Gerberding, Matthias: Cell lineage und engrailed Expression in der Mittellinie der höheren Krebse Orchestia cavimana und Porcellio scaber

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Kapitel 2. Material und Methoden

Substanzen

Tab. 1 Verwendete Substanzen

Asselringer ( nach Anderson aus Sutton 1972)

12g NaCl, 1,6g KCl, 1,6g CaCl2, 1,6g MgCl2, 0,2g NaHCO3 zu 1 l aqua dest.

Bodian-Lösung

90 ml 80 % Etoh + 5ml Glutaraldehyd + 5ml Formaldehyd

Bouin'sche Lösung

80 Teile aqua dest., 15 Teile Formaldehyd, 5 Teile Ethanol, 1 Teil Pikrinsäure

BrdU

5-Brom-2'-desoxyuridin

BSA

Bovines Serum Albumin, Sigma

DAB Lösung

1mg DAB Sigma /1ml PBS

DiI

1, 1' - Dioctadecyl - 3,3,3', 3' - Tetramehtyl-indocarbocyanin Perchlorat, Molecular Probes

EGTA

Ethylen-Glykol-Tetraessigsäure, Sigma

Formaldehyd

37% Formaldehyd, Roth

Orchestiaringer

9,8g NaCl, 1,0g KCl, 1,0g CaCl2, 0,9g MgCl2, 0,1g NaHCO3, 0,15g Na2HPO4, 0,05g NaH2PO4 zu 1l aqua dest.

PBS

8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na2HPO4, O,24g KH2PO4, mit HCl auf pH 7,2 eingestellt

PBT

PBS + 0,1% BSA + 0,1% Triton X-100

PBT+ N

PBT + 5% Normal Goat Serum

PEM

0,1M Pipes, 2mM EGTA, 1mM MgSO4

PEMFA

9 Teile PEM, 1 Teil Formaldehyd

Primärer Antikörper anti-Engrailed

Mab 4D9, zu Verfügung gestellt von N. Patel, C. Klämbt, H. Saumweber

Primärer Antikörper anti-BrdU

Amersham Proliferation Kit RPN 20

Sekundärer Antikörper anti-Engrailed

Goat Anti-mose peroxidase konjugiert, Jackson Immunoresearch, 1:200

Sekundärer Antikörper anti-BrdU

Goat Anti-rabbit Cy3 konjugiert, Jackson Immunoresearch, 1:500

Triton X-100

Triton X-100, Sigma

Tierhaltung

Orchestia cavimana wurde den Sommer über am Flakensee nahe Waltersdorf bei Berlin, am Griebnitzsee bei Berlin, am Tegeler See in Berlin und an der Weser nahe Elsfleth bei Bremen gefangen. Die Tiere wurden mit Haferflocken und Möhren gefüttert und legten ganzjährig Eier. In den Gelegen zeigten sich mit zunehmenden Alter der Zucht eine Häufung von leichten bis schweren Anomalien der Embryonen, so zum Beispiel eine geringe Härte der Membranen und veränderte mechanische Eigenschaften der Keimstreifen beim Fixieren, und außerdem ein


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Nachlassen der Festigkeit der Oostegiten der Mütter, die die Gelege dann nicht mehr stabil im

Marsupium aufbewahren sondern verlieren.

Porcellio scaber überließen Angelika Weber und Dr. Beate Witzel. Die Tiere wurden mit Laub und Möhren gefüttert und legten ganzjährig Eier.

2.1. Das Zellteilungsmuster von Orchestia und Porcellio

Die Bildung eines Gittermusters bei den Malakostraken

Malakostraken zeigen im postnauplialen Abschnitt des embryonalen Keimstreifens, das heißt in dem Abschnitt hinter den nauplialen Segmenten von Antennen und Mandibel, eine regelmäßige Anordnung der Ektodermzellen zu einem Gitter. Dies wurde am Keimstreifen des Malakostraken Diastylis rathkei (Cumacea) entdeckt ( Dohle 1970; 1976a). Das für Diastylis beschriebene Zellteilungsmuster, das dem Gitter zugrunde liegt, wird in gleicher Weise bei allen diesbezüglich untersuchten Malakostraken gefunden, so in der Gruppe der Peracariden bei den Tanaidacea, Isopoda, Mysidacea und Amphipoda und in der Gruppe der Eucarida bei den Decapoda ( Dohle 1972; Hahnenkamp 1974; Scholtz 1984, 1990, 1992a; Vehling 1994). In der Bildungsweise des Gitters unterscheiden sich Amphipoda von den übrigen Malacostraca (Abb. 1.A, B). In den folgenden Abschnitten und Abb. 1 wird, soweit es für das Verständnis förderlich erscheint, ein kurzer Überblick über die bei Orchestia und Porcellio unterschiedliche Bildungsweise des Gittermusters sowie über das bei beiden übereinstimmende Zellteilungsmuster gegeben.


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Abb. 1 A-E Schema des Teilungsmusters der lateralen Zellen der Malacostraca. Reproduktion aus Scholtz et al. (1993). Nur die lateralen Zellen der linke Seite des Tieres sind gezeigt. Die waagerechten Linien geben der Verlauf der genealogischen Grenzen (gb) an. A Die Querreihen (er) werden bei Porcellio und allen diesbezüglich untersuchten Malacostraca mit Ausnahme der Amphipoda durch Ektoteloblasten gebildet (ET) ( Dohle 1970, 1976a; Scholtz 1984, 1992a). B Die Querreihen (er) werden bei Orchestia und anderen Amphipoden aus zufällig verteilten Blastodermzellen gebildet ( Scholtz 1990). C, D Nach ihrer Bildung werden die Reihen von der Mitte zu den Seiten von zwei Wellen von äqualen und längsgerichteten Teilungen durchlaufen. Das Ergebnis sind vier Querreihen, die mit a, b, c und d bezeichnet werden. E Anschließend beginnen die differentiellen Teilungen. Die differentiellen Teilungen variieren in Äqualität und Orientierung. Die Darstellung der differentiellen Teilungen für die fünf Zellen seitlich der Mittellinie ist vereinfacht. Sie berücksichtigt nicht die Merkmale, für die Dohle (1970, 1972, 1976a) und Scholtz (1984, 1990, 1992a) eine Variation zwischen den Taxa beschreiben. Die Segmentgrenze, die durch die Intersegmentalfurchen (if) bestimmt wird, verläuft leicht schräg durch die Abkömmlinge der Reihe b (schattierter Bereich). Die Abkömmlinge einer Querreihe (er in A) sind also nach der Teilung zu den vier Reihen a, b, c und d an zwei aufeinanderfolgenden Segment beteiligt und die genealogischen Grenzen stimmen nicht mit den Segmentgrenzen überein.

Die Bildung der Reihen bei Orchestia

Bei Orchestia ordnen sich im postnauplialen Abschnitt des Keimstreifens regellos verteilte Ektodermzellen parallel in regelmäßigen Querreihen an (Abb. 1B). Die ersten Querreihen bilden sich im Bereich der Segmente der Maxillen. Danach entstehen hinter diesen Reihen sukzessive die Reihen für die Anlagen der thorakalen Segmente, die die Laufbeine tragen, und die der


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abdominalen Segmente, die die Pleopoden tragen, sowie vor diesen Reihen die Reihe für das Segment der Mandibel. Die Reihen wurden bei Gammarus mit arabischen Zahlen numeriert von E1 - E 17 ( Scholtz 1990).

Die Bildung der Reihen bei Porcellio

Bei Porcellio ordnen sich, ähnlich wie bei Orchestia, regellos verteilte Ektodermzellen zu mehreren regelmäßigen Querreihen an. Im Unterschied zu Orchestia differenzieren sich in einem frühen Stadium Zellen der posterior gelegenen Reihe zu Stammzellen, sogenannten Ektoteloblasten (Abb. 1.A) ( Hahnenkamp 1974; Vehling 1994). Die vor den Ektoteloblasten liegenden Reihen, die also nicht von den Ektoteloblasten abstammen, werden mit arabischen Zahlen numeriert. Die Ektoteloblasten geben in 13 Teilungsrunden 13 Querreihen ab, die mit den römischen Zahlen I - XIII bezeichnet werden ( Dohle 1970; Hahnenkamp 1974; Vehling 1994). Aus den Reihen I - XIII gehen die hinteren thorakalen und die abdominalen Segmente hervor.

Das gemeinsame Zellteilungsmuster von Orchestia und Porcellio

Nach der Bildung der Reihen besteht jede Querreihe aus einer unpaaren medianen Zelle in der Mittellinie und paarig zu beiden Seiten der Mittellinie angeordneten Zellen. Für die Zellen neben der Mittellinie kann das Zellteilungsmuster mit morphologischen Methoden gezeigt werden. Die Mittellinienzellen sind während dieser Phase klar erkennbar, die genealogischen Grenzen zwischen den Tochterzellen verschiedener Reihen sind innerhalb der Mittellinie mit morphologischen Methoden nicht eindeutig erkennbar. Das Zellteilungsmuster der Zellen neben der Mittellinie ist gleich in den Reihen von Orchestia, die sämtlich ohne Ektoteloblasten gebildet sind, und in den Reihen von Porcellio, die zum Teil von Ektoteloblasten, zum Teil ohne Ektoteloblasten gebildet sind. Die Zellen durchlaufen zwei äquale und gleich gerichtete Teilungen mit einer Orientierung in Längsrichtung (Abb. 1.C, D) ( Dohle 1970; Scholtz 1990). Die Reihen nach der zweiten Teilung werden mit a, b, c und d und die Zellen mit a1,2,3.., b1,2,3..., c1,2,3.. und d1,2,3... bezeichnet ( Dohle 1970). Für mindestens vier der nächsten Teilungen nach den zwei Teilungen in gleicher Richtung kann gezeigt werden, daß sie weiter nach einem festgelegten Zellteilungsmuster erfolgen (Abb. 1.E) ( Dohle 1976a; Scholtz 1990, 1992a). Die Orientierung und die Äqualität dieser Teilungen ist allerdings von Zelle zu Zelle unterschiedlich und das Muster zeigt Unterschiede zwischen den Vertretern der Taxa der Malacostraca. Diese Teilungen werden deshalb als ”differentielle Teilungen“ bezeichnet ( Dohle 1976a). Die Zellen, die sich im Bereich der zukünftigen Ganglienanlagen befinden und sich inäqual und senkrecht zur Oberfläche teilen, gelten als Stammzellen für Neurone, sogenannte ”Neuroblasten“ (NBs), ihre Tochterzellen als Ganglienmutterzellen ( Dohle 1976a; Scholtz 1992a).


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Stadieneinteilung der Embryonen

Die Einteilung der Embryonen in Stadien erfolgte unter dem Binokular. Die Abb. 2 stellt die morphologischen Kriterien dar und die Tab. 2 listet die Prozesse normiert auf 100% der Entwicklungsdauer.

Tab. 2 Übersicht über die Entwicklungsstadien von Orchestia und Porcellio

 

Entwicklungsstadien Orchestia cavimana

Entwicklungsstadien Porcellio scaber

 

100% Entwicklung (= 100% E) bei 22°C 12 Tage. Stadien eigene Beobachtung.

100% Entwicklung (=100% E) bei 20°C 26 Tage. Bis 45% E eigene Beobachtung, von 45%E - 90% E aus Whitington et al. (1993).

10%E

Teilung bis zum 128 Zell Stadium, Dotter wird dunkler

 

15% E

Aggregation des Blastodermzellen auf der Ventralseite

 

20% E

 

Beginn der Teilungstätigkeit der Teloblasten

25% E

Beginn der Gastrulation

 

30% E

Ende der Gastrulation, Kopflappen und Reihen werden sichtbar

Ende der Tätigkeit der Teloblasten

40% E

Verlängerung des Keimstreifen, Längsteilungen der Reihen, Dotter wird heller

 

45% E

 

Beinanlagen werden unter dem Binokular sichtbar

50% E

Differentielle Teilungen, Beginn der Trennung des Keimstreifens

Beginn des Einschlusses des Dotters in Dottersäcke

55% E

Trennung des Keimstreifens

 

60% E

 

Darm knickt nach vorne um, Dotter zu ¾ eingeschlossen in Dottersack, Embryo schlüpft aus dem Chorion

65% E

Fusion der Hälften, frühe Axonogenese

 

70% E

Bildung der Dottersäcke als vordere Taschen des Darms

Dotter komplett eingeschlossen, Rückenschluß, Bewegungen

80% E

Trennung von Dottersäcken und Darm, Dotter orange, Herz schlägt

Beginn der Pigmentbildung an den Tergiträndern

90% E

Dotter gelb

Beginn der Pigmentierung der Augen

100% E

Schlüpfen

Schlüpfen


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Abb. 2 Schematisierte Gegenüberstellung gleicher Schritte der Embryonalentwicklung von Orchestia und Porcellio. Bei Orchestia liegen nach der Gastrulation zum Zeitpunkt der Reihenbildung mehr Ektodermzellen vor als bei Porcellio. Bei Orchestia bilden sich die regelmäßigen Reihen aus unregelmäßig angeordneten Ektodermzellen, bei Porcellio werden sie gebildet von Stammzellen, den Ektoteloblasten, die in einer Reihe angeordnet sind. Die Trennung des Keimstreifens tritt nur bei Orchestia auf. Die Embryonen von Orchestia und Porcellio zeigen vor dem Schlüpfen gemeinsame Merkmale.


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2.2. Markieren von Orchestia Embryonen mit DiI

Abb. 3 A, B Gravides Tier und Keimstreifen in vivo. A Die Weibchen von Orchestia tragen die Eier im ventralen Brutraum bis zum Schlüpfen und darüber hinaus, bis die Juvenilen ihn selbständig verlassen. Weisse Pfeilspitze markiert den Kopf der Mutter, schw. Pfeilspitze ein juveniles Tier. B Gleichzeitig mit der Bildung der Querreihen (weisse Pfeilspitzen) wird die Mittellinie erkennbar (schw. Pfeilspitze) . Der Dotter ist dunkel, die Zellen hell, da sie Calcium inkorporieren ( Meschenmoser 1996).

2.2.1. Versuchsaufbau

Zum Darstellen der cell lineage werden zu verschiedenen Zeitpunkten Zellen markiert. Die Eier werden aus dem Brutraum entnommen, markiert, nach Stunden bis Tagen fixiert, präpariert und fotografiert.

Ziehen, Schleifen und Füllen der Pipetten: Die Pipetten (Hilsberg, Durchmesser 1,0 mm, Wandstärke 0,2 mm) werden ausgezogen (Kopf Puller P 720) und geschliffen (Bachofer Schleifgerät). Beim Ausziehen werden Stärke 15,5 der Heizwendel und die Stärke 1,5 des Magneten verwendet. Beim Schleifen wird, anders als in den Laboren Technau/Mainz und Saumweber/Berlin, verhältnismäßig lang geschliffen, ca. 45 Sekunden. Es wird mit einer Spritze geprüft, ob die Pipette Luft durchlässt. Die Pipette wird in den Halter des Mikromanipulators eingespannt und in einem Tropfen Farbstoff durch Unterdruck gefüllt. Entnahme der Eier aus dem Brutraum und Rückgabe: Die Oostegiten bilden auf der Ventralseite der Tiere das Marsupium (Abb. 3. A). Die Oostegiten sind durch kleine Borsten an ihrem Rand miteinander verhakt und bilden einen geschlossenen Brutraum. Die Eier werden aus dem Brutraum entnommen und nach der Markierung wieder in den Brutraum zurückgegeben. Dabei dürfen keine Luftblasen in der Pipette sein. Die Entnahme der Eier aus dem Brutraum und die Rückgabe erfolgen von anterior.


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Der Zusammenhalt der Oostegiten wird dabei leicht irreversibel zerstört, was dazu führt, daß diese

Tiere die Eier nach der Rückgabe einfach verlieren. Befestigung der Eier: Die Befestigung der Eier erfolgt durch Festklemmen des Eis zwischen einem Objektträger und einem kleinen Quadrat aus Deckglas. Markieren: Die Markierung wird unter einem inversen Mikroskops (Leica DMIRB) durchgeführt unter Beleuchtung mit einer Kaltlichtlampe von der Seite, da das Licht des Mikroskops von oben nicht durch den Dotter dringt (Abb. 4) . Das Markieren erfolgt unter blauem Fluoreszenzlicht, um eine möglichst geringere Anregung des DiI zu erreichen, damit das emittierte Licht nicht die Zelle schädigt und der Farbstoff nicht bereits ausbleicht. Das Markieren ist der Punkt der Methode, bei dem die größte Zahl von Verlusten auftritt. Grund für die Verluste sind Verletzungen der Zelle oder ihrer Nachbarn beim Markieren. Die Markierung ist empfindlich für Schwingungen, sei es des Tisches oder des Fußbodens. Die Pipette muß beide Eihüllen durchstoßen und genau auf der zu markierenden Zelle liegen. Dann wird ein Tropfen abgegeben, der ungefähr die Hälfte der Zelloberfläche bedeckt. Die Diffusion des Farbstoffs in die Membran kann unter dem Mikroskop kontrolliert werden. Teilweise fehlt nach Abgabe des Tropfens der Kontakt zwischen Zelle und Tropfen. Aufbewahrung und Fixierung markierter Embryonen: Um die Teilungen und Schritte der Morphogenese und Differenzierung so lückenlos wie möglich zu erfassen, wurden die Embryonen zu unterschiedlichen Zeiten markiert und zu unterschiedlichen Zeiten nach der Markierung fixiert. Für Zeiträume bis maximal 12 Stunden nach der Markierung wurden sie in Ringer in Blockschälchen gehalten. Für Zeiträume von Tagen nach der Markierung wurden sie zurück ins Marsupium gegeben, weil eine Aufbewahrung in Blockschälchen ohne Entwicklungsdefekte nicht möglich war. Während der Aufbewahrung in Blockschälchen und im Marsupium wurden sie Zimmertemperatur ausgesetzt. Für die Untersuchung schnell ablaufender Schritte wurden die Embryonen bei Temperaturen von 10°C bis 15°C aufbewahrt, damit sich ihre Entwicklung um ungefähr die Hälfte verlangsamte und das gesuchte Stadium erst nach 16 h bis 24 h am Tag nach der Markierung statt nach 12 h in der Nacht nach der Markierung auftrat. Fixieren und Präparieren: Das Präparieren erfolgt im Fixans. Beim Präparieren wird mit einem Minutienstift in das Dorsalorgan gestochen und die Dorsalseite aufpräpariert. Dann werden die Embryonalhüllen und der Dotter entfernt. Ein Überführen in Glycerin ist nicht möglich, weil der Farbstoff dann diffundiert. Fotografieren: Das Fotografieren erfolgt unter grünem Fluoreszenzlicht, um eine maximale Anregung des DiI zu erreichen. Die Belichtungzeiten liegen bei ca. einer Minute (Agfa CTx 100). Bildverarbeitung: Die Dias wurden mit einem Nikon Diascanner (Institut für Zoologie, FU Berlin) in der Auflösung 1500x1500 dpi gescannt. Die Dateien wurden mit den Programmen CorelPhotopaint und CorelDraw auf die gewünschte Größe geschnitten, zusammengestellt und beschriftet. Die Schemata wurden mit einem HP Farbtintenstrahldrucker ausgedruckt, die Tafeln mit einem Thermosublimationsdrucker (Rechenzentrum der HU Berlin). Eine Montage oder eine Veränderung der Farben oder eine Retuschierung erfolgten nicht. Jedes Einzelbild einer Tafel stimmt mit je einem Dia überein.


14

Abb. 4 Aufbau der Apparatur. Adaptation der Methode von Bossing und Technau (1994). Die Eier werden auf einem Objektträger unter einem inversen Mikroskop markiert. Erläuterungen s. Text.

2.2.2. Eiachsen und Lage der Keimstreifen

Die Relation zwischen der Lage der Eiachsen und der Lage des Keimstreifens ist von unmittelbarer Bedeutung für die Durchführung der Markierung. Die Pipette kann nach dem Durchstoßen der Eimembranen nur noch in einer Richtung über eine Strecke von ein bis zwei Zellen bewegt werden. Für eine Markierung mit der Pipette sind deshalb nur die wenigen Zellen zugänglich, die am Rand der Fläche liegen, mit der das Ei dem Objektträger aufliegt. Damit die Pipette an einer bestimmten Stelle auf den Keimstreifen treffen kann, müssen die Eier exakt ausgerichtet werden. Diese Ausrichten ist nur mit einem Teil der Eier eines Geleges möglich. Die Relation zwischen der Achse des Eis und der des Keimstreifens und der Grad der Krümmung des Keimstreifens sind entscheidend dafür, ob das Ei gedreht werden kann und ob es in der Weise gedreht werden kann, daß der gewünschten Bereich in den Aktionsradius der der Pipette gelangt. Die Form der Eier zeigt eine Bandbreite von stark elliptisch bis annähernd kreisrund. Unmittelbar nach der Bildung der Reihen können die Keimstreifen in jeder beliebigen Orientierung auf dem Ei liegen, zu etwa 80% aber liegen sie quer zur Längsachse der Eier (Abb. 5.A). Nur diese Eier können in einer für die Markierung geeigneten Weise ausgerichtet werden, weil das Ei durch Rollen in die gewünschte Position gebracht und festgeklemmt werden kann. Zu Beginn der Verlängerung sind die Keimstreifen stark gekrümmt. In diesem Stadium ist das Markieren gut möglich. Die Orientierung der Achsen verändert sich während der Verlängerung der Keimstreifen (Abb. 5.A-C). Nach Ende der Verlängerung sind die Keimstreifen nur noch schwach gekrümmt und die Form des Eis hat sich


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in der Regel so geändert, daß die Keimstreifen entlang der Längsachse orientiert sind (Abb. 5.B).

In diesen Stadium ist das Markieren schwieriger, da das Ei nicht mehr gerollt werden kann und deshalb nur einem einzigen Bereich markiert werden kann, und zwar dem am Rand des Bereichs, mit der das Ei dem Objektträger aufliegt. Im folgenden Stadien beginnen sich die Intersegmentalfurchen einzuschnüren und die Mittellinie sinkt zwischen den seitlichen Ganglienanlagen ein. Die Mittellinienzellen sind in diesem Stadium für eine Markierung gut zugänglich, sie können aber ab diesem Stadium nicht mehr voneinander unterschieden werden. Im darauf folgenden Stadium teilt sich der Keimstreifen in zwei Hälften. Die Mittellinienzellen sind für eine Markierung zugänglich, können aber nicht einzeln identifiziert werden.

Abb. 5 A-C Form des Eis, Lage der Achsen. Md = Mandibel A In frühen Stadien sind die Eier in der Regel rund und jede Reihe des frühen Keimstreifen kann in eine für das Markieren geeignete Lage gerollt werden. In diesem Stadium befinden sich die Reihen vor der ersten Teilung. B, C Im Verlauf der Entwicklung verändert sich die die Form des Eis von rund nach länglich, und die Eier können nicht mehr in jede beliebige Lage gerollt werden. B Bei den Markierungen nach der zweiten Teilung lassen sich am günstigsten die Thoraxsegmente 4, 5 und 6 markieren. C Das längliche Ei kann nicht mehr gerollt werden, und nur noch die abdominal gelegenen Reihen können markiert werden.


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2.2.3. Organisation der Markierungen

Markierung und Fixierung erfolgten zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Fig. 6). Es wurden die cell lineages der Zellen unmittelbar neben der Mittellinie und die der Mittellinienzellen selbst untersucht (Abb. 7. A,B).

Bei den Zellen unmittelbar neben der Mittellinie wurden die Bildung der Reihen und die cell lineage der ersten Teilungen untersucht. Dafür wurden Zellen einzeln markiert. Dies erfolgte zu zwei verschiedenen Zeitpunkten:

(i) vor der Bildung der Reihen (Abb. 8.A)

(ii) nach der Bildung der Reihen, vor der ersten Teilung (eine Zelle, abcd1)(Abb 8.B-D).

Die Fixierung erfolgte zu drei Zeitpunkten: (i) nach der ersten Teilung, vor der zweiten Teilung (zwei Zellen, ab1 anterior und cd1 posterior) (Abb. 8.B),(ii) nach der zweiten Teilung, vor der dritten Teilung (vier Zellen, a1, b1, c1 und d1) (Abb. 8.C) und (iii) nach der dritten Teilung, vor der vierten Teilung (mehr als vier Zellen) (Abb. 8.D).

Bei den Mittellinienzellen wurden die cell lineage und die Morphogenese von den ersten Teilungen der Reihen über die Trennung der Keimstreifenhälften bis zur neuronalen und glialen Differenzierung untersucht. Die Mittellinienzellen wurden sowohl einzeln markiert als auch zu mehreren in einem Keimstreifen. Die Markierungen einzelner Zellen erfolgte:

(i) nach der Bildung der Reihen, vor der ersten Teilung, (die Zelle abcd0), (Abb. 10. A, C),

(ii) nach der ersten Teilung, vor der zweiten Teilung (je eine der zwei Zellen ab0 und cd0), (Abb. 10.B),

(iii) nach der zweiten Teilung, vor der dritten Teilung (je eine der vier Zellen a0, b0, c0 und d0), (Abb. 12 ff.).

Die Fixierung erfolgte wie bei den lateralen Zellen zu drei Zeitpunkten: (i) nach der ersten Teilung, vor der zweiten Teilung (zwei Zellen, ab0 anterior und cd0 posterior) (Abb. 10.A),(ii) nach der zweiten Teilung, vor der dritten Teilung (vier Zellen, a0, b0, c0 und d0) (Abb. 10.B) und (iii) nach der dritten Teilung, vor der vierten Teilung (mehr als vier Zellen) (Abb. 10.C).

Die Markierung mehrerer Zellen erfolgte zu zwei verschiedenen Zeitpunkten:

(i) vor der dritten Teilung, zwei hintereinander liegende Zellen (nur medianer Neuroblast und anteriore und posteriore Nachbarzelle, d.h. c0+d0, d0+ a0) (ohne Abb.), und mehrere Zellen verschiedener genealogischer Einheiten (zwei oder drei Zellen) (Abb. 15.B),


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(ii) während der Trennung der Keimstreifenhälften, mehrere Zellen (maximal sechs Zellen) (Abb. 15.A).

Abb. 6 A-E Zeitpunkt der Markierung. Das Schema zeigt die verschiedenen Zeitpunkte für die Markierung und die unterschiedlichen Zeiten, nach denen die Entwicklung durch Fixieren gestoppt wurden. A-D Markierung einzelner Zellen. A-C Fixierung unmittelbar nach 1-3 Teilungen. D Fixierung während Separation und Neurogenese. E Mehrfachmarkierung

2.2.4. Angaben über Erfolgsraten und Zahl der Wiederholungen der Experimente

Die Markierung selbst und alle weiteren Schritte sind mit Verlusten verbunden. Es treten häufig unmittelbar nach der Markierung sichtbare Defekte an der markierten Zelle auf, im Verlauf der Entwicklung kommt es relativ häufig zu Defekten bei der der Verlängerung der Keimstreifen und sehr häufig zu Störungen bei der Entwicklung der markierten Zelle infolge von Defekten, die


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unmittelbar nach der Markierung nicht sichtbar sind, schließlich geht ein Teil der Eier, die in das

Marsupium zurückgegeben werden, verloren. Zahlen über die Erfolgsraten finden sich in Tab. 3. Zahlen über die Häufigkeit, mit der die einzelnen Markierungen erfolgreich durchgeführt werden konnten, und Verweise zu den Abbildungen im Ergebnisteil finden sich in den Tabellen 4-6.

Tab. 3 Erfolgsrate Markierungen und Anteil normal entwickelter Embyronen und normal entwickelter Klone

 

Lage des Keim-strei-fen ermög-licht Mar-kie-rung

Kon-takt Trop-fen + Mem-bran, Über-gang DiI

Mar-kie-rungen ohne Verlet-zung der Zellen

Block-schale lebend

norma-le Keim-streifen

entwik-kelte Klone

ins Marsu-pium erfolg-reich zurückgege-ben

im Marsu-pium gefun-den

norma-le Keim-streifen

entwik-kelte Klone

Vor Mar-kie-rung

~80%

 

 

 

 

 

 

 

 

 

nach 30 s

 

~70%

 

 

 

 

 

 

 

 

nach 2 min

 

 

~40%

 

 

 

 

 

 

 

Diese 40% werden als neue 100% eingesetzt.

nach < 24 h

 

 

 

80%

50%

~30%

 

 

 

 

nach 24 h - 72 h

 

 

 

 

 

 

80%

40%

20%

~10%

nach > 72 h

 

 

 

 

 

 

80%

40%

20%

~5%

Tab. 4 Markierungen Zellen insgesamt

Entwickelte Klone insgesamt

entwickelte laterale Klone

entwickelte Klone in der Mittellinie.

N = 80

n = 11

n = 69


19

Tab. 5 Markierung laterale Zellen

 

Fixierung vor der ersten Teilung

Fixierung nach der ersten Teilung

Fixierung nach der zweiten Teilung

Fixierung nach der dritten Teilung

Fixierung nach Fusion des Keimstreifens, Klone entwickelt

Markierung vor der ersten Teilung

2 (Abb. 8.A)

 

 

 

 

Markierung vor der ersten Teilung

 

2 (Abb 8.B.)

2 (Abb 8.C)

2 (Abb. 8.D)

 

Markierung nach der ersten Teilung

 

 

1 (ohne Abb.)

 

 

Markierung nach der dritten Teilung

 

 

 

 

10 ( ohne Abb.)


20

Tab. 6 Markierungen Mittellinienzellen

 

Fixierung nach der ersten Teilung

Fixierung nach der zweiten Teilung

Fixierung nach der nach der dritten Teilung

vor Trennung des Keimstreifens

Fixierung nach der nach der dritten Teilung

während der Trennung des Keimstreifens

Fixierung nach der nach der dritten Teilung nach Fusion des Keimstreifens

Markierung vor der ersten Teilung

2

(Abb. 10.A)

0

2

(Abb. 10.C)

 

 

Markierung nach der ersten Teilung

 

 

5

(Abb. 10.B)

 

 

Markierung von a0-c0 nach der zweiten Teilung

 

 

12

(Abb. 13.A)

9

(Abb. 13.B-F)

 

Markierung von d0 nach der zweiten Teilung

 

 

5

(Abb. 14.A, B)

5

(Abb. 14.C-M)

 

Markierung von a0 nach der zweiten Teilung

 

 

 

 

4

(Abb. 19.C)

Markierung von b0 nach der zweiten Teilung

 

 

 

 

3

(Abb. 19.D, E)

Markierung von c0 nach der zweiten Teilung

 

 

 

 

5

(Abb. 19.A, B)

Markierung von d0 nach der zweiten Teilung

 

 

 

 

20

(Abb. 21-24)

Tab. 7 Verteilung der markierten MNB-Klone im Thorax

Anterior des Thorax

T 1

T2

T 3

T 4

T5

T 6

T 7

T 8

posterior des Thorax

0

0

1

1

6

4

5

3

0

0


21

2.3. Markieren von Porcellio mit BrdU

Die Embryonen wurden zwischen 10 min und 120 min in einer BrdU Lösung von 5 mg/ml inkubiert, anschließend in Bodian-Lösung fixiert, 4x15 min in PBS gewaschen, 20 min in 2N HCl inkubiert, 4x15 min in PBS gewaschen, über Nacht mit dem primären Antikörper inkubiert, 4x30 min in PBS gewaschen, 4 h mit dem sekundären Antikörper inkubiert, 4x30 min in PBS gewaschen und in Glycerin eingebettet.

2.4. Anfertigen von Schnitten von Porcellio

Die Embryonen wurden mit Bouin'scher Lösung fixiert, in Technovit 7200 (Kulzer) eingebettet und mit einem Reichert-Jung Mikrotom in Schnitte von 3µm Dicke geschnitten und mit Toluidinblau gefärbt.

2.5. Markieren von Orchestia und Porcellio mit Antikörpern

Getestete Antikörper

An Embryonen von Porcellio wurden Antikörper gegen folgende Proteine getestet: Fasciclin I, Fasciclin II, Lethal-of-scute, Orthodenticle, Gooseberry-distal, Gooseberry-proximal, Horse-radish-peroxidase, Engrailed (4D9), Even-skipped (3C10 und 2B8), Spalt, Crustacean Cardioactive Peptide und der Antikörper 22C10, der bei der gleichnamigen Drosophila enhancer trap Linie Proteine in Mittellinienzellen markiert. Eine distinkte Färbung lieferten die Antikörper 4D9 und 2B8 gegen Engrailed und Even-skipped. Der Antikörper 2B8 lieferte nur wenige gute Färbungen, deren Zahl nicht ausreichte für eine Auswertung. Der Antikörper 4D9 liefert reproduzierbare Resultate. Er wurde verwendet für Markierungen von Porcellio und Orchestia.

Färbung mit dem Anti-Engrailed Antikörper 4D9

30 min Fixierung in PEMFA, 3 x 5 min PBS, 1 x 30 min PBS, 30 min PBT+N, über Nacht primärer Antikörper : PBS 1 : 1, 3 x 5 min PBT, 4 x 30 min PBT, 30 min PBT+N, über Nacht sekundärer Antikörper : PBS 1 : 200, 3 x 5 min PBT, 4 x 30 min PBT, 15 min PBT + DAB (200 µl PBT, 100 µl DAB), 10 min 3% H2O2 zu den 300 µl PBT/DAB µl, 10 min PBS, 10 min Bisbenzimid, 10 min Aqua dest.

2.6. Dokumentation im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop

Ein Teil der BrdU und DiI markierten Embryonen wurde mit Konfokalen Laser Scanning Mikroskopen des Instituts für Physiologie, UKBF, FU Berlin (Zeiss), des Instituts für Neurobiologie, FU Berlin (Leica) und der AG Membranphysiologie des Instituts für Biologie, HU Berlin (Leica) analysiert und dokumentiert. Dabei wurden Software-Programme für die Funktion


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des Extended Focus verwendet. Diese Technik liefert für die BrdU Markierungen Daten, deren

Qualität vergleichbar ist mit solchen eines Zeiss Axiophot. Für die DiI Markierungen erwies sich, daß sie nach der Fixierung in der für den Transport zum Mikroskop benötigten Zeit von einer bis zwei Stunden ausbleichen und einen stärkeren Hintergrund entwickeln.


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Tue Apr 25 19:05:46 2000