Untersuchungen zur Bildung des Endoplasmatischen Reticulum und der Kernhülle

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
im Promotionsfach Biologie
Spezialisierung Zellbiologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Institut für Biologie der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biochemiker Lars Dreier

geboren am 16. Januar 1968 in Bremervörde

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Fakultät: Prof. Dr. J. Rabe

Gutachter:
1. Prof. Dr. Tom A. Rapoport, Boston
2. Prof. Dr. Enno Hartmann, Göttingen
3. Prof. Dr. Harald Saumweber, Berlin

Tag der mündlichen Prüfung: 6. Juli 1998

Abstract

Membrane-bound organelles form amazingly elaborate structures in eucaryotic cells. For instance, the endoplasmic reticulum (ER) forms a network of membrane tubules and flattened cisternae.

We have investigated the mechanisms involved in this process by establishing an in vitro system that reconstitutes the formation of membrane tubules and membrane networks of the ER. It uses an extract of the eggs of X.laevis. In this system the membrane tubules are formed by the fusion of small membrane vesicles. Cytosol is not required for the fusion but for the formation of the membrane tubules and networks. In the absence of cytosol fusion of the small membrane vesicles simply results in the formation of large spherical membrane vesicles.

It is generally believed that microtubules and microtubule motor proteins are essential for the formation of the membrane networks of the ER. Interestingly, in our in vitro system microtubules are not involved in this process since the addition of inhibitors of microtubule formation or depletion of tubulin form the cytosol has no effect. This suggests that microtubule-independent mechanisms for the formation of the membrane network of the ER exist. The identification of cytosolic factors needed for this process will help to reveal these mechanisms.

The nuclear envelope has some similarity to the flattened cisternae of the ER and the Golgi-apparatus. A cell-free system for the formation of nuclei was established that uses the same egg extract as for the formation of the ER. To specifically study the steps in the formation of the nuclear envelope, we developed a simplyfied system that allowed the observation of a novel step in this process: The flattening of the chromatin-bound membrane vesicles on the chromatin surface. A cytosolic activity is required for this process. Without cytosol nuclear membrane vesicles can still bind to the chromatin and fuse with each other, but this fusion results only in the formation of bigger, spherical membrane vesicles that do not flatten on the chromatin surface.

The identification of cytosolic factors involved in the flattening of the nuclear envelope and the formation of the membrane tubules of the ER should help to understand the underlying mechanisms and thereby reveal if similar mechanisms are responsible for the formation of similar membrane structures in the eukaryotic cell.

Zusammenfassung

Das Endoplasmatische Reticulum (ER) bildet ein ausgedehntes Netzwerk aus Membran-tubuli und abgeflachten Zisternen in der eukaryontischen Zelle. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines Extraktes der Eier von Xenopus laevisein in vitro System zur Bildung der polygonalen Membrannetzwerke des ER entwickelt. In diesem System wurde zum ersten Mal eine Mikrotubuli-unabhängige Bildung der Membrannetzwerke des ER demonstriert und damit die Existenz Mikrotubuli-unabhängiger Mechanismen für ihre Bil-dung. Die Membrantubuli entstehen durch die Fusion kleiner Membranvesikel miteinander. Diese Fusion allein, die unabhängig von Cytosol ist, ist jedoch nicht ausreichend, da durch die Fusion in Abwesenheit von Cytosol lediglich große, kugelförmige Membranvesikel entstehen. Vielmehr ist eine unbekannte cytosolische Aktivität notwendig, damit die Fusion zur Bildung von Membrantubuli und Netzwerken führt. Mit dem in vitro System wurde die Voraussetzung für die Identifizierung dieser Mikrotubuli-unabhängigen, cytosolischen Aktivität geschaffen.

Das Verhalten des ER in vitro ähnelt dem des ER in Zellen. Werden Zellen mit Calcium-Ionophoren behandelt, so deassembliert das ER, während in vitro die Bildung des ER durch hohe Konzentrationen von Ca2+ verhindert wird. In der Mitose deassembliert das ER in Abhängigkeit vom Zelltyp zu einem unterschiedlichen Ausmaß. Analog wird das ER in vitro zu einem unterschiedlichem Ausmaß gebildet, abhängig von der Art, in der die zuge-gebenen mitotischen Cytosole hergestellt wurden.

Die Kernhülle hat Ähnlichkeit mit den abgeflachten Zisternen des ER und des Golgi-Apparates. In dieser Arbeit wurde die Bildung des Zellkerns in einem zellfreien System etabliert, das den für die ER-Bildung eingesetzten Extrakt verwendet. Einzelne Phasen bei der Bildung der Kernhülle wurden in einem vereinfachten Kernbildungssystem untersucht. Dabei wurde ein neuer Schritt in diesem Prozeß entdeckt: Das Abflachen von Chromatin-gebundenen Membranvesikeln auf der Oberfläche des Chromatins. Die hierfür verantwort-liche Aktivität befindet sich in der cytosolischen Fraktion. Ohne Cytosol binden die Kernmembranvesikel an das Chromatin und fusionieren miteinander, die resultierenden großen Membranvesikel bleiben jedoch kugelförmig, flachen nicht ab und können keine Kernhülle bilden.

Die Identifizierung der cytosolischen Faktoren, die an dem Abflachen der Membranen bei der Bildung der Kernhülle und der Bildung der Membrantubuli des ER beteiligt sind, sollte Hinweise auf die zugrunde liegenden Mechanismen geben und zeigen, ob verwandte Mechanismen an der Bildung ähnlicher Membranstrukturen in der eukaryontischen Zelle beteiligt sind.

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12.02.2004