Kernekewisch, Michaela: Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

Kapitel 2. Material

2.1. Chemikalien und Reagenzien

Agfa Gaevert (Leverkusen) :

Entwickler G153; Fixierer G153

Boehringer (Mannheim) :

ABTS; Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (Complete)

Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :

Agarose; Lipofektin

Merck (Darmstadt) :

APS; EDTA; Essigsäure; Ethanol; Glyzerol (87%); Methanol; NaCl; Tris

NEN Du Pont (Bad Homburg) :

L-[³⁵S]-Methionin, < 1000 Ci/mMol; Röntgenfilme Reflection NEF-496

Packard :

Ultima Gold Szintillationsflüssigkeit

Riedel de Haehn (Seelze) :

Diethanolamin; Gelatine

Roth :

BCIP; NBT; Rotiphorese Gel 30; TEMED

Serva (Heidelberg) :

Acrylamid; BSA, Fraktion V, pH 7,0; N, N, Methylenbisacrylamid

Sigma (Deisenhofen) :

Ampicillin; beta -Mercaptoethanol; Bicin; Bistris; Ethidiumbromid; Glutaraldehyd; L-Homoarginin; NP-40; p-Nitrophenolphosphat; Paraformaldehyd; Protein-A-Sepharose; SDS; Triton X-100; Tween20

2.2. Reagenzien für die Zellkultur

Biomol (Hamburg) :

K-252a; Herbimycin A; Wortmannin

Calbiochem (Bad Soden) :

Bisindolylmaleimid; H-89, Dihydrochlorid; KT5823; KT5926

Boehringer (Mannheim) :

- TGF beta 1 (human, rekomb.), wirksam in Maus-, Ratten- und Human-Zellen
- IL1 beta (Maus, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen
- IL6 (human, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen
- bFGF (Rind, rekomb.), wirksam in Maus-, Ratten-, Human-, Kaninchen- und Rinder-Zellen
- IFN gamma (human, rekomb.), wirksam in Human-Zellen

Life Technologies :

IFN gamma (Ratte, rekomb.), wirksam in Maus- und Ratten-Zellen

Promega (Madison) :

TNF alpha (human, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen

Schering AG (Berlin) :

Rolipram, PGD2-Analoga

Sigma (Deisenhofen) :

Forskolin; PGE1; PGE2; PGF2 alpha

2.3. Enzyme und Antikörper

Amersham :

Schaf-anti-Maus Ig-POD, Schaf-anti-Kaninchen Ig-POD

Boehringer (Mannheim) :

DNase I, Restriktionsendonukleasen, monoklonaler Antikörper anti-human-ICAM-1

Camon Labor Service GmbH (Wiesbaden) :

Vectastain ABC Elite Kit, enthält sekundären, Biotin-gekoppelten Antikörper anti-Maus-IgG-Biotin und Peroxidase-gekoppeltes Avidin

Eurogentec (Seraing):

Präimmunserum aus Kaninchen

PharMingen (San Diego) :

MAk anti-Ratten-ICAM-1
MAk anti-GFAP (aus den Zellklonen 4A11, 1B4, 2E1)

Promega (Madison):

Ziege-anti-Maus-IgG-AP; Ziege-anti-Kaninchen-IgG-AP

Serotec :

anti-APP/CT (AHP338), gegen die C-terminale Sequenz NQMQEFFKYTPNEYG des APP gerichtet

Sigma (Deisenhofen) :

Kaninchen-anti-Maus-IgG, polyklonales Kaninchenserum; polyklonales Kaninchenserum anti-Aktin; MAk anti-NF68; MAk anti-Synaptophysin (Klon SVP-38)

Außerdem wurden folgende Antikörper der AG Beyreuther (ZMBH, Heidelberg) verwendet :

MAk 22C11:

monoklonaler Antikörper (IgG1) gegen das E. coli-Fusionsprotein FdAPP695 ( Weidemann et al., 1989 ); das Epitop liegt im N-terminalen Bereich von APP ( Hilbich et al., 1993 )

anti-FdAPP:

polyklonales Kaninchenserum gegen das bakterielle E.coli-Fusions-protein FdAPP695 ( Weidemann et al., 1989 )

anti-A4CT:

polyklonales Kaninchenserum gegen A4CT ( Dyrks et al., 1993 )

anti-CT:

polyklonales Kaninchenserum gegen die zytoplasmatische Domäne des APP770, Reste 728-770 ( Mönning et al., 1995 )

anti-A beta (2-43):

polyklonales Kaninchenserum gegen die A beta -Sequenz, Reste 2-43

Schering AG Berlin (Dr. U. Mönning) :

anti-A beta (1-6) :

monoklonaler Antikörper (Klon 8A6) gegen die N-terminale A beta -Sequenz, Reste 1-6; erkennt A beta (1-40) und (1-42) sowie sekretorisches APP nach alpha -Sekretase-aktivität

anti-A beta (1-40) :

monoklonaler Antikörper (Klon 13E9) gegen den C-Terminus von A beta , der spezifisch A beta (1-40) sowie p3 erkennt

anti-A beta (1-42) :

monoklonaler Antikörper (Klon 6D5) gegen den C-Terminus von A beta , der spezifisch A beta (1-42) sowie p3 erkennt

2.4. Molmassenstandards

Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :

Für niedrige Molmassen (2,3 bis 43 kDa), vorgefärbte Proteinmischung
Für hohe Molmassen (26,6 bis 180 kDa), vorgefärbtte Proteinmischung

Novex (San Diego):

MultiMark Multi-Colored-Standard (3 bis 185 kDa), vorgefärbte Proteinmischung

Sigma (Deisenhofen):

Für hohe Molmassen (35 bis 190 kDa), vorgefärbte Proteinmischung

Amersham International:

Für niedrige Molmassen (3 bis 43 kDa), [¹⁴C]-methylierte Proteine
Für hohe Molmassen (14,3 bis 200 kDa), [¹⁴C]-methylierte Proteine

2.5. Zellkulturmedien und Zusätze

Biochrom (Berlin) :

Fötales Kälberserum (FCS, Fetal Calf Serum) (Charge 691H, hitzeinaktiviert)
Pferdeserum (Charge 725H, hitzeinaktiviert)

Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :

BME-Medium (ohne L-Glutamin)
DMEM-Medium (mit L-Glutamin, 4500 mg Glukose/l, ohne Natriumpyruvat)
Einfriermedium mit Glyzerol
HBSS-Lösung (mit Ca²⁺, Mg²⁺, ohne Phenolrot)
HBSS-Lösung (ohne Ca²⁺, Mg²⁺, mit Phenolrot)
Hygromycin B-Lösung (50 mg Hygromycin B/ml)
L-Glutamin-Lösung (200 mM)
MEM-Medium (ohne L-Glutamin, ohne Methionin)
MEM-Medium (1000 mg Glukose/l, 292 mg L-Glutamin/l)
nicht essentielle Aminosäure-Lösung, 100fache Stammlösung (ohne L-Glutamin)
Nutrient Mixture Ham’s F12-Medium (1802 mg Glukose/l, 146 mg L-Glutamin/l, 110 mg Na-Pyruvat/l)
Opti-Mem-1-Medium (mit L-Glutamin, 2,4 g Natriumbicarbonat/l)
PBS (Dulbecco’s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,2 g KCl/l, 0,2 g KH₂PO₄/l, 8 g NaCl/l, 1,15 g Na₂HPO₄/l; ohne Ca²⁺, Mg²⁺, Natriumbicarbonat)
Penicillin-/Streptomycin-Lösung (10000 U Penicillin/ml, 10 mg Streptomycin/ml)
Trypsin-Lösung (0,25 % w/v in 0,4 g KCl/l, 2,2 g NaHCO₃/l, 6,8 g NaCl/l, 1 g Glukose/l, 0,005 g Phenolrot/l)
Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 g Trypsin/l, 0,2 g EDTA/l in modifizierter Puck’s Salzlösung)
Sigma (Deisenhofen) :

Poly-L-Lysin, Hydrobromid (Molmassen 70000 - 150000) Cytosin--D-Arabinofuranosid, Hydrochlorid

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2.6. Bakterienmedien

LB-Medium :

10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, ad 1000 ml Bidest

LB-Amp-Medium :

100 µg Ampicillin/ml in LB-Medium

LB-Amp-Agar :

1,5 % w/v Agar in LB-Medium aufkochen, und nach Abkühlen der Agar-Lösung auf ca. 40^oC werden 100 µg/ml Ampicillin hinzugegeben.

2.7. Bakterienstämme

E.coli DH5 alpha :

F-, endA1, hsdR17 (rk-, mk+), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, s80dlacZ M15 ( Hanahan, 1985 ); von der Firma Life Technologies bezogen

2.8. Zellinien

SH-Sy5y :

humane Neuroblastom-Zellinie Sy5y (Schering AG Berlin)

Sy5y/SPA4CT :

stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/SPA4CT ( Dyrks et al., 1988 )

Sy5y/751 :

stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/APP751 ( Urmoneit, 1996 )

Sy5y/751sw :

stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/APP751sw ( Urmoneit, 1996 )

CCF-STTG1 :

humane Astrozytom-Zellinie (ATCC, Rockville Maryland)

H4 :

humane Neurogliom-Zellinie (ATCC, Rockville Maryland)

2.9. Tiere

Wistar-Ratten, Tierzucht der Schering AG

2.10. Plasmide

pCEP4:

Episomal replizierender Expressionsvektor der Firma Invitrogen (Leek) mit einem starken, ubiquitär exprimierenden Cytomegalovirus-Promotor (CMV) und einem Hygromycin B-Selektionsmarker für eukaryotische Zellen.

Abb. 5 : Struktur des Vektors pCEP4

pCEP4/SEAP :

Plasmid pCEP4 mit sekretorischer, alkalischer Phosphatase als Reporter (Invitrogen)

pCEP4/SPA4CT:

Plasmid pCEP4 mit der cDNA des humanen SPA4CT ( Dyrks et al., 1992 )

pCEP4/695, 751

bezeichnen die entsprechenden Plasmide, die für die APP- Isoformen APP695 bzw. APP751 kodieren ( Weidemann et al., 1989 )

pCEP4/695sw,751sw

bezeichnen die entsprechenden Plasmide, die für die APP-Isoformen APP695 bzw. APP751 mit der schwedischen Mutation kodieren ( Urmoneit, 1996 )

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anti-A(1-6) :	monoklonaler Antikörper (Klon 8A6) gegen die N-terminale A-Sequenz, Reste 1-6; erkennt A (1-40) und (1-42) sowie sekretorisches APP nach -Sekretase-aktivität
anti-A(1-40) :	monoklonaler Antikörper (Klon 13E9) gegen den C-Terminus von A, der spezifisch A (1-40) sowie p3 erkennt
anti-A(1-42) :	monoklonaler Antikörper (Klon 6D5) gegen den C-Terminus von A, der spezifisch A (1-42) sowie p3 erkennt

Agfa Gaevert (Leverkusen) :	Entwickler G153; Fixierer G153
Boehringer (Mannheim) :	ABTS; Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (Complete)
Life Technologies (Gibco BRL), (Eggenstein) :	Agarose; Lipofektin
Merck (Darmstadt) :	APS; EDTA; Essigsäure; Ethanol; Glyzerol (87%); Methanol; NaCl; Tris
NEN Du Pont (Bad Homburg) :	L-[³⁵S]-Methionin, < 1000 Ci/mMol; Röntgenfilme Reflection NEF-496
Packard :	Ultima Gold Szintillationsflüssigkeit
Riedel de Haehn (Seelze) :	Diethanolamin; Gelatine
Roth :	BCIP; NBT; Rotiphorese Gel 30; TEMED
Serva (Heidelberg) :	Acrylamid; BSA, Fraktion V, pH 7,0; N, N, Methylenbisacrylamid
Sigma (Deisenhofen) :	Ampicillin; -Mercaptoethanol; Bicin; Bistris; Ethidiumbromid; Glutaraldehyd; L-Homoarginin; NP-40; p-Nitrophenolphosphat; Paraformaldehyd; Protein-A-Sepharose; SDS; Triton X-100; Tween20

Biomol (Hamburg) :	K-252a; Herbimycin A; Wortmannin
Calbiochem (Bad Soden) :	Bisindolylmaleimid; H-89, Dihydrochlorid; KT5823; KT5926
Boehringer (Mannheim) :	- TGF1 (human, rekomb.), wirksam in Maus-, Ratten- und Human-Zellen - IL1 (Maus, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen - IL6 (human, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen - bFGF (Rind, rekomb.), wirksam in Maus-, Ratten-, Human-, Kaninchen- und Rinder-Zellen - IFN (human, rekomb.), wirksam in Human-Zellen
Life Technologies :	IFN (Ratte, rekomb.), wirksam in Maus- und Ratten-Zellen
Promega (Madison) :	TNF (human, rekomb.), wirksam in Maus- und Human-Zellen
Schering AG (Berlin) :	Rolipram, PGD2-Analoga
Sigma (Deisenhofen) :	Forskolin; PGE1; PGE2; PGF2

Amersham :	Schaf-anti-Maus Ig-POD, Schaf-anti-Kaninchen Ig-POD
Boehringer (Mannheim) :	DNase I, Restriktionsendonukleasen, monoklonaler Antikörper anti-human-ICAM-1
Camon Labor Service GmbH (Wiesbaden) :	Vectastain ABC Elite Kit, enthält sekundären, Biotin-gekoppelten Antikörper anti-Maus-IgG-Biotin und Peroxidase-gekoppeltes Avidin
Eurogentec (Seraing):	Präimmunserum aus Kaninchen
PharMingen (San Diego) :	MAk anti-Ratten-ICAM-1 MAk anti-GFAP (aus den Zellklonen 4A11, 1B4, 2E1)
Promega (Madison):	Ziege-anti-Maus-IgG-AP; Ziege-anti-Kaninchen-IgG-AP
Serotec :	anti-APP/CT (AHP338), gegen die C-terminale Sequenz NQMQEFFKYTPNEYG des APP gerichtet
Sigma (Deisenhofen) :	Kaninchen-anti-Maus-IgG, polyklonales Kaninchenserum; polyklonales Kaninchenserum anti-Aktin; MAk anti-NF68; MAk anti-Synaptophysin (Klon SVP-38)

MAk 22C11:	monoklonaler Antikörper (IgG1) gegen das E. coli-Fusionsprotein FdAPP695 ( Weidemann et al., 1989 ); das Epitop liegt im N-terminalen Bereich von APP ( Hilbich et al., 1993 )
anti-FdAPP:	polyklonales Kaninchenserum gegen das bakterielle E.coli-Fusions-protein FdAPP695 ( Weidemann et al., 1989 )
anti-A4CT:	polyklonales Kaninchenserum gegen A4CT ( Dyrks et al., 1993 )
anti-CT:	polyklonales Kaninchenserum gegen die zytoplasmatische Domäne des APP770, Reste 728-770 ( Mönning et al., 1995 )
anti-A(2-43):	polyklonales Kaninchenserum gegen die A-Sequenz, Reste 2-43

LB-Medium :	10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, ad 1000 ml Bidest
LB-Amp-Medium :	100 µg Ampicillin/ml in LB-Medium
LB-Amp-Agar :	1,5 % w/v Agar in LB-Medium aufkochen, und nach Abkühlen der Agar-Lösung auf ca. 40^oC werden 100 µg/ml Ampicillin hinzugegeben.

SH-Sy5y :	humane Neuroblastom-Zellinie Sy5y (Schering AG Berlin)
Sy5y/SPA4CT :	stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/SPA4CT ( Dyrks et al., 1988 )
Sy5y/751 :	stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/APP751 ( Urmoneit, 1996 )
Sy5y/751sw :	stabil transfizierte SH-Sy5y mit dem Konstrukt pCEP4/APP751sw ( Urmoneit, 1996 )
CCF-STTG1 :	humane Astrozytom-Zellinie (ATCC, Rockville Maryland)
H4 :	humane Neurogliom-Zellinie (ATCC, Rockville Maryland)

pCEP4/SEAP :	Plasmid pCEP4 mit sekretorischer, alkalischer Phosphatase als Reporter (Invitrogen)
pCEP4/SPA4CT:	Plasmid pCEP4 mit der cDNA des humanen SPA4CT ( Dyrks et al., 1992 )
pCEP4/695, 751	bezeichnen die entsprechenden Plasmide, die für die APP- Isoformen APP695 bzw. APP751 kodieren ( Weidemann et al., 1989 )
pCEP4/695sw,751sw	bezeichnen die entsprechenden Plasmide, die für die APP-Isoformen APP695 bzw. APP751 mit der schwedischen Mutation kodieren ( Urmoneit, 1996 )