Kernekewisch, Michaela: Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

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Kapitel 1. Einleitung

Bis zum Ende des 19. Jahrhunderts wurde den Neuronen die Hauptrolle bei den physiologischen Prozessen des Gehirns zugeschrieben. Mit der Entdeckung der Astrozyten hat sich jedoch diese Ansicht gewandelt. Anfangs wurden sie noch als uninteressanter ”Nervenkitt“ beschrieben, ein Bindegewebe zwischen den Neuronen (”Neuroglia“). Der größte Teil des Gehirnvolumens besteht jedoch aus nicht-neuronalen Zellen, zu denen neben den Astrozyten auch die Mikroglia und Oligodendrozyten zählen. Im Gegensatz zu den Astrozyten und Oligodendrozyten, die sich wie die Neurone aus dem ektodermalen Keimblatt entwickeln, sind Mikroglia mesodermalen Ursprungs.

Astrozyten erfüllen neben einer Schlüsselrolle bei der Embryonalentwicklung auch metabolische und neurotrophische Funktionen durch Aufnahme und Metabolisierung von Neurotransmittern, Hormonen sowie durch Produktion von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Neuropeptiden (zur Übersicht de Vellis, 1993 ). Außerdem helfen Astrozyten zusammen mit Endothelzellen, die Blut-Hirn-Schranke und damit das innere Milieu des zentralen Nervensystems aufrecht zu erhalten.

Die Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS) und seine Antworten auf Erkrankung und Verletzung sind abhängig von den zellulären Interaktionen, die durch Ausschleusung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Proteasen und Proteaseinhibitoren reguliert werden. Verletzungen des Gehirns ziehen oft eine Aktivierung der umliegenden glialen Zellen nach sich, die auch als reaktive Gliose oder, je nach aktiviertem Zelltyp, als Astrogliose bzw. Mikrogliose bezeichnet wird. Dabei weisen Astrozyten eine hypertrophe Morphologie und eine verstärkte Immunreaktivität des für diesen Zelltyp spezifischen Intermediärfilamentes GFAP (glial fibrillary acidic protein) auf ( Amaducci et al., 1981 ; Aquino et al., 1988 ; Balasingam et al., 1994 ). Pathologische Prozesse wie die Gliose werden als ein für die Regeneration von Nervenfortsätzen schädigender Prozeß diskutiert. Es wird jedoch auch vermutet, daß zumindest in der Anfangsphase nach einer Verletzung die Gliose ein Reparaturversuch der glialen Zellen darstellt, da eine Vielfalt von neurotrophisch wirksamen Wachstumsfaktoren und extrazellulären Matrixbestandteilen die Verletzungsstelle umgeben. Ein charakteristisches Beispiel für die reaktive Gliose sind chronisch neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise die Alzheimer-Krankheit, bei der aktivierte Astrozyten und Mikroglia immunhistochemisch dargestellt werden können ( Duffy et al., 1980 ; Schechter et al., 1981 ; Mancardi et al., 1983 ).

1.1. Die Alzheimer-Krankheit

Im Jahre 1906 berichtete Alois Alzheimer zum ersten Mal über eine Erkrankung des Gehirns, die hauptsächlich Menschen höheren Alters betrifft und mit einem fortschreitenden Verlust der mentalen Fähigkeiten verbunden ist ( Alzheimer, 1906 ). Die Alzheimer-Krankheit stellt eine ätiologisch heterogene Gruppe von klinisch und neuropathologisch sehr ähnlichen Krankheitsbildern dar. So werden präsenile, familiäre (autosomal dominante) Formen (familial Alzheimer’s disease, FAD) von der Gruppe der senilen, sporadischen Erkrankungen (Senile Demenz vom Alzheimer-Typ, SDAT) unterschieden. Bei der sporadischen Form treten die ersten klinischen Symptome meist erst nach Erreichen des 65. Lebensjahres auf, während sich bei der familiären Form die Symptomatik häufig schon vor dem 50. Lebensjahr manifestiert, in einzelnen Fällen sogar schon vor dem 30. Lebensjahr ( Breitner & Folstein, 1980 ; Nee et al., 1983 ; Reisberg, 1983 ).

Auf neuropathologischer Ebene führt die Alzheimer-Krankheit zu einem massiven Verlust von Neuronen im limbischen System und im cerebralen Cortex. Die damit verbundene Atrophie kann zu einem Gewichtsverlust des Gehirns von bis zu 60 % führen. Charakteristische Merkmale der Alzheimer-Krankheit sind intra- und extrazelluläre unlösliche, proteinhaltige Ablagerungen vor allem im Hippocampus, in der Großhirnrinde und im Hirnstamm ( Alzheimer, 1907 ; Katzman, 1986 ; Reisberg, 1983 ). Die intrazellulären Ablagerungen in Perikarya, Axonen, Dendriten und Nervenendigungen treten in Form von neurofibrillären Bündeln (neurofibrillary tangel, NFT) auf und bestehen aus dem in pathologischer Weise veränderten Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau ( Goedert et al., 1991 ; Trojanowski & Lee, 1994 ). Die Neurofibrillenbündel sind kein Spezifikum der Alzheimer-Krankheit, sondern treten auch bei


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anderen neurodegenerativen Erkrankungen auf. Die extrazellulären Ablagerungen bilden kugel-förmige Läsionen mit einem Durchmesser von 10 bis 200 µm und werden durch deren Hauptkomponente auch als amyloidogene Ablagerungen, Amyloid-Plaques oder kurz als Plaques bezeichnet. Es werden in Abhängigkeit von der Aggregationsform und Fibrillenbildung des Amyloid-Proteins diffuse und senile Plaques unterschieden, wobei die diffusen Plaques die am frühesten erkennbaren strukturellen Veränderungen darstellen und auch bei älteren Menschen ohne Demenzerscheinungen beobachtet werden können ( von Braunmühl, 1937 ). Ein typischer seniler Plaque besteht aus einem stark verdichteten Kern des Amyloid-Proteins, umgeben von degenerierten und häufig angeschwollenen Nervenendigungen. Darüber hinaus findet sich bei einem Teil der Alzheimer-Patienten auch eine Ablagerung des Amyloid-Proteins in den cerebralen und meningealen Blutgefäßen in Form eines vaskulären Amyloids, die als kongophile Angiopathie bezeichnet wird ( Müller-Hill & Beyreuther, 1989 ). Solche Amyloid-Ablagerungen konnten auch aus Gehirnen von älteren Patienten mit Down-Syndrom, mit HCHWA-D (hereditary cerebral hemorrage with amyloidosis of Dutch type) und mit Guam-Parkinson-Demenz isoliert werden ( Glenner & Wong, 1984 ; Beyreuther et al., 1986 ; Prelli et al., 1988 ; van Duinen et al., 1987 ; Guiroy et al., 1987 ).

1.2. Das Amyloid und sein Vorläuferprotein APP

Da ein vermehrtes Vorkommen amyloidogener Ablagerungen in den für die intellektuellen Fähigkeiten entscheidenden Hirnregionen ein durchgängiges Merkmal der Alzheimer-Krankheit darstellt, und die Zahl dieser extrazellulären Ablagerungen mit dem Grad der Demenz korreliert ( Masters et al., 1985 ), bestand ein großes Interesse an der Aufklärung der molekularen Struktur des Amyloid-Proteins und der Entstehung amyloidogener Ablagerungen, der Amyloidogenese. Die biochemische Analyse des Amyloid-Proteins führte 1984 zur Isolierung eines aus maximal 42 bis 43 Aminosäuren bestehenden Peptides als Haupbestandteil der beschriebenen extrazellulären Ablagerungen ( Glenner & Wong, 1984 ; Masters et al., 1985 ). Aufgrund der Tendenz dieses Proteins, beta-Faltblattstrukturen auszubilden ( Glenner & Wong, 1984 ; Hilbich et al., 1991 ) und durch die starken Aggregationseigenschaften wurde es mit einem Molekular-gewicht von ca. 4 kDa als Amyloid beta-Protein, Abeta-Protein oder auch kurz als Abeta bezeichnet.

Ausgehend von der Abeta-Proteinsequenz gelang es, cDNA-Klone aus Gehirn-Genbibliotheken zu identifizieren, die zeigten, daß die Abeta-Sequenz Teil eines wesentlich größeren Vorläuferproteins ist, dessen Gen auf dem langen Arm von Chromosom 21 lokalisiert ist ( Goldgaber et al., 1987 ; Kang et al., 1987 ; Robakis et al., 1987 ; Tanzi et al., 1987 ). Mittlerweile sind verschiedene cDNA’s des mehr als 170 kb umfassenden APP-Gens (amyloid precursor protein, APP) beschrieben, die durch alternatives Spleißen von vier der insgesamt 19 Exons ( Kang et al., 1987 ; Kitaguchi et al., 1988 ; Ponte et al., 1988 ; Tanzi et al., 1988 ; Yoshikai et al., 1990 ) entstehen. Die verschiedenen Isoformen der Amyloid-Vorläuferproteine werden nach der Anzahl der Aminosäuren (AS) benannt und besitzen eine Molmasse von ca. 100 bis 140 kDa. Die Abb. 1 zeigt eine schematische Domänenstruktur des Amyloid-Vorläuferproteins, dessen Primärstruktur charakteristische Merkmale eines Plasmamembran-ständigen Glykoproteins aufweist: Sie enthält einen großen extrazellulären Bereich, bestehend aus drei Domänen, gefolgt von einer Transmembranregion und einer kleinen zytoplasmatischen Domäne ( Kang et al., 1987 ; Dyrks et al., 1988 ). Diese enthält u.a. die NPXY-Konsensussequenz, wie sie für Clathrin-vermittelte Endozytose beschrieben wurde ( Chen et al., 1990 ). Die Abeta-Sequenz (1-43) umfaßt 28 AS des extrazellulären Teils und 15 AS der Transmembranregion.


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Abb. 1 : Schematische Darstellung der Domänenstruktur des Amyloid-Vorläuferproteins
Am N-Terminus des APP ist das 17 AS große Signalpeptid (SP) lokalisiert, das die Translokation des Polypeptids in das endoplasmatische Retikulum vermittelt. Posttranslationale Modifizierungen sind O- und N-Glykosylierungen (O/N), Tyrosin-Sulfatisierung (S) und Phosphorylierung (P). Cys: Cystein-reiche Region. Glu/Asp: stark saure Domäne. KPI: Kunitz-Protease-Inhibitor-Domäne, die nur in den Isoformen APP751 und APP770 enthalten ist. OX-2: MRC-OX-2-Antigen-Domäne, die nur in APP770 enthalten ist. CHO: Kohlenhydrat-Domäne. Abeta: Amyloid beta-Protein, PM: Plasmamembran.

Allen Translationsprodukten gemeinsam ist eine Vielzahl von posttranslationalen Modifizierungen, zu denen sowohl N- als auch O-Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Tyrosin-Sulphatisierungen und proteolytische Spaltung zählen ( Oltersdorf et al., 1989 ; Weidemann et al., 1989 ). Durch proteolytische Spaltung wird ein großes, N-terminales APP-Fragment in das extrazelluläre Milieu sekretiert, das als sekretorisches APP bezeichnet wird.

Als häufigste Translationsprodukte im peripheren System wurden die Isoformen APP770 und APP751 mit einer Domäne beschrieben, deren Sequenz etwa 45% Homologie zu den Kunitz Typ II Serin-Protease-Inhibitoren (KPI) aufweist ( Kitaguchi et al., 1988 ; Ponte et al., 1988 ; Tanzi et al., 1988 ). APP770 enthält zusätzlich eine Domäne, die Ähnlichkeiten mit dem MRC OX-2 Antigen auf Thymozyten aufweist ( Clark et al., 1985 ). Oltersdorf et al. ( Oltersdorf et al., 1989 ) und van Nostrand et al. ( van Nostrand et al., 1989 ) zeigten, daß das sekretorische, KPI-haltige APP identisch mit einem schon vorher bekannten Serinproteasen-Inhibitor namens Protease-Nexin II ist. Die dominierende Isoform im Gehirn von Mensch und Ratte ist APP695 ohne die Domänen KPI und OX-2 und wird vorwiegend von Neuronen exprimiert ( Golde et al., 1990 ; Kang et al., 1987 ; Kang & Müller-Hill, 1990 ; Neve et al., 1988 ; Tanzi et al., 1987 ). Die Isoformen APP751 und APP770, die die KPI-Domäne aufweisen, werden vorwiegend von glialen Zellen exprimiert ( Gray & Patel, 1993a , Gray & Patel, 1993b ).

Ein weiteres alternativ gespleißtes APP-Transkript (ohne Exon 15) wurde als erstes in peripheren Leukozyten und Mikroglia nachgewiesen und daher als Leukozyten-abgeleitetes APP oder auch L-APP bezeichnet ( Banati et al., 1993 ; König et al., 1992 ). Homologe APP-Formen wurden sowohl in Säugetieren mit APLP-1 (amyloid precursor like protein 1) ( Wasco et al., 1992 ) und APLP-2 ( Wasco et al., 1993 ) als auch in Drosophila melanogaster (APPL) ( Rosen et al., 1989 ) und im Fadenwurm Caenorhabditis elegans (APL-1) ( Daigle & Li, 1993 ) gefunden. Im Gegensatz zu APP besitzen alle APP-ähnlichen Proteine keine Abeta-Region ( Sandbrink et al., 1994 ).


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Eine für die Alzheimer-Krankheit wesentliche posttranslationale Modifizierung ist die proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins. Es werden zwei Prozessierungswege unterschieden: Den amyloidogenen Weg, bei dem das Abeta-Protein freigesetzt werden kann und den nicht-amyloidogenen Weg, bei dem die Entstehung des Abeta-Proteins durch einen proteolytischen Schnitt in der Abeta-Region verhindert wird. Die APP-Prozessierung zu den verschiedenen Spaltprodukten erfolgt durch unterschiedliche, bisher noch nicht identifizierte Sekretasen, die als alpha-, beta- und gamma-Sekretaseaktiviät bezeichnet werden (siehe Abb. 2).

Abb. 2 : Schematische Darstellung der APP-Prozessierungswege
Die nicht-amyloidogene Prozessierung beginnt mit der alpha-Sekretase (alpha), die in der Abeta-Region (dunkler Kasten) schneidet, so daß kein Abeta freigesetzt werden kann. Der amyloidogene Weg wird durch die Aktivität der beta-Sekretase (beta) eingeleitet, die N-terminal der Abeta-Region schneidet. Die gamma-Sekretase (gamma) spaltet dann die bei beiden Prozessierungswegen entstehenden C-terminalen Fragmente CTalpha bzw. A4CT, so daß bei dem nicht-amyloidogenen Prozessierungsweg das p3-Fragment und bei der amyloidogenen Prozessierung Abeta-Protein sekretiert wird.


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Für den nicht-amyloidogenen Weg wird vermutet, daß eine sogenannte alpha-Sekretase APP an der Position Lys16/Leul7 innerhalb der Abeta-Sequenz schneidet ( Weidemann et al., 1989 , Esch et al., 1990 , Sisodia et al., 1990 ), wodurch ein großes N-terminales Spaltprodukt (secAPPalpha) und ein membranständiges C-terminales Fragment (CT) entstehen ( Oltersdorf et al., 1990 ). Das C-terminale Fragment kann durch Aktivität der gamma-Sekretase weiter prozessiert werden, woraus die Sekretion eines 3 kDa großen Fragmentes, der C-terminale Teil der Abeta-Sequenz (AS 17-40/42, p3), resultiert ( Haass et al., 1993 ), oder das gesamte CT-Fragment wird über das NPXY-Motiv internalisiert und in den Lysosomen abgebaut.

Im amyloidogenen Prozessierungsweg entsteht vermutlich durch Aktivität der beta-Sekretase, die an Position AS1 der Abeta-Sequenz schneidet, zunächst das membran-ständige A4CT-Fragment mit der gesamten Abeta-Sequenz ( Golde et al., 1992 ) und das große N-terminale Spaltprodukt secAPPbeta. Die enzymatische Aktivität der gamma-Sekretase führt dann zur Freisetzung des vollständigen Abeta-Proteins (1-40/42) in den extrazellulär-en Raum ( Haass & Selkoe, 1993b ). Von verschiedenen Arbeitsgruppen konnte gezeigt werden, daß ein Teil des APP unter Bildung amyloidogener C-terminaler Fragmente über einen endosomalen/lysosomalen Weg prozessiert wird ( Estus et al., 1992 , Golde et al., 1992 ; Haass et al., 1992 ).

Wie in der Abb. 3 (siehe 1.3.) angedeutet, wurden im Hinblick auf den C-Terminus unterschiedlich lange proteolytische Spaltprodukte des Abeta-Proteins nachgewiesen ( Zhong et al., 1994 ). Es wird vermutet, daß die C-terminale Heterogenität des Abeta-Proteins eine Folge unterschiedlicher gamma-Proteaseaktivitäten ist ( Citron et al., 1996 ). Unter physiologischen Bedingungen wird jedoch vorwiegend Abeta(1-40) gebildet ( Haass et al., 1992 ; Seubert et al., 1992 ; Dyrks et al., 1993 ). Neben verschiedenen gamma-Sekretaseschnittstellen wurden auch für die alpha- und beta-Sekretaseaktivität unterschiedlich lange Spaltprodukte beschrieben. Aus diesem Grund werden die einzelnen Sekretasen auch häufig als Sekretaseaktivitäten bezeichnet, da so die Möglichkeit miteinbezogen wird, daß es sich um mehrere Proteasen handeln könnte.

Der zelluläre Ursprung des Abeta-Proteins ist noch nicht endgültig geklärt. Viele Autoren sind überzeugt, daß Neurone die Hauptproduzenten des Abeta-Proteins sind ( Palmert et al., 1989 ; Golde et al., 1992 ; Haass et al., 1992 ; Shoji et al., 1992 ). Die Befunde von Le Blanc et al. ( Le Blanc et al., 1997 ) und Busciglio et al. ( Busciglio et al., 1993 ) deuten jedoch darauf hin, daß neben den Neuronen auch Astrozyten in der Lage sind, amyloidogene Spaltprodukte wie das Abeta-Protein zu bilden. Ein wesentlicher Schwerpunkt in der Alzheimer-Forschung ist die Aufklärung der Amyloidogenese. Es stellt sich die Frage, warum es zu einer verstärkten Abeta-Freisetzung in der Alzheimer-Pathogenese kommt und welche Zellen darin involviert sind. Die Anwesenheit aktivierter Astrozyten und zahlreicher immunmodulatorischer Moleküle (siehe 1.4.) scheinen hierbei immer mehr an Bedeutung zu gewinnen. Einen Hinweis für eine veränderte APP-Expression in aktivierten Astrozyten lieferten Untersuchungen an Tier- und Zellkulturmodellen verschiedener Arbeitsgruppen, die zeigten, daß aktivierte Astrozyten ihre APP-Expression verstärken ( Siman et al., 1989 ; Gray & Patel, 1993a , Gray & Patel, 1993b ). Inwieweit aktivierte Astrozyten ihre amyloidogene APP-Prozessierung verändern, wurde bisher noch nicht untersucht.

1.3. Genetische Ursachen der Alzheimer-Krankheit

Die Ätiologie der Alzheimer-Krankheit ist zum Teil genetisch bedingt und wird daher auch als familiäre Alzheimer-Demenz (FAD) bezeichnet. Es konnten bislang neben dem APP-Gen auf Chromosom 21 drei weitere Gene identifiziert werden (siehe Tab. 1), die zur Ausbildung der Alzheimer-Pathogenese beitragen. Dabei handelt es sich um das Gen für Apolipoprotein (ApoE) auf Chromosom 19, Presinilin 1 (PS1) auf Chromosom 14 und Presinilin 2 (PS2) auf Chromosom 1. Insgesamt sind diese vier Gene an ca. 50 % aller FAD-Fälle beteiligt ( Tanzi et al., 1996 ).


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Tab. 1 : Genetische Ursachen der Alzheimer-Krankheit und deren Einfluß auf die Entstehung des Abeta-Proteins

Chromosom

Gendefekt

Alter bei Diagnose

Anteil an AD-Fällen insgesamt

Abeta-Phänotyp

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APP-Mutationen :

Swedish

Dutch/Flemish

London

50 Jahre

< 0,5 %

erhöhte Produktion :

Abeta(1-40) und Abeta(1-42)

Abeta(1-42)

Abeta(1-42)

19

ApoE-epsilon4-Polymorphismus

> 60 Jahre

30 - 50 %

Dichte der Plaques und vaskuläre Ablagerungen

14

Presinilin 1-Mutationen

40-50Jahre

2 - 5 %

erhöhte Produktion des

Abeta(1-42)

1

Presinilin 2-Mutationen

50 Jahre

< 0,5 %

erhöhte Produktion von

Abeta(1-42)

Bisher konnten sechs verschiedene Mutationen im APP-Gen identifiziert werden, die alle in der Nähe oder innerhalb der Abeta-Region lokalisiert sind und zu einer erhöhten Sekretion des Abeta(1-40) und Abeta(1-42) führen ( Mullan et al., 1992 ; Murell et al., 1991 ; Chartier-Harlin et al., 1991 ; Levy et al., 1990 ). In Abb. 3 sind die im APP-Gen vorkommenden Mutationen wie z.B. die ”schwedische Mutation“ (swedish mutation) mit einer Doppelmutation im Kodon 670/671 (APP770) direkt N-terminal der Abeta-Region ( Mullan et al., 1992 ) dargestellt. Diese Mutation führt in Zellkulturexperimenten zu einer fünf- bis achtfach erhöhten Freisetzung des gesamten Abeta in das konditionierte Medium im Vergleich zu Wildtyp APP-exprimierenden Zellen, wobei hauptsächlich Abeta(1-40) verstärkt sekretiert wird ( Citron et al., 1992 ). Die flämische Mutation (flemish mutation) im APP-Gen bei Kodon 692 führt neben den klassischen Merkmalen der Alzheimer-Krankheit zu einer Amyloidose durch zusätzliche Ablagerungen von Abeta in cerebralen Blutgefäßen, die auch als kongophile Amyloid-Angiopathie bezeichnet wird ( Hendriks et al., 1992 ). Ebenso tritt bei der holländischen Mutation (dutch mutation) im Kodon 693 neben den typischen Merkmalen der Alzheimer-Krankheit zusätzlich die cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose-Dutch-Typ (HCHWA-D) auf. Beide Mutationen sind mit einer verstärkten Entstehung des Abeta(1-42) assoziiert, das auf eine verstärkte Aktivität der gamma-Sekretase hinweist. Eine weitere Mutation, die London-Mutation, ist im Bereich der gamma-Sekretase-Schnittstelle lokalisiert. Die Aminosäure Valin in Position 717 (APP770) ist gegen Isoleucin, Phenylalanin oder Glycin ausgetauscht ( Goate et al., 1991 ; Murell et al., 1991 ; Yoshioka et al., 1991 ; Chartier-Harlin et al., 1991 ; Farlow et al., 1994 ). Auch durch diese Mutation wird in Zellkulturexperimenten die Sekretion des Abeta(1-42) verstärkt ( Cai et al., 1993 ; Suzuki et al., 1994 ; Tamaoka et al., 1994 ). Alle Mutationen im APP-Gen führen in Zellkulturmodellen zu einer verstärkten Expression des amyloidogenen C-terminalen Fragments A4CT.


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Abb. 3 : Darstellung der Abeta-Region mit den verschiedenen Mutationen im APP-Gen, die zu familiärer Alzheimer-Krankheit bzw. bei der Flemish-/Dutch-Mutation zusätzlich zu der HCWA-D führen. Auf molekularer Ebene haben diese die verstärkte Bildung von Abeta(1-40) bzw. Abeta(1-42) zur Folge. Die Schnittstellen der Sekretaseaktivitäten sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Neben den Mutationen im APP-Gen konnten zahlreiche Missense-Mutationen in den Genen für Presinilin 1 und 2 (PS1 bzw. PS2) identifiziert werden, wodurch es zu einem frühen Ausbruch der Alzheimer-Krankheit (early-onset) in der fünften bis sechsten Lebensdekade kommt ( Sherrington et al., 1995 ; Levy-Lahad et al., 1995 ). In Zellkulturmodellen konnte ein Einfluß von Mutationen im Presinilin-Gen auf die Prozessierung des APP und die Entstehung des Abeta-Proteins gezeigt werden ( Borchelt et al., 1996 ; Scheuner et al., 1996 ; Citron et al., 1997 ; Haass, 1997 ).

Als ein weiteres Risikogen wurde durch verschiedene Arbeitsgruppen ApoE-epsilon4 auf Chromosom 19 beschrieben ( Corder et al., 1993 ; Strittmatter et al., 1993 ; Saunders et al., 1993 ). ApoE ist Bestandteil der ”low densitiy“-Lipoproteine (LDL) und vermittelt die Bindung von LDL an den LDL-Rezeptor. Es existieren drei verschiedene Allele des ApoE-Gens, die als epsilon2, epsilon3 und epsilon4 bezeichnet werden ( Weisgraber, 1994 ). Im ZNS ist ApoE an der Regeneration und Degeneration neuronaler Zellen beteiligt, indem es die Neuverteilung von Lipiden, Lipid-Abbauprodukten und Cholesterin ermöglicht. Im Gehirn wird ApoE hauptsächlich nach cerebraler Schädigung von Astrozyten produziert.

1.4. Pathophysiologische Prozesse der Alzheimer-Krankheit

Neben den genetischen Faktoren der Alzheimer-Krankheit, die die Ursache vieler familiärer Fälle sind, spielen pathophysiologische Prozesse eine wesentliche Rolle im Auftreten der sporadischen Alzheimer-Form. Im Jahre 1975 wurde erstmals vermutet, daß inflammatorische Prozesse in der Alzheimer-Pathogenese involviert sind ( Ishii et al., 1975 ). Erst in den letzen Jahren konnte durch den Nachweis zahlreicher Proteine, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, und durch die Anwesenheit aktivierter Astrozyten und Mikroglia in der Nähe amyloidogener Ablagerungen die Vermutung verstärkt werden, daß eine chronische Neuroinflammation in der Alzheimer-Krankheit existiert (zur Übersicht McGeer & McGeer, 1995 ; Rogers et al., 1996 ). Immunhistochemische Studien zeigen, daß eine Vielfalt an Zytokinen,


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Wachstumsfaktoren, Komplement-Proteinen, Akute-Phasen-Proteinen und Adhäsions-molekülen mit diffusen und senilen Plaques im Hirn von Alzheimer-Patienten assoziiert sind (siehe Tab. 2).

Tab. 2 : Charakteristische Marker inflammatorischer Prozesse im Hirn von Alzheimer-Patienten

MHC I ( McGeer et al., 1989 )

Proteine aus dem klassischen Komplementsystem

Clq ( Eikelenboom & Stam, 1984 )

MHC II

C4 ( Eikelenboom & Stam, 1984 )

HLA-DR ( Luber-Narod & Rogers, 1988 )

C44 ( McGeer et al., 1989 )

HLA-DP ( Luber-Narod & Rogers, 1988 )

C3 ( Eikelenboom & Stam, 1984 )

HLA-DQ ( Luber-Narod & Rogers, 1988 )

C3b ( Eikelenboom & Stam, 1984 )

C3c ( Eikelenboom & Stam, 1984 )

Zytokine

C3d ( Eikelenboom & Stam, 1984 )

IL-lalpha ( Griffin et al., 1989 )

C7 ( McGeer et al., 1989 )

IL-1beta ( Wood et al., 1993 )

C9 ( McGeer et al., 1989 )

IL-6 ( Bauer et al., 1991 )

C5b-9 (MAC) ( McGeer et al., 1989 )

TNF ( Fillit et al., 1991 )

mRNA’s aus dem klassischen Komplementsystem

Zytokinrezeptoren

C1q ( Walker & McGeer, 1992 )

IL-2R ( Itagaki et al., 1989 )

C4 ( Walker & McGeer, 1992 )

IFN-Ralpha ( Yamada & Yamanaka, 1995 )

C3 ( Walker & McGeer, 1992 )

Leucocyte Common Antigen

Komplement-Verteidigungsproteine

CD45 ( Rozemuller et al., 1989 )

MIRL ( McGeer et al., 1991 )

Clusterin ( Choi-Miura et al., 1992 )

Leukozyten Adhäsionsmoleküle

Vitronectin ( Akiyama et al., 1991 )

ICAM-1 ( Akiyama et al., 1993 )

C4BP ( Kalaria & Kroon, 1992 )

LFA-1 ( Rozemuller et al., 1989 )

C1-INH ( Eikelenboom et al., 1989 )

Fc Rezeptoren

Komplementrezeptoren

FcgammaR 1 ( McGeer et al., 1989 )

CR3 ( Akiyama et al., 1990 )

CR4 ( Akiyama et al., 1990 )

Akute Phasen Proteine

alpha-1-Antichymotrypsin ( Abraham et al., 1988 )

Wachstumsfaktoren

alpha-2-Makroglobulin ( Bauer et al., 1991 )

bFGF ( Stopa et al., 1990 )

Serum Amyloid P ( Coria et al., 1988 )

TGFbeta-1 ( Chao et al., 1994 )

alpha-1-Antitrypsin ( Gollin et al., 1992 )

Midkine ( Yasuhara et al., 1993 )

C-reaktives Protein ( Iwamoto et al., 1994 )


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Die immunmodulatorischen Moleküle im Hirn von Alzheimer-Patienten entsprechen dem molekularen Profil aktivierter Astrozyten und Mikroglia innerhalb einer reaktiven Gliose. Astrozyten in der Nähe amyloidogener Ablagerungen zeigen eine fünf- bis zehnfach verstärkte GFAP-Expression.

Abb. 4 : Immunhistochemische Dreifachfärbung eines senilen Plaques eines humanen post-mortem Alzheimer-Gewebes, bei dem das Amyloid beta-Protein (Abeta) als helle globuläre Masse (ThioflavinS-Färbung) und schwarz-gefärbte Mikroglia (HLA-DR-Färbung) sichtbar sind. Umgeben wird der Plaque von sternförmigen aktivierten Astrozyten (GFAP-Färbung) ( McGeer & McGeer, 1995 ).

Die Anordnung aktivierter Astrozyten und Mikroglia um den senilen Plaque (siehe Abb. 4) läßt vermuten, daß diese Zellen möglicherweise durch das Abeta-Protein selbst aktiviert werden. Tatsächlich konnte ein direkter Einfluß des Abeta-Proteins auf Astrozyten und Mikroglia nachgewiesen werden. In Zellkulturexperimenten konnte gezeigt werden, daß Mikroglia, die mit Abeta-Protein und IFNgamma (Interferon-gamma) behandelt wurden, die neurotoxischen Faktoren TNFalpha (Tumor necrosis factor alpha) und NO sekretieren ( Meda et al., 1995 ). Astrozyten, die mit Abeta-Protein behandelt wurden, sekretieren verstärkt Zytokine und Wachstumsfaktoren ( Araujo & Cotman, 1992 ; Gitter et al., 1995 ).

Wie Zellkultur- und Tiermodellen belegen, exprimieren Astrozyten im aktivierten Zustand eine Vielfalt an Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Matrixproteinen und Adhäsionsmolekülen (zur Übersicht Eddleston & Mucke, 1993 ). So wurde beispielsweise mittels eines Tiermodelles gezeigt, daß die intracerebrale Injektion von IL1 (Interleukin-1) die Astrogliose auslöst ( Giulian et al., 1988 ). Durch Zellkulturexperimente wurde gezeigt, daß IL1-behandelte Astrozyten verstärkt TNFalpha, IL6 (Interleukin-6) und TGFbeta (Transforming growth factor beta) sekretieren ( Chung & Benveniste, 1990 ; da Cunha & Vitkovic, 1992 ). Neben der verstärkten Zytokin-Sekretion fanden Ballestas und Benveniste ( Ballestas & Benveniste, 1995 ), daß primäre Astrozyten, die mit den Zytokinen IL1beta und TNFalpha behandelt wurden, verstärkt Adhäsionsmoleküle wie z.B. ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) exprimieren. Aus immunhistochemischen Untersuchungen geht hervor, daß ICAM-1 mit amyloidogenen Ablagerungen und aktivierten Astrozyten im Hirn von Alzheimer-Patienten assoziiert ist ( Akiyama et al., 1993 ; Eikelenboom et al., 1994 ; Verbeek et al., 1994 ). Welche Rolle Adhäsionsmoleküle in der Alzheimer-Pathogenese spielen, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. Interessanterweise sind Mikroglia in der Nähe amyloidogener Ablagerungen immunreaktiv für den Liganden des ICAM-1, das beta2-Integrin LFA-1 (CD11a, leukocyte function-associated antigen).

Die Anwesenheit all dieser immunmodulatorischen Marker belegen die Existenz einer Hirn-spezifischen Inflammation, die zu einer Dysregulation der Hirnhomöostase führen kann. Interessanterweise ist eine chronische Neuroinflammation immer mit dem Auftreten einer


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Neurodegeneration assoziiert. Dies läßt die Vermutung zu, daß eine chronische Neuro-inflammation an der Ausprägung einer Neurodegeneration ursächlich beteiligt ist.

Neben den klassischen Merkmalen der Neuroinflammation weisen erste Tiermodelle auf einen kausalen Zusammenhang zwischen Neuroinflammation und Amyloidogenese hin. In den letzten Jahren wurde mit großem Aufwand an der Etablierung transgener Tiermodelle gearbeitet, die Teilaspekte der Alzheimer-Pathogenese reflektieren sollen. Zur Zeit existieren unterschiedliche transgene Mauslinien, die aufgrund verstärkter Expression der APP-cDNA mit FAD-Mutationen die für die Alzheimer-Krankheit spezifische Plaque-Bildung zeigen ( Games et al., 1995 ; Hsiao et al., 1996 , Sturchler-Pierrat et al., 1997 ). Allerdings konnte in diesen Mäusen keine signifikante Neurodegeneration beobachtet werden. In allen älteren Tieren tritt neben den amyloidogenen Ablagerungen eine starke Astro- und Mikrogliose auf. Es bleibt abzuwarten, inwieweit Neurodegeneration eine Folgereaktion der starken Gliose ist.

1.5. Zielsetzung

Neben einer reaktiven Astro- und Mikrogliose weisen zahlreiche Zytokine und Wachstumsfaktoren, die in der Nähe amyloidogener Ablagerungen im Hirn des Alzheimer-Patienten auftreten, auf eine Alzheimer-assoziierte Neuroinflammation hin, die an der Ausprägung der Neurodegeneration ursächlich beteiligt sein kann. Astrozyten sind in der Lage, im aktivierten Zustand eine Vielfalt immunmodulatorischer Moleküle zu exprimieren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind. Es stellt sich zum einen die Frage, warum Astrozyten in der Alzheimer-Pathogenese aktiviert werden, und zum anderen, welche pathophysiologische Bedeutung aktivierte Astrozyten für die Alzheimer-Krankheit besitzen. Aus immunhistochemischen Daten geht hervor, daß aktivierte Astrozyten um amyloidogene Ablagerungen verstärkt das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 exprimieren ( Akiyama et al., 1993 ). Somit stellt ICAM-1 ein Marker für die astrozytäre Aktivität dar, die mit der Alzheimer-Pathogenese assoziiert ist. Untersuchungen zur Expression des ICAM-1 in Astrozyten waren Ausgangspunkt der in dieser Arbeit beschriebenen Experimente. Es sollte überprüft werden, ob die astrozytäre ICAM-1-Expression direkt durch die amyloidogenen Ablagerungen verursacht oder verstärkt werden kann oder eine Folgereaktion der mikroglialen Aktivierung ist. Anschließend wurde der Signaltransduktionsweg, der zur Astrozyten-Aktivierung führt, näher charakterisiert.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung aktivierter Astrozyten im Zusammenhang mit der Alzheimer-assoziierten Amyloidogenese. Bisher standen Neurone als Hauptproduzenten des Amyloid beta-Proteins im Vordergrund der Alzheimer-Forschung. Da jedoch verschiedene Veröffentlichungen darauf hinweisen, daß Astrozyten ebenfalls in der Lage sind, eine direkte Rolle in der Entstehung der amyloidogenen Ablagerungen zu spielen ( Le Blanc et al., 1997 ; Busciglio et al., 1993 ), wurde die amyloidogene APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten untersucht.

Abschließend sollte die pathophysiologische Bedeutung der Astrozyten in der Alzheimer-Pathogenese im Zusammenhang mit den erzielten Ergebnissen diskutiert werden.


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Fri Jul 16 11:22:38 1999