Kernekewisch, Michaela: Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

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Kapitel 2. Material

2.1. Chemikalien und Reagenzien

Agfa Gaevert (Leverkusen) :

Entwickler G153; Fixierer G153

Boehringer (Mannheim) :

ABTS; Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (Complete)

Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :

Agarose; Lipofektin

Merck (Darmstadt) :

APS; EDTA; Essigsäure; Ethanol; Glyzerol (87%); Methanol; NaCl; Tris

NEN Du Pont (Bad Homburg) :

L-[35S]-Methionin, < 1000 Ci/mMol; Röntgenfilme Reflection NEF-496

Packard :

Ultima Gold Szintillationsflüssigkeit

Riedel de Haehn (Seelze) :

Diethanolamin; Gelatine

Roth :

BCIP; NBT; Rotiphorese Gel 30; TEMED

Serva (Heidelberg) :

Acrylamid; BSA, Fraktion V, pH 7,0; N, N, Methylenbisacrylamid

Sigma (Deisenhofen) :

Ampicillin; beta-Mercaptoethanol; Bicin; Bistris; Ethidiumbromid; Glutaraldehyd; L-Homoarginin; NP-40; p-Nitrophenolphosphat; Paraformaldehyd; Protein-A-Sepharose; SDS; Triton X-100; Tween20

2.2. Reagenzien für die Zellkultur

Biomol (Hamburg) :

K-252a; Herbimycin A; Wortmannin

Calbiochem (Bad Soden) :

Bisindolylmaleimid; H-89, Dihydrochlorid; KT5823; KT5926

Boehringer (Mannheim) :

- TGFbeta1 (human, rekomb.), wirksam in Maus-, Ratten- und Human-Zellen

- IL1beta (Maus, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen

- IL6 (human, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen

- bFGF (Rind, rekomb.), wirksam in Maus-, Ratten-, Human-, Kaninchen- und Rinder-Zellen

- IFNgamma (human, rekomb.), wirksam in Human-Zellen

Life Technologies :

IFNgamma (Ratte, rekomb.), wirksam in Maus- und Ratten-Zellen

Promega (Madison) :

TNFalpha (human, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen

Schering AG (Berlin) :

Rolipram, PGD2-Analoga

Sigma (Deisenhofen) :

Forskolin; PGE1; PGE2; PGF2alpha


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2.3. Enzyme und Antikörper

Amersham :

Schaf-anti-Maus Ig-POD, Schaf-anti-Kaninchen Ig-POD

Boehringer (Mannheim) :

DNase I, Restriktionsendonukleasen, monoklonaler Antikörper anti-human-ICAM-1

Camon Labor Service GmbH (Wiesbaden) :

Vectastain ABC Elite Kit, enthält sekundären, Biotin-gekoppelten Antikörper anti-Maus-IgG-Biotin und Peroxidase-gekoppeltes Avidin

Eurogentec (Seraing):

Präimmunserum aus Kaninchen

PharMingen (San Diego) :

MAk anti-Ratten-ICAM-1

MAk anti-GFAP (aus den Zellklonen 4A11, 1B4, 2E1)

Promega (Madison):

Ziege-anti-Maus-IgG-AP; Ziege-anti-Kaninchen-IgG-AP

Serotec :

anti-APP/CT (AHP338), gegen die C-terminale Sequenz NQMQEFFKYTPNEYG des APP gerichtet

Sigma (Deisenhofen) :

Kaninchen-anti-Maus-IgG, polyklonales Kaninchenserum; polyklonales Kaninchenserum anti-Aktin; MAk anti-NF68; MAk anti-Synaptophysin (Klon SVP-38)

Außerdem wurden folgende Antikörper der AG Beyreuther (ZMBH, Heidelberg) verwendet :

MAk 22C11:

monoklonaler Antikörper (IgG1) gegen das E. coli-Fusionsprotein FdAPP695 ( Weidemann et al., 1989 ); das Epitop liegt im N-terminalen Bereich von APP ( Hilbich et al., 1993 )

anti-FdAPP:

polyklonales Kaninchenserum gegen das bakterielle E.coli-Fusions-protein FdAPP695 ( Weidemann et al., 1989 )

anti-A4CT:

polyklonales Kaninchenserum gegen A4CT ( Dyrks et al., 1993 )

anti-CT:

polyklonales Kaninchenserum gegen die zytoplasmatische Domäne des APP770, Reste 728-770 ( Mönning et al., 1995 )

anti-Abeta(2-43):

polyklonales Kaninchenserum gegen die Abeta-Sequenz, Reste 2-43

Schering AG Berlin (Dr. U. Mönning) :

anti-Abeta(1-6) :

monoklonaler Antikörper (Klon 8A6) gegen die N-terminale Abeta-Sequenz, Reste 1-6; erkennt Abeta (1-40) und (1-42) sowie sekretorisches APP nach alpha-Sekretase-aktivität

anti-Abeta(1-40) :

monoklonaler Antikörper (Klon 13E9) gegen den C-Terminus von Abeta, der spezifisch Abeta (1-40) sowie p3 erkennt

anti-Abeta(1-42) :

monoklonaler Antikörper (Klon 6D5) gegen den C-Terminus von Abeta, der spezifisch Abeta (1-42) sowie p3 erkennt


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2.4. Molmassenstandards

Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :

2.5. Zellkulturmedien und Zusätze

Biochrom (Berlin) :

Fötales Kälberserum (FCS, Fetal Calf Serum) (Charge 691H, hitzeinaktiviert)

Pferdeserum (Charge 725H, hitzeinaktiviert)

Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :

2.6. Bakterienmedien

LB-Medium :

10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, ad 1000 ml Bidest

LB-Amp-Medium :

100 µg Ampicillin/ml in LB-Medium

LB-Amp-Agar :

1,5 % w/v Agar in LB-Medium aufkochen, und nach Abkühlen der Agar-Lösung auf ca. 40oC werden 100 µg/ml Ampicillin hinzugegeben.

2.7. Bakterienstämme

E.coli DH5alpha :

F-, endA1, hsdR17 (rk-, mk+), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, s80dlacZ M15 ( Hanahan, 1985 ); von der Firma Life Technologies bezogen

2.8. Zellinien

SH-Sy5y :

humane Neuroblastom-Zellinie Sy5y (Schering AG Berlin)

Sy5y/SPA4CT :

stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/SPA4CT ( Dyrks et al., 1988 )

Sy5y/751 :

stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/APP751 ( Urmoneit, 1996 )

Sy5y/751sw :

stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/APP751sw ( Urmoneit, 1996 )

CCF-STTG1 :

humane Astrozytom-Zellinie (ATCC, Rockville Maryland)

H4 :

humane Neurogliom-Zellinie (ATCC, Rockville Maryland)

2.9. Tiere

Wistar-Ratten, Tierzucht der Schering AG

2.10. Plasmide

pCEP4:

Episomal replizierender Expressionsvektor der Firma Invitrogen (Leek) mit einem starken, ubiquitär exprimierenden Cytomegalovirus-Promotor (CMV) und einem Hygromycin B-Selektionsmarker für eukaryotische Zellen.

Abb. 5 : Struktur des Vektors pCEP4


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pCEP4/SEAP :

Plasmid pCEP4 mit sekretorischer, alkalischer Phosphatase als Reporter (Invitrogen)

pCEP4/SPA4CT:

Plasmid pCEP4 mit der cDNA des humanen SPA4CT ( Dyrks et al., 1992 )

pCEP4/695, 751

bezeichnen die entsprechenden Plasmide, die für die APP- Isoformen APP695 bzw. APP751 kodieren ( Weidemann et al., 1989 )

pCEP4/695sw,751sw

bezeichnen die entsprechenden Plasmide, die für die APP-Isoformen APP695 bzw. APP751 mit der schwedischen Mutation kodieren ( Urmoneit, 1996 )


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Fri Jul 16 11:22:38 1999