El Fari, Mustafa: Untersuchungen zur Taxonomie und Phylogenie der Familie Arthrodermataceae (Dermatophyten) und Entwicklung einer spezifischen Sonde für Trichophyton rubrum.

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Kapitel 2. Ziel der Arbeit

In den letzten Jahren haben Verfahren, die sich molekularbiologischer Techniken bedienen, die Möglichkeiten zur Beantwortung diagnostischer, epidemiologischer und phylogenetischer Fragestellungen unter anderem in der medizinischen Mikrobiologie erweitert.

Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die phylogenetischen Verwandtschaft innerhalb der Dermatophyten mit Hilfe molekularbiologischer Methoden zu klären.

Die taxonomische Einordnung von Spezies und Varianten in die Gattungen Trichophyton, Microsporum oder Epidermophyton erfolgte bisher auf der Basis morphologischer und zum Teil biochemischer Charakteristika. Bei den humanpathogenen Pilzspezies dieser Gattungen wurde bisher kein sexueller Modus der Vererbung gefunden. Sie zählen somit zu den Formgattungen der Fungi imperfecti, d.h. ihre Einordnung hat keine phylogenetischen Grundlagen. Bisher entdeckte teleomorphe Formen von einigen zoophilen und geophilen Arten gehören zu der Ascomycetengattung Arthroderma.

Die zur Zeit am meisten genutzte Methode für phylogenetische Untersuchungen ist der Vergleich von Sequenzdaten der ribosomalen DNA oder RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde der “Internal Transcribed Spacer“ (ITS) im ribosomalen Operon analysiert. Die Gesamt-ITS-Region ist ca. 800 bp groß und liegt zwischen den Genen für die “small subunit“ (ssu) und “large subunit“ (lsu) der rRNA und schließt das Gen für die 5.8S rRNA ein. Für die Amplifizierung dieser Region wurden die von White et al. (1990) entwickelten und von Vilgalys (persönliche Mitteilung) modifizierten Universalprimer verwendet. Die Sequenzierung dieser Region sollte über Einzelstrang-DNA-Sequenzierung mit den gleichen Universalprimern erfolgen.

In einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob verschiedene PCR-Verfahren für die Identifizierung von Dermatophytenisolaten eingesetzt werden können.


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Die Identifizierung von Dermatophyten in der klinischen Diagnostik beschränkt sich zur Zeit auf die makroskopische und mikroskopische Charakterisierung morphologischer Merkmale nach Anzucht. Bei Ausbleiben derartiger Merkmale ist die Zuordnung der Erreger unsicher bzw. nicht möglich. Die Ausprägung der morphologischen Attribute ist zudem langwierig, was zu regelmäßigen Verzögerungen in der Therapieplanung führt. Weiterhin können z.B. 30% der mikroskopisch positiven Trichophyton rubrum-Isolate bei den Onychomykosen kulturell nicht bestätigt werden. Dies Problem in der mykologischen Labordiagnostik ist sowohl klinisch als auch epidemiologisch (Erregerwandel) und wirtschaftlich (Einsatz von Breitbandantimykotika mit differenziertem Wirkungsspektrum bei unsicherer Diagnostik) relevant.

Für eine Identifizierung der Dermatophytenarten mit der PCR sollten einmal die Sequenzen der ITS-Regionen herangezogen werden. Für die schnelle Diagnostik von Trichophyton rubrum direkt aus dem klinischen Material sollte versucht werden, eine spezifische Gensonde basierend auf den ITS-Sequenzdaten zu entwickeln. Dieser Eereger gehört zu den häufigsten bei Hautmykosen in Europa. Der Nachweis des ätiologischen Agens sollte dann über die Amplifizierung der ITS-Region und die anschließende Hybridisierung mit dieser Sonde geführt werden. Ferner sollte das PCR-Fingerprinting verwendet werden, bei dem speziesspezifische DNA-Polymorphismen durch den Einsatz von Zufallsprimern bzw. unspezifischen Primern in der PCR nachgewiesen werden. Durch Vergleich der PCR-Profile von unbekannten klinischen Isolaten mit denen der entsprechenden Referenzstämme sollte eine schnelle und spezifische Dermatophyten-Diagnostik auf Grundlage des Genotyps und nicht seiner phänotypischen Ausprägung ermöglicht werden.

Aus der Literatur ist bekannt, daß mit dem PCR-Fingerprinting bei anderen Pilzarten (Candida, Trichoderma, Cryptococcus usw.) neben artspezifischen auch stammspezifische Unterschiede nachweisbar sind. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb geprüft werden, ob diese Methode auch für die Charakterisierung von Stämmen unterschiedlicher Dermatophytenspezies geeignet ist. Insbesondere sollte mit dem PCR-Fingerprinting untersucht


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werden, ob zwischen Trichophyton tonsurans-Stämmen, die von jungen Sportlern im Zeitraum von 1993 bis 1996 im Raum Berlin isoliert wurden, epidemiologische Zusammenhänge bestehen.

Für die verschiedenen Aufgaben in dieser Arbeit war es wichtig, eine Mini-DNA-Präparationsmethode zu etablieren, um DNA aus Frühkulturen (nach 1-2 wöchiger Anzucht) isolieren zu können. Darüberhinaus sollte für den Nachweis von medizinisch relevanten Dermatophytenspezies (Trichophyton rubrum) direkt in klinischem Material eine effiziente Zellaufschlußmethode entwickelt werden.


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