische Cytosol wurde auch zusammen mit Interphasen-Membranen verwendet. Es ist bekannt, daß der meiotische Zustand des Cytosols dabei dominant ist, und die Interphasen-Membranen durch Phosphorylierungsreaktionen in meiotische Membranen umgewandelt werden [Seite 81↓](Pfaller et al., 1991; Vigers und Lohka, 1992). Nach 30-minütiger Inkubation des meiotischen Cytosols mit Interphasen-Membranen wurden etwaige gebildete Membrannetzwerke durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren zerstört und anschließend wie üblich die ER-Bildungsreaktion auf dem Objektträger durchgeführt. Auch in diesem Fall formten sich ausgedehnte Membrannetzwerke, die nicht von den im Interphasen-Cytosol gebildeten zu

Abb. 20: Die Bildung der Membrannetzwerke mit meiotischem Cytosol und Membranen

unterscheiden waren (Abb. 20B). Das Gesamtbild der ER-Bildungsreaktion zeigt ebenfalls keinen Unterschied (Abb. 20C). Die Histon H1-Kinaseaktivität war wiederum hoch (Abb. 20F) und in Kontrollexperimenten wurden keine Zellkerne mit dem meiotischen Cytosol gebildet (Abb. 21C).

Beide mitotischen/meiotischen Extrakte sind also zur ER-Bildung in der Lage, unterscheiden sich jedoch sehr in dem Ausmaß der ER-Bildung (vergleiche auch Abb. 19D mit Abb. 20C). Dagegen bilden beide Extrakte keine Zellkerne (Abb. 21).


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Abb. 21: Sowohl der mitotische Extrakt als auch das meiotische Cytosol und Interphasen-Membranen bilden keine Zellkerne

(A) Interphasen-Extrakt bildet zusammen mit Spermien-Chromatin große Zellkerne. Die DNA (linke Spalte) und die Membranen (mittlere Spalte) wurden wie in Abb. 3 gefärbt. In der rechten Spalte ist ein Phasenkontrastbild gezeigt.


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3.2.6.  Die in vitro Bildung des ER ist unabhängig von Mikrotubuli und Actin-Filamenten

Es ist leicht vorstellbar, wie Cytoskelettstrukturen an der Bildung der Membrannetzwerke beteiligt sein können. Im Falle der Mikrotubuli könnten Mikrotubuli-abhängige Motoren an die ER-Membran binden und beim Bewegen entlang der Mikrotubuli die Membrantubuli mit sich ziehen. Entsprechendes ist für Actin-Filamente denkbar. Einige permanente Kontaktpunkte zwischen dem Membrannetzwerk des ER und dem Cytoskelett könnten das einmal gebildete Netzwerk in der Zelle stabilisieren. In Übereinstimmung mit diesem Modell der ER-Bildung wurde in Zellkulturzellen und in vitro gezeigt, daß das ER mit den Mikrotubuli in Kontakt steht, Membrantubuli sich entlang von Mikrotubuli bewegen können und die Bildung und Aufrechterhaltung der netzwerkartigen Struktur des ER Mikrotubuli benötigt (Dabora und Sheetz, 1988; Allen und Vale, 1994; Steffen et al., 1997; Lee et al., 1989). Im folgenden wurde untersucht, ob die ER-Bildung in dem von uns entwickelten in vitro System sensitiv gegenüber Reagenzien ist, die Cytoskelettstrukturen wie Mikrotubuli oder Actin-Filamente zerstören.

Bei der Herstellung des Extraktes wird bereits Cytochalasin B zum Extrakt gegeben, um die Bildung von Actin-Filamenten zu verhindern (siehe Material und Methoden). Zusätzlich wurde Latrunculin A, ein Reagenz, das ebenfalls die Bildung von Actinfilamenten hemmt, in verschiedenen Konzentrationen zu der ER-Bildungsreaktion gegeben. Selbst bei den höchsten eingesetzten Konzentrationen von Latrunculin A, die weit über den in der Literatur als ausreichend angegebenen Konzentrationen lagen (Ayscough et al., 1997; Müsch et al., 1997), wurden keine Veränderungen bei der ER-Bildung festgestellt (Abb. 22). Actin-Filamente spielen somit bei der ER-Bildung in diesem System keine Rolle.


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Abb. 22: Die ER-Bildung ist unabhängig von Actin-Filamenten
Abb. 23: : Mikrotubuli und Membrantubuli des ER stehen miteinander in Kontakt


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Membrantubuli über einen Knotenpunkt hinaus zusammen laufen, scheint es wahrscheinlich, daß sie in Kontakt miteinander stehen. Die meisten Membrantubuli hatten jedoch keine Mikrotubuli in ihrer Nähe und viele Mikrotubuli sind nicht in Kontakt mit den Membrantubuli.

Drei verschiedene Reagenzien, die die Bildung von Mikrotubuli verhindern, wurden auf ihre Wirkung bei der ER-Bildung getest. Weder Nocodazol, noch Colchicin oder Vinblastin hatten einen erkennbaren Einfluß auf die Netzwerkbildung, obwohl sie in bis zu fünfmal höheren Konzentrationen, als in der Literatur als ausreichend angegeben, eingesetzt wurden (Dabora und Sheetz, 1988; Lee et al., 1989; Allan und Vale, 1991). Dies war der Fall unabhängig davon, ob Eiextrakt (Abb. 24A), Membranen und Cytosol (Abb. 24B, C) oder auch mitotischer Extrakt oder meiotisches Cytosol mit Interphasen-Membranen (Abb. 19B, 20D, E) verwendet wurden. Die Netzwerkbildung war sowohl auf der Glasoberfläche des Objektträgers als auch in Lösung zu beobachten (Abb. 24B, C).

Es ist möglich, Tubulin aus dem Cytosol zu depletieren, indem nach Zugabe von Taxol das gesamte Tubulin in stabile Mikrotubuli assembliert wird, die durch Zentrifugation von dem restlichen Cytosol abgetrennt werden können. Eine andere Möglichkeit ist die Zugabe von Vinblastin zum Cytosol, das mit Tubulin große, kristalline Aggregate bildet, die ebenfalls vom restlichen Cytosol durch Zentrifugation abgetrennt werden können (Palacek et al., 1982). Durch einen quantitativen ”Western Blot” wurde gezeigt, daß mit der ersten Methode 90-95% (Abb. 25D) und mit der zweiten Methode mehr als 95% des Tubulins aus dem Cytosol entfernt wurden (Daten nicht gezeigt). Diese Tubulin-depletierten Cytosole waren in der ER-Bildung genauso aktiv wie nicht-depletiertes Cytosol (Abb. 25A, B). Auch die Zugabe von Vinblastin zu dem mit der ersten Methode depletierten Cytosol hatte keinen erkennbaren Einfluß auf die ER-Bildung (Abb. 25C). Es ist anzumerken, daß es eine mit der Menge des im Cytosol vorhandenen Tubulins vergleichbare Menge in der Membranfraktion gibt (Daten nicht gezeigt). Dieses Tubulin ist offensichtlich fest an die Membran gebunden, da es trotz mehrmaligen Waschens membranassoziiert bleibt (Daten


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Abb. 24: Reagenzien, die die Bildung von Mikrotubuli verhindern, hemmen die ER-Bildung nicht

(A) Colchicin (100μM) oder Nocodazol (0.2mg/ml) wurden zu der ER-Bildungsreaktion im Eiextrakt gegeben und die ER-Bildung wie in Abb. 13 analysiert.


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nicht gezeigt). Über die Funktion dieses membrangebundenen Tubulins ist nichts bekannt. Eine verbreitete Annahme ist, daß es sich lediglich um denaturiertes Tubulin handelt.

Zusammengefaßt wird die ER-Bildung durch Reagenzien, die die Bildung von Mikrotubuli verhindern, und durch das Entfernen von Tubulin aus dem Cytosol nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß Mikrotubuli in diesem System nicht für die Bildung der Membrannetzwerke des ER notwendig sind; die Wechselwirkung zwischen den Mikrotubuli und den Membrantubuli kann jedoch unter bestimmten Bedingungen beobachtet werden.

3.2.7. Für die Aufrechterhaltung der Struktur der Membrantubuli ist eine Protease-sensitive Komponente notwendig

Die bisherigen Experimente machen es wahrscheinlich, daß ein Schritt bei der Bildung der Membrannetzwerke des ER die Fusion der kleinen Membranvesikel ist, und daß diese Fusion nach einem ähnlichen Mechanismus wie die anderer zellulärer Fusionsreaktionen abläuft. Nachdem gezeigt wurde, daß weder Mikrotubuli noch Actin-Filamente an der Netzwerkbildung beteiligt sind, stellte sich die Frage, ob zusätzlich zur Fusion überhaupt ein weiterer Protein-vermittelter Prozeß an der Bildung der tubulären Membranstrukturen beteiligt ist. Hierfür spricht zwar, daß in Abwesenheit von Cytosol trotz der stattfindenden Membranfusion keine Netzwerke gebildet werden (Abb. 13C); da jedoch die durch Fusion in Abwesenheit von Cytosol entstandenen großen, kugelförmigen Membranvesikel bei nachträglicher Zugabe von Cytosol keine tubulären Strukturen mehr bilden, können diese beiden Schritte bei der ER-Bildung nicht getrennt untersucht werden. Es ist jedoch möglich zu testen, ob nach der Bildung der Membrannetzwerke Proteine zur Aufrechterhaltung der tubulären Membranstrukturen notwendig sind. Dazu wurden die Netzwerke wie üblich


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Abb. 25: Die Depletion von Tubulin aus dem Cytosol hemmt die ER-Bildung nicht

Tubulin wurde durch die Zugabe von kurzen Mikrotubuli und Taxol (A, Methode 1) oder mit Hilfe von Vinblastin (B, Methode 2) aus dem Cytosol depletiert und das depletierte Cytosol wie in Abb. 13 in der ER-Bildungsreaktion getestet.


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gebildet und anschließend mit Proteinase K, einer relativ unspezifischen Protease, inkubiert. Nach 5-15 Minuten Inkubation mit der Protease vergrößert sich der Durchmesser der Membrantubuli dramatisch (Abb. 18C). Es scheint demnach ein Protein zur Aufrechterhaltung der dünnen Membrantubuli notwendig zu sein, das durch Proteinase K inaktiviert wird, so daß die Membrantubuli spontan eine andere Form annehmen. Die Wirkung der Proteinase K ist ähnlich der von nachträglich zugegebenen Ca2+ (vergleiche Abb. 18C mit Abb. 18B).

3.2.8. Erste Fraktionierungen der für die ER-Bildung notwendigen cytosolischen Aktivitäten

Für die ER-Bildung in diesem System werden ein oder mehrere Faktoren aus dem Cytosol benötigt. Da das Cytosol nicht für die Fusion der Membranvesikel notwendig ist, handelt es sich bei diesen cytosolischen Faktoren wahrscheinlich nicht um Proteine einer allgemeinen Fusionsmaschinerie. Ebenso kann es sich bei der cytosolischen Aktivität auch nicht um Tubulin, Actin oder Tubulin- oder Actin-assoziierte Proteine handeln, da weder Mikrotubuli noch Actin-Filamente für die ER-Bildung notwendig sind. Somit gibt es keine offensichtlichen guten Kandidaten für die cytosolische Aktivität und damit auch nicht die Möglichkeit, einzelne Proteine zum Beispiel durch Antikörper aus dem Cytosol zu entfernen und die Wirkung auf die ER-Bildung zu beobachten, oder Kandidatenproteine anstelle des Cytosols mit den Membranen zu inkubieren.

Eine Möglichkeit zur Identifizierung beteiligter Faktoren ist stattdessen, das Cytosol zu fraktionieren und die an der ER-Bildung beteiligten Aktivitäten zu reinigen. Wie schon bei der Kernbildung erwähnt, ist es für die Reinigung dieser cytosolischen Aktivitäten ideal, einen quantifizierbaren Prozeß zu untersuchen, in dem die Aktivitäten noch in hoher Verdünnung bestimmt werden können, und Ausgangsmaterial in großen Mengen zur Verfügung zu haben.


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Das Cytosol kann bis zu vierfach verdünnt werden, bevor die Aktivität merklich abnimmt. Bei einer 10fachen Verdünnung bilden sich nur noch sehr wenige Membrantubuli (Daten nicht gezeigt). Eine exakte Quantifizierung der Aktivität ist nicht möglich, aber die Verdünnung, bis zu der die ER-Bildung noch nicht merklich abnimmt, gibt ein Maß für die Konzentration der Aktivität. Eine Reihe von Cytosolen aus verschiedenen Organismen und Geweben wurden auf ihre Aktivität bei der ER-Bildung getestet. Cytosole aus Xenopus laevis-Leber und Rinderpankreas waren ähnlich aktiv wie das Cytosol aus dem Eiextrakt, während Cytosole von S.cerevisiae und aus Weizenkeimen keine Aktivität besaßen (Daten nicht gezeigt). Xenopus-Leber oder Rinderpankreas stehen als Ausgangsmaterial zur Fraktionierung in großer Menge zur Verfügung.

Schließlich wurden zwei verschiedene Fraktionierungen des aus dem Eiextrakt hergestellten Cytosols getestet. Die durch eine Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Färben mit ”Coomassie-Blau” analysiert (Abb. 26A). Nach Aufkonzentrierung wurden die Fraktionen in der ER-Bildungsreaktion getestet. Die Aktivität für die ER-Bildung wurde hauptsächlich in zwei aufeinanderfolgenden Fraktionen wiedergefunden (Abb. 26B). Ein Vergleich mit Standardproteinen zeigt, daß in diesen Fraktionen Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 50kDa zu finden sind. Die cytosolischen Aktivitäten für die ER-Bildung konnten außerdem bei einer Salzkonzentration von 50 mM Kaliumacetat an eine DEAE-Anionenaustauschersäule gebunden werden und eluierten mit 150 mM Kaliumacetat (Daten nicht gezeigt). Der Durchlauf sowie Fraktionen, die mit höheren Salzkonzentrationen eluiert wurden, zeigten keine ER-Bildungsaktivität.

Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß es gute Voraussetzungen gibt, eine oder mehrere Aktivitäten aus dem Cytosol durch Fraktionierung zu reinigen.


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Abb. 26: Fraktionierung der cytosolischen Aktivität für die Bildung der Membrantubuli durch Gefiltration


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12.02.2004