El Fari, Mustafa: Untersuchungen zur Taxonomie und Phylogenie der Familie Arthrodermataceae (Dermatophyten) und Entwicklung einer spezifischen Sonde für Trichophyton rubrum.

18

Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Pilzstämme und Patientenmaterial

Die Herkunft der in der vorliegende Arbeit untersuchten Pilzstämme und Patientenmaterialien ist in Tab. 5 dargestellt.

Tab. 5: Dermatophytenspezies und Varianten, die in der Arbeit verwendet wurden

Spezies

CBS.

L. Nr.

N. R.

Verwendet für

ITS bp.

GC %

Gattung: Arthoderma

 

 

 

 

 

 

A. benhamiae

624.66 MT-;T

86

Z.

T

713

55,1

A. benhamiae

623.66 MT+;T

71

Z.

T u

713

55,1

A. cuniculi

492.71 MT-;PT

25

G.

T u P

716

56,6

A. curreyi

130.70

46

G.

T u P

737

54,1

A. grubyi

244.66 MT-

56

G.

T u

651

54,8

A. fulvum

167.64 MT+

30

G.

T u

684

56,7

A. incurvatum

173.64 MT+

29

G.

T u

653

56,5

A. insingulare

521.71

27

G.

T u

698

55,7

A. quadrifidum

464.62 MT+

24

G.

T u

695

54,8

A. otae

495.86 MT+

51

Z.

T u

763

63,9

A. otae

496.86 MT-

52

Z.

T

763

62,9

A. persicolor

468.74 MT-

53

Z.

T u

700

57,6

A. simii

448.65 MT+;T

43

Z.

T u

720

56,5

A. simii

449.65 MT+;PT

47

Z.

T

720

56,5

A. uncinatum

316.65 MT-;T

50

G.

T u P

692

55,3

A. vanbreuseghemii

646.73 MT+;PT

72

A.

T u P

717

56,3


19

Spezies

CBS.

L. Nr.

Teleomorph

N. R.

Verwendet für

ITS bp.

GC %

Gattung: Epidermophyton

 

 

 

 

 

 

 

E. stockdaleae

128.75

31

---

G.

T u P

692

55,3

E. floccosum

970.95

75

---

A.

T

812

58,6

E. floccosum

553.84

74

---

A.

T P

812

58,6

E. floccosum

358.93

14

---

A.

T u P

808

58,6

 

 

 

 

 

 

 

 

Gattung: Microsporum

 

 

 

 

 

 

 

M. audouinii

280.63

34

---

A.

T u P

766

58,5

M. audouinii

545.93

13

---

A.

T

766

58,5

M. audouinii var. langeronii

404.61;AUT

59

---

A.

T u P

767

58,5

M. audouinii var. rivalierii

409.51

58

---

A.

T u

768

58,6

M. canis

132.88

11

69

A. otae

Z.

T u P

T u P

769

769

58,9

M. canis

282.63

33

A. otae

Z.

T u P

769

58,9

M. canis var. distortum

277.62

70

---

Z.

T u P

770

59,1

M. cookei

228.58 ;AUT

87

A. cajetani

G.

T u P

731

57,0

M. equinum

218.32

60

---

Z.

T u P

771

59,0

M. ferrugineum

457.80

77

---

A.

T u P

771

59,1

M. ferrugineum

427.63

79

---

A.

T P

768

59,o

M. fulvum

287.55 T

57

A. fulvum

G.

T u

685

56,6

M. gallinae

300.52

32

---

Z.

T u

649

54,5

M. gypseum var. gypseum

161.69

12

28

A. incur.

G.

G.

T u

T

653

653

55,7

55,7

M. persicolor

469.74 MT+

54

A. persi.

Z.

T u

700

57,6

M. vanbreuseghemii

243.66 MT+;T

55

A. grubyia

G.

T u

651

54,8

 

 

 

 

 

 

 

 

Gattung: Trichophyton

 

 

 

 

 

 

 

T. ajelloi

315.65 MT+;T

49

A. uncina.

G.

T u

692

55,3

T. ajelloi var. nanum

180.64 T

45

 

G.

T u

718

55,6

T. concentricum

452.59

36

---

A.

T u P

769

59,2

T. concentricum

196.26 AUT

66

---

A.

T

712

54,8

T. concentricum

563.83

73

---

A.

T

712

54,8

T. equinum var. equinum

292.81

44

---

Z.

T u

691

55,4


20

Spezies

CBS.

L. Nr.

Teleomorph

N. R.

Verwendet für

ITS bp.

GC %

T. equ. var. autotrophicum

635.82

67

---

Z.

T

719

56,3

T. equ. var. autotrophicum

634.82

85

---

Z.

T

721

56,0

T. fischeri

288.86

76

---

G.

T

726

57,6

T. gloriae

228.79

89

A. gloriae

G.

T

721

55,3

T. kanei

289.86

65

 

A.

T u P

727

57,6

T. megninii

735.88

10

---

A.

T u P

726

57,8

T. m. var. erinacei

344.79

15

---

Z.

T u P

713

55,4

T. m. var. erinacei

677.86

68

---

Z.

T u P

713

55,4

T. m. var. goetzii

392.68

17

---

A.

T u P

717

56,2

T. m. var. granulosum

280.83 MT-

16

A. benha.

Z.

T u P

715

56,1

T. m. var. interdigitale

558.66

22

---

A.

T u P

717

56,3

T. m. var. quinckeanum

106.67

19

---

Z.

T u P

720

56,1

T. m. var. quinckeanum

n. b.

1

---

Z.

T u P

719

56,1

T. m. var. mentagrophytes

318.56

20

---

Z.

T u P

718

56,1

T. m. var. nodulare

429.63

18

---

A.

T u P

710

56,2

T. rubrum

494.62.

9

 

A.

T u P

727

57,9

T.rubrum

392.58

37

---

A.

T u P

727

57,9

T. rubrum var. granulare

304.60

78

---

A.

T u P

724

57,9

T. rubrum (49 klinsiche Stämme)

 

R1 - R49

 

A.

u

 

 

T. rubrum (direkt aus Patientenmaterial)

 

T1 - T35

---

A.

u

 

 

T. schoenleinii

855.71

2

---

A.

T u

718

56,1

T. schoenleinii

433.63

38

---

A.

T u P

718

56,1

T. simii

417.65 MT-;T

48

A. simii

Z.

T u P

720

56,5

T. soudanense

452.61

42

---

A.

T u P

732

57,5

T. terrestre

613.74 MT+

8

A. quadrifi.

G.

T u P

695

54,8

T. tonsurans

483.76

4

---

A.

T

721

56,2

T. tonsurans

496.48

39

---

A.

T u P

720

56,2

T. t. var. epilans

332.32

40

---

A.

T u P

718

56,1

T. t. var. crateriforme

495.48

41

 

A.

T u P

719

56,2

T. t. var. sulfureum

118.65

62

63

 

A.

T u P

T u P

720

720

56,4

T. vanbreuseghemii

598.66 T

26

A. gertleri

G.

T u

685

53


21

Spezies

CBS.

L. Nr.

Teleomorph

N. R.

Verwendet für

ITS bp.

GC %

T. ver. var. verrucosum

134.66

6

---

Z.

T u P

 

56,0

T. ver. var. verrucosum

554.84

64

---

Z.

T P

712

56,0

T. ver. var. ochraceum

564.50

61

---

Z.

T u P

711

56,0

T. violaceum

n. b.

7

---

A.

T u P

733

57,5

Andere Familien

 

 

 

 

 

 

 

Onygenaceae

 

 

 

 

 

 

 

Chrysosporium keratino-philum

104.62 T

83

A. cuniculi,

A. curreyi

 

T u

642

50,1

Gymnoasaceae

 

 

 

 

 

 

 

Arachniotus ruber

352.90

84

 

 

T u

667

54,7

Schimmelpilze

 

 

 

 

 

 

 

Scopulariopsis*

H. C.

S 1

 

 

u

--

--

Aspergillus fumigatus*

H. C.

S 2

 

A.

u

--

--

Candida

 

 

 

 

 

--

--

C. guilliermondii*

ATCC 6260

S 3

 

A.

u

--

--

C. famata*

1795

S 4

 

A.

u

--

--

C. parapsilosis*

604

S 5

 

A.

u

--

--

C. zeylanoides*

619

S 6

 

A.

u

--

--

C. lipolytica*

599

S 9

 

A.

u

--

--

Cryptococcus albidus*

H. C.

S 8

 

A.

u

--

--

Trichosporum cutaneum

2466

S 7

 

A.

u

--

--

Leishmania tropica

NLB 305

S 10

 

A.

u

--

--

A.= anthropophil, Z.= zoophil, G.= geophil, ATCC= American Type culture collection, CBS= Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn-Delft, Niederlande, ITS bp.= Gesamt-ITS-Sequenz in Basenpaaren, GC %= GC-Gehalt in Prozent, H. C.= Hautklinik Charite, L. Nr. = Labornummer, n. b.= nicht bekannt, N. R.= natürliches Reservoir, AUT= Authentischer Stamm, MT= Sexuelle Kompatibilität, PT= Paratyp und T= Typstamm.

T Stämme, die sequenziert wurden

u Stämme, die zum Testen derTR20S-Sonde verwendet wurden

P Stämme, mit dem PCR-Fingerprinting charakterisiert wurden.


22

3.2. Methoden

3.2.1. Kultivierung der Pilzstämme

Referenzstämme und klinische Pilzisolate wurden auf Sabouraud-Agar für ca. 2 - 4 Wochen bei Raumtemperatur angzüchtet. Alle klinischen Isolate wurden mikro- und makroskopisch (Art der Mikro- und Makrokonidien, Hyphenbildung, Pigmentierung usw.) charakterisiert.

Die Stammhaltung erfolgte bei Zimmertemperatur auf Sabouraud-Schrägagar.

Dieser Teil der Arbeit wurde im Pilzlabor der Hautklinik Charité unter der Leitung von Herrn PD. Dr. Hans-Jürgen Tietz durchgeführt.

3.2.2. Isolierung chromosomaler DNA aus den Dermatophyten

3.2.2.1. DNA-Präparation nach Zellaufschluß mit der Magnetmühle

Drei ausgewachsene Kolonien wurden mit sterilem Skalpell klein geschnitten und in 25 ml Hexadecetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Puffer [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM ETDA, 4 M NaCl, 2% CTAB, 0,2% Mercaptoethanol] homogenisiert. Die Probe wurde dann in ein Zellaufschlußröhrchen überführt und anschließend 10 bis 15 min bei einem Zeitintervall von 20 sec in der Magnetmühle (Hoechst, Bad Boden) aufgeschlossen. Der Zellaufschluß erfolgt dabei über die schnelle Bewegung der Stahlspäne im magnetischen Feld.

Danach wurde die Probe in ein 60 ml Falkonröhrchen gegeben und 3x schnell in flüssigem Stickstoff gefroren und im Wasserbad bei 80°C wieder aufgetaut (Deckel vorher schnell öffnen “Druckausgleich“). Anschließend wurden 12 µl einer 20 mg/ml Protease-K-Lösung (AGS GmbH, Heidelberg) dazupipettiert und bei 65°C für ca. 1,5 h inkubiert. Die Probensuspension wurde dann bei 4.500 rpm und 4°C 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übernommen, mit 1 Volumen Kirby-Mix [Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol = 25 : 24 : 1] gemischt (leicht Schütteln) und dann bei 5.000 rpm und 4°C erneut 10 min zentrifugiert. Dieser Schritt wurde solange


23

wiederholt, bis keine Interphase mehr zu sehen und der Überstand möglichst farblos war.

Der Überstand wurde in ein neues Falkonröhrchen überführt, mit 1/10 Volumen 5M Na-Acetat und 1 Volumen eiskaltem Isopropanol versetzt. Die DNA-Suspension wurde über Nacht bei -20°C oder für ca. 5 h bei -70°C inkubiert. Danach wurde die Probe bei 5.300 rpm und 4°C mindestens 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig abgegossen.

Mit Hilfe einer steril abgeschnittenen 1 ml Pipettenspitze wurde das Sediment resuspendiert, in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen überführt, mit 12 µl einer 20 mg/ml RNAse-Lösung (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) versetzt und ca. 15 min bei 37°C inkubiert.

Die DNA-Suspension wurde mit 1 Volumen Kirby-Mix gemischt (leicht schütteln) und dann bei 13.000 rpm für 7 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt, mit 1/10 Volumen 5,3 M NaAc (pH 5,2) und 1 Volumen eiskaltem Isopropanol versetzt. Die DNA-Suspension wurde über Nacht bei -20°C inkubiert. Danach wurde die Probe bei 13.000 rpm ca. 30 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert.

Das DNA-Sediment wurde mit 70%-igem eiskaltem Ethanol gewaschen, bei 13.000 rpm 10 min zentrifugiert und anschließend in der Speed Vac 100 (Savant Instruments, Farmingdale) getrocknet. Das DNA-Sediment wurde in TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] oder in Aqua bidest gelöst.

3.2.2.2. Maxi-DNA-Präparation (nach Gruber 1990, modifiziert)

Drei gut ausgewachsene Kolonien wurden mit sterilem Skalpell geschnitten und in einem bei -70 C° vorgekühltem Mörser mit flüssigem Stickstoff gemörsert. Die noch tiefgefrorenen pulverisierten Zellen werden in 60 ml Falkonröhrchen überführt und mit 25 ml CTAB-Puffer homogenisiert.

Alle anderen Schritte sind genau wie unter 3.2.2.1. beschrieben.


24

3.2.2.3. Mini-DNA-Präparation

Diese Methode wurde aus der Maxi-Methode entwickelt.

Eine 0,5 - 1 cm große Kolonie wurde steril aus dem Saubouraud Agar geschnitten und in flüssigem Stickstoff gemörsert. Das Pulver wurde in 1 ml CTAB-Extration-Puffer aufgenommen, zum besseren Zellaufschluß 3x in flüssigem N2 gefroren und bei 80°C aufgetaut.

Die Suspension wurde 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, danach wurde dem Überstand Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugesetzt.

Nach einer 1,5-stündigen Inkubation bei 60°C wurde die Lösung mindstens 4x mit Kirby-Mix extrahiert und anschließend für 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Danach wurde die wäßrige Phase entnommen, mit 1 Volumen Chloroform gewaschen und erneut zentrifugiert.

Zur Fällung der DNA wurde 1/10 Volumen 5,3 M NaAc (pH 5,2) und 1 Volumen eiskaltes Isopropanol zugegeben. Die DNA-Lösung wurde bei -20°C für 10 h aufbewahrt und anschließend 15 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde mit 70%-igem Ethanol gewaschen, erneut zentrifugiert und anschließend getrocknet. Das DNA-Pellet wurde in 1x TE-Puffer resuspendiert, 100 µg/ml (Endkonzentration) RNase zugegeben und 15 min bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde für den weiteren Gebrauch bei -20°C gelagert.

3.2.2.4. DNA-Präparation aus dem Patientenmaterial

Für die Isolierung von Dermatophyten-DNA aus 0,01 - 0,02 g infiziertem Nagelmaterial wurden verschiedene Methoden zum Zellaufschluß getestet.

  1. Normales Mörsern der Zellen in flüssigem Stickstoff.
    Dabei wurde das Nagelmaterial in flüssigem Stickstoff gemörsert, 3x in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend bei 80°C aufgetaut.
  2. Proteinase-K- Behandlung
    Das infizierte Nagelmaterial wurde über Nacht bei 37°C in einer Proteinase-

    25

    K-Lösung (Endkonzentration 75 µg/ml) inkubiert.
  3. Lytikase- und anschließende Proteinase-K- Behandlung
    Um einen besseren Zellaufschluß zu erzielen, wurde das infizierte Nagelmaterial zuerst für 4 h in75 µl Lytikase-Lösung (67 mg/ml) und anschließend über Nacht bei 37°C in Proteinase-K (Endkonzentration 75 mg/ml) inkubiert.
  4. KOH-Inkubation
    Die Proben wurden über Nacht in 15-20%iger KOH-Lösung inkubiert und anschließend mit mit dem gleichen Volumen 2M Tris-HCL neutralisiert.

Nach entsprechender Vorbehandlung (b, c bzw. d) wurden die Proben in flüssigem Stickstoff gemörsert und 3x in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend bei 80°C aufgetaut.

Neben dem Nagelmaterial wurden auch 2 Hautproben verwendet.

Für die nachfolgende Reinigung der DNA wurden kommerziell verfügbare Kits entsprechend den Angaben der Hersteller verwendet: InViSorbTM Genomic DNA Kit (InViTek, Berlin), ChelexR 100 Resin (Bio-Rad Laboratories, München), RapidprepTM Genomic DNA Isolation Kit (Pharmacia Biotech, Freiburg), DNA Isolation-Kit (Puregene, Biozym, Oldendorf), ELU-QUIK (Schleicher & Schuell, Basel) und DynabeadsR DNA DirectTM (Dynal, Hamburg).

3.2.3. DNA-Konzentrationsbestimmung

Hierzu wurde ein 5 µl Aliquot der zu messenden DNA-Lösung entnommen und mit 995 µl Aqua bidest. oder TE-Puffer verdünnt. Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte spektralphotometrisch (Quarzküvette, 1 cm Schichtdicke) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260).

Unter diesen Bedingungen entspricht eine Extinktion von 1 einer Konzentration von ungefähr von 50 µg/ml bei doppelsträngiger DNA, 40 µg/ml bei einzelsträngiger DNA bzw. RNA und 20 µg/ml bei einzelsträngigen Oligonukleotiden (Sambrook et al. 1989).


26

Um den Reinheitsgrad der DNA-Lösung zu ermitteln, wurde der Quotient aus OD260/OD280 bestimmt. Der errechnete Wert soll für eine ausreichend reine DNA-Präparation bei 1,8 - 2,0 liegen. Liegt der Wert darunter, so weist dies auf eine Kontamination der Probe durch Proteine oder Phenol hin, während ein Quotient > 2 für eine Verunreinigung durch RNA spricht.

3.2.4. Polymerasekettenreaktion (PCR)

3.2.4.1. PCR-Optimierung

Für die Optimierung der PCR-Bedingungen wurde in der vorliegenden Arbeit eine modifizierte Methode ( Tab. 6 ) nach Taguchi verwendet (Taguchi 1986, Cobb & Clarkson 1994).

Die Konzentrationen von Primern, Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), Mg-Ionen, DNA-Template und Annealing-Temperatur wurden gegeneinander optimiert, um eine größtmögliche Empfindlichkeit und Spezifität in der PCR-Reaktion zu erreichen.

Tab. 6: PCR-Optimierung ( 25 µl Ansätze)

Ansätze*

H2O µl

Puffer µl

dNTPs µl

MgCl2 µl

Je Primer µl

DNA µl

Taq µl

A, B , C

60,3

7,5

1,5

0,0

2,25

0,9

0,3

A, B , C

54,0

7,5

3,0

4,5

2,25

1,2

0,3

A, B , C

44,7

7,5

6,0

10,5

2,25

1,5

0,3

A, B , C

46,8

7,5

6,0

4,5

4,5

0,9

0,3

A, B , C

45,0

7,5

1,5

10,5

4,5

1,2

0,3

A, B , C

53,7

7,5

3,0

0,0

4,5

1,5

0,3

A, B , C

34,8

7,5

3,0

10,5

9,0

0,9

0,3

A, B , C

42,0

7,5

6,0

0,0

9,0

1,2

0,3

A, B , C

41,7

7,5

1,5

4,5

9,0

1,5

0,3

Gleiche Probe bei drei verschiedenen Annealing-Temperaturen. (z.B. A = 52,5°C, B= 54°C und C= 55,5°C, für die Optimierung der PCR der Gesamt ITS-Region mit den Primern LR1 und SR6R)


27

3.2.4.2. PCR zur Amplifizierung der ITS-Region

Die PCR zur Amplifizierung der Gesamt-ITS-Region wurde in 0,5 ml Eppendorf-Gefäßen unter der Verwendung von LR1- und SR6R-Primern (Tib-Molbiol, Berlin, siehe Tab.3.3) nach folgendem Ansatz durchgeführt:

(Bei PCR-Produkten, die anschließend mit Dynabeads bearbeitet wurden, wurde im PCR-Ansatz ein Biotin markierter Primer verwendet).

Der PCR-Ansatz wurde mit 1 Tropfen PCR-Mineralöl überschichtet, gut gemischt und dann für 5 Sekunden zentrifugiert. Zur Denaturierung der DNA wurde der Ansatz für 5 Minuten auf 95°C erhitzt, und das Zyklerprogramm im Thermozykler (Gene Amp PCR System 9600; Perkin Elmer, Überlingen) gestartet. Ein Zyklus bestand aus folgenden 3 Schritten:

1. Schritt (Denaturierung): 1 min bei 95°C

2. Schritt (Primer-Bindung): 30 sec bei 54°C

3. Schritt (Primer-Extension): 2 min bei 72°C

Der Zyklus wurde 30 - 35 mal wiederholt. An den letzten Zyklus schloß sich eine 10-minütige Inkubation bei 72°C und eine Kühlung bei 4°C an. Die Dauer des Extensionsschrittes war von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragmentes abhängig.

3.2.4.3. PCR-Fingerprinting

Bei den PCR-Fingerprinting-Reaktionen wurden ebenfalls 50 µl PCR-Ansätze verwendet, die folgende Komponenten enthielten:

25 ng DNA, Reaktionspuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM KCl, 1.5 mM


28

MgCl2, 3 mM MgAc), jeweils 200 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 2,5 U Taq-DNA-Polymerase. Die Primer T3B, M13 core, AP3 und (AC)10 (Tab. 3.3) wurden bis zu einer Endkonzentration von 25 pmol und der Primer (GTG)5 mit einer Endkonzentration von 5 pmol dem PCR-Ansatz zugefügt. Nach Überschichtung mit einem Tropfen Mineralöl wurde das folgende PCR-Programm im Trioblock (Biometra/ Hybaid, Göttingen) gestartet.

1. Schritt (Denaturierung): 1 min bei 95°C
2. Schritt (Primer-Bindung): 30 sec bei der für den jeweiligen Primer spezifi- schen Annealing-Temperatur (s. Tab. 7 )

3. Schritt (Primer-Extension): 2 min bei 72°C

Der Zyklus wurde 32 mal wiederholt mit Ausnahme der PCR mit Primer AP3, bei der 45 Zyklen notwendig waren. An den letzten Zyklus schloß sich eine 6-minütige Inkubation bei 72°C und eine Kühlung bei 4°C an.

Tab. 7: Primer, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden

Primer

Sequenz

Tm C_

M13core (Huey & Hall 1989)

5` GAG GGT GGC GGT TCT 3`

50.0

T3B (McClelland et al. 1992)

5` AGG TCG CGG GTT CGA ATC C 3`

52.0

AP3 (Williams et al. 1990)

5` TCA CGA TGC A 3`

36.0

(GTG)5 (Ali et al. 1986)

5` GTG GTG GTG GTG GTG 3`

50.0

(AC)10 (Niesters et al. 1993)

5` ACA CAC ACA CAC ACA CAC AC 3`

54.0

LR1 (White et al. 1990)

5` GGT TGG TTT CTT TTC CT 3`

48.0

LR1* (diese Arbeit)

5` CTT TTC CTCCGCTTATT 3`

54,0

SR6R (White et al. 1990)

5` AAG TAA AAG TCG TAA CAA GG 3`

54.0

5.8S (White et al. 1990)

5` CGC TGC GTT CTT CAT CG 3`

54.0

5.8SR (White et al. 1990)

5` TCG ATG AAC GCA GCG 3`

56.0

DXYS156Y (Chen et al. 1994)

5` CAG ATA CCA AGG TGA GAA TC 3`

58.0

DXYS156X (Chen et al. 1994)

5` GTA GTG GTC TTT TGC CTC C 3`

58.0

_ Zugehörige Annealingtemperaturen


29

Die PCR-Produkte wurden in der Speed Vac. auf 20 µl eingeengt und elektrophoretisch in einem 1.2 Agarose- (Pharmacia / LKB, Freiburg) oder Separide-Gel (GibcoBRL, Eggenstein) aufgetrennt.

3.2.5. Auftrennung von DNA-Fragmenten in Agarosegelen

Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden meist 1-1,2 %ige Agarosegele verwendet. Die Agarosekonzentration richtete sich nach der Größe der erwarteten DNA-Fragmente. Die Agarose wurde durch Erhitzen in der Mikrowelle (Bosch) in 1 x TBE-Puffer [107,8 g Tris-Base, 55,0 g Borsäure, 20 mM EDTA, auf 1000 ml mit Aqua bidest auffüllen und pH 7,5 mit Phosphorsäure einstellen] vollständig gelöst und nach leichter Abkühlung in eine Gelschale gegossen (Elektrophoresekammern, cti, Heidelberg). Als Laufpuffer wurde 0,5x TBE-Puffer verwendet. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese mit 1/8 Volumen Blue Marker [0,5 ml Formamid, 0,4 ml 0,5M EDTA, 5 mg Bromphenolblau, 5 mg Xylencyanol und 0,1 ml Aqua bidest.] versetzt und aufgetragen. Als Molekulargewichtsmarker wurde meist die 1 kb Leiter (GibcoBRL, Eggenstein) benutzt.

Zunächst erfolgte ein kurzer Vorlauf für 5 Minuten bei 25 - 40 Volt (Gleichstromgeber für Elektrophorese Pawer PAC 300Bio Rad laboratories, München), damit die gesamte Probe aus der Geltasche in das Gel einlaufen konnte. Dann wurden die DNA-Fragmente bei konstanter Spannung von 100 - 120 Volt 1h, die Fingerprinting-Gele 5 h separiert.

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel 5-10 Minuten in einem Ethidiumbromidbad (Endkonzentration 0,5 µg/ml) gefärbt. Zur Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz durch freies Ethidiumbromid und zur besseren Analyse komplexer DNA-Bandenmuster wurde das Gel in Wasser entfärbt. Anschließend wurde das Gel unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 305 nm (UV-Transilluminator, UVP, San Gabriel, USA) ausgewertet und gegebenenfalls photographiert (Polaroid, USA bzw. Eagle Eye II, Startagene, Heidelberg).


30

3.2.6. Trennung von DNA- Doppelsträngen mittels Dynabeads® M-280 Streptavidin

Um die für die Sequenzierung der ITS-Region benötigten DNA-Einzelstränge zu erhalten, wurden die doppelsträngigen PCR-Produkte, von denen ein Strang niotinmarkiert war, mit Hilfe von Dynabeads-Molekülen (Dynal, Hamburg) aufgetrennt. Dynabeads sind einzelne, uniforme, superparamagnetische, monodisperse Polyacryl-Partikel. Sie sind über eine kovalente Bindung mit Streptavidin beschichtet. Die hohe Affinität zwischen Streptavidin und Biotin (Kd=10-15) erlaubt eine schnelle und effiziente Isolierung von biotinmarkierten Molekülen.

Die Durchführung dieser Methode erfolgte entsprechend der Vorschrift des Herstellers.

3.2.6.1. Vorbereitung der Dynabeads

200 µl Dynabeads-Lösung wurden in 0,5 ml Eppendorfgefäße pipettiert, mit dem Magnetgestell für ca. 30 bis 90 sec magnetisiert und der Überstand abpipettiert. Zum Waschen der Dynabeads-Moleküle wurden 200 µl Bindungs- & Wasch- Puffer [10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 2 M NaCl und auf pH 7,5 einstellen] pipettiert, homogenisiert, ca. 30 bis 90 sec magnetisiert und anschließend der Überstand verworfen. Dieser Schritt wurde 2x wiederholt.

Die Dynabeads-Moleküle wurden zum Schluß in 200 µl Bindungs- & Wasch- Puffer resuspendiert und für den weiteren Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.

3.2.6.2. Trennung von DNA-Strängen

10 µl PCR-Produkt wurden mit 10 µl gewaschener Dynabeads-Lösung gemischt und 15 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln inkubiert.

Danach wurde der Ansatz ca. 30 bis 90 s magnetisiert und der Überstand vorsichtig entfernt. Zum Waschen der Probe wurden 10 µl Bindungs- & Wasch-Puffer hinzugegeben, magnetisiert und der Überstand wieder entfernt. Die Trennung der DNA-Stränge erfolgte durch Zugabe von 10 µl 0,1 M NaOH während einer Inkubationszeit von ca. 15 min. Das Gemisch wurde


31

magnetisiert und der Überstand entfernt. Dieser Schritt wurde 2x durchgeführt. Zum Neutralisieren bzw. Waschen der an die Dynabeads gebundenen einzelsträngigen DNA wurde das Sediment mit 10 µl Bindungs- & Wasch-Puffer versetzt, magnetisiert und der Überstand abpipettiert. Anschließend wurde das DNA-Pellet mit 10 µl TE-Puffer gemischt. Die einzelsträngige DNA, die an die Dynabeads-Moleküle gebunden blieb, wurde dann bis zur Sequenzierung bei 4°C aufbewahrt. Unmiitelbar vor Gebrauch wurde nochmals magnetisiert und der TE-Puffer entfernt.

3.2.7. DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten

Alle in dieser Arbeit durchgeführten DNA-Sequenzierungen beruhen auf dem Prinzip des Kettenabbruch- oder Didesoxynukleotid-Verfahrens nach Sanger et al. (1977).

Bei der Sequenzierungsreaktion wird die Matrizen-DNA zunächst mit dem Sequenzier-Primer hybridisiert. Dabei werden die gleichen Primer wie für die Amplifikation der jeweiligen DNA verwendet, die allerdings am 5’-Ende mit einem Infrarotfarbstoff markiert sind (MWG-Biotech, Ebersberg). Ausgehend von dem Primer erfolgt die enzymatische Synthese des komplementären Stranges mit Hilfe einer DNA-Polymerase (Exel-Polymerase, Biozym, Oldendorf). Die Synthese findet in 4 Reaktionsgefäßen statt. Jedes Gefäß enthält Matrizen- DNA , markierten Primer, Exel-Polymerase und alle 4 dNTPs sowie zusätzlich eines der 4 Didesoxynucleotidtriphosphate (ddNTPs). Bei jeder der 4 Einzelreaktionen laufen gleichzeitig zahlreiche Primer- Verlängerungen ab. Das Enzym akzeptiert dabei sowohl die dNTPs als auch das jeweilige ddNTP als Substrat. Wird allerdings ein ddNTP zur Kettenverlängerung verwendet, so bricht die Reaktion nach dessen Einbau (Kettenbruch) ab. Aufgrund des fehlenden 3´-Hydroxynukleotids kann kein weiteres Nukleotid angefügt werden. Man erhält so in jeder der 4 Einzelreaktionen eine statistische Mischung aller Kettenlängen bei den neu synthetisierten, markierten DNA-Fragmenten. Das 5´-Ende jedes Fragments wird vom Sequenzier-Primer gebildet, während das 3´-Ende aus dem Didesoxynucleotid der entsprechenden Einzelreaktion besteht.


32

3.2.7.1. Nichtradioaktive, automatische Sequenzierung von PCR-Produkten

Die DNA-Sequenzen der ITS-Region wurden durch direkte Sequenzierung von einzelsträngigen PCR-Produkten mit infrarotmarkierten Primern (MWG Biotech, Ebersberg) ermittelt. Dabei wurden die ddNTP’s mit der “Cycle Sequencing“-Technik eingebaut, die Produkte der Sequenzierreaktion wurden mit dem Sequenzierautomat LI-COR, Modell 4000 (MWG Biotech, Ebersberg), aufgetrennt und analysiert. Prinzipiell wurde alle PCR-Produkte sowohl in der Hin- als auch in der Rückrichtung unter Verwendung der entsprechenden Primer (SR6R, 5.8S, 5.8SR, LR1 bzw. LR1*) sequenziert.

3.2.7.2. PCR-Cycle-Sequencing

wobei mit dem “Sequi Therm Exel™ -Long Read™ Cycle Sequenzing Kit-LC“ (Biozym, Oldendorf) gearbeitet wurde. Folgender Reaktionsansatz wurde hergestellt (0,5 ml Reaktionsgefäß).

Das DNA-Pellet wurde durch leichtes Schütteln gelöst. Je 4 µl des Ansatzes wurden in die vorbeschrifteten 0,5 ml Eppendorfgefäße, die jeweils 2µl der A, C, G und T- Terminatoren enthalten, pipettiert. Die Reagenzien wurden mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet und kurz zentrifugiert. Zur Denaturierung der DNA wurde der Ansatz für 5 Minuten auf 96°C erhitzt und dann das Zyklusprogramm gestartet. Ein Zyklus besteht aus drei Schritten:

1. Schritt (Denaturierung) : 30 Secunden bei 96°C

2. Schritt (Primer-Bindung): 30 Secunden bei 60°C

3. Schritt (Primer-Extension): 1 Minuten bei 70°C


33

Dieser Zyklus wurde 29 mal wiederholt. Anschließend wurden die Proben auf 4°C herunter gekühlt. Zum Abbrechen der Reaktion wurden in jedes Reaktionsgefäß 4 µl Stopplösung gegeben.

3.2.7.3. Herstellung eines 7%-igen Polyacrylamidgels und Durchführung der Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Vor der Herstellung der Sequenzgele wurden die Glasplatten wie folgt vorbehandelt:

Abb. 4

Die 25 x 40 cm großen Glasplatten wurden mit Seifenlauge abgewaschen, mit Aqua bidest gespült und anschließend mit 70%- igem Ethanol gewaschen. Zwischen die Platten wurde ein 0,2 mm dicken Abstandhalter eingelegt, die Platten mit zwei Schienen befestigt (siehe Abb. 4 ).

In der vorliegenden Arbeit wurde für die DNA-Sequenzierungen jeweils ein vorgefertigtes Polyacrylamid- und N,N´ Methylen Bisacrylamidgel (Sequagel XR; Biozym, Ebersberg) verwendet.

Um ein 7%-iges Gel herzustellen wurde folgende Bestandteile miteinander gemischt:

Für die Polymerisierung wurden 280 µl 10%-iges Ammoniumperoxidsulfat (APS) zugegeben und gut gemischt. Anschließend wurde das Gemisch zwischen die vorbereiteten Glasplatten gegossen. Der Kamm wurde eingesetzt und anschließend das Gel in horizontaler Lage für 2 Stunden bei Raumtemperatur polymerisiert.

Die Gelelektrophorese erfolgte in der vertikalen LI-COR-Elektrophorese-Apparatur. Die Außenseiten der Glasplatten wurden vor dem Einsetzen von allen auspolymerisierten Polyacrylamidgelresten gereinigt. Die Elektrophorese


34

wurden mit 1 x TBE als Laufpuffer durchgeführt. 1,5 - 2 µl der Sequenzieransätze wurden aufgetragen und über Nacht bei 1500 V, 35 mA , 31,5 W und 50°C aufgetrennt.

3.2.7.4. Detektion und Auswertung der Sequenzdaten im LI-COR-Gerät

Abb. 5

Der LI-COR 4000 Sequenzierautomat besteht aus einer Elektrophorese- und einer Detektionseinheit.

Die Detektionseinheit ist ein Laser-Leseauge, welches das Gel waagerecht mit einer bestimmten Geschwindigkeit nach Infrarot-Signalen abtastet. Diese Signale werden dann als weiße Banden auf schwarzem Hintergrund oder schwarze Banden auf weißem Hintergrund wiedergegeben ( Abb. 5 ).

Das Lesen der Signale kann automatisch erfolgen. Um dies zu kontrollieren, wurde die gelesene Datei in ein anderes Format umgewandelt, in dem die Nukleotide je nach Infrarot-Aktivität in Peaks darstellt werden So können Sequenzen, bei denen das automatische Lesen Schwierigkeiten bereitet, manuell bearbeitet werden. ( Abb. 6 ).

Abb. 6


35

3.2.8. Analyse der DNA-Sequenzen

3.2.8.1. Sequenz-Alignment

Da die ITS-Sequenzen der unterschiedlichen Dermatophytenarten zahlreiche Längenpolymorphismen aufwiesen, bereitete die Erstellung eines Gesamt-Alignment in einem Schritt große Schwierigkeiten. Deswegen wurden zunächst mit dem Programm CLUSTAL V 4 (DKFZ, Heidelberg) separate Alignments von Speziesgruppen, die ähnliche Sequenzen aufwiesen, erarbeitet. Ein vollständiges Alignment aus den 4 separaten Alignments wurde dann mit Hilfe des Programms PROFIALIGN (DKFZ, Heidelberg) erhalten (dargestellt im Anhang A).

Die Alignment-Regionen, welche Längenmutationen (Insertionen/Deletionen) aufwiesen, d. h. deren Nukleotidpositionen nicht zweifelsfrei zugeordnet werden konnten, wurden als besondere Charaktere am Ende des Alignments rekodiert. Dabei erhielten ähnliche Sequenzen denselben Charakterstatus (z.B. Microsporum canis-Komplex). Es gab insgesamt 7 solcher Regionen, die als 7 neue Charaktere rekodiert wurden. Somit konnte der Informationsgehalt, der in diesen Regionen zweifellos enthalten ist, besser in die Analyse einbezogen werden.

3.2.8.2. Berechnung des Variationsindex für den Vergleich der ITS-Sequenzen

Zum Vergleich der ITS-Sequenzen innerhalb der Arthodermataceae wurde ein Variationsindexes mit Hilfe des Programms Pc/Gene Relase 6.50 (Datenbank, Uni. Freiburg) berechnet. Es wurden jeweils zwei Sequenzen miteinander verglichen und deren prozentuale Unterschiede errechnet, wobei sowohl Punktmutationen als auch Insertionen/Deletionen berücksichtigt wurden. Dieser Koeffizient betrug 0% für identische Sequenzen. Für diese Analysen wurden nur die ITS1- und die ITS2-Region verwendet (d. h. ohne das dazwischen liegende 5.8S-Gen).


36

3.2.8.3. Phylogenetische Analyse der Sequenzdaten

Die phylogenetischen Beziehungen können aus den Sequenzdaten mit Hilfe von Computerprogrammen abgeleitet werden. Die Parsimonie-Analyse wurde mit dem Programm PAUP 3.1.1 (Swofford 1991) durchgeführt. Für alle Datensets wurde dabei die heuristic-search- Option verwendet. Die Neighbor-Joining-Analyse (Saitou & Nei 1987) wurde mit dem Program TreeCon erstellt. (Van de Peer & De Wachter 1994). Ein Gesamt-Konsensus-Baum wurde bei der Parsimonie-Analyse mit der Option 50% “Majorety consensus tree“ erstellt, wenn mehr als ein Baum während der Analyse gefunden wurde. Für den generellen Stammbaum der Familie Arthrodermataceae wurde für die Parsimonie-Analyse das Alignment mit den rekodierten Daten, für die Neighbor-Joining-Analyse das gleiche Datenset (3.2.9.1) unter Weglassung der rekodierten Charaktere verwendet, da das Programm keinen zusätzlichen Charakterstatus akzeptiert. Bei den Unterbäumen wurden die beiden Analysen mit allen variablen Charaktergruppen durchgeführt. Die Robustheit der einzelnen Verzweigung wurde mit einer Bootstrap-Analyse mit mindestens 100 Replikationen überprüft. Für jeden Knoten im Kladogramm wurde ein Wert ermittelt, der die statistische Wahrscheinlichkeit der Verzweigungen nach dem Knoten ausdrückt. Erst bei Werten über 70% bei der Parsimonie-Analyse und 90% bei der Neighbor-Joining-Analyse kann die jeweilige Topologie als gesichert angesehen werden (Swofford and Olsen1990, Hillis and Dull 1993). Für die Einschätzung, wie gut das analysierte Datenset, d. h. die Distribution der Merkmalszustände durch den gefundenen Baum erklärt wird, wurden mehrere Indices vorgeschlagen, von denen an dieser Stelle der Consistency-Index (CI) , der Retention-Index (RI) und der Homoplasie-Index (HI) genannt sein sollen (Kluge and Farris 1969; Farris 1989).

3.2.9. Dot Blot-Hybridisierung mit der spezifischen Trichophyton rubrum-TR20S-Sonde

3.2.9.1. Herstellung der Dot Blots

Die zu analysierenden PCR-Produkte oder chromosomalen DNA-Proben wurden 5 min bei 95°C denaturiert und dann sofort im Eis gekühlt.


37

Anschließend wurden sie in Portionen von je 1 bis 2 µl auf eine Nylon-Membran (HybondTM-N; Amersham Buchler, Braunschweig) aufgetropft. Die Membranen wurden kurz luftgetrocknet. Die Fixierung der DNA erfolgt durch Exposition im UV-Licht bei 305 nm für 5 min.

3.2.9.2. Markierung der Sonde mit Digoxigenin-ddUTP

Die TR20S-Sonde (5` CCC TGG CCC CAA TCT TTA TA 3`) wurde mit Hilfe einer terminalen Transferase (Dig Oligonucleotide 3´-End Labeling Kit; Boehringer, Mannheim) an ihrem 3'-Ende mit Digoxigenin-ddUTP markiert. Das Enzym katalysiert die Verknüpfung von Desoxyribonukleotidtriphosphaten mit der endständigen 3'-Hydroxylgruppe von DNA-Molekülen unter Freisetzung von anorganischem Phosphat.

Die Markierung wurde durch 30 minütige Inkubation bei 37°C in einem Eppendorfgefäß nach folgendem Ansatz durchgeführt:

Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 µl sterilem 0,2 M EDTA gestoppt.

3.2.9.3. Durchführung der DNA-DNA Hybridisierung

Zur spezifischen Detektion von Trichophyton rubrum-ITS-Sequenzen wurden Hybridisierungen mit der Digoxigenin-ddUTP-markierten TR20S-Sonde durchgeführt. Die optimale Hybridisierungstemperatur von 48,6°C wurde mit Hilfe des OLIGO-Programms (Rychlik et al., 1989) berechnet.

Die Blot-Membran wurde zunächst für 1 Stunde bei 48,6°C in 20 ml Prähybridisierungslösung [5x SSC, 0,1% N-lauroylsarcosine, 1% Blocking Reagenz aus der Blocking-Vorratslösung und bei 120°C autoklavieren] inkubiert, um eine unspezifische Bindung der Sonden an die Membran zu verhindern. Anschließend wurde der Blot in 20 ml Prähybridisierungslösung,


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die 100 ng markierter Sonde enthielt, gegeben. Die Hybridisierung erfolgte für mindestens 3 Stunden oder über Nacht bei 48,6°C. Daran schlossen sich die folgenden Waschschritte bei Hybridisierungstemperatur an:

3.2.9.4. Detektion der markierten Hybride

Die Detektion erfogte mit dem Dig Luminesent Detection Kit for Nucleic Acid (Boehringer, Mannheim). Hier wurde folgendes durchgeführt.

Nach einem kurzen Abspülen des Blots mit Waschpuffer I [0,1 M Maleinsäure,15 M NaCl auf pH 7,5 mit NaOH einstellen] für ca. 15 min wurde die Membran zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen 20 Min lang in 20 ml Puffer II [Blocking-Vorratslösung 1 : 10 in Puffer I (Vorratslösung 10 g Blocking Reagenz in 100 ml Boehringer Puffer I lösen und bei 120°C autoklavieren)] inkubiert. Anschließend wurde Antikörper-Konjugat (Anti-Digoxigenin, konjugiert an alkalische Phosphatase) in einer 1:10000 Verdünnung der Stammlösung zugegeben und 30 Min inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden durch zweimal je 15-minütiges Waschen in Waschpuffer I entfernt.

Die Hybridisierungsreaktion wurde durch das chemolumineszierende Substrat (CSPD) {Disodium3-(4-methoxysprio[1,2-dioxetane-3,2´-(5´-chloro) tricyclo (3.3.1.1 3,7) decan]-4-yl)phenyl phosphate} sichtbar gemacht. Dafür wurde der Blot für 5 Minuten in Puffer III [0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl auf pH 9,5 mit 32% NaOH einstellen] äquilibriert und dann 5 -7 min in der CSPD-Gebrauchslösung [1 ml CSPD und 99 ml Boehringer Puffer III] inkubiert. Anschließend wurde der Blot für einige Sec luftgetrocknet und mit einer Nylonfolie umgeben. Die Detektion der Lichtsignale erfolgte durch 1,5 - 3 stündige Exposition auf einem Röntgenfilm (HyperfilmTM-MP; Amersham Buchler, Braunschweig).


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