Kernekewisch, Michaela: Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION IM FACH BIOLOGIE
Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Dipl.-Ing. (FH) Michaela Kernekewisch ,
geboren am 21.09.1967 in Berlin

Dekan der Fakultät
Prof. Dr. J. P. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. R. Ehwald
Prof. Dr. H. Bielka
PD Dr. T. Bunte

eingereicht: 18.09.1998

Datum der Promotion: 22.01.1999

Zusammenfassung

Neben aktivierten Astrozyten weisen zahlreiche Zytokine und Wachstumsfaktoren, die in der Nähe amyloidogener Ablagerungen im Hirn des Alzheimer-Patienten auftreten, auf eine Alzheimer-assoziierte Neuroinflammation hin, die an der Ausprägung der Neurodegeneration ursächlich beteiligt sein kann. Bisher ist die Bedeutung aktivierter Astrozyten für die Alzheimer-Pathogenese wenig untersucht worden. Von besonderem Interesse war in diesem Zusammenhang das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1, da es mit amyloidogenen Ablagerungen und Astrozyten assoziiert vorliegt. Um einen ersten Hinweis auf eine mögliche pathophysiologische Rolle des ICAM-1 in der Alzheimer-assoziierten Neuroinflammation zu erhalten, wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Mitogene untersucht, die für die Alzheimer-Pathogenese von Bedeutung sind. Aus diesen Untersuchungen ging hervor, daß Astrozyten, die mit den Zytokinen IL1beta, TNFalpha und TNFalpha mit IFNgamma behandelt wurden, ihre ICAM-1-Expression verstärkten. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration durch Forskolin, Rolipram und Prostglandine die Zytokin-verstärkte ICAM-1-Expression verminderte. Allerdings konnte eine schon bestehende astrozytäre Aktivität durch cAMP-erhöhende Substanzen nicht beeinflußt werden. Im Rahmen weiterer Untersuchungen wurde in dieser Arbeit gezeigt, daß die astrozytäre ICAM-1-Expression nicht durch das Amyloidbeta-Protein ausgelöst oder verstärkt wird, dagegen konditionierte Medienüberstände Abeta-aktivierter Mikroglia einen starken Einfluß auf die astrozytäre Aktivität ausüben.

Im zweiten Teil dieser Arbeit ist die Untersuchung aktivierter Astrozyten in der Alzheimer-assoziierten Amyloidogenese beschrieben, die im Zusammenhang mit der amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP steht. Bisher standen Neurone als Hauptproduzenten des Amyloid beta-Proteins im Vordergrund der Alzheimer-Forschung. Da jedoch verschiedene Veröffentlichungen darauf hinweisen, daß Astrozyten ebenfalls eine direkte Rolle in der Entstehung der amyloidogenen Ablagerungen spielen können, wurde die amyloidogene APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten untersucht. Neben vergleichenden Analysen der astrozytären und neuronalen APP-Prozessierung konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, daß sich die APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten zugunsten des nicht-amyloidogenen Prozessierungsweges verlagert, d.h. aktivierte Astrozyten verringerten die Sekretion des Abeta-Proteins. Ein charakteristisches Merkmal aktivierter Astrozyten ist eine verstärkte alpha-Sekretaseaktivität bei der APP-Prozessierung. Astrozyten, die mit den Zytokinen IL1beta, TNFalpha und TNFalpha mit IFNgamma aktiviert wurden, akkumulierten nicht-amyloidogene C-terminale Fragmente, sekretierten verstärkt sekretorisches APP nach alpha-Sekretaseaktivität und zeigten eine verringerte Abeta-Sekretion bei gleichzeitig verstärkter Sekretion des nicht-amyloidogenen p3-Fragmentes.

Abschließend wurde die pathophysiologische Bedeutung der Astrozyten in der Alzheimer-Pathogenese im Zusammenhang mit den erzielten Ergebnissen aus dieser Arbeit und mit den Befunden anderer Forschungsgruppen diskutiert und ein Modell über die zellulären, neuroinflammatorischen Vorgänge in der Alzheimer-Pathogenese entwickelt.

Schlagwörter:
Astrozyten, Alzheimer-Krankheit, Amyloid, ICAM-1

Abstract

Activated astrocytes, number of cytokines and growth factors are associated with amyloidogenic deposits in the brain of Alzheimer-patients, pointed to an Alzheimer-associated neuroinflammation, that could be involved in the progression of the neurodegeneration. So far the implication of activated astrocytes in the pathogenesis of Alzheimer’s disease is not clear. In this connection the adhesion molecule ICAM-1 was of particularly interest, because it is associated with astrocytes and amyloidogenic deposits. To get insights in a possible pathophysiological role of ICAM-1 in the Alzheimer-associated neuroinflammation, in the first part of this thesis the astrocytic expression of ICAM-1 was investigated dependent on different mitogens, that are relevant to the pathogenesis of Alzheimer’s disease. It was shown that the expression of ICAM-1 was enhanced in astrocytes treated with the cytokines IL1beta, TNFalpha and the combination TNFalpha with IFNgamma. It was shown that an elevation of intracellular concentration of cAMP by forskolin, rolipram and prostaglandines results in an suppressed cytokine-stimulated ICAM-1 expression. But it was impossible to reduce an existing astrocytic activity by these cAMP-elevating agents. Within the scope of additional investigations it was shown that the expression of ICAM-1 was not induce by the amyloid beta-peptide, whereas the ICAM-1 expression was strongly enhanced by conditioned media of Abeta-activated microglia.

In the second part of this thesis the investigation of activated astrocytes in the Alzheimer-associated amyloidogenesis is described, the astrocytic processing of the amyloid precursor protein (APP). So far it is believed that the neurons are the main producers of the amyloid beta-peptide. But different publications pointed to the possibility that astrocytes could play a direct role in the generation of the amyloidogenic deposits. From this reason the amyloidogenic processing of APP was investigated in activated astrocytes. Besides comparative study of astrocytic and neuronal APP processing it was first shown that activated astrocytes practise more the non-amyloidogenic pathway of APP processing. A characteristic hallmark of activated astrocytes is an increased activity of alpha-secretase. Astrocytes that are activated by the cytokines IL1beta, TNFalpha or TNFalpha with IFNgamma showed an accumulation of non-amyloidogenic C-terminal fragments, increased APP-secretion followed by alpha-scretase activity, decreased Abeta-secretion and enhanced p3-secretion.

In conclusion the pathophysiological role of astrocytes in the pathogenesis of Alzheimer’s disease was discussed leading to a model of cellular neuroinflammatory events in the pathogenesis of Alzheimer’s disease.

Keywords:
astrocytes, Alzheimer’s disease, amyloid, ICAM-1


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten
1 Einleitung
1.1.Die Alzheimer-Krankheit
1.2.Das Amyloid und sein Vorläuferprotein APP
1.3.Genetische Ursachen der Alzheimer-Krankheit
1.4.Pathophysiologische Prozesse der Alzheimer-Krankheit
1.5.Zielsetzung
2 Material
2.1.Chemikalien und Reagenzien
2.2.Reagenzien für die Zellkultur
2.3.Enzyme und Antikörper
2.4.Molmassenstandards
2.5.Zellkulturmedien und Zusätze
2.6.Bakterienmedien
2.7.Bakterienstämme
2.8.Zellinien
2.9.Tiere
2.10.Plasmide
3 Methoden
3.1.Mikrobiologische Techniken
3.1.1.Herstellung kompetenter Zellen
3.1.2.Transformation von Bakterien
3.2.DNA-Techniken
3.2.1.Präparation von Plasmid-DNA
3.2.2.DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
3.2.3.Elektrophoretische Auftrennung der DNA
3.3.Zellkultur-Techniken
3.3.1.Isolierung und Kultivierung primärer Astrozyten
3.3.2.Isolierung und Kultivierung primärer Neurone
3.3.3.Kultivierung von Zellinien
3.3.4.Kultivierung stabil transfizierter Zellinien
3.3.5.Kryokonservierung eukaryotischer Zellen
3.3.6.Auftauen kryokonservierter eukaryotischer Zellen
3.3.7.Metabolische Markierung von Zellen mit L-[35S]-Methionin
3.3.8.Bestimmung der Zellvitalität durch Messung der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen (MTS-Test)
3.3.9.Transfektion eukaryotischer Zellen
3.3.10.Behandlung der Zellen mit Substanzen
3.4.Protein-Analytik
3.4.1.Aufarbeitung des Gewebematerials
3.4.2.Aufarbeitung des Zellkulturmaterials
3.4.3.Bestimmung der Proteinkonzentration
3.4.4.Proteinfällung mit Aceton
3.4.5.Immunpräzipitation radioaktiv markierter Proteine
3.4.6.Immunpräzipitation nicht-radioaktiv markierter Proteine
3.4.7.Herstellung von anti-IgG-Maus-gekoppelter Protein A-Sepharose
3.4.8.Tris-/Glycin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
3.4.9.Tris-/Tricin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
3.4.10.Tris-/Bicin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit dem NuPage-System
3.4.11.Tris-/Bicin-/Harnstoff-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
3.4.12.Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie Blue
3.4.13.Autoradiographie mit Phosphorimager
3.4.14.Western-Transfer-Analyse (Western-Blot)
3.4.15.Nachweis von Prostaglandin E2
3.4.16.ICAM-1-ELISA
3.4.17.Nachweis sekretorischer alkalischer Phosphatase
3.4.18.Immunzytochemischer Nachweis des ICAM-1
4 Ergebnisse
4.1.Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 in Astrozyten
4.1.1.Übersicht und Fragestellung
4.1.2.ICAM-1 als Marker für die astrozytäre Aktivität
4.1.3.Quantifizierung des ICAM-1 durch einen Zell-basierenden ELISA
4.1.4.Astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Zytokin-Konzentrationen
4.1.5.Zeitverlauf der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression
4.1.6.Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß verschiedener Mitogene
4.1.7.Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß von physiologischem Abeta-Protein
4.1.8.Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia
4.1.9.Pharmakologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression
4.1.10.Physiologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression
4.1.11.Astrozytäre Sekretion des Prostaglandin E2
4.2.Untersuchungen zur Expression und Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten
4.2.1.Übersicht und Fragestellung
4.2.2.APP-Prozessierung in Astrozyten
4.2.3.Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Abeta-Protein
4.2.4.Nachweis der beta-Sekretaseaktivität in transfizierten Astrozyten
4.2.5.Nachweis der gamma-Sekretaseaktivität in transfizierten Astrozyten
4.2.6.APP-Prozessierung stabil transfizierter H4-Zellen
4.2.7.Untersuchung der APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten
5 DISKUSSION
5.1.Astrozytäre Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1
5.1.1.Astrozytäre Zellinien als Zellkulturmodell für die Analyse der astrozytären ICAM-1-Expression
5.1.2.Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß verschiedener Mitogene
5.1.3.Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß von Abeta-Protein
5.1.4.Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia
5.2.Signaltransduktionsweg der astrozytären ICAM-1-Expression
5.2.1.Pharmakologische Beeinflussung der astrozytäre ICAM-1-Expression
5.2.2.Physiologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression
5.2.3.Unterschiedliche Hemmung der IL1beta- und TNFalpha-verstärkten ICAM-1-Expression
5.3.Astrozytäre Expression und Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP
5.3.1.Amyloidogene APP-Prozessierung astrozytärer Zellen
5.3.2.Amyloidogene APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten
5.4.Mögliche pathophysiologische Rolle aktivierter Astrozyten in der Alzheimer-Pathogenese
5.4.1.Rekrutierung von Mikroglia als pathophysiologische Rolle des ICAM-1
5.4.2.Astrozytäre Sekretion von Plaque-katalysierenden Substanzen
5.4.3.Störung der Hirnhomöostase
5.5.Modell über zelluläre, neuroinflammatorische Vorgänge in der Alzheimer-Pathogenese
5.6.Therapeutische Ansatzpunkte und Ausblick
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 : Genetische Ursachen der Alzheimer-Krankheit und deren Einfluß auf die Entstehung des Abeta-Proteins
Tab. 2 : Charakteristische Marker inflammatorischer Prozesse im Hirn von Alzheimer-Patienten
Tab. 3 : Zusammensetzung der Tris-/Tricin-Trenngele
Tab. 4 : Ermittlung der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten des ICAM-1-ELISA‘s
Tab. 5 : Übersicht der verwendeten Hemmstoffe und Aktivatoren von Enzymen

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 : Schematische Darstellung der Domänenstruktur des Amyloid-Vorläuferproteins
Am N-Terminus des APP ist das 17 AS große Signalpeptid (SP) lokalisiert, das die Translokation des Polypeptids in das endoplasmatische Retikulum vermittelt. Posttranslationale Modifizierungen sind O- und N-Glykosylierungen (O/N), Tyrosin-Sulfatisierung (S) und Phosphorylierung (P). Cys: Cystein-reiche Region. Glu/Asp: stark saure Domäne. KPI: Kunitz-Protease-Inhibitor-Domäne, die nur in den Isoformen APP751 und APP770 enthalten ist. OX-2: MRC-OX-2-Antigen-Domäne, die nur in APP770 enthalten ist. CHO: Kohlenhydrat-Domäne. Abeta: Amyloid beta-Protein, PM: Plasmamembran.
Abb. 2 : Schematische Darstellung der APP-Prozessierungswege
Die nicht-amyloidogene Prozessierung beginnt mit der alpha-Sekretase (alpha), die in der Abeta-Region (dunkler Kasten) schneidet, so daß kein Abeta freigesetzt werden kann. Der amyloidogene Weg wird durch die Aktivität der beta-Sekretase (beta) eingeleitet, die N-terminal der Abeta-Region schneidet. Die gamma-Sekretase (gamma) spaltet dann die bei beiden Prozessierungswegen entstehenden C-terminalen Fragmente CTalpha bzw. A4CT, so daß bei dem nicht-amyloidogenen Prozessierungsweg das p3-Fragment und bei der amyloidogenen Prozessierung Abeta-Protein sekretiert wird.
Abb. 3 : Darstellung der Abeta-Region mit den verschiedenen Mutationen im APP-Gen, die zu familiärer Alzheimer-Krankheit bzw. bei der Flemish-/Dutch-Mutation zusätzlich zu der HCWA-D führen. Auf molekularer Ebene haben diese die verstärkte Bildung von Abeta(1-40) bzw. Abeta(1-42) zur Folge. Die Schnittstellen der Sekretaseaktivitäten sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
Abb. 4 : Immunhistochemische Dreifachfärbung eines senilen Plaques eines humanen post-mortem Alzheimer-Gewebes, bei dem das Amyloid beta-Protein (Abeta) als helle globuläre Masse (ThioflavinS-Färbung) und schwarz-gefärbte Mikroglia (HLA-DR-Färbung) sichtbar sind. Umgeben wird der Plaque von sternförmigen aktivierten Astrozyten (GFAP-Färbung) ( McGeer & McGeer, 1995 ).
Abb. 5 : Struktur des Vektors pCEP4
Abb. 6 : Immunzytochemische Detektion von ICAM-1 in Astrozyten, die mit unterschiedlichen Mitogenen für 18 h behandelt wurden (freundlicherweise von G. Bodewitz, Schering AG, zur Verfügung gestellt). A. unbehandelte CCF-STTG1-Zellen, B. CCF-STTG1-Zellen, mit 100 U IL1beta/ml behandelt, C. CCF-STTG1-Zellen mit 50 ng TNFalpha/ml behandelt. Antikörper : MAk anti-human-ICAM-1 (1:1000). Vergrößerung : 400fach.
Abb. 7 : Immunpräzipitation des ICAM-1
Autoradiographie des gelelektrophoretisch aufgetrenntem, mit anti-human-ICAM-1 immunpräzipitiertem, 35S-markiertem ICAM-1 aus Zellysat unbehandelter (Kontrolle) und Zytokin-behandelter (100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml) humaner Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1). Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker)
Abb. 8 : Expression des ICAM-1 in Abhängigkeit von der IL1beta- und TNFalpha-Konzentration
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 0,75; 1,56; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 U IL1beta/ml (1) bzw. mit 10, 20, 30, 40 und 50 ng TNFalpha/ml (2) für 18 h behandelt und im ICAM-1-ELISA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils drei unabhängigen Experimenten und die daraus resultierende Standardabweichung berechnet.
Abb. 9 : Zeitverlauf der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml bzw. 50 ng TNFalpha/ml für 2, 4, 8, 14, 18, 24, 48 und 72 h behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils 3 Meßwerten berechnet und der Mittelwert der Zytokin-aktivierten Zellen vom Mittelwert der Kontrollzellen (nicht behandelt) subtrahiert. Diese Daten waren in zwei weiteren Experimenten reproduzierbar.
Abb. 10 : Einfluß verschiedener Mitogene auf die Expression des ICAM-1 in CCF-STTG1-Zellen
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml, 100 U IFNgamma/ml, 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGFbeta/ml für 18 h behandelt und anschließend im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Es wurde der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten gebildet und die Standardabweichung errechnet.
Abb. 11 : Einfluß verschiedener Mitogene auf die Expression des ICAM-1 in H4-Zellen
H4-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml, 100 U IFNgamma/ml, 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGFbeta/ml für 18 h behandelt und anschließend im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Es wurde der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten gebildet und die Standardabweichung errechnet.
Abb. 12 : Einfluß des Abeta-Proteins auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml oder 50 ng TNFalpha/ml und 100 U IFNgamma/ml in Kombination mit konditionierten Medien von Sy5y-, Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen für 19 h behandelt. Anschließend wurden die Zellen im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Im Diagramm ist der Mittelwert aus jeweils vier Meßwerten und die daraus resultierende Standardabweichung dargestellt.
Abb. 13 : Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml (TNF) oder mit konditionierten Medienüberständen von Mikroglia (MG-KM) für 18 h behandelt und im ICAM-1-ELISA analysiert. Primäre Mikroglia wurden unbehandelt für 2 Tage kultiviert oder mit monomerem Abeta(1-42) (Aßmono.) bzw. mit aggregiertem Abeta(1-42) (Aßaggreg.) für 2 und 5 Tage kultiviert. Im Diagramm ist der Mittelwert aus jeweils 6 Meßwerten und die daraus resultierende Standardabweichung dargestellt. Diese Daten waren in drei weiteren Experimenten reproduzierbar.
Abb. 14 : Einfluß von Enzym-Hemmstoffen auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
(1) CCF-STTG1-Zellen wurden für 1 h mit den o.g. pharmakologischen Substanzen inkubiert, für 18 h mit 100 U IL1beta/ml oder 50 ng TNFalpha/ml behandelt und im ICAM-1-ELSIA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils drei unabhängigen Experimenten und die daraus resultierende Standardabweichung ermittelt. (2) Es wurde die prozentuale Hemmung der Zytokin-stimulierten ICAM-1-Expression berechnet. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten.
Abb. 15 : Einfluß von Prostaglandinen auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden für 1 h mit 1 µM PGE2 und 1 µM PGD2-Analoga in Mikrotiterplatten behandelt und anschließend für 18 h mit 100 U IL1beta/ml bzw. 50 ng TNFalpha/ml stimuliert. Es wurden mit dem MTS-Test die Vitalität der Zellen (1) und mit dem ICAM-1-ELISA die ICAM-1-Expression (2) analysiert. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (3) Es wurde die prozentuale Hemmung der Zytokin-stimulierten ICAM-1-Expression berechnet (Formel siehe 4.1.9.). Hierfür wurden die Meßdaten des ICAM-1-ELISA’s auf die Meßwerte des MTS-Tests normalisiert.
Abb. 16 : PGE2-Sekretion aktivierter Astrozyten
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 50 U IL1beta/ml, 10 ng TNFalpha/ml oder mit konditioniertem Medium Abeta-aktivierter Mikroglia (1:2, MG-KM) mit und ohne Cyclooxygenase-Hemmstoff Fluosilit für 5 Tage behandelt. Das konditionierte Medium der Zellen wurde im PGE2-ELISA analysiert. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten und wurden anhand des jeweiligen mitgeführten PGE2-Standards (ohne Abb.) berechnet.
Abb. 17 : Nachweis proteolytischer APP-Fragmente von Astrozyten und Neuronen
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. (1) Western-Blot gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit Aceton gefällten Lysate von Rattenhirn, primären Astrozyten (Astrozyten), primären Neuronen (Neurone) und humanen astrozytären Zellinien (CCF-STTG1-, H4-, H4/APP695sw-, H4/APP751sw-Zellen). Es wurden APP-Isoformen und proteolytische Fragmente der APP-Prozessierung nachgewiesen. C-terminale, nicht-amyloidogene Fragmente (CT) wurden mit polyspezifischem anti-CT, posttranslational modifizierte (APP*) und nichtposttranslational modifizierte (APP) APP-Isoformen mit MAk 22C11 nachgewiesen. (2) Sekretorisches APP (secAPP) wurde in immunpräzipitierten, konditionierten Medienüber-ständen nach gelelektrophoretischer Auftrennung im Western-Blot mit MAK 22C11 nachgewiesen. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard angegeben.
Abb. 18 : Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Abeta-Protein
Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit den o.g. monoklonalen Antikörpern immunpräzipitierten, 35S-markierten Abeta aus konditionierten Medienüberständen von Sy5y/APP751sw-Zellen. Abeta-Peptide (1-40) und (1-42) wurden über Coomassie Blue-Färbung detektiert. Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in einem 12 %igen Tris-/Bicin-/Harnstoff-Gel. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker).
Abb. 19 : APP-Prozessierung transfizierter Astrozyten und Neurone
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. Autoradiographie astrozytärer Zellen (CCF-STTG1, H4) und Neuroblastom-Zellen (Sy5y), die mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695 (APP695), pCEP4/APP695sw (APP695sw), pCEP4/APP751 (APP751) oder pCEP4/APP751sw (APP751sw) transfiziert wurden. Die [35S]-Methionin markierten, anti-A4CT-immunpräzipitierten Zellysate (1) wurden im Gradientengel elektrophoretisch aufgetrennt, die anti-FdAPP-präzipitierten Medienüberstände (2) im 7,5 %igen Laemmli-Gel. Es wurde die gesamte Proteinmenge auf das Gel aufgetragen.
Abb. 20 : Abeta-Sekretion transfizierter Astrozyten und Neuronen
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. Autoradiographie von metabolisch mit [35S]-Methionin markierten, mit (1) anti-Abeta(1-40) und (2) anti-Abeta(1-42) immunpräzipitierten Medienüberständen astrozytärer Zellen (CCF-STTG1, H4) und Neuroblastom-Zellen (Sy5y), die mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695 (APP695), pCEP4/APP695sw (APP695sw), pCEP4/APP751 (APP751) oder pCEP4/APP751sw (APP751sw) transfiziert wurden. Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin).
Abb. 21 : Verhältnis [Abeta(1-40):p3] transfizierter Astrozyten und Neuronen
Das Diagramm zeigt das Verhältnis [Abeta(1-40):p3], das nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie (Abb. 20B-1) mit densitometrischen Meßeinheiten, die mit den Meßwerten der radioaktiven Einbaurate normalisiert wurden, berechnet wurde. CCF-STTG1-, H4- und Sy5y-Zellen wurden mit den o.g. APP-cDNA transiziert.
Abb. 22 : APP-Prozessierung stabil transfizierter H4-Zellen
Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, immunpräzipitierter, [35S]-markierten APP-Fragmenten aus Zellysaten (A) und konditionierten Medien (B) von H4-Zellen: nichttransfizierte H4-Zellen (Wildtyp), transfizierte H4/pCEP4-APP695- (APP695) und H4/pCEP4-APP695sw-Zellen (APP695sw). Das Zellysat wurde mit anti-A4CT (A), das konditionierte Medium mit anti-FdAPP (1), anti-Abeta(1-40) (2) und anti-Abeta(1-42) (3) immunpräzipitiert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in NuPage-Gelen. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker).
Abb. 23 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen - Analyse der Zellysate
A. H4/APP695sw-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 20 bzw. 50 ng TNFalpha/ml (TNFalpha/20 bzw. TNFalpha/50), 100 U IFNgamma/ml, 20 oder 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF /ml oder 2 ng TGFbeta/ml für 4 h während einer metabolischen Markierung mit [35S]-Methionin behandelt. Die gesamte Proteinmenge der mit anti-A4CT präzipitierten Lysatüberstände wurde im NuPage-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographisch analysiert. B. Das Diagramm zeigt das Verhältnis [CT:A4CT], das nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie mit der Software ImageQuant berechnet wurde. Die auf gleiche radioaktive Einbaurate (siehe 3.3.7.) korrigierten densitometrischen Meßwerte der Kontrollzellen wurden gleich 1,0 gesetzt. Werte > 1,0 = Zellen zeigen verringerte beta-Sekretaseaktivität, Werte < 1,0 = Zellen zeigen verstärkte beta-Sekretaseaktivität.
Abb. 24 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen - Analyse der konditionierten Medienüberstände
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege B. Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit den Antikörpern anti-Abeta(1-6) (1), anti-Abeta(1-40) (2) und anti-Abeta(1-42) (3) immunpräzipitierter 35S-markierter APP-Fragmente aus konditionierten Medien Mitogen-behandelter H4/APP695sw-Zellen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin). Sekretorisches APP nach alpha-Sekretase-aktivität (secAPPalpha).
Abb. 25 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen
Die Diagramme zeigen das Verhältnis [secAPPalpha:Abeta] (1), [p3:Abeta(1-40)] (2) und die gemessenen, densitometrischen Einheiten der Abeta(1-42)-Sekretion (3), die nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographien (Abb. 24) berechnet wurden. Die auf gleiche radioaktive Einbaurate korrigierten Werte der Kontrollzellen wurden gleich 1,0 gesetzt (1, 2). Werte > 1,0 = nicht-amyloidogene APP-Prozessierung, Werte < 1,0 = amyloidogene APP-Prozessierung.
Abb. 26 : Hemmung der räumlichen Ausbreitung der Astrozyten-Aktivierung
Aktivierte Astrozyten, die in einem inflammatorischen Bereich gelegen sind, könnten durch die verstärkte PGE2-Sekretion das räumliche Ausmaß der Astrozyten-Aktivierung vermindern.
Abb. 27 : Abeta-Sequenz des Menschen und der Maus
Es sind sowohl die Aminosäurenaustausche in der humanen und mäuslichen Abeta-Sequenz an den Positionen Abeta-AS5 (ArgrarrGly), Abeta-AS10 (TyrrarrPhe) und Abeta-AS16 (LysrarrArg) als auch die potentiellen Schnittstellen der Sekretaseaktivitäten dargestellt.
Abb. 28 : Modell über zelluläre, neuroinflammatorische Prozesse in der Alzheimer-Pathogenese

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Fri Jul 16 11:22:38 1999