El Fari, Mustafa: Untersuchungen zur Taxonomie und Phylogenie der Familie Arthrodermataceae (Dermatophyten) und Entwicklung einer spezifischen Sonde für Trichophyton rubrum.

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Kapitel 5. Diskussion

5.1. Molekularbiologische Identifizierung der Dermatophyten

Die Charakterisierung und Identifizierung der Dermatophyten stellt bis heute ein Problem in der mykologischen Praxis dar. Sie beruhen im wesentlichen, wie schon erwähnt wurde, auf der Beobachtung der makro- und mikroskopisch faßbaren morphologischen Merkmale der auf dem Nährboden gewachsenen Kolonie (Meinhof 1990, Weitzman & Summerbell 1995). Ihre Klassifizierung ist somit abhängig von der Definition verschiedener morphologischer und physiologischer Parameter. Die konventionellen Methoden sind sehr zeitaufwendig und dauern ca. 4 Wochen. Da die phänotypischen Charakteristika (z.B. Konidienbildung) oft nicht ausgeprägt werden, ist die Bestimmung der Spezies dann unsicher und kann zu Falschinterpretationen führen. Die Identifizierung der Isolate mit einiger Sicherheit kann meist nur durch Spezialisten erfolgen, die auf dem Gebiet der Dermatophyten jahrelange Erfahrung besitzen.

Eines der jüngsten Beispiele betrifft die Identifizierung von 6 Dematophytenisolaten im Rahmen einer Studie, die sich mit dem Dermatophytenspektrum in Nord-Malawi befaßt hat (Pönnighaus et al. 1996). Eines der Isolate wurde in drei verschiedenen mykologischen Labors unterschiedlich identifiziert [London (Clayton, Y.)= Trichophyton mentagrophytes, Deutschland (Pönnighaus, J.M.) = Trichophyton rubrum/Trichophyton mentagrophytes, Holland (CBS)= Trichophyton terrestre].

Immer mehr Dermatophytenstämme werden gegen gängige Antimykotika wie z.B. Griseofulvin resistent und bereiten damit weitere Schwierigkeiten bei der Charakterisierung. Wie notwendig verbesserte Identifizierungsmethoden sind, wurde bei einer Trichophyton tonsurans-Epidemie unter den deutschen Ringer sichtbar (siehe 5.1.2).

Den neuen Anforderungen werden vor allem molekularbiologische Methoden, wie die Gensondentechnik und die PCR, gerecht. In der vorliegenden Arbeit wurden das PCR-Fingerprinting für die Differenzierung unterschiedlicher


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Dermatophytenspezies sowie eine spezifische DNA-Sonde für den Nachweis von Trichophyton rubrum eingesetzt.

5.1.1. Identifizierung der Dermatophyten mittels PCR-Finger-printing

Ein großer Teil der Eukaryontengenome setzt sich aus DNA-Abschnitten zusammen, die sich in identischer oder leicht abgewandelter Form mehrmals wiederholen. Die Kopienzahl reicht von zwei bis zu mehreren Millionen. Sequenzwiederholungen findet man nicht nur bei Eukaryonten. Auch Prokaryonten wie E.coli besitzen kurze Palindromsequenzen von 20 bis 40 bp, die in ca. 500 Kopien zwischen den Genen liegen und bis zu 0,5% des gesamten Genoms ausmachen. Diese Satelliten-DNA enthält nichtkodierende Sequenzen. Die Bedeutung dieser Satelliten-DNA ist im allgemeinen noch nicht klar. Man nimmt an, daß sie Angriffsstellen für die DNA-Gyrase bieten, da sich dieses Enzym mit hoher Affinität an sie bindet.

1990 wurde unabhängig voneinander von Welsh and McClelland sowie von Williams et al. eine Methode beschrieben, bei der reproduzierbare DNA-Polymorphismen durch die Nutzung einzelner Zufallsprimer in der PCR erzeugt werden. Für die Durchführung dieses PCR-Fingerprintings sind nur geringe Kenntnisse über die Molekulargenetik des untersuchten Organismus notwendig. Es werden polymorphe DNA-Abschnitte nachgewiesen, die zufällig über das gesamte Genom verteilt sind. Sequenzinformationen sind deshalb nicht erforderlich. Welsh und McClelland verwendeten Zufallsprimer mit einer Länge von 12-34 mer und nannten ihre Methode "Arbitrarily Primed- PCR" (AP-PCR). Williams et al. hingegen setzten bei ihrer "Random Amplification of Polymorphic DNA" (RAPD) kürzere Primer (5-10 mer) ein. Bei Anwendung einzelner Zufallsprimer unterschiedlicher Länge und Nukleotidsequenz in der PCR konnten polymorphe Abschitte in der DNA verschiedener Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierarten, darunter auch bei Candida spp., nachgewiesen werden (Williams et al. 1990; Welsh and McClelland 1990; Welsh et al. 1992; Crowhurst et al. 1991; Weising


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et al. 1991;Jayarao et al. 1992; Wilde et al. 1992; Aufauvre-Brown et al. 1992; Kersulyte et al. 1992; Fekete et al. 1992; Lehmann et al. 1992; Niesters et al. 1993; Lieckfeldt et al. 1993; Thanos et al. 1996). Dieses PCR-Fingerprinting konnte erfolgreich für epidemiologische Studien bei Bakterien und Pilzen (Mazurier et al. 1992; Bingen et al. 1993; Gräser et al. 1993; Loudon et al. 1993; Schönian et al. 1993) wie auch für die Untersuchung der genetischen Beziehungen verschiedener Bakterien- und Pilzarten und deren Subspezies (Welsh et al. 1992; Cobb et al. 1993; Goodwin et al. 1993; Meyer et al. 1993; Meyer et al. 1993; Meyers et al. 1993; Van Belkum et al 1993) angewendet werden. Als Ursachen für die auftretenden Polymorphismen werden Punktmutationen, die Mismatche bei der Anlagerung der Primer zur Folge haben, Deletionen von "priming sites" oder Insertionen, die entweder zur Vergrößerung des DNA-Segments oder zur Verschiebung der "priming site" führen, so daß eine Amplifikation des entsprechenden Abschnitts nicht mehr möglich ist, diskutiert (Williams et al. 1990; Welsh et al. 1992).

Für die Typisierung der Dermatophyten mit dem PCR-Fingerprinting mußten zunächst geeignete Primer (siehe Tab. 7 ) ausgewählt und die Reaktions-bedingungen optimiert werden. Als Einzelprimer wurden beispielsweise die Core-Sequenz des Phagen M13 und die "simple repeat" -Sequenz (GTG)5 genutzt, die ursprünglich als Hybridisierungssonden beim konventionellen DNA-Fingerprinting angewandt wurden und die spezifisch Mini- und Mikrosatelliten-DNA nachweisen (Ali et al. 1986; Huey et al. 1989; Meyer et al. 1992). Außerdem wurden auch Primer verwendet, die von anderen Autoren für das PCR-Fingerprinting beschrieben wurden, wie die (AC)10-Sequenz (Niesters et al. 1993), das 10mer Oligonukleotid AP3 (Williams et al., 1990) und die T3B-Sequenz, die aus dem intergenischen Spacer in der tDNA stammt (McClelland et al. 1992).

Für die Typisierung mit dem PCR-Fingerprinting wurde die DNA aus Frühkulturen (1-2 Wochen) isoliert. Durch den Vergleich mit den PCR-Profilen charakterisierter Referenz-Stämmen konnten mit dieser Methode klinische Isolate sicher identifiziert werden.

Mit allen vier Fingerprinting-Primern [(GTG)5, (AC)10, (AP)3 und M13-core]


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wurden charakteristische und reproduzierbare Amplifikationsmuster für alle geprüften Spezies erhalten. Allerdings war der Differenzierungsgrad des DNA-Fingerprinting mit (GTG)5 nicht so optimal wie mit den anderen Primern. Dieser Primer konnte nicht zur Differenzierung von Trichophyton mentagrophytes und seinen Varianten herangezogen werden.

Drei Trichophyton- bzw. Microsporum- Isolate, die keine bzw. eine reduzierte Bildung von Makrokonidien auf Sabouraud- oder Malz-Agar zeigten, wurden mit dem PCR-Fingerprinting als Trichophyton tonsurans (A6), Trichophyton mentagrophytes var. granulosum (NB6) und Microsporum canis (NB3) richtig identifiziert. Weiterhin wurde der Stamm Trichophyton tonsurans var. sulfureum (CBS 933.73) mit dem PCR-Fingerprinting als Trichophyton rubrum identifiziert. Durch die Sequenzierung der Gesamt-ITS-Region konnte dieser Befund bestätigt werden.

Die Ähnlichkeit der Fingerprintingmuster bei den 3 Speziespaaren Trichophyton verrucosum und Trichophyton mentagrophytes var. Erinacei, Microsporum audouinii und Microsporum canis, Microsporum gallinae und Microsporum vanbreuseghemii deutet auf eine enge Verwandtschaft dieser Arten hin. Für Microsporum audouinii und Microsporum canis sind morphologische Ähnlichkeiten bekannt (De Hoog & Guarro 1995). Bei Trichophyton verrucosum und Trichophyton mentagrophytes var. erinacei handelt es sich um zoophile Erreger, die beide im Urease-Test negativ sind. Die Ähnlichkeit zwischen den zoophilen Microsporum gallinae und den geophilen Microsporum vanbreuseghemii bestätigt, daß die beide Spezies Anamorphe von Arthroderma grubyi sind.

1996 erhielten Liu et. al. charakteristische Fingerprinting-Banden bei 5 verschiedenen Dermatophytenspezies unter Verwendung eines 10-mer-Primers. Sie konnten Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes und Trichophyton tonsurans anhand ihrer Bandenmuster differenzieren, Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes und Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale konnten jedoch nicht unterschieden werden, während mit den von uns verwendeten Primern eine sehr gute Diskriminierung dieser Varianten erreicht werden konnte.


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Mit dem PCR-Fingerprinting war bei vielen Spezies eine Identifizierung auf Speziesebene möglich, manchmal konnten auch Varianten der gleichen Spezies diskriminiert werden. Als Beispiel dafür ist hier das PCR-Fingerprinting von Trichophyton mentagrophytes var. granulosum und Trichophyton mentagrophytes var. erinacei zu nennen. Andere Varianten (Trichophyton mentagrophytes var. nodulare und Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale bzw. Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes und Trichophyton mentagrophytes var. quinckeanum) zeigten jedoch identische Bandenmuster, was auf ihre enge Verwandtschaft untereinander schließen läßt. Dieses Ergebnis wurde durch die Sequenzanalyse der ITS-Region bestätigt, die eine Sequenzhomologie von 99,5% bei dem ersten Paar und von 99,9% bei dem zweiten Paar aufzeigte. Die anamorphe Art Trichophyton mentagrophytes stellt sich somit als heterogene Spezies dar, bei der die sexuell reproduktiven Formen von den unterschiedlichen teleomorphen Spezies, Arthroderma benhamiae, Arthroderma simii und Arthroderma vanbreusegehemii repräsentiert werden. Für die drei anthropophilen Spezies Trichophyton mentagrophytes var. nodulare, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale und Trichophyton mentagrophytes var. goetzii ist bis jetzt keine teleomorphe Form bekannt. Es scheint aber, daß Trichophyton mentagrophytes var. Interdigitale ein degenerierter Stamm von Arthroderma vanbreusegehemii ist (Mochizuki at al. 1996).

Die Differenzierung von Trichophyton rubrum und seiner Variante granulare von Trichophyton kanei, Trichophyton fischeri, Trichophyton violaceum, Trichophyton soudanense und Trichophyton megninii ist von den verwendeten Primern abhängig. Identische Bandenmuster wurden für diese Isolate mit dem Primer (AC)10 erhalten. Eine bessere Differenzierung gelang mit dem T3B-Primer, der ähnliche, aber unterscheidbare PCR-Profile lieferte ( Abb. 12 ), so daß eine enge Verwandtschaft dieser Spezies wahrscheinlich ist.

Auch Microsporum canis und seine Variante distortum, Microsporum audouinii und seine Varianten rivalierii und langeronii, Microsporum equinum und Microsporum ferrugineum zeigten sowohl mit dem (AC)10- als auch mit dem T3B-Primer eine große Übereinstimmung ihrer Fingerprintingmuster, die auch hier auf enge taxonomische Beziehungen zwischen ihnen schließen läßt. Microsporum cookei und Microsporum gallinae konnten sehr leicht identifiziert werden, da ihre


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PCR-Profile zahlreiche Unterschiede zu denen der anderen Microsporum-Arten aufwiesen.

Eine Diskriminierung der Trichophyton verrucosum- und Trichophyton tonsurans-Varianten war mit keinem der verwendeten Primer möglich. Die Sequenzierung der Gesamt-ITS-Region zeigte beim Vergleich von Trichophyton verrucosum und seiner Variante ochraceum nur eine Basendeletion. Die Variante ochraceum zeichnet sich durch morphologischen Unterschiede (verzögertes Wachstum und fehlende bzw. verzögerte Makrokonidienbildung) aus und ruft eine atypische Form der Trichophytie bei Rindern hervor, die auch bei Tieren, die mit einem Trichophyton verrucosum- Impfstoff immunisiert worden sind, auftritt und schwer therapierbar ist. Die identischen Bandenmuster beim Fingerprinting-PCR lieferten den Beweis, daß diese Unterschiede eher eine phänotyische Modifikation der gleichen Spezies als ein autonomes Taxon darstellen.

Die vorliegenden Ergebnisse stimmen mit den Angaben anderer Autoren (Mochizuki et al. 1990, Mochizuki et al. 1996, Liu et al. 1996) überein, die keine Intra-spezies-Polymorphismen bei klinischen Isolaten unterschiedlicher Trichophyton-Spezies beobachten konnten.

Die Fingerprinting-Profile der anamorphen Dermatophyten und ihrer dazugehörigen teleomorphen Formen waren immer ähnlich. Das ist nicht überraschend, da man sie als vegetative bzw. sexuelle Zustandsformen der gleichen Spezies betrachten kann.

Wie unsere Ergebnisse zeigen, ist das PCR-Fingerprinting eine wertvolle genotypische Methode, die die konventionelle Diagnostik der Dermatophyten supplementieren und bei der Identifizierung problematischer Vertreter der Familie Arthrodermataceae helfen kann. Diese Methode hat viele Vorteile:

  1. Sie ist ein billiges und einfaches Verfahren, welches nur ca. 10 bis 20 ng gereinigte DNA benötigt.
  2. In kurzer Zeit können eine große Anzahl von Isolaten typisiert werden.
  3. Man benötigt nur wenige biochemische und molekularbiologische Kenntnisse über die jeweiligen Erreger, eine vorhergehende Sequenzinformation ist nicht notwendig.

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  4. Es ist möglich, bei jedem Dermatophyten-Isolat die gleichen zufällig ausgewählten Primer einzusetzen. Es ist jedoch wünschenswert Primer mit einem bestimmten GC-Gehalt zu benutzen, da GC-reiche Sequenzen besser mit GC-reichen Primern amplifiziert werden können.

Darüberhinaus kann diese Methode einen Beitrag zur Reklassifizierung der Dermatophyten leisten.

Ein Nachteil des PCR-Fingerprinting besteht darin, daß die verwendete DNA hoch gereinigt sein muß, da Verunreinigungen mit Fremd-DNA oder auch Protein- und RNA-Kontaminationen die Reaktion mit dem unspezifischen Primer stören.

5.1.2. Epidemisches Vorkommen von Trichophyton tonsurans in Deutschland

Die Klassifikation der Dermatophyten in anthropophile, zoophile und geophile ist wichtig, um die Epidemiologie der Dermatophyten-Infektionen verstehen zu können. Die Einordnung trägt dazu bei, die Reservoire der Erreger zu beschreiben und geeignete therapeutische und antiepidemische Maßnahmen zu ergreifen. Viele Spezies der verschiedenen Gruppen können übereinstimmende klinische Symptome erzeugen (Murphy et al., 1993). Ein Beispiel ist die speziesübergreifende hohe Virulenz zoophiler Erreger, die insbesondere in den klinischen Verläufen eine eindrucksvolle Bestätigung findet.

Die geophilen Dermatophyten, d.h. im Boden lebende Dermatophyten, verursachen eher selten ausgeprägte Dermatomykosen. Solche Erkrankungen sind vor allem für Microsporum gypseum beschrieben.

Die zoophilen Dermatophyten sind demnach klinisch und therapeutisch wichtiger als die anthropophilen. Bei einer Infektion verursachen sie eine starke Entzündungsreaktion und sind im Gegensatz zu den anthropophilen Erregern enorm kontagiös, was wiederum epidemiologisch relevant ist

Trichophyton mentagrophytes var. granulosum, Trichophyton verrucosum und Microsporum canis sind die wichtigsten zoophilen Dermatophyten, die auch den Menschen befallen und teils ausgedehnte Infektionen hervorrufen können.


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Trichophyton verrucosum hat überwiegend Bedeutung als Erreger bei den Rindern. (Segal 1989). Microsporum canis kommt gewöhnlich als Erreger bei Katzen und Hunden vor, von wo er dann auf den Menschen, besonders auf Kinder, die ständig mit ihren Haustieren spielen, übertragen werden kann (Ginter 1996).

Die anthropophilen Dermatophyten werden von Mensch zu Mensch durch den Kontakt mit infizierten Hautschuppen eines Infektionsträgers verbreitet. Zu diesen Erregern gehören Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton violaceum, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale und Epidermophyton floccosum.

In den letzten Jahrzehnten sind die früher bei Kindern dominierenden Microsporum audouinii-Infektionen vom “black dot ringworm“ durch Trichophyton tonsurans verdrängt worden (Babel et al. 1990). In Deutschland galt dieser Erreger jedoch als “beinahe ganz verschwundener“ Dermatophyt (Rieth.1976). Zu verschiedenen Zeiten wurde eine zunehmende epidemische Verbreitung von Trichophyton tonsurans beobachtet, vor allem in den USA (Bronson et al. 1983, Stiller, 1993 ,Aly 1994, Ginter 1996, Frieden & Howard 1994). Dort beobachtete man bei den Ringern eine Epidemie von Tinea corporis gladiatorum, die durch diesen Erreger verursacht wurde (Stiller et al. 1993). Auch Arnow et al. (1991) beschrieben eine Epidemie von Trichophyton tonsurans bei Klinikpersonal, die von einem für 5 Wochen undiagnostiziert infizierten Patienten verursacht wurde. In den benachbarten mitteleuropäischen Länder trat dieser Erreger gelegentlich epidemisch in Erscheinung. Ein Beispiel ist hier die im Jahre 1992 ausgebrochene Trichophyton tonsurans-Epidemie bei 23 polnischen Dorfkindern (Fitowski & Ratka 1992). Die Dermatomykosen, besonders die Tinea capitis, tritt bei Frauen häufiger auf als bei Männern. In manchen Fällen war das Verhältnis sogar 9:1 (Aly 1994, Ginter 1996). Der Grund dafür liegt offenbar darin, daß Frauen mehr Kontakte zu Kindern haben (Aly 1994).

In der vorliegenden Arbeit war vor allem der aktuelle epidemiologische Aspekt des Auftretens von Trichophyton tonsurans-Infektionen bei Ringern von besonderem Interesse.


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Anhand molekularbiologischer Untersuchungen durch PCR-Fingerprinting und ITS-Sequenzanalyse konnten wir zeigen, daß die zu überprüfenden Proben zur Spezies Trichophyton tonsurans gehörten. Ob die gesamte Epidemie in Deutschland durch eine Infektionsübertragung aus Amerika entstanden ist, bleibt fraglich, obwohl die Sequenzanalyse der Gesamt-ITS-Region der Erreger bei unseren Patienten ergab, daß diese Sequenzen eine große Homologie zu Trichophyton tonsurans var. sulfureum zeigten, die als prädominierende Trichophyton tonsurans-Variante in der USA gilt (Sharma et al. 1988).

Die meisten unserer Patienten waren Kinder bzw. Schüler, die in ihrer Freizeit regelmäßig Sport in verschiedenen Ringervereinen trieben. Nach Auskunft der Patienten gab es keine Kontakte zueinander, aber innerhalb der Vereine wurden ähnliche Hauterscheinungen bei den Trainingskameraden beobachtet. Zwei der Ringer waren schon einmal bei einem internationalen Wettbewerb in der USA gewesen, wo sie sich möglicherweise mit dem Erreger infiziert haben können. Somit deutet alles auf Infektionen durch unabhängige Infektionsquellen hin. Eine Ausnahme stellte ein junges Mädchen dar, das sich während ihres Urlaubs in der USA mit dem Erreger infizierte. Bei ihrer Rückkehr wurde die Infektion auf ihre jüngere Schwester übertragen, die wiederum ihre Freundin damit infizierte.

Damit wird die Meinung von De Hoog (MYK 97, in Aachen) bestätigt, daß die zunehmend importierten Mykosen in Europa nicht nur auf die größeren Zahlen an Einwanderern, sondern auch auf Fernurlaube europäischer Touristen zurückzuführen sind. Die meisten der infizierten Patienten in unserer Studie waren Kindern im Alter von 7 - 14 Jahre. Das könnte daran liegen, daß die Haut der Kinder eine besondere Prädisposition für die Erkrankung besitzt. Deshalb sollte auch bei teilausgedehnten Fällen eine systematische Therapie mit Grisofulvin bzw. Fluconazol durchgeführt werden (Jacobs 1990, Lopez-Gomez et al. 1994, Elewski 1994). Sportarten, bei denen körperliche Kontakte oft vorkommen, wie bei den in dieser Arbeit untersuchten Ringern, stellen ein erhöhtes Ansteckungsrisiko dar. Hierbei können die engen körperlichen Kontakte zu kleinen Verletzungen (Mikrotraumata) und zu einer Vermischung von Schweißflüssigkeiten führen, die die Übertragung des Erregers begünstigen. In vielen Fällen konnte der Erreger sogar aus den Sportmatten bei Ringervereinen isoliert werden. Eine Verbreitungsgefahr des Erregers ist besonders bei Kindern


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gegeben, weil diese Patienten im Alltag in ihrer Beziehung zur Außenwelt verschiedenartige Kontaktmöglichkeiten (z.B. Schulen, Kindergärten und Sportplätze) ausgesetzt sind.

5.2. Sequenzdatenanalyse und Phylogenie der Dermatophyten

5.2.1. Amplifizierung und Sequenzierung der ITS-Regionen

Bei der Translation der mRNA und bei der Weiterverarbeitung von RNA-Vorläufermolekülen wirkt ein umfangreiches Inventar an RNA-Molekülen mit. Viele der rRNA- und tRNA-Moleküle werden in relativ großen Mengen gebraucht. Dieser hohe Bedarf wird häufig durch eine entsprechend große Genzahl gedeckt (Singer & Berg 1992).

Die zwei hochmolekularen zytoplasmatischen rRNA-Moleküle (18S- und 26S-rRNA) einschließlich der zwischen ihnen liegenden 5.8S-rRNA werden in allen eukaryontischen Zellen durch die Polymerase I als ein Molekül transkribiert (Raué & Planta 1991), während die 5S-rRNA wie die tRNAs durch die Polymerase III synthetisiert wird. Im eukaryontischen Genom findet man bis zu mehrere hundert Kopien der rRNA-Gene. Bei eukaryonten Miroorganismen besteht das gesamte ribosomale Operon aus den Genen für die 18S- (ssu rRNA), 5.8S- und 26S-RNA (lsu rRNA), die durch zwei nichtkodierende Spacer (internal transcribed spacer, ITS 1 und ITS 2) getrennt sind. Außerdem sind vor dem Gen für die ssu rRNA sowie hinter dem Gen für die lsu rRNA weitere nichtkodierende Abschnitte vorhanden, die externen transkribierten Spacer (ETS). Die Kopien der rRNA-Transkriptionseinheiten, die durch den nichttranskribierten intergenischen Spacer (IGS) getrennt sind, liegen gehäuft in langen, direkten Tandem-sequenzwiederholungen auf einem oder verschiedenen Chromosomen. Das primäre Transkriptionsprodukt (prä-rRNA) enthält noch die ITS-und ETS-Sequenzen und wird später durch spezifische endonukleolytische Spaltungen und anschließende Methylierung an Basen und 2´-Hydroxyl-Gruppen der Ribose in reife Moleküle umgewandelt. Bei diesem Processing assoziieren die ribosomalen


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Proteine mit den Prä-rRNA. Am Ende dieses Prozesses entstehen die reifen 40S- und 60S- ribosomalen Untereinheiten (Sollner-Webb & Mougey 1991).

Die Funktion der ITS-Regionen wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht. 1989 entwickelten Musters et al. ein System (tagged ribosome) in Saccharomyces cerevisiae, das die Identifizierung von cis-aktiven Elementen erlaubt, die bei dem Processing eine Rolle spielen, und das die Funktion von rRNA-Sequenzen durch eine in vivo Mutationsanalyse untersucht. Dieses System basiert auf der Verwendung von in Plasmid klonierten rRNA-Einheiten. Diese Autoren konnten zeigen, daß die Deletion von verschiedenen Teilen der 5´ ETS- oder von Teilen der ITS1-Region die Reifung der 18 S rRNA verhindert; die Reifung der 26S rRNA war davon nicht betroffen (Musters et al. 1990a). Bei einer Deletion größerer Teile der ITS2-Region oder bei deren vollständiger Entfernung wurde keine reife 26S rRNA gebildet; die Reifung der 18 S rRNA war dadurch nicht beeinflußt (Carine 1992). Bei Mutanten, die eine Deletion am 3´-Ende der ITS 2 besaßen, war die Entstehung reifer 26 S rRNA-Moleküle jedoch nicht beeinträchtigt ( Musters et al. 1990b). Es konnte gezeigt werden, daß die Nukleotidfolge 1-153 in der ITS2, nicht aber die nachfolgenden Basen (153-235), für das effiziente Reifen der 26 S rRNA verantwortlich ist.

1990 haben Lee et. al. ein Sekundärstruktur-Modell (Secondary structure elements) für die ITS 1 in Saccharomyces cerevisiae entwickelt. Dieses Modell basiert im Vergleich zu den anderen Modellen nicht nur auf theoretischen Kalkulationen, sondern auch auf experimentellen Daten. Nach dem vorgeschlagenen Modell von Yeh & Lee 1990 würde jede Deletion das Falten des Spacers stark beeinflussen; derartige Veränderungen der Sekundärstruktur in der ITS würden sich auf die Effizienz der rRNA-Reifung auswirken.

In der vorliegenden Arbeit wurden zur Amplifizierung der ITS-Regionen unterschiedlicher Dermatophytenspezies vier verschiedene Universal-Pilz-Primer verwendet. Diese Primer wurden 1990 von White et. al publiziert, und später von Vigalys (persönliche Mitteilung) teilweise modifiziert.

Die Gesamt-ITS-Region der Dermatophyten wies einen hohen GC-Gehalt von 53-63,9% im Vergleich zu anderen nahestehenden Pilzspezies wie Chrysosporium keratinophilum (50,1%) und Arachinotus ruber (54,7%) auf. Der Vergleich der


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ITS-Sequenzen unterschiedlicher Dermatophytenarten (siehe Anhang A) ergab, daß die ITS 1-Region tatsächlich sowohl größer als auch variabler als die ITS 2-Region war. Beide ITS-Regionen zeigten unterschiedlich lange konservierte Abschnitte, die von variablen Abschnitten unterbrochen wurden. Die Tatsache, daß viele dieser konservierten Regionen in allen Spezies vorkommen, deutet auf eine mögliche Funktion dieser Sequenzen beim Reifen der rRNA hin. Es könnte z.B. möglich sein, daß an diesen Stellen das Herausschneiden der Spacer erfolgt. Da bei der Sequenzierung der ITS-Regionen von Vertretern anderer Pilzfamilien (Chrysosporium keratinophilum, Familie Onygenaceae und Arachinotus ruber, Familie Gymnoascaceae) zahlreiche Unterschiede in den konservierten Regionen gefunden wurden, könnten diese Sequenzen auch zur Entwicklung von spezifischen Primern bzw. Sonden verwendet werden, um die Dermatophyten von diesen nahverwandten Pilzen zu diskrimieren. Andererseits könnte die Variabilität in den ITS-Regionen genutzt werden, um spezifische Sonden zur Identifizierung ausgewählter Spezies innerhalb der Dermatophyten herzustellen.

Um eine quantitative Analyse der ITS-Sequenzen zu ermöglichen, wurde ein Variablitätsindex berechnet, der die prozentualen Unterschiede in der Basenzusammensetzung bei jeweils zwei miteinander verglichenen Dermatophytenisolaten ausdrückt. Der Variationsindex innerhalb einer Spezies bzw. zwischen den Anamorphen und den jeweiligen Teleomorphen schwankte zwischen 0,0 - 2,7%. Ein Index von 2,7% wurde daher als Grenzwert für Intraspezies-Variationen festgelegt. Im Vergleich zu Trichophyton rubrum wiesen die Spezies Trichophyton kanei, Trichophyton fischeri, Trichophyton violaceum, Trichophyton soudanense und Trichophyton megninii nur geringere Sequenzunterschiede auf; der Varia- tionsindex lag mit Werten von 0,0-2,7% im Bereich der für Vertreter der gleichen Spezies erhaltenen Werte. Innerhalb dieser Speziesgruppe wurden die höchsten Indices von 2,9% bei dem Vergleich von Trichophyton violaceum mit Trichophyton kanei bzw. mit Trichophyton megninii bestimmt, was für eine enge Verwandtschaft der oben genannten Spezies spricht. Diese Ergebnisse werden auch durch die morphologischen Ähnlichkeiten unterstützt (siehe Seite 103).

Ein ähnliches Resulat wurde für Microsporum canis und seine Variante distortum, Microsporum audouinii und seine Varianten rivalierii und langeronii, Microsporum


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equinum, Microsporum ferrugineum und Arthroderma otae gefunden. Diese Spezies zeigten alle untereinander sehr geringe Sequenzunterschiede (Variationsindex 0,0-2,7%) (siehe Seite 104).

5.2.2. Phylogenie der Dermatophyten

Die bisherige traditionelle Taxonomie beruht hauptsächlich auf den Wachstums-eigenschaften der Dermatophyten, auf ihrer mikroskopischen und makroskopischen Morphologie und auf wenigen physiologischen Eigenschaften. Das Kreuzungsverhalten kann nur selten zu ihrer Identifizierung beitragen, da für viele der anamorphen Spezies (besonderes bei den anthropophilen Trichophyten) der zur sexuellen Vermehrung benötigte teleomorphe Partner nicht bekannt ist. Seit den 60-iger Jahren wurde versucht, die Analyse der Proteine, insbesondere der Enzyme, zur Klärung der taxonomischen Beziehungen innerhalb der Dermatophyten einzusetzen (Schechter et al. 1968, Jones & Noble 1982, Jeffries et al.1984, Symoens et al. 1989). In den 80-iger Jahren wurde zu diesem Zweck besonders die Fettsäure-Analytik mittels Gas-Chromatographie benutzt (Jeffries et al. 1984, Jones & Noble 1981, Sekhon & Carmichael 1972, Swenson & Ulrich 1980).

In einer Studie über die Zusammensetzung der chromosomalen DNA von 34 verschiedenen Dermatophyten-Spezies stellten Davidson et al. (1980) einen GC-Gehalt von 48,7-50.0 % fest. Sie nutzten ihre Ergebnisse über die DNA-Homologien für Aussagen zur Taxonomie der Dermatophyten, wobei alle Spezies mit DNA-Homologien von 65-80% in die gleiche Gattung eingeordnet wurden (Davidson & Mackenzie 1984).

Seit dem Ende der 80-iger Jahre wurden zur Klärung der taxonomischer Fragestellungen die mitochondriale DNA und später die rRNA-Gene verwendet (De Biévre et al. 1987, Ishizaki et al. 1993, Kawasaki et al. 1992, 1995, Mochizuki et al. 1990, Nishio et al. 1993, Leclerc et al. 1994, Harmsen et al. 1995). Insbesondere die rRNA wird oft für Untersuchungen zur molekularen Systematik verwendet, weil sie bei allen Organismen vorkommt, homologe Sequenzen besitzt und wie ein Einzelkopie-Gen envolviert (Bruns et al. 1991, Seifert et al. 1995). Innerhalb des rRNA-Genclusters gibt es Regionen, die in


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unterschiedlichem Tempo evolvieren, so daß man in Abhängigkeit von der interessierenden taxonomischen Ebene unterschiedliche Sequenzen in der rDNA auswählen kann. Die hochkonservierten Abschnitte der rRNA gehören zu den am stärksten konservierten Sequenzen, die bisher bekannt sind (Gerbi 1985). Die variablen Abschnitte in den rRNA-Genen lieferten gute Ergebnisse für die Klärung der phylogenetischen Beziehungen der Pilze bis auf die Gattungsebene (Bowmann et al. 1992, Harmsen et al. 1995) Für bestimmte Fragestellungen reicht die Variabilität der 5S-, 25S- und 18S-rRNA-Gene jedoch nicht aus. Als Alternative wurde in verschiedenen Untersuchungen bei Pilzen die ITS-Regionen analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß diese Regionen besonders geeignet für phylogenetische Untersuchungen innerhalb von Gattungen und auf Artebene sind. Die Heterogenität der ITS-Sequenzen ist von Gattung zu Gattung unterschiedlich [ (Mykorrhiza-Pilze, Laccaria) Grades & Bruns1993, (Oomyceten, Peronospora) Wiglesworth et al. 1991, (Oomyceten, Pythium) Chen et al. 1993, (Ascomyceten, Ophiostoma) Jeng et al. 1996, (Ascomyceten, Leptosphaeria) Morales et al. 1995].

Von verschiedenen Autoren wurden die Beziehungen zwischen den Dermatophyten sowie zwischen diesen und den übrigen Pilzfamilien innerhalb der Ascomyceten analysiert. Bowmann et al. konnten 1992 und 1996 zeigen, daß die 2 untersuchten Spezies der Familie Arthrodermataceae (Trichophyton rubrum und Ctenomyces serratus ) innerhalb der Ordnung Onygenales eine monomorphe Gruppe in Bezug auf Coccidiodes immitis, Blastomyces dermatitidis und Histoplasma capsulatum bildeten. 1994 fanden Leclerc et al., daß die geophilen Spezies der Familie Arthrodermataceae (wie Trichophyton terrestre, Trichophyton ajelloi und Chrysosporium keratinophilum) von den anthropophilen und zoophilen Dermatophyten separiert werden konnten, wobei die geophilen Vertreter der Familie Onygenaceae (Chrysosporium keratinophilum) und der Familie Gymnoascaceae (Arachinotus ruber) eng mit den geophilen Spezies Trichophyton terrestre und Trichophyton ajelloi verwandt waren. Aus diesem Grund wurden diese beiden Spezies als Außengruppen in der vorliegenden Arbeit ausgewählt. Harmsen et al. untersuchten 1995 in ihrer Analyse einige anthropophile, zoophile und geophile Spezies der Dermatophyten. Diese bildeten dann auch eine monomorphe Gruppe im Vergleich zu Coccidiodes immitis,


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Blastomyces dermatitidis und Histoplasma capsulatum. Beim Vergleich mit anderen pathogenen Pilzen zeigte diese Phylogeniestudie, daß die Dermatophyten innerhalb der filamentösen Ascomyceten eine monophyletische Gruppe bilden.

In der vorliegenden Arbeit wurden zur Klärung der phylogenetischen und taxonomischen Beziehungen innerhalb der Familie Arthrodermataecae die ITS-Regionen 1, 2 und das dazwischen liegende 5.8 S rRNA-Gen verwendet. Zur Analyse der Sequenzdaten wurden die Parsimony- und die Neighbor-joining-Distanz-Analysen benutzt. Dabei zeigten die Konsensusbäume mit beiden Methoden weitgehend übereinstimmende Ergebnisse.

In unserer Studie wird die Trennung der Dermatophyten von den Spezies anderer nahe stehender Familien wie der Onygenaceae (Chrysosporium keratinophilum) und der Gymnoascaceae (Arachniotus ruber) unterstützt und die oben erwähnte Einordnung von Leclerc und Harmsen bestätigt.

Die Konsensusbäume (Abb. 21a und 21b) zeigen, daß die Gattung Trichophyton innerhalb der Familie Arthrodermataceae polyphyletisch und die Gattung Microsporum paraphyletisch ist. Die zwei Spezies (stockdaleae und floccosum) der Gattung Epidermophyton lassen sich zwei phylogenetisch verschiedenen Gruppen zuordnen, was ihrem Vorkommen in der Umwelt entspricht. Der anthropophile Epidermophyton floccosum ist in einer Gruppe mit den anthropophilen und zoophilen Trichophyton-Spezies zu finden, während der geophile Epidermophyton stockdaleae enger mit den geophilen Dermatophytenarten verwandt ist. Daher kann man vermuten, daß diese beiden Spezies während der Evolution unabhänigig voneinander ihre Fähigkeit zur Bildung von Mikrokonidien verloren haben. Unsere Ergebnisse widersprechen der bisher beschriebenen Einteilung der Dermatophyten in 3 monophyletische Gruppen, die auf morphologischen Kriterien beruht.

Aufgrund unserer Daten wurden die geophilen Trichophyton-Spezies (mit Ausnahme von Trichophyton fischeri) mit 89 bzw. 96%iger Bootstrap-Unterstützung von den anderen Dermatophyten Spezies getrennt. Dieser Befund stimmt mit den Ergebnissen der Analyse von Leclerc et al. (1994) auf der Basis


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der 25S rRNA-Sequenzen überein. Auch eine Restriktionsanalyse der mtDNA von Arthroderma quadrifidum, und Arthroderma insingulare, den teleomorphen Formen von Trichophyton terrestre, zeigte größere Unterschiede im Vergleich zu anderen Dermatophyten-Spezies (Kawasaki et al. 1992). In unserer Untersuchung war die zoophile Art Trichophyton equinum die einzige nichtgeophile Spezies dieser Gruppe. Das verwendete Isolat stammt aus einem nichtinfizierten Pferd, das möglicherweise zufällig kontaminiert war. Eine falsche Zuordnung als nicht-geophil kann in diesem Fall daher nicht ausgeschlossen werden.

Unsere Ergebnisse lassen auch vermuten, daß sich die Microsporum- und die Trichophyton- Spezies von den geophilen Spezies entwickelt haben.

Die Vermutung von George et al. (George et al 1962 ), daß Arthroderma grubyi zwei Anamorphe (Microsporum vanbreuseghemii und Microsporum gallinae) besitzt, wird durch unsere Befunde bestätigt. Daß der anamorphe Trichophyton terrestre neben Arthroderma quadrifidium eine zweite teleomorphe Form Arthroderma insingulare besitzt, wird jedoch durch unsere Daten nicht unterstützt. Beide geophilen Teleomorphe (Tab. 4.5) unterscheiden sich gravierend sowohl in ihrem PCR-Fingerprintingmuster als auch durch ihre ITS-Sequenzen (Variationsindex 16,6%).

Unsere Ergebnisse weichen teilweise von der konventionellen Klassifizierung der Dermatophyten ab, stimmen jedoch gut mit neuen taxonomischen Hypothesen anderer Autoren überein (Biévre et al. 1987, Ishizaki et al. 1993, Kawasaki et al. 1992, 1995, Mochizuki et al. 1990, Nshio et al. 1993, Leclerc et al. 1994, Harmsen et al. 1995). Vielleicht können unsere Befunde ein weiterer Anlaß dazu sein, die bisher gültige Klassifizierung der Dermatophyten zu überprüfen.

5.2.2.1. Trichophyton mentagrophytes-Komplexe

Die Analyse der ITS-Sequenzen und der PCR-Fingerprintingdaten (Abb. 10 und 11) ergab, daß Trichophyton mentagrophytes und seine 6 Varianten sich 3 verschiedenen Komplexen zuordnen lassen. Während die ITS-Sequenzen innerhalb der Komplexe nur geringe Unterschiede aufwiesen (bis zu 0,7% in Komplex I, 0,2% in Komplex II und 2,1% in Komplex III), waren die beim


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Vergleich der unterschiedlichen Komplexe bestimmten Variationsindices deutlich höher: 3,6 beim Vergleich der Komplexe I und II, 10,7 bei den Komplexen I und III sowie 11,6 bei den Komplexen II und III. Daraus kann man den Schluß ziehen, daß diese Komplexe eventuell unterschiedliche Spezies repräsentieren und daß die bisherige Taxonomie der Trichophyton mentagrophytes-Gruppen unter Beachtung der morphologischen und biochemischen Merkmale überprüft werden müßte.

Die zoophilen Trichophyton mentagrophytes var. erinacei und Trichophyton mentagrophytes var. granulosum (Komplex III) sind dabei enger mit Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum var. ochraceum, Arthroderma benhamiae und Trichophyton concentricum verwandt als mit den anderen Trichophyton mentagrophytes- Varianten. Unsere Einteilung wird auch dadurch gestützt, daß Trichophyton verrucosum ein zoophiler Erreger ist, Arthroderma benhamiae als der Paarungspartner von Trichophyton mentagrophytes var. granulosum identifiziert wurden (Takashio 1977) und die morphologische Identifizierung von Trichophyton concentricum wegen der fehlenden Sporenbildung oft sehr schwierig ist.

Die enge Verwandtschaft von Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes und Trichophyton mentagrophytes var. quickeanum (Komplex II) in Bezug auf Trichophyton schoenleinii wird durch das ähnliche PCR-Fingerprintingsprofil und die geringen Unterschiede in den ITS-Sequenzen (Variationsindex 0,7 - 1,1) bestätigt. Es ist bekannt, daß die Trichophyton mentagrophytes pleomorph sind (Basitis 1960), so daß einige Isolate (Nachkommen) sehr schwer klassifizierbar sein können und die Kulturen steril (ohne Konidien) bzw. myzelartig wachsen (Weitzman 1964). Das gleiche gilt auch für Trichophyton schoenleinii. Er wächst myzelartig ohne Mikro- oder Makro-Konidien, aber mit Chlamydosporen. Bei den biochemischen Untersuchungen unterscheidet er sich von Trichophyton mentagrophytes nur durch den negativen Haar-Performationstest (Meinhof 1990, De Hoog & Guarro 1995). Unsere Ergebnisse lassen vermuten, daß Trichophyton schoenleinii aus diesem Trichophyton mentagrophytes-Komplex II stammt. Die von uns gefundene Gruppierung der Trichophyton mentagrophytes-Spezies befindet sich in völliger Übereinstimmung mit den von Nishio et al. (1992) publizierten Ergebnissen der Restriktionsenzymanalyse der mtDNA.


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5.2.2.2. Trichophyton rubrum-Komplex

Trichophyton rubrum und seine Variante granulare, Trichophyton fischeri, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton soudanense und Trichophyton violaceum bilden eine eng verwandte Gruppe, was durch identische bzw. ähnliche DNA-Fingerprintingprofile (Abb. 11) und eine große Ähnlichkeit der ITS-Sequenzen (Variationsindex 0,0-2,7) belegt wird (Tab. 4.6). Daß Trichophyton soudanense und Trichophyton violaceum in diese Gruppe gehören, wurde von anderen Autoren teilweise bestätigt (Leclerc et al. 1994, Harmsen et al. 1995). Mit der Ausnahme der geophilen Spezies Trichophyton fischeri sind alle anderen Arten anthropophile Erreger. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, daß die Spezies in der oben genannten Gruppe Varianten von Trichophyton rubrum darstellen. Die Identität der Restriktionsenzymlängenpolymorphismen von Trichophyton rubrum und Trichophyton raubitschekii ließ 1993 Ishizaki ähnliche Vermutungen äußern (Ishizaki 1993). Das einzige Unterscheidungsmerkmal von Trichophyton fischeri gegenüber Trichophyton rubrum (Variationsindex 0,0%) ist das Fehlen der roten Pigmentierung auf der Kolonieunterseite bei Anzucht auf “Cornmeal- Agar“ (CMA) (Kane 1977). Nishio et al. berichteten 1992 von klinischen Trichophyton rubrum- Isolaten, die ebenfalls unpigmentiert waren. Bisher wurde Trichophyton fischeri nur als Kontaminante gefunden; ob er auch das Potential hat, zu infizieren, ist noch unklar. Trichophyton kanei unterscheidet sich von Trichophyton rubrum (Variationsindex 0,2%) nur durch das Fehlen von Mikrokonidien und den positiven Urease-Test. Auch Trichophyton megninii (Variationsindex 1,6%), als Erreger von Onychomykosen und Tinea barbae beschrieben, zeigt eine weitgehend ähnliche Morphologie wie Trichophyton rubrum. Er kann jedoch anhand des positiven Urease-Tests und seiner Wachstumsabhänigkeit von L-Histidin differenziert werden (Meinhof 1990). Trichophyton soudanense (Variationsindex 1,6%) ist wie Trichophyton rubrum im Urease- und Haarperforations-Test negativ. Er kann aber leicht durch sein langsames Wachstum und seine auffälligen reflexiven Seitenhyphen identifiziert werden. Trichophyton violaceum wird als der Trichophyton rubrum Afrikas bezeichnet (Tietz, persönliche Mitteilung). Trichophyton violaceum, wie auch Trichophyton megninii und Trichophyton soudanense, kommen nur in warmen Regionen vor , wobei Trichophyton soudanense fast ausschließlich in Afrika


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gefunden wird. Ob die im Vergleich zu Europa höhere Temperatur oder die Hautbeschaffenheit der afrikanischen Völker eine Rolle bei dieser Verbreitung spielt, bleibt fraglich.

Weitere Untersuchungen unter Einbeziehung einer größeren Anzahl von Isolaten müssen zeigen, ob die bisherige Einteilung in unterschiedliche Spezies beibehalten werden soll und es sich bei den von uns untersuchten Isolaten um degenerierte Stämme handelt oder ob diese Arten eher als Varianten von Trichophyton rubrum betrachtet werden sollten.

5.2.2.3. Microsporum canis-Komplex

1995 berichteten Kawasaki et al., daß Microsporum canis var. distortum, Microsporum audouinii und seine Varianten, Microsporum equinum, Microsporum ferrugineum und Arthroderma otae eng miteinander verwandt sind und eine Auflösung zwischen diesen Stämmen nicht möglich war. Unsere Befunde bestätigen im wesentlichen diese Ergebnisse mit 69%- bzw. 100%-igem Bootstrapwert (Abb. 21a und b). Basierend auf den Unterschieden in den ITS- Sequenzen konnte jedoch sowohl in der Parsimony- als auch in der Neighbor-Joining-Analyse eine Diskriminierung zwischen den oben genannten Spezies erreicht werden (Abb. 23a und b). Ihre enge Verwandtschaft äußert sich jedoch auch in ähnlichen morphologischen und physiologischen Eigenschaften. Microsporum canis, seine Variante distortum und seine teleomorphe Form Arthroderma otae können z.B. von Microsporum audouinii und seinen Varianten, Microsporum equinum, Microsporum ferrugineum nur durch den positiven Urease- und Haarperforations-test unterschieden werden (De Hoog & Guarro 1995).

Die Einordnung von Arthroderma otae in diese Gruppe ist nicht überraschend, da diese Spezies die teleomorphe Form von Microsporum canis und Microsporum canis var. distortum darstellt (Matsumoto et al. 1983). Kreuzungsversuche zwischen Microsporum equinum und Arthroderma otae blieben erfolglos (Padhye et al. 1979, Kane et al. 1982, Takatori & Hasegawa 1985). Die von uns bestimmten identischen bzw. ähnlichen PCR-Fingerprinting-Profile und die


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geringen Unterschiede in der ITS-Sequenz dieser Spezies unterstützen die Hypothese von DeHoog&Guarro (1995), daß Microsporum equinum als Variante von Microsporum canis angesehen werden sollte. Mit Ausnahme des zoophilen Microsporum equinum verursachen alle anderen Spezies dieser Gruppe Tinea capitis beim Menschen. Dies gilt auch für den zoophilen Microsporum canis, wobei er stärker inflammatorische und weniger chronische Erkrankungen als Microsporum audouinii hervorruft.

Unsere Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß der Microsporum canis-Komplex überklassifiziert ist und daß es sich bei den unterschiedlichen Spezies dieses Komplexes eher um Varianten von Microsporum canis handelt.

5.3. Identifizierung der Trichophyton rubrum durch die Hybridi- sierung mittels TR20S-Sonde.

Trichophyton rubrum ist ein anthropophiler Erreger und gehört zu den am häufigsten isolierten Spezies bei Nagel- und Hautmykosen. Der Verlauf seiner Ausbreitung in Europa ist sehr interessant. Zum ersten Mal wurde er hier im Jahre 1937 isoliert (Binazze et al. 1983). Während des Zweiten Weltkriegs und des darauffolgenden instabilen Zeitraums ist er vermutlich aus dem Fernen Osten nach Europa und in die USA eingeschleppt worden (English 1980).

Trichophyton rubrum verursacht in Ostasien und im pazifischen Raum meist Tinea corporis (Else 1995). In Europa wird er mit über 90% besonders häufig bei Onychomykosen isoliert (Tietz et al. 1994). Fast in allen europäischen Ländern konnte sich Trichophyton rubrum behaupten und oft sogar die früher dominierenden Erreger verdrängen (Else 1995).

Die konventionelle kulturelle Identifizierungsmethode für Trichophyton rubrum ist sehr zeitaufwendig (ca. 4 Wochen) und aufgrund des häufigen Fehlens typischer phänotypischer Merkmale, wie der Pigmentbildung, unsicher. Bei den Onychomykosen können ca. 30% der mikroskopisch positiven Befunde kulturell nicht bestätigt werden. Verwechslungen mit der pigmentlosen Variante interdigitale von Trichopyhton mentagrophytes können vorkommen. Die Notwendigkeit einer exakten Differenzierung beider Spezies ergibt sich vor allem


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aus der sehr hohen minimalen Hemmkonzentration von Trichophyton mentagrophytes-Isolaten gegenüber Griseofulvin und anderen Azol-Antimykotika im Vergleich zu Trichophyton rubrum.

Bisher wurden in der Literatur verschiedene Primer-Systeme entwickelt, mit denen sich in der PCR Dermatophyten, aber auch Hefe und Schimmelpilze nachweisen lassen (Bock, et al. 1994, Makimura et al. 1994a, Makimura et al. 1994b). Speziesidentifizierungen bei den Dermatophyten waren mit den beschriebenen Verfahren jedoch nicht möglich.

In der vorliegende Arbeit konnte durch die Hybridisierung der TR20S-Sonde an die amplifizierte ITS-Region eine Identifizierung auf der Speziesebene für Trichophyton rubrum etabliert werden.

Ein Sequenzvergleich der beiden für die Amplifizierung der ITS publizierten Primer LR1 und SR6R zeigte große Homologien zu den in der Datenbank erfaßten Pilzsequenzen, aber auch zu Sequenzen der humanpathogenen Protozoen der Gattung Leishmania, die ebenfalls Hautinfektionen hervorrufen können. Das konnte durch eine Amplifizierung von Leishmania-Sequenzen mit den Primern LR1 und SR6R bestätigt werden.

Da diese Identifizierungsmethode für eine schnelle Diagnostik von Trichophyton rubrum in Labors und Kliniken entwickelt werden sollte, mußte eine anwenderfreundliche nichtradioaktive Markierung der Sonde (Digoxigeninmarkierung) etabliert werden. Durch den Nachweis positiver Hybridisierungssignale nur bei den Trichophyton rubrum-Stämmen sowie seinen möglichen Varianten konnte gezeigt werden, daß die TR20S-Sonde für Trichophyton rubrum spezifisch war.

Da die Primer LR1 und SR6R humane DNA nicht amplifizieren, sollte diese Methode zur direkten Identifizierung von Trichophyton rubrum in klinischen Materialien wie Haut, Haar und Nägeln, auch wenn eine Mischinfektion vorliegt, angewendet werden.

Das in der vorliegenden Arbeit entwickelte Nachweissystem für Trichophyton rubrum bietet noch weitere Vorteile:


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  1. Bereits nach der Amplifikation der ITS-Region konnte man anhand unterschiedlicher Amplifikatgrößen andere Dermatophyten-Spezies (Microsporum- und Epidermophyton-Gattung) wie auch andere potentielle Infektionserreger ausschließen.
  2. Bei einer vergleichbaren Amplifikatgröße (wie bei einigen Spezies innerhalb der Trichophyton-Gattung) erbrachte die Detektion mit der Sonde die absolute Ergebnissicherheit. Die Hybridisierung führte dabei nicht nur zu einer verbesserten Spezifität, sondern auch zu einer höheren Sensitivität des Nachweises.

Für die Etablierung der TR20S-Sonde für die Schnelldiagnostik von Trichophyton rubrum mußten drei Kriterien erfüllt werden.

  1. Entwicklung einer DNA-Extraktionsmethode aus Patientenmaterial,
  2. Testen der Sondenspezifität,
  3. Einführung einer effektiven nichtradioaktiven Detektion.

In der vorliegenden Arbeit konnten die letzten beiden Punkte erfolgreich gelöst werden. Probleme traten bei der DNA-Isolierung aus Patientenmaterial auf. Während die Dermatophyten -DNA aus infizierten Hautproben erfolgreich extrahiert werden konnte, bereitete der Zellaufschluß in den Nagelproben große Schwierigkeiten, die bisher noch nicht überwunden werden konnten. Vielleicht kann eine kurze Inkubation der Erreger in flüssigem Nährmedium zur Lösung des Problems beitragen. Eine andere Möglichkeit bestünde darin zu prüfen, ob eine fluoreszenzmarkierte TR20S-Sonde in einer in-situ-Hybridisierung auf Objektträgern eingesetzt werden könnte. Auch bei diesem Verfahren müßte jedoch zunächst das Problem des Zellaufschlusses bei den Dermatophyten gelöst werden.


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