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4.  Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Bildung der Zellkernhülle und der Membrannetzwerke des ER in einem zellfreien System untersucht.

Die ER-Bildung in vitro

Die in diesem in vitro System gebildeten Membrannetzwerke des ER haben eine erstaunliche Ähnlichkeit mit den polygonen Netzwerken des ER in der Peripherie eukaryontischer Zellen.Die Membrantubuli haben im EM-Bild einen Durchmesser von etwa 100nm, vergleichbar mit dem Durchmesser von Membrantubuli des ER in anderen in vitro Systemen (Dabora und Sheetz, 1988; Allan und Vale, 1994). Dies ist etwas größer als der Durchmesser der Membrantubuli des ER und die Dicke von Membranzisternen des ER in Zellen, die zwischen 30nm und 70nm liegen. Die Ursache für den Unterschied ist nicht klar. Es scheint jedoch angesichts der großen Ähnlichkeit der in vitro gebildeten Netzwerkstrukturen mit dem ER der Zelle wahrscheinlich, daß das in dieser Arbeit entwickelte in vitro System die ER-Bildung in Zellen reproduziert.

Die ER-Bildung weist Eigenschaften eines Protein-vermittelten, energieabhängigen Prozesses auf. Die Proteasebehandlung der Membranen sowie die Depletion von ATP verhindern die Bildung. Bei der ER-Bildung können zwei Schritte unterschieden werden: Die Fusion kleiner Membranvesikel und ein Cytosol-abhängiger Schritt, der für die Bildung der Membrantubuli notwendig ist. Die Hemmung der Netzwerkbildung durch NEM und GTPγS könnte durch die Inaktivierung von bekannten Komponenten einer allgemeinen Fusionsmaschinerie verursacht sein. Ohne Cytosol erfolgt eine effiziente Fusion der Membranvesikel, durch die sich jedoch keine Membrantubuli und Netzwerke bilden, sondern große, kugelförmige Vesikel. Wird zu einer solchen Reaktion nachträglich Cytosol gegeben, so bilden sich keine Netzwerke mehr. Dies bedeutet zum einen, daß die cytosolische Aktivität, die für die Bildung der Netzwerke verantwortlich ist, während der Fusion wirken muß. Zum anderen bestätigt es die Annahme, daß die [Seite 99↓]Membranvesikel, die die Netzwerke bilden können, in Abwesenheit von Cytosol zu großen Vesikeln fusioniert sind. Denn würden sie in Abwesenheit von Cytosol nicht fusioniert sein, gäbe es keinen Grund, warum sie bei nachträglicher Zugabe des Cytosols keine Netzwerke mehr bilden können.

Die Interaktion der in diesem in vitro System gebildeten Membrantubuli des ER mit Mikrotubuli konnte unter Bedingungen, die Mikrotubuli stabilisieren, beobachtet werden. Membrantubuli und Mikrotubuli können über mehrere Mikrometer, auch über Knotenpunkte hinweg, zusammen laufen. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit den zahlreichen Untersuchungen zur ER-Bildung in Zellkulturzellen und in vitro Systemen, in denen beobachtet wurde, wie sich Membrantubuli des ER entlang von Mikrotubuli bilden und bewegen. Überraschenderweise kann Bildung von Mikrotubuli in dem von uns entwickelten in vitro System verhindert werden, ohne daß die ER-Bildung beeinflußt wird. Dies wurde mit Hilfe von Reagenzien, die zur Depolymerisation der Mikrotubuli führen, und durch das Entfernen von Tubulin aus dem Cytosol gezeigt. Es muß also alternative, Mikrotubuli-unabhängige Mechanismen zur Bildung der Membrannetzwerke des ER geben. Die beobachtete Interaktion der Mikrotubuli mit den Membrantubuli des ER kann auf die Rolle der Mikrotubuli bei der Verteilung des ER in der Zelle zurückzuführen sein. Danach könnten zum Plusende der Mikrotubuli gerichtete Motorproteine, wie z.B. Kinesine, an spezifische Rezeptoren der ER-Membran binden und die Membrannetzwerke entlang der Mikrotubuli in die Zellperipherie bewegen. Interessanterweise hat die Depolymerisation der Mikrotubuli keinen Einfluß auf die Membrannetzwerke des peripheren ER in S.cerevisiae. Eine Ursache hierfür könnte sein, daß die Hefezelle mit einem Durchmesser von etwa 5μm wesentlich kleiner ist, als höhere eukaryontische Zellen mit Durchmessern bis zu 50μm, und daher andere Mechanismen zur Lokalisation des peripheren ER benutzt.

Actin-Filamente sind ebenfalls nicht für die ER-Bildung notwendig, da Reagenzien, die zur Depolymerisation der Actin-Filamente führen, die Netzwerkbildung nicht beeinflussen.


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Mögliche Mechanismen zur Bildung der Membrantubuli des ER

Zunächst sprechen einige Ergebnisse dagegen, daß bei der Bildung der Membrantubuli die miteinander fusionierten Membranvesikel einfach unabhängig von Proteinen eine energetisch günstige Struktur annehmen. Ohne Cytosol entstehen durch die Fusion der Membranvesikel nicht Membrantubuli, sondern große, kugelförmige Vesikel. Werden die gebildeten Membrannetzwerke mit Proteinase K behandelt, so vergrößern die dünnen Membrantubuli ihren Durchmesser deutlich. Schließlich sind die auf der Glasoberfläche eines Objektträgers gebildeten Membrannetzwerke in Puffer nur für kurze Zeit stabil.

Die Beteiligung von Intermediärfilamenten an der ER-Bildung wurde in dieser Arbeit nicht ausgeschlossen; in Zellkulturzellen wurde jedoch keine Interaktion zwischen Membranen des ER und dem Intermediärfilament-Protein Vimentin beobachtet (Lee et al., 1989). Es ist vorstellbar, daß Strukturproteine, die die Membrantubuli an der Außenseite umschließen, durch ihre eigene Krümmung der Membran ihre Form aufzwingen. Ein Beispiel für ein solches ”Membranskelett” ist das von den Proteinen Spectrin und Ankyrin gebildete zweidimensionale Netzwerk, das der Plasmamembran von Zellen unterliegt. Am besten ist das Spectrin/Ankyrin-Netzwerk in Erythrocyten untersucht. Spectrin bildet Tetramere mit einer Länge von 200nm, die miteinander über kurze Actin-Filamente vernetzt und über Ankyrin an die Plasmamembran gebunden sind. Ankyrin ist ein peripheres Membranprotein, das in Erythrocyten an das integrale Membranprotein ”Bande 3” bindet und in anderen Zellen unter anderem an die Na+/K+-ATPase der Plasmamembran. Das Spectrin/Ankyrin-Netzwerk gibt Erythrocyten mechanische Stabilität und ist an der Bildung der charakteristischen konkaven Form beteiligt. Menschen mit genetisch bedingten Veränderungen des Spectrins haben kugelförmige Erythrocyten, die sehr fragil sind. Ein dem Spectrin/Ankyrin-Netzwerk ähnliches Membranskelett könnte an der Bildung der Membranstrukturen des ER beteiligt sein. Vor kurzem wurden homologe Proteine von Spectrin und Ankyrin auf der Membran des Golgi-Apparates gefunden, die in großen Proteinkomplexen vorliegen (Beck et al., 1994; Devarajan et al., 1996; Beck et al., 1997). Unter Bedingungen, die zur Deassemblierung des Golgi-Apparates führen, z.B. während der Mitose oder nach [Seite 101↓]Behandlung von Zellen mit Brefeldin A, dissoziieren das Golgi-Spectrin und -Ankyrin von der Membran. Werden Golgi-Spectrin und -Ankyrin jedoch durch die Expression eines veränderten Golgi-Spectrins in der Zelle vom Golgi-Apparat dissoziiert, so beeinflußt dies die Struktur des Golgi-Apparates nicht (Devarajan et al., 1997). Stattdessen wird der Transport einiger Membranproteine vom ER zum Golgi-Apparat verhindert.

Bei der Bildung der Membrantubuli des ER könnten Filament-bildende Proteine eine Rolle spielen, die das Innere der Membrantubuli oder der abgeflachten Membranzisternen des ER oder Golgi-Apparates durchspannen und gegenüberliegende Seiten der Membran verbinden. Die Länge der Proteinfilamente würde den Durchmesser der Membrantubuli bzw. den Abstand der Membranen abgeflachter Membranzisternen bestimmen, und könnte gut den gleichmäßigen Durchmesser dieser Strukturen erklären. Für die Existenz von Filament-Strukturen im Inneren membranumschlossener Organellen gibt es keine experimentellen Hinweise. Die Sensitivität der Membrantubuli gegenüber der von der cytosolischen Seite einwirkenden Proteinase K spricht eher dafür, daß vom Cytosol zugängliche Proteine auf der Außenseite der Membranen für die Aufrechterhaltung der Struktur der Membrantubuli verantwortlich sind.

Darüberhinaus ist die Form eines Membranvesikels abhängig von einer Reihe physikalischer Parameter, die unter Berücksichtigung physiologischer Bedingungen die Bildung tubulärer Membranstrukturen favorisieren können (Mui et al., 1995; Chou et al., 1997; Sciaky et al., 1997). Zunächst bestimmt das Verhältnis vom Volumen zur Oberfläche die Form eines Membranvesikels. Durch Ionenkanäle können Ionen aus einem Vesikel hinaus oder in ein Vesikel hinein transportiert werden. Dies kann die Osmolarität im Inneren des Membranvesikels verändern und zu einer Veränderung des Volumens und somit zu einer Änderung der Form des Vesikels führen. Ein kugelförmiges Membranvesikel könnte beispielsweise durch die Verringerung seines Volumens eine tubuläre Form annehmen.


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Jedes Verhältnis von Volumen zu Oberfläche, das kleiner als das einer Kugel ist, kann durch eine unendlich große Zahl von Formen des Membranvesikels, unter anderem auch tubuläre Strukturen, realisiert werden. Welche Form ein Membranvesikel tatsächlich annimmt, ob zum Beispiel eine eher kugelförmige oder tubuläre, könnte dann von der bevorzugten Oberflächenkrümmung der Lipidmembran abhängen, da die unterschiedlichen Formen mit gleichem Verhältnis von Volumen zu Oberfläche eine sehr unterschiedliche Krümmung ihrer Oberfläche aufweisen können. Große, kugelförmige Membranvesikel, die sich in Abwesenheit von Cytosol bilden, haben eine geringere Krümmung, als die dünnen Membrantubuli des ER. Die bevorzugte Krümmung eines Membranvesikels kann von vielen Parametern abhängen. Eine Erhöhung der Zahl der Lipidmoleküle in der äußeren Membranschicht führt dazu, daß ein Membranvesikel eine Form mit stärkerer Krümmung einnimmt (Mui et al., 1995). Eine Erniedrigung bewirkt das Gegenteil und kann z.B. zur Einstülpung der Membranvesikel führen. In der Zelle könnten Flippasen, die den Wechsel eines Lipidmoleküls von einer Seite der Lipiddoppelschicht zur anderen katalysieren, oder Lipidtransfer-Proteine, die Lipide binden und sie in die äußere Schicht einer Lipidmembran einfügen oder aus dieser entfernen, diese Veränderungen bewirken. Über die Beteiligung von Flippasen wurde bei dem Wechsel zwischen zwei Formen des Erythrocyten, vom Echinocyten zum Discocyten, spekuliert (Artmann et al., 1997).

Außerdem kann die Form der Lipidmoleküle oder der integralen Membranproteine in der Lipidmembran einen Einfluß auf die bevorzugte Krümmung haben (Schekman und Orci, 1996). Während Lipide wie Dioleat-Phosphatidylcholin eine zylindrische Form haben, da ihre polare Kopfgruppe einen annähernd gleichen lateralen Durchmesser wie ihre Acylketten hat, ist Cholesterin mehr keilförmig, da dessen Hydroxyl-Kopfgruppe einen kleineren Durchmesser als der hydrophobe Teil hat. Eine Erhöhung der Cholesterinmenge in der äußeren Membranschicht bewirkt somit eine bevorzugte geringere Krümmung des Membranvesikels. Die Form eines Lipidmoleküls kann durch das Abspalten einer Fettsäure durch eine Phospholipase verändert werden. Interessanterweise stimuliert das an dem Vesikeltransport vom ER zum Golgi-Apparat und innerhalb des Golgi-Apparates beteiligte Protein ”ADP-ribosylation factor”, ARF, die Phospholipase D und bewirkt [Seite 103↓]dadurch die Bildung der Transportvesikel (Brown et al., 1993; Ktistakis et al., 1996). Ein denkbarer Mechanismus ist, daß das Abspalten von Fettsäuren die Krümmung der Membran beim Abschnüren des Transportvesikels bewirkt oder erleichtert.

Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Kopfgruppen der Lipide können auch einen Einfluß auf die bevorzugte Krümmung haben, da in einer gekrümmten Membran der Abstand zwischen den Kopfgruppen der Lipide der äußeren Lipidschicht ein anderer ist, als der Lipide der inneren Lipidschicht. Sind die elektrostatischen Wechselwirkungen auf den Seiten der Lipidmembran unterschiedlich, z.B. dadurch, daß auf der einen Seite positiv geladene Proteine binden und auf der anderen einfach geladene Kationen, so kann dies zur Änderung der Krümmung des Membranvesikels führen (Chou et al., 1997). Ähnlich wirkt die Phosphorylierung der Inositol-Gruppe von Phoshphatidyl-Inositol durch spezifische Proteinkinasen (PI-Kinasen). Die Phosphorylierung der Lipide auf einer Seite der Lipidmembran führt zu einer größeren Abstoßung zwischen den Kopfgruppen dieser Seite. PI-Kinasen spielen unter anderem eine Rolle beim Vesikeltransport vom Trans-Golgi-Netzwerk und bei der Endocytose. Die Phosphorylierung von Phosphatidyl-Inositol könnte dabei die Krümmung der Lipidmembran beim Abschüren von Transportvesikeln erleichtern (de Camilli et al., 1996).

In vielen eukaryontischen Zellen wirken wahrscheinlich Mikrotubuli-abhängige und

-unabhängige Mechanismen zusammen, um die Bildung und Aufrechterhaltung des ER zu bewerkstelligen. Welche der oben aufgeführten Mikrotubli-unabhängigen Mechanismen tatsächlich für die ER-Bildung in diesem System und damit in eukaryontischen Zellen eine Rolle spielen, wird am besten durch die Identifizierung der beteiligten Faktoren geklärt werden. Einen ersten Schritt in diese Richtung stellt das in dieser Arbeit etablierte in vitro System dar, da es im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen in vitro Systemen der ER-Bildung keine Mikrotubuli und damit auch keine Mikrotubuli-abhängigen Faktoren benötigt. Dies sollte die Identifizierung der Mikrotubuli-unabhängigen Faktoren durch Fraktionierung des Cytosols erleichtern. Die ersten Ergebnisse von Fraktionierungen des Cytosols unterstützen diese Annahme.


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Die Rolle von Ca2+ bei der ER-Bildung

Die ER-Bildung wird in diesem System durch Ca2+ in einer Konzentration von 1mM verhindert. Die Zugabe von Ca2+ zu bereits gebildeten Membrannetzwerken führt, ähnlich wie die Behandlung mit Proteinase K, zu einer Vergrößerung des Durchmessers der Membrantubuli. Ähnlich bewirkt die Behandlung von Zellkulturzellen mit Calcium-Ionophoren in Gegenwart von 1mM Ca2+ im extrazellulären Medium, daß das ER in kleine Vesikel fragmentiert (Koch et al., 1988; Subramanian und Meyer, 1997). Die Fragmentierung in Zellen ist reversibel und möglicherweise spezifisch für das ER, da die Kernhülle bei der Behandlung intakt bleibt. Leider wurden andere Membranstrukturen, wie z.B. der Golgi-Apparat in diesen Arbeiten nicht analysiert. Die Ursache für die Wirkung von Ca2+ auf das ER in vivo und die ER-Bildung in vitro ist nicht bekannt. Überraschenderweise benötigt die Neubildung des durch die Behandlung mit Calcium-Ionophoren deassemblierten ER Ca2+ im extrazellulären Medium und kann durch die Behandlung der Zellen mit Calciumkanal-Inhibitoren verhindert werden (Koch et al., 1988). Eine mögliche Erklärung hierfür ist, daß Ca2+ in niedrigen Konzentrationen im Cytosol für die Bildung des ER notwendig ist und in hohen Konzentrationen zur Deassemblierung führt. Interessanterweise ist über die Beteiligung des Calcium-bindenden Proteins Calmodulin an der Bildung tubulärer Membranstrukturen in der Zelle spekuliert worden (de Figueiredo und Brown, 1995). Calmodulin-Inhibitoren verhinderten die Bildung der Membrantubuli des Golgi-Apparates, die bei der Behandlung von Zellkulturzellen mit Brefeldin A auftreten. Wird Ca2+, vielleicht zusammen mit Calmodulin, von der Zelle benutzt, um das ER in regulierter Weise zu bilden und zu deassemblieren, zum Beispiel bei der Fragmentierung des ER in der Mitose oder wenn die Zelle bei der Zellwanderung ihre Form ändert? Calcium wird von der Zelle als ”second messenger” für eine Vielzahl von Signaltransduktions-Prozessen verwendet. Ca2+/Calmodulin kann z.B. an Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinasen binden und diese dadurch aktivieren. Interessanterweise wurde in einem in vitro System zur ER-Bildung beschrieben, daß Phosphatase-Inhibitoren die ER-Bildung stimulieren (Allen, 1995). Also könnten Phosphorylierungen durch Proteinkinasen die Bildung des ER stimulieren. In dem in dieser Arbeit etablierten in vitro System wurden drei verschiedene Calmodulin-[Seite 105↓]Inhibitoren auf ihre Wirkung bei der ER-Bildung getestet. Vorläufige Ergebnisse zeigen, daß zwei der drei getesten Inhibitoren bei relativ hohen Konzentrationen die ER-Bildung verhindern (Daten nicht gezeigt). Eine Rolle von Ca2+/Calmodulin bei der ER-Bildung in vitro ist allerdings fraglich, da der Calcium-Chelator EGTA im meiotischen Cytosol die ER-Bildung nicht hemmt.

Die ER-Bildung unter mitotischen Bedingungen

Wie ist das unterschliedliche Ausmaß der Deassemblierung des ER in verschiedenen Zelltypen während der Mitose zu erklären? Eine Antwort wird erst durch die Identifizierung der beteiligten Faktoren möglich sein. In dem hier vorgestellten in vitro System wurde mit zwei unterschiedlich hergestellten mitotischen/meiotischen Cytosolen eine unterschiedlich effiziente Bildung des ER beobachtet. Während mit dem ”meiotischen” Cytosol die Membrannetzwerke genauso effizient wie mit dem Interphasen-Cytosol gebildet wurden, wurden mit dem durch Cyclin B hergestellten mitotischen Extrakt deutlich weniger Netzwerke erhalten. Die Netzwerke waren außerdem ”grobmaschiger”, d.h. sie besßen weniger Knotenpunkte. Eine genaue Quantifizierung dieses Unterschiedes ist jedoch schwer möglich. Beide Cytosole besaßen eine hohe Histon H1-Kinase Aktivität und bildeten keine Zellkerne in Gegenwart von Spermien-Chromatin. Sie erfüllen damit eindeutige Kriterien für einen mitotischen Zustand. Es könnte sein, daß das unterschiedliche Ausmaß der ER-Bildung in vitro mit dem unterschiedlichen Ausmaß der Deassemblierung des ER in verschieden Zelltypen in der Mitose in Zusammenhang steht.

Viele Fusionsreaktionen zwischen Membranen kommen in der Mitose zum Erliegen. Es ist also unerwartet, daß sich unter mitotischen Bedingungen in vitro überhaupt Membrannetzwerke bilden können, da dies die Fusion von Membranvesikeln voraussetzt. In einer Arbeit, die die typische Fusionsreaktion zwischen frühen Endosomen quantitativ und in Abhängigkeit von Interphasen-Cytosol und mitotischem Cytosol bestimmt hat, war jedoch die Fusion in Gegenwart von mitotischem Cytosol nur um etwa 50% reduziert (Tuomikosky et al., 1989). Eine solche Reduktion der ER-Bildung wäre in dem hier [Seite 106↓]verwendeten in vitro System nicht sicher zu detektieren. Die Fusionseffizienz der frühen Endosomen nahm mit steigender Histon H1-Kinaseaktivität des Cytosols durch die Zugabe von gereinigter CDC2/Cyclin B-Kinase ab. Da die Histon H1-Kinaseaktivität des mit Cyclin B hergestellten mitotischen Cytosols etwa doppelt so hoch wie die des ”meiotischen” Cytosols war, könnte dies eine Erklärung für das unterschiedliche Ausmaß der ER-Bildung bieten. Es könnte natürlich auch sein, daß in dem mitotischen Zustand andere an der ER-Bildung beteiligte Proteine aktiviert oder inaktiviert sind als in dem meiotischen Zustand, und dadurch die beobachteten Unterschiede entstehen.

Vor kurzem wurde gezeigt, daß eine MAP(Mitogen aktivierte Protein)-Kinase-Kinase, MEK1, für die Deassemblierung des Golgi-Apparates in der Mitose in einem permeabilisierten Zellsystem notwendig ist (Acharya et al., 1998). Als potentielles Substrat dieser Kinase wurde eine MAP-Kinase auf der Membran des Golgi-Apparates identifiziert. Da der Golgi-Apparat, wie auch das ER, nicht in allen Zelltypen in der Mitose deassembliert, wurde spekuliert, daß die Zelltypen, in denen der Golgi-Apparat nicht deassembliert, auch nicht die mit dem Golgi-Apparat assoziierte MAP-Kinase besitzen (Stanley et al., 1997; Acharya et al., 1998). Ob MAP-Kinasen an der Deassemblierung des ER in der Mitose beteiligt sind, ist nicht bekannt.

Die Bildung der Zellkernhülle

Der X.laevis Eiextrakt kann in eine cytosolische und zwei Membranfraktionen getrennt werden. Die leichte Membranfraktion enthält die Membranen des ER und bildet zusammen mit Cytosol die polygonen Membrannetzwerke. Membranvesikel aus dieser Fraktion binden an das Chromatin und bilden zusammen mit dem Cytosol kleine Zellkerne. Für die Bildung großer Zellkerne, wie sie in dem unfraktionierten Extrakt entstehen, ist zusätzlich die schwere Membranfraktion notwendig, die keine ER-Membranen enthält, selber nicht ans Chromatin binden kann und zusammen mit dem Cytosol keine Zellkerne bildet. Es ist möglich, daß Membranvesikel der schweren Membranfraktion mit der äußeren Kernhülle fusionieren, und so zum Wachstum der Kernhülle beitragen. Dies würde bedeuten, daß Membranen mit der Kernhülle [Seite 107↓]fusionieren, die nicht ER-Membranen sind. Andererseits könnte der Effekt der schweren Membranfraktion auch indirekt durch die in dieser Fraktion stark angereicherten Mitochondrien verursacht sein, die zum Beispiel aktiv Phosphat- und Calcium-Ionen aufnehmen können, und dadurch die Konzentrationen dieser Ionen im Cytosol verändern können. Für das Wachstum eines kleinen Zellkerns ist es wahrscheinlich notwendig, daß Membranen von der äußeren Kernmembran über die Verbindungen an den Kernporen zur inneren Kernmembran gelangen, damit auch diese mitwachsen kann. Die in Zellen beobachtete Größenveränderung des Zellkerns könnte nach einem ähnlichem Mechanismus wie die Größenzunahme der in vitro gebildeten Zellkerne ablaufen (Rosania und Swanson, 1995).

In dieser Arbeit wurde die Bildung der Zellkernhülle mit einer hochauflösenden CCD-Kamera verfolgt und die Qualität der erhalten Bilder durch anschließende Bildverarbeitung weiter verbessert. Mit dieser Technik können drei Schritte nach der Dekondensation des Chromatins unterschieden werden: Die Bindung von Membranvesikeln an das Chromatin, die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel und das Abflachen der fusionierenden Membranvesikel auf der Oberfläche des Chromatins. Die Bindung der Membranvesikel benötig kein Cytosol und keine Energie in Form von ATP. Die Fusion der Membranvesikel läuft wahrscheinlich nach einem ähnlichen Mechanismus ab, wie andere Fusionsreaktionen in der Zelle, da sie durch NEM und GTPγS gehemmt werden kann. Offensichtlich sind alle für die Fusion notwendigen Faktoren in ausreichender Menge auf den Membranvesikeln vorhanden, da die Fusion auch in Abwesenheit von Cytosol stattfindet. Interessanterweise reicht die Fusion allein nicht für die Bildung einer Kernhülle aus. Durch die Fusion ohne Cytosol bilden sich stattdessen große, Chromatin-gebundene Membranvesikel, die eine kugelförmige Gestalt behalten, statt flach auf der Oberfläche des Chromatins zu liegen. Für das Abflachen der Membranvesikel auf der Oberfläche des Chromatins sind eine oder mehrere cytosolische Aktivitäten notwendig. In der vereinfachten Kernbildungsreaktion sind nach zehn Minuten die Chromatin-gebundenen Membranvesikel bereits zum Teil miteinander fusioniert. In Gegenwart von Cytosol liegen die resultierenden größeren Membranvesikel flach auf der Oberfläche des Chromatins und sind manchmal durch [Seite 108↓]dünne Membrantubuli verbunden. Im Verlauf der Reaktion wird die von den abgeflachten Membranvesikeln bedeckte Oberfläche des Chromatins wahrscheinlich durch die weitere Fusion mit Membranvesikeln größer, bis sich schließlich eine geschlossene Kernhülle bildet. Zu keinem Zeitpunkt sind am Chromatin große, kugelförmige Membranvesikel, vergleichbar mit den in Abwesenheit von Cytosol gebildeten, zu sehen. Wird Cytosol nachträglich zu einer Kernbildungsreaktion gegeben, bei der bereits große, fusionierte Membranvesikel am Chromatin gebunden sind, so flachen diese Membranvesikel nicht mehr ab und es bildet sich keine Kernhülle. Das Cytosol enthält demnach Faktoren, die während der Fusion der Membranvesikel das Abflachen auf der Chromatinoberfläche bewirken.

Die Parallelen zwischen der Bildung der Kernhülle und der Bildung der Membrannetzwerke des ER sind auffällig. Sowohl die Kernhülle als auch die Membrantubuli des ER werden durch die Fusion kleiner Membranvesikel der gleichen leichten Membranfraktion gebildet. Die Fusion ist unabhängig von Cytosol, jedoch allein nicht für die Bildung der abgeflachten Kernhülle und der Membrantubuli des ER ausreichend. Stattdessen werden in beiden Fällen große, kugelförmige Membranvesikel gebildet. Nur in Gegenwart von Cytosol werden die jeweiligen Membranstrukturen gebildet. Die nachträgliche Zugabe von Cytosol zu großen Membranvesikeln, die durch die Fusion kleiner Membranvesikel in Abwesenheit von Cytosol entstanden sind, ist hierfür nicht ausreichend. Bei der Bildung der Kernhülle im vereinfachten in vitro System sind in frühen Stadien nicht nur kleine Membranflächen, sondern auch Membrantubuli auf der Chromatinoberfläche zu sehen. Membrantubuli wurden ebenfalls bei der Reassemblierung der Kerhülle auf der Oberfläche der getrennten Chromosomen am Ende der Mitose in Zellkulturzellen beobachtet (Ellenberg et al., 1997). Angesichts der Ähnlichkeiten beider Prozesse ist es denkbar, daß der Bildung dieser Membranstrukturen ähnliche Mechanismen zugrunde liegen.

Daher könnten die Mechanismen, über die bereits bei der Bildung der Membrantubuli des ER spekuliert wurde, auch für das Abflachen der Kernhülle verantwortlich sein. Wie bei den Membrantubuli des ER könnten Filamentstrukturen im Innern der Kernhülle, die die [Seite 109↓]innere und äußere Kernmembran miteinander verbinden, durch ihre Länge den Abstand zwischen innerer und äußerer Kernmembran vorgeben. Auch ein äußeres Membranskelett wie das Spectrin/Ankyrin-Netzwerk ist denkbar. Eine Verringerung des inneren Volumens hätte zur Folge, daß ein Membranvesikel, das vorher rund war, eine flachere Form annehmen kann, da hierdurch bei gleicher Oberfläche das Volumen geringer wird.

Darüberhinaus gibt es einige speziell für das Abflachen der Kernhülle denkbare Mechanismen. Die Kernporen könnten die innere und äußere Kernmembran zusammenhalten. Dagegen spricht, daß in vitro Zellkerne mit normaler Kernhülle, aber völlig ohne Kernporen, gebildet werden können. Dies wird durch die Zugabe des Calcium-Chelators BAPTA (1,2-bis-(o-Aminophenoxy)-ethan-N,N,N’,N’-tetra-ethansäure) zu einer Kernbildungsreaktion im Xenopus in vitro System erreicht, wobei der Wirkungsmechanismus von BAPTA nicht verstanden ist (Macaulay und Forbes, 1996).Außerdem ist vorstellbar, daß Chromatin-bindende Proteine eines großen Membranvesikels so weit verteilt auf der Oberfäche des Chromatins binden, daß die dem Chromatin abgewandte Seite des Membranvesikels nur noch flach zur anderen Seite verlaufen kann. Dies sollte jedoch auch in Abwesenheit von Cytosol geschehen, da die Bindung der Membranvesikel an das Chromatin Cytosol-unabhängig ist. Denkbar wäre auch, daß Chromatin-bindende Motorproteine ein Membranvesikel, das an einer Stelle des Chromatins gebunden ist, entlang der Oberfläche des Chromatins ziehen, und so das Abflachen erreichen.

Um den Mechanismus des Abflachens der Kernmembran zu verstehen, ist es notwendig, die beteiligten cytosolischen Faktoren zu identifizieren. Hierfür stellt die vereinfachte Kernbildungsreaktion einen ersten Schritt dar. Die in diesem System gebildeten Zellkerne bleiben klein, bilden aber eine geschlossene Kernhülle mit innerer und äußerer Kernmembran. Im vereinfachten Kernbildungssystem erfolgt die Dekondensation des Chromatins durch Polyglutamat, und Kernimport ist nicht erforderlich. Da außerdem die Fusion der Chromatin-gebundenen Membranvesikel unabhängig vom Cytosol ist, ist es wahrscheinlich, daß das Cytosol nur die Faktoren, die für das Abflachen der fusionierenden Membranvesikel notwendig sind, bereitstellen muß. Das Ergebnis der [Seite 110↓]Fraktionierung mittels Anionenaustauscher-Chromatographie zeigt, daß es möglich ist, die Aktivtät des Cytosols, die das Abflachen der Membranvesikel bei der Bildung der Kernhülle bewirkt, zu fraktionieren.

Cytosolische Faktoren, die in einem der beiden in dieser Arbeit entwickelten in vitro Systeme identifiziert werden, sollten Hinweise auf den Mechanismus der Bildung der jeweiligen Membranstruktur geben und können leicht auf ihre Funktion in dem anderen System getestet werden. Sie sollten Aufschluß darüber geben, ob ähnliche Mechanismen bei der Bildung der Kernhülle und der Membrantubuli des ER, sowie anderer ähnlicher Membranstrukturen der Zelle, wie z.B. der abgeflachten Membranzisternen des ER und des Golgi-Apparates oder der Membrantubuli des Cis- und Trans-Golgi-Netzwerkes eine Rolle spielen.


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12.02.2004