El Fari, Mustafa: Untersuchungen zur Taxonomie und Phylogenie der Familie Arthrodermataceae (Dermatophyten) und Entwicklung einer spezifischen Sonde für Trichophyton rubrum.
Untersuchungen zur Taxonomie und Phylogenie der Familie Arthrodermataceae (Dermatophyten) und Entwicklung einer spezifischen Sonde für
Trichophyton rubrum.
D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat. )
im Fach Mikrobiologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biologe Mustafa El Fari ,
geboren am 03. 01. 1967 in Rafah / Gaza-Streifen

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h. c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. W. Presber
Prof. Dr. T. Börner
Prof. Dr. H. De Hoog

Tag der mündlichen Prüfung: 12.10.1998

ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit den Problemen der Taxonomie und Phylogenie sowie der Identifizierung der Familie Arhrodermataceae (Dematophyten).

Da die konventionelle Identifizierungsmethode der Dermatophyten bis heute ein Problem darstellt, wurde hier zur Lösung der Fragestellungen die Geasamt-ITS Region (Internal Transcribed Spacer) und das PCR-Fingerprinting verwendet.

Zur Analyse der Taxonomie und Phylogenie wurde die Gesamt-ITS-Region von 72 Arthrodermataceae-Isolaten mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Ausgehend von den Sequenzdaten wurden phylogentische Stammbäume mittels Parsimonie- und Neigbour-Joining-Analysen generiert.

In den beiden Analysen bildeten die Dermatophyten eine monomorphe Gruppe mit Arachniotus ruber und Chysosporium keratinophilum als Außengruppen. Dabei war die Gattung Trichophyton polyphyletisch und die Gattung Microsporum paraphyletisch. Die Vertreter der Gattung Epidermophyton wurden in weit entfernten Gruppen gefunden. Die 6 T. mentagrophytes Varianten bildeten in der Analyse 3 Komplexe, die eine enge Verwandtschaft zu anderen Spezies der Familie Arthrodermataceae zeigten.

T. rubrum seine Variante granulare, T. fischeri, T. kanei, T. megninii, T. soudanense und T. violaceum sind so eng miteinander verwandt, daß in der vorliegenden Arbeit vorgeschlagen wurde, sie als Varianten von T. rubrum einzuordnen.

Das Gleiche gilt auch für den M. canis-Komplex (M. canis Variante distortum, M. audouinii und seine Varianten, M. equinum, M. ferrugineum und Arthroderma otae). Diese Schlußfolgerungen beruhen auf den Ergebnissen des PCR-Fingerprinting, den Vergleichen der ITS-Sequenzen (Variationsindex) und auf die Ähnlichkeiten der morphologischen bzw. biochemischen Merkmalen der jeweiligen Spezies.

Mit PCR-Fingerprinting war es möglich, die Dermatophytenspezies anhand ihrer charakteristischen PCR-Fingerprintingmuster zu identifizieren. Schwierig war die Differenzierung zwischen den Subspezies bzw. zwischen den Anamorphen und ihren Teleomorphen. Diese Methode wurde dann zur Identifizierung von klinischen T. tonsurans in einer Epidemiestudie bei Ringern verwendet.

Aus dem variablen Teil der ITS 2-Sequenz wurde eine Sonde (TR20S-Sonde) entwickelt, die für T. rubrum spezifisch war. Die Spezifität der Sonde konnte anhand der Hybridisierung mit der Gesamt-ITS-Region von 50 verschiedenen klinischen T. rubrum-Isolaten, 57 verschiedenen Spezies der Familie Arthrodermataceae und 10 anderen dermatologischen Infektionserregern nachgewiesen werden.

SUMMARY

The present work deals with problems of taxonomy and phylogeny as well as with the identification of the family Arhrodermataceae (Dermatophyten).

Since conventional methods for the detection of dermatophytes are often difficult, we analysed sequences of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) and data obtained by a PCR fingerprinting method to solve phylogenetic and identification questions.

The whole ITS region of 72 Arthrodermataceae isolates was amplified and sequenced. Phylogenetic relationships among these dermatophytes were reconstructed using parsimony and neighbour joining methods which lead both to a highly similar topology for the family Arthrodermataceae.

In both phylogenetic pedigrees the species of the family Arthrodermataceae formed a monophyletic group with Arachiotus ruber and Chrysosporum keratinophilum as outgroups.

Within the family Arthrodermataceae the genus Trichophyton is polyphyletic and the genus Microsporum paraphyletic. The genus Epidermophyton does not represent a monophyletic group as could be expected from the conventional systematics

Based on the comparisons of the ITS sequences(variation index), on the results of PCR fingerprinting, and on similarities of the morphological and biochemical features of the respective species the following conclusions can be drawn:

Trichophyton mentagrophytes and its 6 various variants belonged to 3 different complexes. Complex I was closely related to T. tonsurans, complex II to T. schönleinii and complex III to T concentricum and T. verrucosum.

rubrum , T. rubrum var. granulare, T. fischeri, T. kanei, T. megninii, T. soudanense and T. violaceum formed a monophyletic group. According to our results these species should be considered as variants of T. rubrum.

It has been also suggested that the members of the M. canis complex, M. canis variant distortum, M. audouinii and its variants, M. equinum, M. ferrugineum and Arthroderma otae seem to be rather variants of M. canis than different species.

Various dermatophyte species could be identified based on their PCR fingerprinting profiles. In an epidemic study among wrestlers this technique has been successfully employed to identify clinical isolates of T. tonsurans. However, the differentiation between subspecies and between anamorphs and its teleomorphs was not always possible.

From the variable part of the ITS2 sequence a probe specific for T. rubrum (TR20S) was developed. The specificity of the probe was proved by the hybridization of this probe to the amplified ITS region of 50 different clinical T. rubrum isolates, 57 strains of different species of the family Arthrodermataceae and 10 other dermatological agents.


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Taxonomie und Phylogenie der Familie Arthrodermataceae (Dermatophyten) und Entwicklung einer spezifischen Sonde für Trichophyton rubrum.
Widmung
1 Einleitung
1.1.Definition Dermatomykosen-Dermatophyten
1.2.Taxonomie und Systematik der Dermatophyten
1.3.Molekularbiologische Methoden zur Untersuchung von Taxonomie und Systematik bei Mikroorganismen
1.4.Pathogenität der Dermatophyten
1.5.Ökologie und Epidemiologie
2 Ziel der Arbeit
3 Material und Methoden
3.1.Material
3.1.1.Pilzstämme und Patientenmaterial
3.2.Methoden
3.2.1.Kultivierung der Pilzstämme
3.2.2. Isolierung chromosomaler DNA aus den Dermatophyten
3.2.2.1. DNA-Präparation nach Zellaufschluß mit der Magnetmühle
3.2.2.2. Maxi-DNA-Präparation (nach Gruber 1990, modifiziert)
3.2.2.3.Mini-DNA-Präparation
3.2.2.4. DNA-Präparation aus dem Patientenmaterial
3.2.3. DNA-Konzentrationsbestimmung
3.2.4.Polymerasekettenreaktion (PCR)
3.2.4.1.PCR-Optimierung
3.2.4.2.PCR zur Amplifizierung der ITS-Region
3.2.4.3. PCR-Fingerprinting
3.2.5. Auftrennung von DNA-Fragmenten in Agarosegelen
3.2.6.Trennung von DNA- Doppelsträngen mittels Dynabeads® M-280 Streptavidin
3.2.6.1.Vorbereitung der Dynabeads
3.2.6.2.Trennung von DNA-Strängen
3.2.7.DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten
3.2.7.1.Nichtradioaktive, automatische Sequenzierung von PCR-Produkten
3.2.7.2. PCR-Cycle-Sequencing
3.2.7.3.Herstellung eines 7%-igen Polyacrylamidgels und Durchführung der Polyacrylamidgel-Elektrophorese
3.2.7.4. Detektion und Auswertung der Sequenzdaten im LI-COR-Gerät
3.2.8.Analyse der DNA-Sequenzen
3.2.8.1.Sequenz-Alignment
3.2.8.2.Berechnung des Variationsindex für den Vergleich der ITS-Sequenzen
3.2.8.3.Phylogenetische Analyse der Sequenzdaten
3.2.9. Dot Blot-Hybridisierung mit der spezifischen Trichophyton rubrum-TR20S-Sonde
3.2.9.1.Herstellung der Dot Blots
3.2.9.2. Markierung der Sonde mit Digoxigenin-ddUTP
3.2.9.3. Durchführung der DNA-DNA Hybridisierung
3.2.9.4. Detektion der markierten Hybride
4 Ergebnisse
4.1.Vergleich unterschiedlicher Verfahren zur DNA-Extraktion bei Dermatophyten
4.2.Identifizierung und Charakterisierung der Dermatophyten mittels PCR-Fingerprinting
4.3.Epidemie-Studie von Trichophyton tonsurans
4.4.Amplifizierung und Sequenzierung der ITS-Region der Dermatophyten
4.4.1.Amplifizierung der ITS-Regionen
4.4.2.Sequenzierung der ITS-Regionen
4.4.3.Alignment und Sequenzanalyse
4.4.4.Variabilität der ITS-Regionen innerhalb der Arthrodermataceae
4.4.5. GC-Gehalt der ITS-Regionen
4.5.Phylogenie der Dermatophyten (Arthrodermataceae)
4.6.Entwicklung der TR20S-Sonde und ihre Anwendung zur Identifizierung von Trichophyton rubrum
5 Diskussion
5.1.Molekularbiologische Identifizierung der Dermatophyten
5.1.1. Identifizierung der Dermatophyten mittels PCR-Finger-printing
5.1.2. Epidemisches Vorkommen von Trichophyton tonsurans in Deutschland
5.2. Sequenzdatenanalyse und Phylogenie der Dermatophyten
5.2.1. Amplifizierung und Sequenzierung der ITS-Regionen
5.2.2. Phylogenie der Dermatophyten
5.2.2.1. Trichophyton mentagrophytes-Komplexe
5.2.2.2.Trichophyton rubrum-Komplex
5.2.2.3. Microsporum canis-Komplex
5.3. Identifizierung der Trichophyton rubrum durch die Hybridi- sierung mittels TR20S-Sonde.
6 ZUSAMMENFASSUNG
Bibliographie REFERENZEN
Anhang A
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis verwendeter Abkürzungen
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1:. Einige bekannte Teleomorphe von Dermatophyten mit ihren dazugehörigen Anamorphen
Tab. 2: Nach ihrem Vorkommen klassifizierte bekannte Dermatohytenarten
Tab. 3: Die wichtigsten Erreger von Tinea capitis (Infektion der Kopfhaut) in verschiedenen geographischen Gebieten (Aly 1994)
Tab. 4: Klinischen Dermatophytosen und ihre Erreger
Tab. 5: Dermatophytenspezies und Varianten, die in der Arbeit verwendet wurden
Tab. 6: PCR-Optimierung ( 25 µl Ansätze)
Tab. 7: Primer, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden
Tab. 8: Klinische Isolate und CBS-Referenzstämme, die bei der Fingerprinting-Studie verwendet wurden
Tab. 9: Dermatophytenstämme, die in der Epidemiologie-Studie von Trichophyton tonsurans verwendet wurden
Tab. 10: Prozentualer Variationsindex für die ITS-Sequenzen innerhalb der zur Familie Arthrodermataceae gehörenden Spezies (Intraspezies-Variationen)
Tab. 11: Prozentualer Variationsindex für die ITS-Sequenzen einiger bekannter anamorpher und teleomorpher Spezies der Familie Arthrodermataceae
Tab. 12: Prozentualer Variationsindex für die ITS-Sequenzen der Trichophyton rubrum-Spezies und ausgewählter Arthrodermataceae- Spezies.
Tab. 13: Prozentualer Variationsindex für die ITS-Sequenzen einiger Microsporum-Spezies und ausgewählter Arthrodermataceae-Spezies.
Tab. 14: Prozentualer Variationsindex für die ITS-Sequenzen von Trichophyton tonsurans und seinen Varianten
Tab. 15: Prozentualer Variationsindex für die ITS-Region einiger Trichophyton mentagrophytes-Varianten und ausgewählter Spezies der Familie Arthodermataceae-.
Tab. 16 : Teil-Sequenzalignment der ITS 2-Region unterschiedlicher Arthodermataceae-Spezies. Die TR20S-Sonde ist rot geschieben und unterstrichen

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Trichophyton mentagropythes mit speziellen spiralförmigen Hyphen (SH), ca. 2 µm großen kugelförmigen Mikrokonidien (MiK) und einigen Makrokonidien (MaK).
Abb. 2: Microsporum canis mit typischen spindelförmigen Makrokonidien (MaK). Mikrokonidien (MiK) sind nur vereinzelt zu sehen
Abb. 3: Klinische Manifestation der Infektion durch Microsporum canis bei Kindern (a) und Erwachsenen (b)
Abb. 4
Abb. 5
Abb. 6
Abb. 7: Agarosegelelektophorese von gereinigter Dermatophyten-DNA
Abb. 8: Nachweis von Dermatophyten-DNA durch ihre Amplifizierung mit den Primern LR1 und SR6R
Abb. 9: Nachweis humaner DNA mit den Primern DXYS156X und DXYS156Y unter Verwendung von 2 verschiedenen Polymerasen
Abb. 10: PCR-Fingerprinting von verschiedenen Dermatophyten-Spezies mit den Primern M13 (A) und AP3 (B)
Abb. 11: Differenzierung von Trichophyton-Varianten und Identifizierung klinischer Isolate mittels PCR-Fingerprinting mit den Primern M13 (A) und AP3 (B)
Abb. 12: DNA-Fingerprinting von Trichophyton rubrum und nah verwandten Spezies mit den Primern (AC)10 (1-9) und T3B (1a-9a)
Abb. 13: DNA-Fingerprinting von Microsporum canis und nah verwandten Spezies mit den Primern (AC)10 (1-9) und T3B (1a-9a)
Abb. 14: PCR-Fingerprinting von anamorphen (A) Dermatophyten-Spezies und den dazugehörigen teleomorphen (T) Formen mit den Primern a= (AC)10 und b= T3B
Abb. 15: Identifizierung problematischer klinischer Dermatophyten-Isolate (?) anhand des Vergleichs ihrer PCR-Fingerprintingprofile mit dem der entsprechenden CBS-Referenzstämme (Primer T3B)
Abb. 16: Identifizierung problematischer klinischer Dermatophyten-Isolate (?) anhand des Vergleichs ihrer PCR-Fingerprintingprofile mit den der CBS-Referenzstämme mittels (AC)10 Primer
Abb. 17: PCR-Fingerprinting von klinischen Trichophyton tonsurans- Isolaten sowie von den dazu gehörigen Referenzstämmen mit den Primern M13 (A), (AC)10 (B) und (GTG)5 (C)
Abb. 18: Schematische Darstellung der Gesamt-ITS-Region mit der Lokalisation der in der PCR verwendeten Primer
Abb. 19: Amplifizierung der ITS-Regionen von Spezies der Familie Arthrodermataceae
Abb. 20: Chromatogramm und Nukleotidsequenz der ITS 1-Region.
Abb. 21a: Konsensus-Baum von 72 verschiedenen Isolate nder Familie Arthrodermataceae, der durch eine Prsimonie- Analyse der Gesamt-ITS-Sequenz erhalten wurde. Die oberen Zahlen entsprechen den Boot- strapwerten, die unteren Zahlen stehen für die Anzahl der Nukleotidaustausche. ( 83 von 429 informative Stellen, Schritte 303, CI= 0,693,HI= 0,379 ). Rot: anthropophil, Blau: zoophil und Grün: geophil
Abb. 21b: Konsensus-Baum von 72 verschiedenen Spezies der Familie Arthrodermataceae, der durch eine Neighbor-Joining-Analyse der Gesamt-ITS-Sequenz erhalten wurde. Die Zahlen entsprechen den Bootstrapwerten. Rot: anthropophil, Blau: zoophil und Grün: geophil
Abb. 22a: Konsensus-Baum von Trichophyton-Isolaten, der durch eine Parsimonie-Analyse der Gesamt-ITS-Sequenzen erhalten wurde. Die oberen Zahlen entsprechen den Bootstrapwerte, die unteren Zahlen stehen für die Anzahl der Nukleotidaustausche. (139 von 757 informative Stellen, Schritte 232, CI= 0,853, HI= 0,147). Rot: anthropophil, Blau: zoophil und Grün: geophil
Abb. 22b: Konsensus-Baum von Trichophyton-Isolaten abgeleitet durch eine Neighbor-Joining- Analyse der Gesamt-ITS-Region. Die Zahlen entsprechen Bootstrapwerten. Rot: anthropophil, Blau: zoophil und Grün: geophil
Abb. 23a: Konsensus-Baum von Microsporum canis und nahstehenden Spezies, der durch eine Parsimonie-Analyse der Gesamt-ITS-Sequenz erhalten wurde. Die oberen Zahlen entprechen den Bootstrapwerten, die unteren Zahlen stehen für die Anzahl der Nukleotidaustausche. (14 von 775 informative Stellen, Schritte 244, CI= 0,841, HI= 0,159). Rot: anthropophil und Blau: zoophi
Abb. 23b: Konsensus-Baum von Microsporum canis und nahstehenden Spezies, der durch eine Neighbor-Joining-Analyse der Gesamt-ITS-Sequenz erhalten wurde. Die Zahlen entsprechen den Bootstrapwerten. Rot: anthropophil und Blau: zoophil.
Abb. 24: Amplifikation der Gesamt-ITS-Region verschiedener potentieller Erreger von Haut und Nagelinfektionen
Abb. 25: Dot-Blot-Hybridisierung der amplifizierten ITS-Region bzw. chromo-somaler DNA verschiedener Vertreter der Arthrodermataceae sowie anderer potentieller Erreger von Haut- und Nagel-Infektionen mit der TR20S-Sonde
Abb. 26: Detektion von Trichoython rubrum und nahverwandten Spezies anhand der Dot-Blot-Hybridisierung der amplifizierten ITS-Region mit der TR20S-Sonde
Abb. 27: Amplifikation der ITS-Region von Trichophyton rubrum direkt aus Patientenmaterial unter Verwendung von 2 verschiedenen Polymerasen in der PCR

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