Gerberding, Matthias: Cell lineage und engrailed Expression in der Mittellinie der höheren Krebse Orchestia cavimana und Porcellio scaber

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Kapitel 4. Diskussion

4.1. Vergleich von Mustern der Entwicklung und ihre Homologisierung

In der Einleitung wurde der Gedanke vorgestellt, daß die Embryonalentwicklung einer Art untersucht werden kann, ohne gleichzeitig Fragen nach ihrer Stammesgeschichte und nach der Embryonalentwicklung anderer Arten nachzugehen, daß die Stammesgeschichte einer Art dagegen nur im Vergleich mit anderen Arten geklärt werden kann und daß in mehreren Fällen die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen Taxa in Abwesenheit anderer Merkmale gerade durch den Vergleich der Embryonalentwicklung erhellt werden können. In der Diskussion soll ein Vergleich durchgeführt werden zwischen der Entwicklung der Mittellinie von Orchestia und Porcellio und ihrer Entwicklung in anderen Taxa, die eine Mittellinie aufweisen. Ziel ist es dabei, die Homologie von Merkmalen zu begründen und damit einen Beitrag zu leisten zur Rekonstruktion der Stammesgeschichte, also einer Rekonstruktion der Neubildung, des Verlustes und der Abwandlung von Merkmalen und der Aufspaltung von Linien in Schwestergruppen.

Grenzen des Vergleichs und der Homologisierung

Wie weit die vergleichende Betrachtung fruchtbar sein und zur Begründung von Homologien führen kann, wird von zwei Umständen bestimmt. Zum einen wird sie dadurch limitiert, wieviel Daten für andere Taxa verfügbar sind zum Ablauf der Prozesse, die bei Orchestia untersucht wurden, also vom Stand der entwicklungsbiologischen Forschung. Zum andern hängt sie davon ab, wie weit es über die Verwandschaftserhältnisse zwischen Orchestia und den in den Vergleich einbezogenen Taxa gut begründete Hypothesen gibt, also vom Stand der phylogenetischen Forschung.

Eine vergleichende Betrachtung der Muster muß deshalb drei Bedingungen unterscheiden. Wenn sie sich stützen kann auf eine gut begründete Verwandschaftshypothese, kann abgeleitet werden, welches Muster der Entwicklung als vermutlich ursprünglich anzusehen ist und welche Abwandlung es in der Evolution erfahren hat. Wenn mehrere Verwandschaftshypothesen konkurrieren, kann deutlich gemacht werden, welche Aussage zur Evolution der Muster der Entwicklung gilt, folgt man der einen oder der anderen Hypothese; außerdem können mit Gemeinsamkeiten von Mustern einzelne Verwandschaftshypothesen unterstützt werden. Wenn keine ausreichend begründete Verwandschaftshypothese existiert, können nur Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Muster der Entwicklung beschrieben werden, es kann aber nichts über ihre Evolution abgeleitet werden.

Stand der entwicklungsbiologischen Forschung


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Die Zahl der Untersuchungen, die mit gleichen oder ähnlichen Methoden gleiche Stadien

untersucht haben, ist für die Taxa der Arthropoden verschieden. Dies ist durch Ungleichheiten im Interesse an Organismen und in der Verfügbarkeit von Techniken bedingt. Der Schwerpunkt der entwicklungsbiologischen Forschung an Arthropoden liegt heute auf Drosophila. Die Entwicklung der DiI Markierung von sogenannten neural progenitors liegt vier Jahre zurück ( Bossing und Technau 1994), die Herstellung von anti-BrdU Antikörpern sechzehn ( Gratzner 1982), die von anti-Engrailed Antikörpern neun ( Patel et al. 1989a). Die anti-Engrailed Markierung und die DiI Markierung wurden an Drosophila entwickelt, die anti-BrdU Markierung an Zellkulturen. Über den Einsatz der DiI Markierung an anderen Arthropoden liegen keine Veröffentlichungen vor. Eine Reihe von anderen Farbstoffen, zum Beispiel Fluoresceine, werden schon seit längerem in Studien der cell lineage eingesetzt ( Goodman 1982; Condron und Zinn 1994; Ho und Kimmel 1993; Kimmel et al. 1994; Papan und Campos-Ortega 1997). Die BrdU Markierung hat breite Anwendung in Untersuchungen an Arthropoden und anderen Metazoen gefunden ( Shain et al. 1998; Shepherd und Bate 1990; Whitington et al. 1991; Harzsch und Dawirs 1994; Papan und Campos-Ortega 1997). Der anti-Engrailed Antikörper wurde gegen ein konserviertes Epitop des Engrailed-Proteins hergestellt und seine Kreuzreaktivität wird zur Untersuchung der Expressionsmuster anderer Arthropoden und Metazoen genutzt ( Patel et al. 1989a, b).

Die für einen Vergleich herangezogenen Daten fallen in zwei Kategorien. Die eine Sorte Daten liefert Angaben zur Morphologie; teilweise enthalten diese auch Angaben über die engrailed Expression. Auf dieser Basis kann die Entwicklung von Zellgruppen wie zum Beispiel Keimblättern oder Organanlagen verglichen werden. Die Bildungsweise der Ganglien ist an Vertretern verschiedener Gruppen innerhalb der Krebse, Insekten, Tausendfüßler und Cheliceraten untersucht (Übersicht bei Anderson 1973; weitere Angaben s.u.). Das Muster der frühen Axone kennt man für wenige Insekten und malakostrake Krebse und für einen Vertreter der Tausendfüßler ( Thomas et al. 1984; Whitington et al. 1991, 1993, 1996). Das Muster der engrailed exprimierenden Neurone liegt für Schistocerca und Drosophila vor ( Condron und Zinn 1994; Condron et al. 1994; Patel et al. 1989c). Die andere Sorte von Daten enthält neben den Angaben über Morphologie und engrailed Expression zusätzlich Aussagen über cell lineages identifizierter Zellen. Mit der cell lineage ist die Herkunft der Zellen und die Genealogie ihrer Tochterzellen impliziert und eine zusätzliche Ebene für einen Vergleich nutzbar. Daten, die Informationen zu cell lineages enthalten, liegen für die Vertreter der malakostraken Krebse und für die Insekten Schistocerca und Drosophila vor. Bei malakostraken Krebsen sind cell lineages und engrailed Expression für die Stadien der Bildung des Keimstreifens und der frühen Neurogenese beschrieben ( Dohle 1970, 1972, 1976a; Scholtz 1984, 1990, 1992a; Scholtz et al. 1993, 1994); bei Schistocerca und Drosophila sind es die cell lineages und die engrailed Expression der frühen und mittleren Neurogenese und der Axonogenese ( Condron und Zinn 1994; Condron et al. 1994; Bossing und Technau 1994; Bossing et al. 1996; Schmidt et al. 1997; Broadus et al. 1995).


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Stand der phylogenetischen Forschung

Große Teile der Verwandschaftsverhältnisse innerhalb der Arthropoden sind unstrittig. Hierzu gehört die Zugehörigkeit von Orchestia zu den Malakostraken und die Zugehörigkeit der Malakostraken zu den Krebsen insgesamt und das Schwestergruppenverhältnis zwischen Mandibulata und Chelicerata; auf dieser Ebene können also Muster der letzten gemeinsamen Vertreter und ihre Abwandlung in den Teiltaxa rekonstruiert werden. Strittig dagegen sind die Fragen nach der Schwestergruppe der Malakostraken, die Frage nach der Schwestergruppe der Krebse und die Frage nach der Schwestergruppe der Arthropoden. Als Schwestergruppe der Malakostraken werden die Maxillopoda favorisiert ( Brusca und Brusca 1990; Schminke 1996), darüber hinaus lassen sich spezifischen Übereinstimmungen der Malakostraken mit den Insekten finden ( Scholtz 1992b; Wiens und Wolf 1993; Nilsson und Osorio 1997). Über den Umfang der Schwestergruppe der Krebse konkurrieren zwei Hypothesen, von denen die eine nur die Insekten umfaßt, die andere die Insekten und die Tausendfüßler ( Friedrich und Tautz 1995; Averof und Akam 1995; Dohle 1996b, 1997). Als Schwestergruppe der Arthropoden werden die Anneliden und ein Taxon derjenigen Nemathelminthen, die sich häuten, diskutiert ( Brusca und Brusca 1990; Westheide 1996; Aguinaldo et al. 1997; Schmidt-Rhaesa et al. 1998).

4.2. cell lineage in der Mittellinie

4.2.1. Bildung des Keimstreifens

Bildung der Mittellinie in einem Gitter

Im postnauplialen Abbschnitt des Keimstreifens von Malacostraca sind die Zellen in einem Gitter angeordnet ( Bergh 1893; Dohle 1970; Scholtz 1992a). Das Gitter bei Orchestia wird dadurch gebildet, daß sich Zellen im Ektoderm des postnauplialen Teils des Keimstreifens parallel in Querreihen anordnen. Diese Art der Bildung eines Gitters hat Orchestia gemeinsam mit den übrigen Amphipoden ( Scholtz 1990). Das Gitter wird bei den anderen Gruppen der Malacostraca dadurch gebildet, daß sich Stammzellen, die Ektoteloblasten, in einer Querreihe anordnen und durch mehrfache, inäquale Längsteilungen Tochterzellen nach anterior abgeben ( Dohle 1970; Scholtz 1992a). Unabhängig von der Bildungsweise besteht bei allen Malacostraca jede Querreihe des Gitters aus einer unpaaren, medianen Zelle und einer gleichen Zahl von lateralen Zellen zu beiden Seiten ( Dohle 1970; Scholtz 1992a). Für die lateralen Zellen läßt sich mit morphologischen Methoden zeigen, daß die Zellteilungen nach der Bildung der Reihen nach einem festgelegten Muster verlaufen ( Dohle 1970, 1976a; Scholtz 1992a). In den ersten beiden Teilungen zeigen die lateralen Zellen ein gemeinsames Muster, in dem sich jede Zelle zweimal in Längsrichtung teilt. In der dritten, sogenannten ersten differentiellen Teilung und weiteren Teilungen, die bis zur vierten differentiellen Teilung, also bis zur sechsten nach der Bildung der Reihen, dokumentiert wurden,


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zeigen die Zellen unterschiedliche Orientierung und Äqualität ( Dohle 1970; 1976a; Scholtz 1992a).

Für die medianen Zellen ist für die Reihen, die die Anlagen der Thoraxsegmente bilden, mit der DiI Färbung gezeigt worden, daß ihr Zellteilungsmuster festgelegt ist vom Zeitpunkt der Bildung der Reihen bis zum Schlüpfen des Embryos. Das Muster stimmt in den ersten beiden Teilungen überein mit dem der lateralen Zellen, in dem zwei Längsteilungen zur Bildung von a0, b0 c0 und d0 führen. Anders als die lateralen Zellen a1,2,3... - d1,2,3... zeigen die Zellen a0 - d0 auch in der dritten Teilung noch ein gemeinsames Muster, in dem eine weitere Teilung in Längsrichtung zur Bildung der Zellen a0', a0'', b0', b0'', c0' und c0' sowie d0 und d0* führt. Nach dieser Teilung zeigen auch die Mittellinienzellen Unterschiede im Zellteilungsmuster. Die Zellen a0', a0'', b0', b0'', c0' und c0' teilen sich bis zum Schlüpfen nicht mehr, die Zelle d0 teilt sich weiter und bildet einen Klon von ~ 10 Tochterzellen. Für die Klärung dessen, wie häufig sich d0 teilt ob sich auch die Tochterzellen der Zelle d0 teilen und, falls ja, wie häufig, sind Experimente nötig, in denen diese Zellen unmittelbar nach einer Teilung der Zelle d0 markiert werden.

Zwischen den lateralen Zellen und denen der Mittellinie bestehen Unterschiede. Der erste betrifft die Zellen a0, b0 und c0, der zweite die Zelle d0. Die Zellen a0' - c0'' der cell lineages von a0, b0 und c0 beenden nach der ersten differentiellen Teilung eine Proliferation; für die lateralen Zellen ist keine derartige cell lineage bekannt. Für die Zelle d0 legen es die Aufnahmen der Klone der Tochterzellen nahe, daß sämtliche Tochterzellen zu Neuronen differenzieren; bis zu Markierungsexperimenten der Zellen d0*, d**... ist es jedoch nicht gesichert. Trifft es zu, wäre die Zelle d0 schon bei der dritten Teilung nach Bildung der Reihen als Stammzelle für Neurone festgelegt. Dieser Zeitpunkt liegt vor dem der lateralen Zellen. Bei den lateralen Zellen treten die ersten inäqualen Teilungen, die gleichgesetzt werden mit der Abgabe von Vorläufern für Neurone, auf nach der vierten Teilung bei den Zellen d1h und b1h und nach der fünften Teilung bei den Zellen a1ie, c1hin, c1hen, d1vin und anderen.

Bildung einer Mittellinie

Die Bildung einer Mittellinie gleichzeitig mit einem Gitter im postnauplialen Ektoderm ist auf die Malacostraca beschränkt, die Bildung einer Mittellinie überhaupt dagegen ist weit verbreitet bei den Arthropoden. Außerhalb der Malacostraca ist bei den Branchiopoden eine Mittellinie beschrieben. Bei Leptodora kindti (Cladocera) entwickelt sich die Mittellinie im Stadium der Bildung des Keimstreifens aus einer morphologisch homogenen Schicht Ektodermzellen. Nach der Verlängerung tritt eine Mittellinie als Längsreihe kleinerer unpaarer Zellen hervor, die flankiert wird von größeren Zellen, die sich später als Neuroblasten teilen ( Gerberding 1997). Der Zeitpunkt der morphologischen Differenzierung der Mittellinie liegt damit bei Leptodora später als bei den Malacostraca. In Schnitten von Leptodora sind tangentiale Teilungen der Mittellinienzellen quer zur Längsachse zu sehen und in Totalpräparaten findet sich ein zwei bis drei Zellen breiter


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Mittelstrang, also breiter als bei Orchestia ( Gerberding 1997; Abb. 6, 7). Bei den Branchiopoden

Simocephalus vetulus, Acantholebris curvirostris und Artemia franciscana ist für Embryonen im Stadium der Anlage der Extremitäten eine unpaare Mittellinie zu erkennen ( Olesen 1998, Abb. 11; Manzanares et al. 1993, Abb. 5, 6; Manzanares 1996, Abb. 2; Freeman 1989, Abb. 1).

Bei Embryonen von Insekten ist ebenfalls klar eine Mittellinie auszumachen. Bei Drosophila ist die Bildung der Mittellinie gut untersucht. Drosophila ist ein Langkeim, bei dem die Segmente aller Körperabschnitte gleichzeitig angelegt werden. Die prospektiven Mittellinienzellen sind als Zellen der paarigen Mesektodermanlagen schon vor der Gastrulation molekular charakterisierbar ( Thomas et al. 1988). Während der Gastrulation fusionieren die Anlagen der rechten und linken Seite zu einer paarigen Mittellinie ( Klämbt et al. 1991). Untersuchungen an Kurzkeimen, bei denen die Segmente schrittweise gebildet werden (Xiphidium: Wheeler 1891, 1893; Locusta: Roonwal 1936, 1937; Bate und Grunewald 1981; Schistocerca: Bastiani et al. 1992; Hydrophilus: Heider 1889; Tribolium: Ullmann 1964) lassen ab dem Stadium der Gangliogenese eine Population medianer Zellen erkennen. In den Angaben zur Gastrulation und Bildung des Keimstreifens ist nicht eindeutig bestimmt, wie der Modus der Bildung ist, ob die Mittellinienzellen wie bei Drosophila unmittelbar bei der Bildung des Segments aus lateral angelegtem Mesektoderm hervorgehen oder wie bei Leptodora nach Bildung des Segments aus einer Schicht gleichförmiger Ektodermzellen.

Für Myriapoden liegen mehrere Nachweise eines Stranges medianer Zellen in den embryonalen Ganglien vor. Dabei gilt Ähnliches wie das für die Insekten Gesagte, wo seine Existenz nachgewiesen ist, fehlen befriedigende Erklärungen über die Herkunft. Bei Pauropoden und Symphylen geht aus dem Ektoderm ein als median cord bezeichneter Mittelstrang hervor ( Tiegs 1940, 1947). Bei dem Vertreter der Pauropoden, Pauropus sylvaticus, sind median zusätzlich zu den ventral gelegenen, ektodermalen Zellen noch dorsal gelegene, mesodermale gefunden worden, und nur die mesodermalen, nicht die ektodermalen sollen an der Bildung der Ganglien beteiligt sein ( Tiegs 1947). Bei dem Diplopoden Glomeris marginata bilden die Zellen zwischen den Ganglienanlagen keine morphologisch spezialisierte Zellpopulation ( Dohle 1964, Abb. 26.b).

Bei dem Chilopoden Scolopendra sind für die Region zwischen den Ganglienanlagen zwei verschiedene Sorten von Zellen beschrieben worden ( Heymons 1901): Zellen einer medianen, einschichtigen membrana ventralis und Zellen eines Mittelstranges. Der Mittelstrang wird paarig angelegt und die Zellen liegen in frühen Stadien mehrschichtig unmittelbar an denen der Ganglienanlagen ( Heymons 1901, Abb. 51). Sie setzen sich dann von der Ganglienanlage ab und liegen einschichtig ( Heymons 1901, Abb. 50, 68, 70) und fusionieren später median zu einer mehrschichten, keilförmigen Anlage ( Heymons 1901, Abb. 69). Die Ausbildung der Zellen der membrana ventralis bei Scolopendra ist in Zusammenhang zu sehen mit der Trennung der Keimstreifenhälften, die im folgenden Abschnitt ausführlich behandelt wird. Für Scutigera coleoptrata (Chilopoda) sind zwei Typen medianer Zellen beschrieben worden ( Knoll 1974, Abb. 48), für Lithobius forficatus (Chilopoda) nur ein Typ medianer Zellen ( Hertzel 1984, Abb. 9).


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Innerhalb der Chelicerata sind bei den Amblypygi in weit entwickelten Ganglien dort, wo die Kommissuren verlaufen, mediane Zellen beschrieben worden, in anderen Teilen der Ganglien und in früheren Stadien fehlen sie ( Weygoldt 1975). Bei Xiphosura, die an der Basis der Chelicerata stehen, sind mediane Zellen nur für das Gehirn, nicht für das Bauchmark beschrieben ( Kingsley 1893a, b; Scholl 1977), bei Chelonethi und Pantopoden wurden keine Mittellinienzelllen beschrieben ( Weygoldt 1964; Winter 1980).

Für Paraperipatus amboiensis als Vertreter der Onychophora gilt, daß während der Gastrulation sogenannte mediane Faserzellen die prospektiven Entodermzellen, die über eine rechte und eine linke Einwanderungszone einwandern, voneinander trennen, später dann aber nicht mehr unterschieden werden können von den übrigen Ektodermzellen ( Pflugfelder 1948, Abb. 9). Für eine Homologie zu den Mittellinienzellen von Krebsen und Insekten spricht die mediane Lage der Zellen, gegen eine Homologie, daß sie nach der Gastrulation nicht mehr unterschieden sind von den übrigen Zellen. Von Taxa außerhalb der Arthropoden liegt keine morphologische Beschreibung einer Population unpaarer Mittellinienzellen vor.

Solange die Entwicklung der unterschiedlichen median gelegenen Zellen nicht besser bekannt ist, bleibt unklar, ob es sich bei der Population von Zellen in der Mittellinie um einen einmal entstandenen Zelltyp handelt oder um einen mehrfach unabhängig evolvierten Zelltyp. Hinweisen auf Mittellinienzellen in den Taxa der Arthropoden stehen Untersuchungen an anderen Taxa gegenüber, die keine derartigen Zellen zeigen. Die Angaben über die Taxa der Myriapoden, den Chilopoden, Pauropoden und Symphylen, und über Leptodora als Vertreter der nicht-malakostraken Krebse beschreiben distinkte Mittellinienzellen ( Heymons 1901; Tiegs 1941, 1947; Gerberding 1997). Sie stützen deshalb die Annahme, daß bei der Stammart der Mandibulata unpaare Mittellinienzellen im Verlauf der Embryogenese differenziert werden.

4.2.2. Trennung der Keimstreifenhälften

Die vorübergehende Trennung des Keimstreifens entlang der Längsachse tritt innerhalb der Crustacea nur bei Amphipoden auf. Sie ist unterschiedlich stark ausgeprägt bei verschiedenen Amphipoden. Bei Gammarus pulex ist sie weniger deutlich als bei Orchestia cavimana ( Scholtz 1990, 1997b). Angaben zu Orchestia littorea zeigen eine Ausprägung in noch geringerem Umfang als bei Gammarus pulex ( Rossiiskaya 1888). Bei Gammarus und Orchestia wird gleichzeitig mit der Trennung eine Beugung der Keimstreifen nach ventral beobachtet. Gammarus zeigt eine Trennung in einem geringen Umfang gefolgt von einer frühen Ventralkrümmung ( Scholtz 1990). Bei Orchestia setzt die Trennung füher und in deutlicherem Umfang ein als bei Gammarus, und eine Ventralkrümmung folgt später als bei Gammarus (diese Studie).

Neben den Amphipoden wird die Trennung der Keimstreifenhälften innerhalb der Arthropoda bei


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einer Teilgruppe der Myriapoden, den Chilopoden, und bei einer Teilgruppe der Chelicerata, den

Araneen, gefunden ( Heymons 1901; Wallstabe 1908; Whitington et al. 1991). Bei den Chilopoden ist die Teilung entlang der Längsachse verbunden mit einem Knick des Embryos auf der Ventralseite, bei dem anteriore und posteriore Hälften nebeneinander zu liegen kommen ( Heymons 1901; Whitington et al. 1991). Bei den Araneen findet sich kein Knick, und die Anlagen der Extremitäten und Ganglien sind während der Verlängerung des Keimstreifens nach dorsal verlagert ( Wallstabe 1908). Über das Verhalten der Ektodermzellen während der Trennung ist für Chilopoden und Araneen nichts Genaueres bekannt. Es ist unklar, welche Ektodermzellen bei den Taxa an der Trennung des Keimstreifens beteiligt sind und ob wie bei Orchestia der Mechanismus einer Dehnung der Mittellinienzellen verwendet wird oder zusätzlich oder statt dessen der anderer Zellen oder ein anderer Mechanismus.

Die große morphologische Plastizität der Mittellinienzellen und die große Distanz zwischen den beiden Keimstreifenhälften wirft Fragen nach der Physiologie des Embryos während der Trennung auf. Dazu gehören, wie weit die Mittellinienzellen bereits vor der Trennung determiniert sind, wie das molekulare Substrat der Determination während der Trennung aufrechterhalten wird, ob die Mittellinienzellen während der Trennung Signale austauschen, ob die Zellen der lateralen Anlagen Signale austauschen und ob diese Signale intrazellulär in den Mittellinienzellen transportiert werden oder im extrazellulären Raum zwischen den Mittellinienzellen. Die Fragen können an einem geeigneten System experimentell geklärt werden.

Die Verteilung des Merkmals läßt auf eine konvergente Evolution schließen. Es ist unklar, welchen Vorteil die Evolution einer Trennung des Keimstreifens bietet. Bei einer großen Zahl von Araneen, Insekten, Myriapoden und Krebsen findet sich ein nach ventral gekrümmter Keimstreifen ( Anderson 1973). Möglicherweise stellt dies den für die Arthropoden ursprünglichen Zustand dar. Einer der sekundär entwickelten Typen von Keimstreifen ist der gerade Keimstreifen wie zum Beispiel bei dem Käfer Hydrophilus ( Heider 1889). In manchen Fällen breiten sich die Keimstreifen vorübergehend auf die Dorsalseite aus, zum Beispiel bei Drosophila ( Campos-Ortega und Hartenstein 1997) und der Assel Limnoria ( Strömberg 1964). Für Araneen ist es denkbar, daß die Trennung des Keimstreifens den Vorteil eines Längswachstums ohne Ventralkrümmung bietet. Amphipoden dagegen zeigen eine Trennung und eine Ventralkrümmung des Keimstreifens. Der Vorteil einer Trennung bei Amphipoden nach Bildung des Keimstreifens und vor einer Ventralkrümmung liegt möglicherweise in der Möglichkeit zu frühem Längswachstum.

4.2.3. Bildung der Ganglienanlagen

Neuronale versus gliale cell lineage in der Mittellinie

Die Diskussion behandelt in diesem Abschnitt die lineages der Mittellinie insgesamt, in den


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folgenden Abschnitten werden nacheinander Vorläufer für Glia, mediane Neuroblasten und

mediane Neurone behandelt. Die cell lineages der Mittellinie von Orchestia sind neuronal und glial. Über neuronale cell lineages der Mittellinienzellen von Locusta, Schistocerca und Drosophila liegen eindeutige Daten vor ( Bate und Grunewald 1981; Goodman 1982; Thompson und Siegler 1991; Condron und Zinn 1994; Bossing und Technau 1994; Campbell et al. 1995); über gliale cell lineages in der Mittellinie von Schistocerca und Drosophila dagegen liegen einander widersprechende Daten vor ( Bate und Grunewald 1991; Condron und Zinn 1994; Condron et al. 1994; Klämbt und Goodman 1991; Klämbt et al. 1991; Bossing und Technau 1994; Ito et al. 1995; Awad und Truman 1997).

Schistocerca

Locusta hat acht Mittellinienzellen, sieben median precursors, abgekürzt MPs, und einen sogenannten medianen Neuroblasten, abgekürzt MNB. Die MPs MP1, MP3, MP4, MP5 und MP6 sind unpaar, der MP2 tritt paarig der rechten und linken Seite auf als MP2L und MP2R ( Bate und Grunewald 1981). Dieses Muster ist auch für Schistocerca beschrieben ( Goodman 1982). Die sieben MPs von Schistocerca teilen sich jeweils einmal, und ihre Tochterzellen differenzieren zu Neuronen ( Goodman 1982). Die Neurone der MPs MP1, MP2L+MP2R und P3 sind Interneurone, aus MP1 gehen zwei ipsilaterale Interneurone hervor, aus MP2L+MP2R gehen v(für ventral)MP2R, d(für dorsal)MP2R, vMP2L und dMP2Lhervor, aus MP3 die H-Zelle und die Hsib(für sibling)-Zelle ( Goodman 1982; Goodman et al. 1984). Von den Neuronen der Zellen MP4, MP5 und MP6 ist der frühe Verlauf der Axone bekannt. Die Axone wachsen entlang des medianen Fasertraktes und teilen sich dann an den Kommissuren in zwei Äste ( Goodman 1982). Die Axone der MP4 und MP5 Neurone teilen sich an der anterioren Kommissur, die des MP6 an der posterioren. Die Axone der MP5 Neurone verlaufen im medianen Fasertrakt und in den Kommissuren ventral von denen der MP4 Neurone ( Goodman 1982). Der MNB erzeugt die sogenannten dorsal unpaired median neurons, kurz DUM Neurone, von denen im dritten Thoraxsegment ca. 90 beim Schlüpfen vorliegen ( Goodman und Spitzer 1979; Thompson und Siegler 1991). Drei Arten von DUM Neuronen werden unterschieden, efferente Motoneurone, lokale Interneurone und intersegmentale Interneurone. Der MNB erzeugt die Neurone in der genannten Reihenfolge in drei aufeinander folgenden Phasen ( Goodman 1982; Thompson und Siegler 1991). Der Zeitraum zwischen dem Beginn und dem Ende der Teilungsaktivität des MNB und die Zusammensetzung der Population der DUM Neurone unterscheiden sich zwischen Thorax und Abdomen ( Thompson und Siegler 1993).

Diese Daten wurden mit Lebendbeobachtungen im Differential-Interferenz-Kontrast und mit Lucifer Yellow Färbungen differenzierter Neurone gewonnen. Ergebnisse eines anderen experimentellen Vorgehens, in denen der MNB mit Fluorescein markiert wurden, liefern ein anderes Bild ( Condron und Zinn 1994). Zum einen machen sie es wahrscheinlich, daß die Neurone,


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die als Abkömmlinge von MP4, MP5 und MP6 gelten, stattdessen Abkömmlinge des MNB sind.

Die Neurone des Typs MP4 zeigen die Morphologie von Motoneuronen, die des Typs MP6 von Interneuronen ( Condron und Zinn 1994). Zum andern ergaben die Experimente, daß der MNB neben den genannten Neuronen auch Glia produziert und es sich um einen Neuroglioblast handelt ( Condron und Zinn 1994).

Die von den Mittellinienzellen abgeleiteten Neurone sind in einer Ebene annähernd parallel zur Oberfläche angeordnet, wobei der Klon des MNB am Hinterrand der Ganglienanlage liegt ( Bate und Grunewald 1981, Abb. 1; Condron et al. 1994, Abb. 5).

Drosophila

Ähnlich wie bei Schistocerca lieferten bei Drosophila verschiedene experimentelle Methoden unterschiedliche Ergebnisse zu Zahl und lineage der Mittellinienzellen. Im Elektronenmikroskop wurden sechs Gliazellen der Mittellinie gefunden ( Jacobs und Goodman 1989a). Mithilfe der Antikörper gegen Engrailed (für den MNB), die Antigene SOX2, 22C10 (für VUM Neurone) und Fushi-tarazu (für MP1) sowie beta-GAL Färbungen von enhancer trap Linien (AA142 für die vorher genannten und für Gliazellen) wurden acht Mittellinienzellen gezählt, MP1 und MNB und je drei Voläufer für Glia und VUM Neurone ( Klämbt und Goodman 1991). An Schnitten wurden vier Mittellinien-Gliazellen gezählt ( Ito et al. 1995). Mithilfe von Doppelfärbungen mit beta-GAL von single-minded beta-GAL Linien und Antikörpern gegen Engrailed wurde eine variable Zahl von 6-10 Mittellinienzellen gezählt bei einem Durchschnitt von 7,5 ( Bossing und Technau 1994). Eine beta-GAL Färbung einer bereits bekannten enhancer trap Linie (AA142; Klämbt und Goodman 1991) und einer neu untersuchten (P626) färbt eine variable Zahl von 2 -5 Gliazellen, 2 - 3 dorsal und 1- 2 ventral ( Awad und Truman 1997). Bei Verwendung der in der vorliegenden Arbeit für Orchestia adaptierten Technik, der Markierung von Zellen mit DiI, wurde eine Zahl von sieben Mittellinienzellen errechnet aus der Häufigkeit der aufgetretenen Zelltypen ( Bossing und Technau 1994). Während die erstgenannten Verfahren Zellkerne darstellen, liefert die DiI Markierung auch Daten über die Morphologie der Zellkörper und die Differenzierung der Zellen zu Neuronen und Glia und die Verzweigung der Axone, die sich am meisten für den Vergleich mit Orchestia eignen.

Nach der Markierung von Mittellinienzellen mit DiI lassen sich fünf verschiedene Typen von Klonen finden, Paare von Gliazellen, drei unterschiedliche Typen von Paaren von Neuronen und ein Typ, der mehrere Neurone umfaßt ( Bossing und Technau 1994). Die zwei Gliazellen des einen Typs von Klon umkleiden in der Regel die anteriore und posteriore Kommissur eines Segments ( Bossing und Technau 1994). Die Neuronenpaare der drei unterschiedlichen Typen von Klonen sind ventral unpaired median neurons, kurz VUM Neurone, MP1 Neurone und unpaired median interneurons, kurz UMI Neurone ( Bossing und Technau 1994). Der Klon der MP1 Neurone ist aus zwei Interneuronen zusammengesetzt, die jenen des MP1 Klons von Schistocerca gleichen. Der Klon der UMI Neurone ist ebenfalls aus zwei Interneuronen zusammengesetzt, hat aber kein


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Pendant bei Schistocerca. Die Klone der VUM Neurone bestehen aus einem Inter- und einem Motoneuron und werden mit den DUM Motoneuronen von Schistocerca homologisiert ( Bossing und Technau 1994). Zu dem Klon, der mehrere Neurone umfaßt und als MNB Klon bezeichnet wird, gehören zwischen fünf und acht, in der Regel sechs Neurone, und zwar ein Motoneuron und mehrere Interneurone ( Bossing und Technau 1994). Da bei den Markierungen Paare des Typs VUM dreimal häufiger auftreten als alle übrigen Typen, wurde indirekt geschlossen, daß in der Mittellinie drei Vorläufer für die VUM-Neurone liegen und je ein Vorläufer für Glia, MP1, UMI und MNB. In einer kleinen Zahl von Fällen finden sich in Klonen Zellen des einen Typs, zum Beispiel Gliazellen, mit Zellen eines anderen, zum Beispiel MP1 ( Bossing und Technau 1994). Vor dem Schlüpfen der Larve sind die Mittellinienzellen ein einer Säule senkrecht zur Oberfläche angeordnet. Die Position der Säule in der Längsachse ist zwischen anteriorer und posteriorer Kommissur, in der Dorsoventralachse sind ventral die VUM Neurone angeordnet, dann folgen nach dorsal die MNB Neurone, die UMI Neurone und die MP1 Neurone und schließlich die Glia ( Bossing und Technau 1994, Abb. 7).

Zu den Mittellinienzellen von Drosophila müssen auch die zwei MPs MP2L und MP2R gerechnet werden, die MP2L und MP2R von Schistocerca entsprechen. Sie wurden bei keiner der oben erwähnten Studie der Mittellinienzellen von Drosophila erfaßt, weil sie nicht in einer Reihe mit den übrigen MPs liegen wie MP2L und MP2R von Schistocerca sondern in der ventralen Reihe der drei Reihen lateraler Neuroblasten gefunden werden. In allen Studien von Drosophila werden sie deshalb zusammen mit den lateralen Neuroblasten aufgelistet ( Doe 1992; Goodman und Doe 1993; Broadus et al. 1995; Bossing et al. 1996).


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Abb. 34 Vergleich cell lineage und Differenzierung in der Mittellinie von Drosophila, Orchestia und Schistocerca. Den drei Vertretern gemeinsam ist, daß eine Stammzelle pro Segment differenziert wird: bei Drosophila ein MNB, bei Schistocerca ein MNGB, bei Orchestia ein MNB/MNGB. Die cell lineages der drei Vertreter unterscheiden sich in der Zahl der Teilungen vor der Differenzierung als Neuron oder Gliazelle, in der Zahl der Zelltypen und im Anteil der Zelltypen an der Gesamtzahl der Mittellinienzellen.


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Vergleich

Schistocerca und Drosophila zeigen in der Mittellinie gemeinsame Merkmale und Eigenheiten (Tab. 8). Den MPs MP1, MP2L und MP2R von Schistocerca entsprechen MPs mit der gleichen Bezeichnung von Drosophila. Dem MNB von Schistocerca entspricht der MNB von Drosophila nur zum Teil. Der MNB von Schistocerca erzeugt nacheinander die MPs MP4, MP5 und MP6, eine Anzahl Gliazellen und über 90 DUM Neurone ( Condron und Zinn 1994; Condron et al. 1994). Bei Drosophila bringt der MNB einen Klon mit nur sechs Zellen hervor und die VUM Neurone und die Gliazellen gehen aus separaten Vorläufern hervor. Den MPs MP3, MP4, MP5 und MP6 von Schistocerca entsprechen keine MPs von Drosophila. Die MPs für Glia und UMI Neurone von Drosophila haben keine Entsprechung zu MPs von Schistocerca. Gemeinsamkeiten zwischen Schistocerca und Drosophila liegen also im Auftreten von Mittellinienzellen der Typen MP1, MP2 und MNB (Tab. 8 und Abb. 34). Ein weiterer Unterschied ist die Anordnung der Mittellinienzellen parallel zur Eioberfläche bei Schistocerca und senkrecht bei Drosophila ( Bate und Grunewald 1981; Bossing und Technau 1994).

Der Vergleich der Mittellinienzellen von Orchestia mit Schistocerca und Drosophila zeigt Unterschiede in cell lineage, Zellschicksal und Zellzahl (Tab. 8 und Abb. 34). Cell lineage und Zellschicksal sind qualitative Merkmale, Zellzahl ist ein quantitatives. Die cell lineage von Orchestia beginnt mit einem gemeinsamen Vorläufer von Glia und Neuronen und spaltet sich dann auf. Aus ihr gehen zwei Typen von Zellen hervor, drei MPs für Glia und ein MNB. Aus der Mittellinie gehen allein durch die Tätigkeit des MNB insgesamt ~ 10 Neurone hervor. Bei Schistocerca finden sich in der Mittellinie getrennte lineages von vier MPs und eines medianen Neuroglioblast, der die übrigen drei MPs, Gliazellen und DUM Neurone abgibt ( Condron und Zinn 1994).

Aus der Mittellinie gehen also durch die MPs und den Neuroglioblasten ~ 100 Neurone hervor. Bei Drosophila werden in der Mittellinie drei Typen von cell lineages ausgebildet, ähnlich wie bei Schistocerca mehrere MPs für Neurone und wie bei Orchestia ein MP für Glia und ein MNB. Aus der Mittellinie gehen ~ 12 Neurone (~ 6 MNB Neurone + 3x2 VUM Neurone) hervor.

Die Anordnung der Zellen bei Orchestia ist ähnlich wie bei Drosophila, die Kerne des Klons der medianen Neuroblasten liegen zwischen anteriorer und posteriorer Kommissur in einem traubenförmigen Cluster, dessen Achse senkrecht zur Oberfläche verläuft.


69

Tab. 8 Cell lineages in den Mittellinien von Orchestia, Schistocerca und Drosophila. Homologe Neurone und Glia von Schistocerca und Drosophila und mutmaßliche homologe Neurone und Glia von Orchestia untereinander gruppiert.

 

Neu ro-ne

von

MNB

oder MNGB

 

Glia

von MP

oder MNGB

 

Neuro-ne

von MPs

oder MNGB

Neuro-ne

von MP

 

Sigma ML

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Or-chestia

MN/NGB 6-10 Neurone

1 Mo-ton. un-paar

1

In-tern.un-paar

3-5 In-tern.

a0

MP

Glia p. Komm.

b0

MP

Glia

c0

MP

Glia a. Komm.

 

 

 

 

 

 

 

3 MP

Glia 1

MNB

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Schisto-

cer-

ca

MN

GB

>50 Neurone + >20Glia

MP4 Klasse

MP5 Klasse

MP6 Klasse

Glia 2

pc Zel-len (p.

Komm.)

Glia 2

p Zel-len (hi.

Komm.)

Glia 2

ac Zel-len (a.

Komm.)

Glia ~20m, ic, a Zel-len

DUM

lok. In-tern.

DUM

Mo-ton.

DUM

interseg. In-tern.

MP1

MP3

 

2MP Neu-ron 1 MN

GB

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Droso-

phi-

la

MNB

6 Neurone

1 Mo-ton.

un-paar

5

In-tern.

 

 

 

MP

Glia (zw. Komm.)

 

VUM In-tern. + Mo-ton.

VUM In-tern. + Mo-ton.

VUM In-tern.+ Mo-ton.

MP1

MP3

UMI

5MPNeu-on

1 MP

Glia

1

MNB


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Mediane Neuroblasten bei anderen Arthropoden

Zwischen Orchestia, Schistocerca und Drosophila kann auf der Ebene der cell lineages der Mittellinienzellen ein Vergleich durchgeführt werden. Mit den übrigen Crustaceen und anderen Arthropoden kann ein Vergleich durchgeführt werden, ob in der Mittellinie der Zelltyp des medianen Neuroblasten auftritt.

Für die Malakostraken Cherax destructor und Porcellio sind in frühen und mittleren embryonalen Stadien Zellen gefunden worden, die in ihrer Größe, Lage und Teilungsrichtung einem MNB entsprechen ( Scholtz 1992a; diese Arbeit). Bei Hyas araneus findet sich in den Ganglien der Larven verschiedener Stadien mediane Zellen, die sich als Stammzellen teilen ( Harzsch und Dawirs 1994). Bei den Branchiopoden Artemia und Leptodora wurden keine medianen Neuroblasten gefunden ( Blanchard 1986; Gerberding 1997).

Bei Insekten sind mediane Neuroblasten in späten Stadien der Gangliogenese bekannt seit der Beschreibung eines “median neuroblast“ von Xiphidium (Orthoptera) ( Wheeler 1893). Mediane Neuroblasten sind gezeigt für Musca , Eutermes (Isoptera), Carausius (Orthoptera), Tenebrio (Coleoptera) und Ctenolepisma (Apterygota) ( Escherich 1902; Strindberg 1913; Tamarelle et al. 1985; Breidbach und Urbach 1996; Truman und Ball 1998).

Bei Myriapoden schnüren sich in den als Ventralorgane bezeichneten Gebieten Zellen nach innen ab ( Heymons 1901; Tiegs 1940, 1947; Dohle 1964; Knoll 1974; Hertzel 1984). Bei einigen Vertretern beteiligen sich die Zellen des Mittelstrangs am Aufbau der Ganglien, mediane Neuroblasten sind dabei nicht nachgewiesen ( Heymons 1901; Tiegs 1940, 1947; Knoll 1974; Hertzel 1984). Von den bei den Amblypgi als Vertreter der Chelicerata auftretenden medianen Zellen sind keine als mediane Neuroblasten charakterisiert ( Weygoldt 1975). Bei Paraperipatus als einem Vertreter der Onychophoren vollzieht sich die Neurogenese sehr ähnlich wie bei den Myriapoden über Abschnürung von Ganglienanlagen, und ein medianer Neuroblast wird dabei nicht beobachtet ( Pflugfelder 1948).

4.2.4. Cell lineages und Morphologie der medianen Gliazellen

Bei Orchestia teilen sich die cell lineages der 4 Mittellinienzellen nach der zweiten Teilung auf in der Art ¼ : ¾ in einen MNB und drei Vorläufer für Glia. Für zwei dieser Vorläufer, die Zellen a0 und c0, ließ sich mit der DiI Markierung gut klären, daß sie die Kommissuren umhüllen, für den dritten, die Zelle b0, waren die Färbungen nicht so klar auszuwerten und legten nahe, daß je eine Zelle am Vorderrand des einen Ganglions und die andere am Hinterrand des vorhergehenden liegt.


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Für andere Krebse stehen nur Daten über die Morphologie von Glia und keine Daten über die

lineage zu Verfügung. Bei Embryonen von Porcellio und Cherax sind bei einer Lucifer Yellow Markierung dorsal gelegener Zellen der Ganglienanlagen fünf Typen von Gliazellen gefunden worden (P. Whitington, Armidale, unveröffentlichte Ergebnisse). Keiner der fünf Typen entspricht einer der drei Typen, die bei Orchestia gefunden wurden. Bei Embryonen von Hyas und Homarus wurden lateral innerhalb der Konnektive Zellen gefunden, die vermutlich Gliazellen sind und engrailed exprimieren ( Harzsch et al. 1998).

Bei verschiedenen Insekten sind bei den Adulten ähnliche Typen von Gliazellen klassifiziert worden ( Hoyle 1986; Ito et al. 1995; darin Verweise auf ähnlichen Aufbau der Glia bei Manduca, Calliphora, Rhodnius, Periplaneta). Die embryonale Entwicklung ist allerdings, wie auch bei Neuronen, auf der Ebene einzelner Zellen nur für Schistocerca und Drosophila bekannt. Bei Schistocerca sind in der Mittellinie sechs Typen von Gliazellen gefunden worden, posterior midline glia (p) (1-2 Zellen), MNB sheath glia (m) (6 Zellen), posterior comissural glia (pc) (2 Zellen), intercommissural glia (ic) (6 Zellen), anterior commissural glia (ac) (2 Zellen) und anterior midline glia (a) (10 Zellen) ( Condron und Zinn 1994). Diese Glia wird vom MNB erzeugt ( Condron und Zinn 1994). Die Paare der ac und pc Glia entsprechen in der Morphologie exakt den Paaren von Gliazellen von Orchestia, die die Kommissuren umhüllen. Das Paar p Glia entspricht nur in der Zahl, nicht aber in der Lage den Gliazellen b0' + b0'', die bei Orchestia am Vorder- und Hinterrand der Ganglien liegen; die a Glia entspricht den Zellen b0' + b0'' in der Lage, aber nicht in der Zahl. Die cell lineages der Glia von Schistocerca entsprechen in keinem Fall jener von Orchestia, da die Zellen bei Orchestia nicht aus dem MNB, sondern aus den Zellen a0, b0 und c0 hervorgehen.


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Bei Drosophila werden mehrere Typen von Glia differenziert, wobei zur Mittellinie die longitudinal glia und die midline glia gerechnet werden ( Jacobs und Goodman 1989a; Klämbt und Goodman 1991; Ito et al. 1995). Nur die midline glia wird auch von Anfang an median gefunden, die longitudinal glia wird von einem lateralen Glioblasten produziert ( Jacobs et al. 1989). Mit betaGAL-Färbungen von enhancer-trap Linien wurde die Existenz von drei Paar Zellen der midline glia nachgewiesen, anterior MGA, mediane MGM und posteriore MGP, und eine Verschiebung zwischen den Paaren während der Gangliogenese beobachtet ( Klämbt et al. 1991). Andere betaGAL - Färbungen zeigten eine variable Zahl von 2-5 Gliazellen, wobei die MGP Glia in Assoziation mit dem MNB gefunden wurde ( Bossing und Technau 1994; Awad und Truman 1997). Mit der DiI Markierung von Mittellinienzellen wurde im Stadium 17 der Embryogenese nur ein Klon von zwei Gliazellen gefunden ( Bossing und Technau 1994). Der Widerspruch zwischen den Zahlen im Ergebnis der unterschiedlichen Methoden kann erklärt werden mit Zelltod im Stadium 15 ( Bossing und Technau 1994). Bei dem Klon, der mit der DiI Markierung gefunden wird, handelt sich um zwei Zellen, deren Zellkörper in der Regel zwischen den Kommissuren übereinander liegen und die anteriore und posteriore Kommissur umhülllen, z. T. aber voneinander getrennt weiter anterior oder posterior liegen und sogar in aufeinanderfolgenden Ganglien gefunden wurden ( Bossing und Technau 1994). Dieser Typ eines Klons von Glia ist in seiner am häufigsten gefundenen Morphologie nicht vergleichbar mit den bei Orchestia erhaltenen Klonen, denn die Zellkörper liegen bei Orchestia vor und hinter den beiden Kommissuren und nicht zwischen ihnen.

4.2.5. Cell lineages der medianen Neuroblasten

Für Aussagen über die ersten Teilungen der Mittellinienzellen von Orchestia wurden die markierten Klone vor der Trennung der Keimstreifenhälften fixiert. Damit konnten die ersten drei Teilungen der Mittellinienzellen räumlich und zeitlich aufgelöst werden. Für Aussagen über die weiteren Teilungen und die Differenzierung der Mittellinienzellen wurden die markierten Klone zu zwei späteren Zeitpunkten fixiert, zum einen auf dem Höhepunkt der Trennung der Keimstreifenhälften und zum andern nach der Fusion. Für Aussagen über die Teilungen und die Differenzierung der sechs Zellen a0'-c0'' war diese Auflösung ausreichend. Über die Zelle d0 lieferte dies Vorgehen nur die Aussage, daß ihr Klon ca. 10 Zellen umfaßt, zu denen vermutlich ein unpaares Interneuron, ein unpaares Motoneuron und paarige Interneurone gehören. Die Zelle d0 zeigt damit dieselben Merkmale wie die medianen Neuroblasten von Schistocerca und Drosophila, aber das Verfahren löst Einzelheiten der Teilung und Differenzierung der Zelle d0 nicht auf.

Zum einen ist unklar, ob in dem Cluster der Tochterzellen des medianen Neuroblasten von Orchestia neben Neuronen auch Gliazellen vorkommen. Studien an Schistocerca und Drosophila haben geklärt, daß der MNB von Schistocerca Neurone und Glia abgibt und der MNB von Drosophila nur Neurone ( Condron und Zinn 1994; Condron et al. 1994; Bossing und Technau 1994).


73

Zum andern ist unklar, wie oft sich der mediane Neuroblast von Orchestia teilt, welche

Zellen er abgibt und wie oft sich die Tochterzellen teilen. Für Schistocerca und Drosophila ist es ebenfalls unklar, wie oft sich die medianen Neuroblasten teilen, wie oft sich ihre Tochterzellen teilen und wann die Differenzierung der Tochterzellen zum Neuron erfolgt. Die Frage, wie oft sich die Tochterzellen der Neuroblasten teilen, ist für die lateralen Neuroblasten von Schistocerca und Drosophila beantwortet. Sie geben sogenannte Ganglienmutterzellen ab; die Ganglienmutterzellen teilen sich nur einmal und die zwei Tochterzellen differenzieren zu Neuronen (Bate 1976; Goodman und Doe 1993).

Orchestia, Schistocerca und Drosophila gemeinsam ist die Ausbildung eines MNB. Die Klone der MNBs unterscheiden sich in der Zahl der Neurone und im Grad ihrer Verzweigung. In der Zahl sind sich Orchestia mit ca. 10 Neuronen und Drosophila und 5-6 Neuronen ähnlich und unterscheiden sie sich von Schistocerca mit ~90 Neuronen ( Bossing und Technau 1994; Thompson und Siegler 1991, 1993; Condron und Zinn 1994). Im Grad der Verzweigung sind sich Orchestia und Schistocerca ähnlich mit Verzweigungen der Neurone im Neuropil benachbarter Segmente und unterscheiden sie sich von Drosophila, die keine Verzweigungen zeigt. Als ein Grund für die unterschiedlichen Verzweigungsgrade kommt die Tatsache in Frage, daß unterschiedliche Zeitpunkte der relativen Entwicklung der Tiere betrachtet werden. Orchestia und Schistocerca schlüpfen als Tiere, die den Adulten ähnlich sind, und vermutlich mit einem Satz von Neuronen zur Muskelsteuerung komplexer Bewegungen. Drosophila schlüpft als Larve und durchläuft mehrere Larvenstadien und das Puppenstadium bis zum Schlüpfen als adultes Tier, also ist es plausibel anzunehmen, daß beim Schlüpfen zur Larve ein anderer, möglicherweise weniger umfangreicher Satz an Neuronen zur Muskelsteuerung ausgebildet ist als beim Schlüpfen zum Adultus, und deshalb ist es denkbar, daß dieselben Neurone im adulten Tier noch Verzweigungen ausbilden, die denen von Orchestia und Drosophila ähneln.

Die Markierungen an Mittellinienzellen von Orchestia wurden im Thorax vorgenommen im zweiten bis siebten Thoraxsegment. Zwischen den Markierungen wurden keine Unterschiede in der Größe und der Zusammensetzung der MNB-Klone gefunden. Bei Schistocerca und Drosophila sind zwischen den Tagmata Unterschiede in der Zusammensetzung neuraler Klone gefunden worden. Bei Schistocerca unterscheiden sich die MNB-Klone des dritten Thoraxsegmentes und des ersten Abdominalsegmentes in der Zahl ihrer Neurone und in ihrer Zusammensetzung aus Motoneuronen, lokalen Interneuronen und intersegmentalen Interneuronen ( Thompson und Siegler 1993). Bei Drosophila ist der MNB-Klon nur für den Thorax beschrieben ( Bossing und Technau 1994). Für die lateralen Neuroblasten jedoch ist in einem Fall eine unterschiedliche Zusammensetzung bekannt. Der Klon des lateralen NB 1-1 umfaßt im Thorax zusätzliche Motoneurone, im Abdomen dagegen zusätzliche Gliazellen und insgesamt im Thorax mehr Zellen als im Abdomen ( Prokop und Technau 1994).


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4.2.6. Hypothese über die Verteilung der Arborisation

Ein Ergebnis der DiI Markierungen des MNB von Orchestia sind Axone in den Konnektiven, die sich stark verzweigen in den Thoraxganglien. Die Markierungen decken nicht alle Thoraxsegmente ab und wurden nur für wenige Thoraxsegmente mehrfach durchgeführt (Tab. 7). Die Arborisationen der ventralen Axone des MNB Klons zeigen ein Muster einer Verzweigung in sämtlichen Segmenten von T2 - T8, unabhängig davon, ob der MNB in Segment T2, T3, T4, T5, T6 oder T7 markiert wurde. Dies läßt sich durch eine Hypothese erklären, daß der MNB der Segmente T2 - T8 in seinem Klon einen spezifischen Typ Neurone erzeugt, der Arborisationen in den Thoraxsegmenten T2 - T8 ausbildet, die die Laufbeine tragen (Abb. 35).

Abb. 35 Schematische Darstellung der hypothetischen Verteilung der Arborisation der ventralen Interneurone bei Orchestia. Die Ergebnisse der Markierungen sind erklärbar mit der Annahme, daß der MNB der Thoraxsegmente T2 - T8 einen Typ Neurone erzeugt, der Verzweigungen in allen Thoraxsegmenten von T2 bis T8 ausbildet, die die Laufbeine tragen.


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4.2.7. Cell lineages und Morphologie identifizierter Neurone

Cell lineage und Morphologie als Merkmale von Neuronen

Im folgenden sollen die bei Orchestia vom MNB erzeugten Neurone verglichen werden mit identifizierten Neuronen anderer Arthropoden. Der Vergleich dient der Suche nach Homologien. Für die Suche nach Homologien können zwei Merkmalskomplexe eines Neurons verwendet werden, seine Abstammung und seine Morphologie. Seine Abstammung ist definiert durch die Zugehörigkeit zur cell lineage eines identifizierten Neuroblasten oder neural progenitors sowie bei Tochterzellen von Neuroblasten durch den Zeitpunkt der Teilung. Die Morphologie ist definiert durch die Lage des Zellkörpers im Verhältnis zu den Kommissuren und Konnektiven und der Dorsoventralachse der Ganglien sowie durch den Verlauf der Axone. Drei Fälle der Übereinstimmung können auftreten. Im einfachsten Fall sind cell lineage und Morphologie bekannt und stimmen überein. Im zweiten sind cell lineage und Morphologie bekannt und nur die Morphologie stimmt überein. Im dritten ist nur die Morphologie bekannt und sie stimmt überein. Zur Zeit gibt es nur Beispiele für die zwei Fälle von Übereinstimmungen in der Abstammung und Morphologie und von Übereinstimmungen allein in der Morphologie ohne Kenntnis der Abstammung. Es ist gleichwohl denkbar, daß Neuroblasten und neural progenitors, die nicht homolog sind, homologe Neurone erzeugen ( Whitington 1995). Annahmen über eine Homologie von Neuronen, die auf Übereinstimmungen in der Morphologie beruhen, werden durch Unterschiede in der Abstammung nicht widerlegt ( Whitington 1996).

Die Basis für einen Vergleich der Abstammung medianer Neurone bei Orchestia und anderen Arthropoden ist kleiner als jene für einen Vergleich der Morphologie. Daten zur Morphologie und Abstammung früh gebildeter Neurone liegen für Schistocerca und Drosophila vor; sie stammen von median progenitors, medianen Neuroblasten und lateralen Neuroblasten ab ( Thomas et al. 1984; Goodman 1982; Condron und Zinn 1994; Bossing und Technau 1994; Bossing et al. 1996; Schmidt et al. 1997). Daten allein zur Morphologie früher Neurone liegen für verschiedene malakostrake Krebse, ein flügelloses Insekt und einen Myriapoden vor ( Thomas et al. 1984; Whitington et al. 1991, 1993, 1996). In den folgenden Abschnitte wird zuerst die Vergleichbarkeit der Daten diskutiert, dann wird ein Vergleich der medianen Neuronen von Orchestia schrittweise durchgeführt zu Neuronen aus cell lineages der Mittellinie, zu Neuronen aus cell lineages der lateralen Neuroblasten und zu Neuronen unbekannter Abstammung.

Vergleichbarkeit der Daten

Die Methode der DiI Färbung von Klonen weist im Vergleich zu Backfills einzelner Neurone mit Lucifer Yellow eine Schwäche auf. Die räumliche Auflösung des Klons der MNB Neurone ist im Bereich der Axone hoch, im Bereich der Zellkörper niedrig. Bei Betrachtung mit Epifluoreszenz ist


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die Emmission im Bereich der Zellkörper so hell, daß Einzelheiten der Morphologie der Kerne und

Axone überstrahlt werden. Bei Betrachtung mit Epifluoreszenz und zusätzlichem Durchlicht ist nur noch die helle Fluoreszenz der Zellkörper sichtbar und ihre Morphologie der Zellkörper als ein dichtes Cluster (Abb. 21-24), die Axone sind im Bereich ihrer Ansatzstellen an den Zellkörpern in diesem Fall vom Durchlicht überstrahlt. Für den MNB Klon von Orchestia können deshalb die Axone nur bis zum Cluster von Kernen verfolgt werden, nicht aber Axone einzelnen Kernen zugeordnet werden. In Drosophila können mit der DiI Markierung bei neuralen Klonen mit wenigen Zellen Kerne und Axone einander zugeordnet werden; für Klone, die aus vielen Neuronen zusammengesetzt sind, ist eine eindeutige Zuordnung von Axonen und Kernen aus den genannten Gründen ebenfalls nicht möglich (J. Urban, persönliche Mitteilung).

Das Fehlen einer Zuordnung der Axone zu Kernen ist eine Einschränkung in der Interpretation der Daten. Es kann nicht bestimmt werden, welche Axone gemeinsam zu einem einzelnen Neuron gehören und welche Formen von Neuronen auftreten Die Zahl der theoretisch denkbaren Typen von Neuronen im MNB Klon von Orchestia ist angesichts der großen Zahl einzelner Axone hoch (Abb. 36).


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Abb. 36 A-D Vergleich des Axonmusters von Orchestia mit den theoretisch möglichen und den bei Cherax, Porcellio, Schistocerca und Drosophila realisierten Neuronen. A Lage der Axone Orchestia. Von links nach rechts: H-förmiges Axonmuster paariger ventraler und dorsaler Axone in den Konnektiven, unpaares Axon im MFT und Axone eines unpaaren Motoneurons. B Mögliche Zusammensetzung eines H-förmigen Axonmusters durch ein, zwei oder vier Neurone. Von links nach rechts: Zusammensetzung aus einem, zwei paarigen ipsilateralen, zwei unpaaren medianen oder vier paarigen ipsilateralen Neuronen. Nicht gezeichnet: Möglichkeiten der Zusammensetzung aus paarigen kontralateralen Neuronen. C Unpaare Neurone der Insecta und Malacostraca. D Paarige Neurone Insecta.


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Es ist jedoch plausibel anzunehmen, daß bei Orchestia eine ähnlich begrenzte Zahl von Typen von Neuronen der Mittellinienzellen auftritt wie bei Schistocerca und Drosophila. Bei ihnen gehören alle Motoneurone zu dem Typ mit einem unpaaren, median gelegenen Kern und einer Verzweigung in zwei Axone symmetrischen auf beiden Körperseiten (MP4, DUM, VUM, MNB). Die Interneurone treten in zwei Typen auf, mit paarigen Kernen zu beiden Seiten der Mittellinie oder mit unpaaren medianen Kernen. Die Axonen der paarigen Neurone verlaufen stets nur auf einer Seite (MP1, vMP2L, dMP2L, vMP2R, dMP2R), und zwar der ipsilateralen Seite; Neurone mit kontralateralem Verlauf ihrer Axone stammen von lateralen Neuroblasten ab. Die Axone der unpaaren Neurone verlaufen stets auf beiden Seiten symmetrisch, entweder nur nach anterior (MP6, UMI) oder nach anterior und posterior (H-Zelle). Für Orchestia kann zweierlei in Analogie als wahrscheinlich gelten. Die beiden Axone des Paares, das das Zentrale Nervensystem verläßt, gehören sehr wahrscheinlich zu einem unpaaren Motoneuron und nicht zu einem Paar Motoneurone. Die paarig den in den Konnektiven verlaufenden Axone gehören wahrscheinlich jeweils gemeinsam zu unpaaren Interneuronen und nicht getrennt zu unterschiedlichen paarigen Interneuronen. Mit diesen Annahmen können Vermutungen über die Gestalt einzelner Neurone getroffen werden, und diese können dann verglichen werden mit der Gestalt identifizierter Neurone von Schistocerca und Drosophila und anderen.

Cell lineages und Morphologie identifizierter medianer Neurone von Schistocerca und Drosophila

Bei Orchestia ist der MNB die einzige Zelle in der Mittellinie, die Neurone erzeugt. Bei Schistocerca und Drosophila erzeugen in der Mittellinie neben dem MNB noch MPs Neurone (Tab. 8). Der MNB von Orchestia erzeugt ca. 10 Neurone; zu diesen gehören ein unpaares Neuron mit einem Axon im medianen Fasertrakt und ein unpaares Motoneuron mit einem Paar efferenter Axone im Intersegmentalnerv, außerdem noch unpaare Neurone, zu denen ein Paar Axone ventral in den Konnektiven mit Verzweigungen im Neuropil und ein Paar Axone dorsal in den Konnektiven gehören. Bei Schistocerca leiten sich aus der Mittellinie die Neurone des MNB und die Neurone der Zellen MP1, MP2L, MP2R, MP3. Der MNB erzeugt die MP4 Motoneurone, MP5 und MP6 Interneurone sowie eine große Zahl von lokalen und intersegmentalen Interneuronen, deren Axone den Axonen der MPs folgen ( Goodman und Spitzer 1979; Thompson und Siegler 1991; Condron und Zinn 1994). Die weiteren Neurone der Mittellinie sind die Interneurone dMP2L+R und vMP2L+R, H Zelle und Hsib Zelle aus MP2L+R und MP3 ( Bate und Grunewald


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1981). Bei Drosophila leiten sich aus der Mittellinie Neurone des MNB, der Zellen MP1und UMI und der drei VUM Zellen ab. Der Klon des MNB setzt sich zusammen aus einem Motoneuron und mehreren Interneuronen, die Zellen MP1 und UMI erzeugen Paare von Interneuronen, die VUM Zellen je ein Motoneuron und ein Interneuron ( Bossing und Technau 1994).

Das unpaare Neuron mit dem Axon im medianen Fasertrakt von Orchestia hat keine Entsprechung bei Schistocerca oder Drosophila. Das unpaare Motoneuron von Orchestia hat keine Ähnlichkeit mit medianen Neuronen von Schistocerca und Drosophila; seine Axone wenden sich nach posterior in den Intersegmentalnerv ähnlich den RP3, RP4 und RP 5 Neuronen, die der Insekten verlaufen in den Segmentalnerven verlaufen. Die dorsalen und ventralen unpaaren Interneurone von Orchestia zeigen teilweise Gemeinsamkeiten mit unpaaren Interneuronen von Schistocerca und Drosophila. Der Typ des ventralen Interneurons mit Verzweigungen im Neuropil benachbarter Segmente kommt bei Schistocerca und Drosophila nicht vor. Der Typ des unpaaren dorsalen Interneurons ohne Verzweigung kommt bei Schistocerca in ähnlicher Form vor bei intersegmentalen Interneuronen, die im Fall des dritten Thoraxganglions Axone nach anterior und nach posterior in das erste abdominale Ganglion senden ( Thompson und Siegler 1991, Abb. 9), diese Neurone bilden allerdings, anders als die von Orchestia, Arborisationen im Ganglion ihres Ursprungs. Bei Drosophila gibt es für diesen Typ Interneurone keine Entsprechung, denn die Axone der unpaaren Interneurone erstrecken sich beim Schlüpfen der Larve nicht in andere Segmente ( Bossing und Technau 1994).

Der Vergleich des Axonmusters von Orchestia mit dem Muster identifizierter Neurone der Mittellinie von Schistocerca und Drosophila bietet Anhaltspunkte für zwei Übereinstimmungen zwischen hypothetischen Neuronen von Orchestia mit Neuronen von Schistocerca und Drosophila (Tab. 9). Das Axonmuster von Orchestia erlaubt ein hypothetisches Motoneuron von Orchestia zu fordern, das in der medianen Lage der Kerns und dem Verlauf von Axone im ISN übereinstimmt mit den Neuronen der MP4-Klasse von Schistocerca und Drosophila, zu denen die MP4-Neurone selbst von Schistocerca und die DUM/VUM Neurone von Schistocerca und Drosophila und das Motoneuron des MNB Klons von Drosophila gehören (Tab. 9). Ebenfalls erlaubt das Axonmuster von Orchestia, ein hypothetisches Interneuron zu fordern, das in der medianen Lage des Kerns und im Verlauf der Axone in beiden Konnektiven nach anterior und posterior übereinstimmt mit der H-Zelle von Schistocerca.

Cell lineages und Morphologie identifizierter lateraler Neurone von Schistocerca und Drosophila

Außer den Neuronen, die von den Mittellinienzellen gebildet werden, sind weitere embryonale Neurone von Schistocerca und Drosophila morphologisch gut charakterisiert anhand ihrer


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auffallend großen Zellkörper und früh auswachsenden Axone. Dazu gehören die Motorneurone

aCC und U und die Interneurone pCC, RP1, RP2 und Q ( Raper et al. 1983a, b; Thomas et al. 1984; Jacobs und Goodman 1989a, b). Die Herkunft der Neurone aCC und pCC ist für beide Taxa bekannt und stimmt überein. Die Neurone aCC und pCC gehen als siblings gemeinsam aus der Ganglienmutterzelle der ersten Teilung des NB 1-1 hervor ( du Lac et al. 1986; Broadus et al. 1995). Für Drosophila sind cell lineages der lateralen Neuroblasten zu den Neuronen beim Schlüpfen mit DiI Markierungen vollständig geklärt ( Bossing et al. 1996; Schmidt et al. 1997). Unabhängig von der Frage der cell lineage und unabhängig vom Verlauf der Axone kommt von den angeführten Neurone wegen der laterale Position der Zellkörper keines in Frage für eine Homologie mit den Neuronen der Mittellinie von Orchestia, deren Zellkörper median liegen.

Morphologie identifizierter Neurone von Krebsen, flügellosen Insekten und Tausendfüßlern

Bei dem malakostraken Krebs Procambarus clarkii sind im DIK und mit Lucifer Yellow in den Ganglienanlagen Kerne gefunden worden, die in ihrer Positionen übereinstimmen mit denen der Neurone MP1, dMP2, vMP2, RP1, RP2, RP3, aCC und pCC von Schistocerca und Drosophila und deshalb mit der gleichen Terminologie belegt wurden ( Thomas et al. 1984). Bei den Malakostraken Cherax destructor und Porcellio scaber ist die Lage der Kerne zusammen mit dem Verlauf der Axone früher dorsaler Neurone bekannt ( Whitington et al. 1993). 24 verschiedene Neurone können reproduzierbar mit Lucifer Yellow dargestellt werden. Die Zellen B, G, I, L, P, R und T treten nur bei Porcellio auf; die Zellen H, Q', V, X und Y nur bei Cherax; die Zellen A, F, J, O, und Q treten bei Cherax und Porcellio auf; die Zellen D/K, C, M und E entsprechen vMP2, RP2 , aCC und pCC von Procambarus und Insekten, S und E' entsprechen MP4 und U der Insekten und fehlen bei Procambarus; umgekehrt werden Zellen des Typs MP1, dP2, RP1 und RP3 von Procambarus und Insekten bei Cherax und Porcellio nicht gefunden.

Bei dem flügellosen Insekt Ctenolepisma longicaudata gleichen , ebenfalls gezeigt mit Lucifer Yellow Füllungen, die Positionen der Kerne und der Verlauf der Axone von frühen Neuronen jenen der Zellen MP1, dMP2, vMP2, H, Hsib, MP4, RP1, RP2, aCC, pCC, U und Q von Schistocerca und Drosophila ( Whitington et al. 1996) (s. Tab. 9).

Bei dem Tausendfüßler Ethmostigmus rubripes sind mit dieser Methode keine Neurone gefunden worden, die den gemeinsamen Neuronen der Insekten und Malakostraken gleichen ( Whitington et al. 1991).

Die cell lineage der den Krebsen und Insekten gemeinsamen Neurone ist für Schistocerca und Drosophila geklärt und wurde in den vorangegangenen Abschnitten behandelt (siehe oben). Für die Malakostraken und Ctenolepisma ist sie nicht geklärt, so daß nur ein morphologischer Vergleich erfolgen kann. Für ihn sind nicht nur die gemeinsamen Neurone von Krebsen und Insekten


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interessant, sondern alle 24 bei Cherax und Porcellio gefundenen Neurone. Betrachtet man die

Lage ihrer Zellkörper, so wurden nur dorsale Zellen von der Methode erfaßt, von denen die meisten lateral liegen und nur wenige median oder nahe der Medianachse. Das Cluster der MNB Neurone von Orchestia liegt ventral und genau median und ist 2-3 Zellen breit, so daß die genau median gelegenen Zellen und solche mit einem Abstand von der Medianachse von 2 Zelldurchmessern von Cherax und Porcellio noch eine ungefähr vergleichbare Lage haben. Genau median liegen die Zellen P (vor der a. Komm.) und S (hinter der p. Komm.), nahe der Mittellinie liegen die Zellen I (zwischen a. und p. Komm.), K (zwischen a. und p. Komm.), M (hinter der p. Komm.), N (hinter der p. Komm.), Q (zwischen a.und p. Komm.), Q' (zwischen a.und p. Komm.) und Y (zwischen a.und p. Komm.), die anderen liegen weiter seitlich. Die median gelegenen Zellen P und S unterscheiden sich von den MNB Neuronen von Orchestia, weil sie vor der anterioren und hinter der posterioren Kommissur liegen. Die neben der Medianachse gelegenen Zellen I, K, Q, Q' und Y liegen in einer den MNB Neuronen vergleichbaren Position zwischen den Kommissuren. Betrachtet man den Verlauf ihrer Axone, so kommen von allen genannten nur die Neurone P und S für eine Homologie in Frage, weil ihre Axone wie alle MNB Neurone von Orchestia im medianen Fasertrakt verlaufen und sich dann aufspalten. Die Axone der anderen Zellen zeigen keinen gemeinsamen Verlauf im medianen Fasertrakt, sondern kreuzen ihn (Q, Q', I), verlaufen parallel zu ihm (K) oder entfernen sich von ihm (Y). Neuron P hat einen kurzen, nach posterior gewandten Ast im medianen Fasertrakt und verläuft dann in der anterioren Kommissur. Neuron S einen langen Ast nach anterior, dann spaltet sich das Axon und läuft auf beiden Seiten in den Konnektiven nach anterior.

Der Vergleich des Axonmusters von Orchestia mit dem Muster von identifizierten medianen Neuronen Höherer Krebse und Insekten bietet zwei Anhaltspunkte für Übereinstimmungen (Tab. 9). Beide beziehen sich auf die gleichen hypothetischen Neurone von Orchestia, für die bereits eine Übereinstimmung mit Neuronen von Schistocerca und Drosophila postuliert wurde. In diesem Fall kann aber das Argument von Übereinstimmungen in der Herkunft aus cell lineages von Mittellinienzellen nicht verwendet werden, weil die Neurone der Höheren Krebse und des flügellosen Insekts nur morphologisch charakterisiert sind. Zum einen handelt es sich um Übereinstimmungen zwischen einem hypothetischen Motoneuron von Orchestia und dem Neuron S der Höheren Krebse. Neuron S ist für Cherax und Porcellio gezeigt und wird mit DUM Neuronen von Insekten homologisiert ( Whitington et al. 1993, Whitington 1996). Dies weist dem Auftreten eines homologen Neurons bei Orchestia eine gewisse Wahrscheinlichkeit zu. Zum andern handelt es sich um Übereinstimmungen zwischen einem hypothetischen Interneuron von Orchestia und der H-Zelle von Ctenolepisma. Aus dem Auftreten einer H-Zelle bei Schistocerca und Ctenolepisma. läßt sich die Existenz einer H-Zelle bei der Stammart der Insekten ableiten. Das Auftreten einer H-Zelle bei Orchestia ist mit der verwendeten Methode nicht belegt, im


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Axonmuster könnte jedoch eine solche Zelle vorliegen, die dann für den gemeinsamen Vorfahren

von Höheren Krebsen und Insekten zu fordern wäre.

Tab. 9 MNB Neurone von Orchestia und mediane Neurone von drei Malakostraken und drei Insekten. Neurone, die Übereinstimmungen zeigen, untereinander in grau unterlegten Kästen.

 

 

 

 

MP1 Klas-se

dMP2 Klas-se

vMP2 Klas-se

 

MP3 Klasse

 

MP4 Klasse

 

Krite-rium 1

Krite-rium 2

Krite-rium 3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Che-rax

 

 

 

 

 

K

 

 

 

S

 

Zell-körper

Axone

 

Por-cellio

 

 

 

 

 

K

 

 

 

S

 

Zell-körper

Axone

 

Pro-cam-barus

 

 

 

 

”dMP2“

”vMP2“

 

 

 

 

 

Zell-körper

 

 

Schi-sto-cerca

 

 

 

MP1

dMP2

vMP2

 

H/ Hsib Zellen

 

MP4+ DUM

 

Zell-körper

Axone

li-neage

Dro-so-phila

 

 

 

MP1

dMP2

vMP2

 

 

 

MNB+ VUM

 

Zell-körper

Axone

li-neage

Cte-nole-pisma

 

 

 

 

dMP2

vMP2

 

H/ Hsib Zellen

 

 

 

Zell-körper

Axone

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Or-ches-tia

 

In-tern. im MFT

 

 

 

 

 

In-

tern. paarig

 

Moton.

unpaar

 

Zell-körper

Axone

li-neage


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4.3. Die Expression von engrailed

Das Gen engrailed und seine Expression bei Metazoen

Gen engrailed ist in einem Screen für zygotische Letalmutationen von Drosophila charakterisiert worden als ein Gen aus der Klasse der Segmentpolaritätsgene ( Nüsslein-Volhard und Wieschhaus 1980). Es kodiert für einen Transkriptionsfaktor mit einer Homöobox ( Patel et al. 1989a). Die vorliegende Arbeit hat die Expression von engrailed in der Mittellinie von Orchestia während der Segmentierung und frühen Neurogenese untersucht. engrailed Expression ist außer bei Euarthropoden auch bei Onychophoren, Anneliden, Mollusken, Echinodermen, Cephalochordaten und Vertebraten nachgewiesen ( Patel et al. 1989a; Weisblat et al. 1993; Wedeen et al. 1997; Lowe und Wray 1997; Holland et al. 1997; Moshel et al. 1998). Die Diskussion erörtert den Vergleich innerhalb der Euarthropoden und zwischen den Euarthropoden, Onyhchophoren und Anneliden. Die Expression in den Mollusken, Echinodermen, Cephalochordaten und Vertebraten bietet keine Merkmale, an die ein detaillierter Vergleich angeknüpft werden kann.

Die Expression von engrailed während der Segmentierung

Bei Orchestia und Porcellio ist die Entwicklung der engrailed Expression in der Mittellinie eingebettet in die Bildung eines Gitters, das allen Malakostraken gemeinsam ist ( Scholtz 1992a). Bei Orchestia setzt die Expression im thorakalen Abschnitt der Mittellinie ein nach der zweiten Teilung der Reihen zu den vier Reihen a-d in der Zelle a0 und damit zum gleichen Zeitpunkt und in der gleichen Reihe wie bei den lateralen Zellen. Bei Porcellio setzt die Expression im thorakalen Abschnitt der Mittellinie ein nach der ersten Teilung der Reihen zu den zwei Reihen ab und cd in der Zelle ab0, zur gleichen Zeit und in der gleichen Reihe wie bei den lateralen Zellen. Nach der Teilung der Zelle ab0 in die Zellen a0 und b0 exprimieren zunächst beide engrailed, später nur die Zellen a0.

Von anderen Malakostraken ist das engrailed Expressionsmuster der Mittellinienzellen nicht untersucht, dagegen ist das der lateralen Zellen analysiert für Procambarus clarki, Homarus americanus, Mysidium columbae, Gammarus pulex, Gammarus roeselii, Orchestia cavimana, Cherax destructor, und Neomysis integer ( Patel et al. 1989b; Patel 1994b; Scholtz et al. 1993, 1994; Scholtz 1995a, b). Der Verlauf der Expression in der Mittellinie von Orchestia ist identisch mit dem Verlauf in den lateralen Zellen von Orchestia und der Gammarus Arten, wo die Expression einsetzt in dem Stadium, in dem sich die Reihen schon zweimal geteilt haben, in der vordersten, in den Zellen mit a bezeichneten Reihe ( Scholtz et al. 1993, 1994). Der Verlauf der Expression in der Mittellinie von Porcellio ist identisch mit dem Verlauf in den lateralen Zellen von Cherax und Neomysis, wo die Expression bereits einsetzt in dem Stadium, in sich die Reihen erst einmal geteilt


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haben, in den Zellen der vorderen, mit ab bezeichneten Reihe ( Scholtz et al.

1993). Nach der Teilung der Reihe ab exprimieren zunächst die Zellen der Reihen a und b engrailed, danach geht die Expression in b zurück.

Für die Mittellinie und die lateralen Zellen aller untersuchten Malakostraken existiert also ein Stadium, in dem engrailed in einem identischen Muster exprimiert wird in den Zellen der Reihe a. Im weiteren Verlauf der Expression unterscheiden sich Mittellinienzellen und laterale Zellen. In der Mittellinie teilt sich bei Orchestia im nächsten Schritt die engrailed-positive Zelle a0 einmal. Ihre Tochterzellen a0' und a0'' zeigen für die gesamte Embyrogenese keine Proliferation mehr. Beide bleiben zunächst engrailed-positiv. Bei Porcellio legen die Kernfärbungen es nahe, daß sich die Zelle a0 nach einer Teilung ebenfalls nicht weiter teilt. Die vordere der beiden Tochterzellen exprimiert weiter engrailed, die hintere zeigt keine Expression. Die lateralen Zellen von Gammarus, Orchestia, Cherax und Neomysis zeigen in den nächsten Stadien fortdauernde Teilungsaktivität und engrailed Expression in allen Tochterzellen der Zellen der Reihe a sowie der anterioren Tochterzellen der Zellen der Reihe b ( Scholtz et al. 1993, 1994).

Drosophila ist außerhalb der Malakostraken der einzige Vertreter der Arthropoden, von dem im Stadium der Segmentierung die cell lineage von Zellen, die engrailed exprimieren, bekannt ist ( Vincent und O'Farrell 1992). Bei Drosophila setzt die Expression von engrailed im Stadium des Blastoderm ein und persistiert über die Gastrulation hinweg ( Goodman und Doe 1993). Die Expression wird nicht an alle Zellen innerhalb eines Klons weitergegeben, so daß innerhalb einer cell lineage engrailed-positive und engrailed-negative Zellen vorliegen ( Vincent und O'Farrell 1992).

Bei dem anostraken Krebs Artemia franciscana, dem cirripeden Krebs Sacculina caricini, den Insekten Schistocerca, den Hymenopteren Apis mellifera und Copidosoma floridanum, dem Apterygoten Thermobia domestica und den Spinnen Cupiennius salei und Archegozetes longisetus exprimieren in Streifen angeordnete Zellen während der Segmentierung engrailed ( Patel et al. 1989b; Queinnec et al. 1999; Fleig 1990; Manzanares et al. 1993, 1996; Grbic et al. 1996; Peterson et al. 1998; Damen et al. 1998; Telford und Thomas 1998).

Die Expression von engrailed während der Neurogenese

Bei Orchestia läßt sich die Entwicklung des Musters der engrailed Expression im Stadium der frühen Neurogenese und der Trennung des Keimstreifens gut beobachten. Die Mittellinienzellen bleiben wie die Mittellinienzellen und lateralen Neuroblasten aller Malakostraken während der Bildung der Ganglienanlagen an der Oberfläche des Keimstreifens. Die Zellen a0' und a0'' hören auf, engrailed zu exprimieren, und einzelne Tochterzellen des MNB d0 setzen mit einer Expression ein. Die Zahl der engrailed-positiven Zellen in dem Cluster der Tochterzellen von d0 nimmt bis auf 5-6 zu. Für Porcellio und andere Malakostraken ist im Stadium der frühen Neurogenese nichts über die cell lineage der Zellen, die engrailed exprimieren, bekannt.


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Bei Schistocerca und Drosophila vollzieht sich der Übergang von der Expression der Segmentierung zur Expression der Neurogenese nicht innerhalb einer Gruppe von Zellen, sondern die neuroektodermalen Vorläuferzellen der Ganglien trennen sich in der frühen Neurogenese, bevor sie mit den Teilungen beginnen, von den übrigen ektodermalen Zellen, indem sie delaminieren und eine separate Zellschicht dorsal der Epidermis bilden. In dieser delaminierten Zellschicht entwickelt sich ein nicht auf den Segmentrand beschränktes Expressionsmuster der Neuroblasten und Neurone. Der Übergang zwischen den Expressionsmustern vollzieht sich also nicht in einer Zellschicht, sondern in zwei räumlich getrennten Zellpopulationen.

Bei Schistocerca exprimieren in der frühen Neurogenese in der Mittellinie drei große Zellen am Hinterrand des Segmentes engrailed, eine von ihnen verliert die Expression und wird zum MNB, das Schicksal der übrigen beiden ist unbekannt ( Condron und Zinn 1994). Die Tochterzellen des MNB, dazu gehören die MP4-, MP5- und MP6-Klasse Neurone, Gliazellen und DUM Neurone, exprimieren unmittelbar nach ihrer Abgabe durch den MNB engrailed. Die MP4-Klasse Neurone, die Gliazellen und die Motoneurone des DUM clusters stellen die Expression wieder ein, die MP6-Klasse Neurone und die Interneurone des DUM Clusters behalten sie bei ( Condron und Zinn 1994; Siegler und Pankhaniya 1997). Die Expression von engrailed ist für die Tochterzellen des MNB, die zu Gliazellen differenzieren, notwendig für ihre Differenzierung. Unterbindet man die Expression mit Injektion von Antisense-Oligonukleotiden, differenzieren die Zellen als zusätzliche Neurone ( Condron et al. 1994). Bei Drosophila exprimieren in der Mittellinie der MNB und seine Tochterzellen ( Patel et al. 1989c; Doe 1992) sowie 3 der 6 VUM Neurone engrailed ( Bossing und Technau 1994). Bei dem Käfer Tribolium molitor findet sich in den Töchtern des MNB eine Expression von engrailed ( Patel 1994a). Bei der Schabe Periplaneta americana exprimiert der MNB und ein Teil seiner Tochterzellen engrailed ( Blagburn et al. 1995).

Es ist möglich, daß die Expression von engrailed in Zellen des MNB Klons von Orchestia dieselbe Funktion hat wie die der Zellen des MNB Klons von Schistocerca. In diesem Fall wären die 5-6 engrailed-positiven Zellen prospektive Interneurone und die ~4 engrailed-negativen Zellen Motoneurone und Glia. Im MNB Klon ist die Zahl der Kerne mit ~10 bestimmt worden und die Zahl der Interneurone auf ~5, die der Motoneurone auf 1 geschätzt worden. Nach dieser Annahme wären noch zusätzliche 4 Gliazellen im MNB Klon zu vermuten.

Die Expression von engrailed bei Onychophoren und Anneliden

Bei dem Onychophoren Acanthokara kaputensis wird engrailed ausschließlich im Mesoderm exprimiert, deshalb bietet das Muster keinen Anhaltpunkt für einen Vergleich mit dem ektodermalen Muster der Euarthropoden ( Wedeen et al. 1997). Bei dem Egel Helobdella triserialis wird engrailed zunächst in einem Muster segmentaler Streifen exprimiert, die in der ventralen


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Mittellinie unterbrochen sind ( Weisblat et al. 1993). Im nächsten Stadium beenden die Zellen der

Streifen ihre Expression und verschiedene Neurone, insbesondere Cluster aus 3-4 Zellen in der Mittellinie, setzen mit einer Expression ein ( Weisblat et al. 1993, Abb. 3). Diese Abfolge von einem segmentalen unter Ausschluß der Mittellinie zu einem neuronalen Expressionsmuster unter Einschluß der Mittellinie, das nicht auf den Segmentrand begrenzt ist, zeigt eine hohe Übereinstimmung mit der Abfolge bei Krebsen und Insekten. Für eine Entscheidung, ob Homologien auf der Ebene identifizierter Zellen vorliegen, fehlt eine morphologische und molekulare Charakterisierung der engrailed-positiven Neurone von Helobdella und anderer Anneliden.

Die Expression von engrailed bei Wirbeltieren

Die engrailed Expression läßt sich mit dem Antikörper 4D9 auch bei verschiedenen Wirbeltieren im Mesoderm und Neuroektoderm nachweisen. Während bei dem Frosch Xenopus laevis, dem Huhn Gallus domesticus und der Maus Mus musculus nur Zellen im Neuralrohr an der Grenze von Mes- und Metencephalon eine Expression zeigen, findet sich bei dem Zebrafisch Danio rerio eine Expression in je vier Sklerotomzellen jedes Somiten zu beiden Seiten des Neuralrohrs ( Patel 1989a).

Genexpression in der Mittellinie von Anneliden, Nematoden und Wirbeltieren

Bei dem Egel Hirudo medicinalis ist eine Population unpaarer Zellen in der ventralen Mittellinie im Bereich der Ganglienanlagen durch die Expression eine Oberflächenglykoproteins, Lan 3-2, gekennzeichnet; es handelt sich um exakt 16 Zellen in jedem zweiten der 32 Segmente ( McGlade-McCulloh et al. 1990). Die Herkunft dieser Zellen ist unklar, generell werden die Zellen des ZNS von Egeln durch paarige Stammzellen erzeugt ( Shain et al. 1998). Im embryonalen ZNS des Nematoden Caenorhabditis elegans und von Wirbeltieren findet sich die Expression von zweier Proteinklassen, die bei Drosophila spezifisch in der Mittellinie exprimiert werden, zum einen die Netrine und das Produkt des UNC-6 Gens, zum andern Roundabout ( Tessier-Lavigne und Goodman 1996; Flanagan und Van Vactor 1998). Netrine werden bei Caenorhabiditis in unterschiedlichen ventralen Neurogliazellen und Neuronen exprimiert und bei Wirbeltieren in verschiedenen lateralen und ventralen Zellen des Neuralrohres, aber nicht in der dorsalen Mittellinie ( Tessier-Lavigne und Goodman 1996). Roundabout wird bei Caenorhabditis von paarigen, vetnralen sensorischen Neuronen exprimiert und bei Wirbeltieren in einem Streifen in der dorsalen Mittellinie des Neuralrohrs, der mehrere Zellen breit ist ( Flanagan und Van Vactor 1998).


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Die Expressionsmuster werfen zwei Fragen auf. Die Expression von Lan3-2 führt zu der Frage, ob die Expression eines für unpaare Mittellinienzellen spezifischen Gens bei Arthropoden und Anneliden gezeigt und ob damit ein Argument für ein Schwestergruppenverhältnis zwischen den beiden Taxa geliefert werden kann. Die Expression der Netrine und von Roundabout werfen die Frage auf, ob die Gene Teil eines Signalsystems sind, das bereits bei dem hypothetischen gemeinsamen Vorfahren von Arthropoden, Nematoden und Wirbeltieren vorhanden war.

4.4. Fazit

Ein Vergleich der cell lineage, Zelldifferenzierung und engrailed-Expression in der Mittellinie von Arthropoden ist notgedrungen unvollständig, da Daten, die sich über alle drei Bereiche erstrecken, nur für Schistocerca, Drosophila und Orchestia als Vertreter der Insekten und Malakostraken zu Verfügung stehen. Außerhalb dieser Taxa können morphologische Kenntnisse über die Entwicklung von Myriapoden, nicht-malakostraken Krebsen und Cheliceraten herangezogen werden ( Heymons 1901; Tiegs 1941, 1947; Dohle 1964; Weygoldt 1975; Gerberding 1997). Der Vergleich erlaubt eine Aussage über eine Homologie von Zelltypen in der Mittellinie von Insekten und Malakostraken und ihr Auftreten bei der gemeinsamen Stammart.

Für eine Aussage über die homologe Merkmale der Mittellinie gilt, daß zwei Typen von Mittellinienzellen von Schistocerca, Drosophila und Orchestia in einer Reihe von Aspekten übereinstimmen. Zum einen handelt es sich um den medianen Neuroglioblast von Schistocerca, den medianen Neuroblast von Drosophila und die Zelle d0 von Orchestia. Die Zellen stimmen überein in der Abgabe eines Klons von Tochterzellen, dessen Zellen sämtlich oder zum Teil zu Neuronen differenzieren und sämtlich oder zum Teil engrailed exprimieren. Zum andern handelt es sich um die Vorläufer für Glia von Drosophila und die Zellen a0 und c0 von Orchestia. Die Zellen stimmen darin überein, daß sie sich einmal teilen und aus den Tochterzellen Paare von Gliazellen hervorgehen, die mit den Kommissuren assoziiert sind.

Für eine Aussage über die Evolution der Mittellinie gilt: Solange nicht geklärt ist, welche Entwicklung die Mittellinie der Krebse außerhalb der Malakostraken, der Myriapoden und der Cheliceraten durchläuft, kann zwar nichts über die Mittellinie bei der Stammart der Arthropoden gesagt werden, aber für die Mittellinie bei der Stammart von Insekten und Malakostraken kann angenommen werden, daß sie als eine unpaare Längsreihe vorliegt, in der sich je Segment genau eine Zelle als Stammzelle für Neurone oder Neurone und Glia differenziert, daß in der Mittellinie aus der cell lineage der Stammzelle oder aus einer separaten cell lineage Gliazellen hervorgehen, die mit den Kommissuren assoziiert sind, und daß im Klon der Stammzelle Neurone engrailed exprimieren.


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