Kernekewisch, Michaela: Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

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Kapitel 3. Methoden

3.1. Mikrobiologische Techniken

3.1.1. Herstellung kompetenter Zellen

Zunächst wurde eine Vorkultur von E.coli DH5alpha über Nacht angelegt. Diese Vorkultur wurde 100fach in 500 ml LB-Medium verdünnt und bei 37oC bis zu einer bestimmten Zelldichte kultiviert. Die Zelldichte wurde durch Messung der Absorption bei 600 nm mit 1 mm-Küvetten bestimmt und sollte zwischen O.D. 0,6 - 0,9 im optimalen Bereich liegen. Die Zellen wurden nach Erreichen dieser Zelldichte für 5 min auf Eis inkubiert, anschließend durch Zentrifugation (2500xg, 5 min, 4oC) geerntet, und das Zellsediment in 20 ml eiskalter 50 mM CaCl2-Lösung resuspendiert. Nach einer Inkubation auf Eis für 30 min wurden die Zellen erneut zentrifugiert (2500xg, 5 min, 4oC), anschließend in 5 ml eiskalter 50 mM CaCl2-Lösung und 1 ml 100 % Glyzerol resuspendiert und für mindestens 3 h auf Eis inkubiert. Die nun kompetenten Bakterienzellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80oC gelagert.

3.1.2. Transformation von Bakterien

Nach Auftauen der kompetenten Zellen (100 µl) auf Eis wurden 1 bis 100 ng DNA zu der Zellsuspension gegeben und für 15 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte für 1 min ein Hitzeschock bei 42oC und eine erneute Inkubation für 2 min auf Eis. Nach Zugabe von 500 µl LB-Medium wurden die Bakterien für 1 h bei 37oC inkubiert, 50 - 100 µl der Suspension direkt auf LB-Ampicillin-Agar ausplattiert und über Nacht bei 37oC inkubiert.

3.2. DNA-Techniken

3.2.1. Präparation von Plasmid-DNA

Lösungen :

Puffer P1 :

100 µg RNase A/ml, 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA

Puffer P2 :

200 mM NaOH, 1 % w/v SDS

Puffer P3 :

3 M Na-Acetat, pH 5,5

Puffer QBT :

750 mM NaCl, 50 mM MOPS, pH 7,0, 15 % v/v Ethanol, 0,15 % v/v TritonX-100

Puffer QC :

1 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7,0, 15 % v/v Ethanol

Puffer QF :

1,25 M NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH 8,5, 15 % v/v Ethanol

TE-Lösung :

100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA

Die präparative Reinigung von Plasmid-DNA wurde nach dem Protokoll von QIAGEN (Hilden) durchgeführt. Diese basiert auf einer modifizierten alkalischen Lyse ( Birnboim & Doly, 1979 ) und nutzt die selektive Bindung von Nukleinsäuren an das Qiagen-Anionenaustauscherharz.

Es wurden 200 ml einer Bakterienkultur in LB-Medium bei 4oC zentrifugiert (10 min, 2500xg) und in 10 ml P1 resuspendiert. Hierzu wurden 10 ml P2 gegeben, vorsichtig gemischt, 5 min bei RT inkubiert, nach Zugabe von 10 ml eiskalten P3 sofort vorsichtig gemischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Die Präparation wurde in Falcon-Röhrchen bei 4oC abzentrifugiert (30 min, 2500xg) und der klare Überstand auf eine mit 10 ml Puffer QBT äquilibrierte QIAGEN-tip 500-Säule überführt. Die Säule wurde danach zweimal mit Puffer QC gewaschen, und die DNA mit 15 ml Puffer QF eluiert. Die DNA wurde bei RT mit 0,7 Volumen Isopropanol gefällt, sofort bei 15000xg (4oC, 30 min) zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert, luftgetrocknet und in Bidest aufgenommen. Um die Konzentration der DNA in wässrigen Lösungen zu bestimmen, wurde die optische Dichte (O.D.) bei einer Wellenlänge von 260 und


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280 nm in einem UV/VIS Spektrometer Lambda 2 der Firma Perkin Elmer oder im Pharmacia GeneQuant RNA/DNA-Calculator mittels einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke d von 1 cm bestimmt. Die Konzentration der DNA ( Sambrook et al., 1989 ) berechnete sich aus der Formel

Der Quotient zwischen O.D.260 und O.D.280 sollte in etwa zwischen 1 und 2 betragen (Schichtdicke der Küvette d = 1 cm), um Proteinkontaminationen der DNA festzustellen.

3.2.2. DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen

Die Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen wurde nach Herstellerangaben im entsprechenden Inkubationspuffer durchgeführt (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde durch Zugabe von DNA-Probenpuffer (siehe 3.2.3.) gestoppt.

3.2.3. Elektrophoretische Auftrennung der DNA

( Sambrook et al., 1989 )

Lösungen :

TBE-Lösung :

89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA

Ethidiumbromid-Lösung :

10 mg Ethidiumbromid/ml in Bidest

DNA-Probenpuffer :

2,5 M Harnstoff, 0,25 M EDTA, 25 % w/v Saccharose,

5 % w/v SDS, 0,1 % w/v Bromphenolblau, pH 8,0

Die Agarose (1,5 % w/v) wurde in TBE-Lösung suspendiert und aufgekocht. Nach Abkühlen auf ca. 70oC wurde die Lösung mit Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 1 µg Etihidiumbromid/ml versetzt und in eine geeignete Plexiglasform gegossen. Das erstarrte Gel wurde in eine horizontale Flachbett-Apparatur (BioRad) mit TBE-gefüllter Laufkammer eingesetzt, die DNA-Proben in DNA-Probenpuffer aufgetragen und bei 80-100 V elektrophoretisch aufgetrennt.

Nach der elektrophoretischen Trennung wurden die DNA-Fragmente mit UV-Licht anhand des fluoreszierenden, interkalierten Ethidiumbromids detektiert. Zur Dokumentation wurde bei Anregung der Fluoreszenz auf einem Transilluminator (lambda = 254 nm) mit einer Videokamera über das E.A.S.Y. RH3-System (HeroLab) ein digitalisiertes Bild erzeugt und auf einem Video Copy Processor (Mitsubishi) ausgedruckt.

3.3. Zellkultur-Techniken

3.3.1. Isolierung und Kultivierung primärer Astrozyten

( McCarthy & DeVellis, 1980 ; modifiziert)

Lösungen :

HBSS-1 :

Hanks gepufferte Salzlösung, ohne Ca2+- und Mg2+

DMEM-Medium :

450 ml DMEM-Medium, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin-/ Streptomycin-Lösung


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Für die Präparation von Astrozyten wurde das Gesamthirn von P3-Ratten (3 Tage postnatal) verwendet. Nach Dekapitation der Ratte wurde die Kopfhaut entfernt und die Schädelkalotte abgehoben. Das freiliegende Hirn wurde entnommen, in HBSS-1 auf Eis überführt und von Meningen befreit. Die gesammelten Hirne wurden mit einem Skalpell grob zerkleinert, in ein Falcon-Röhrchen mit 2 ml Trypsin-Lösung pro Hirn überführt und für 15 min bei 37oC in einem Wasserbad inkubiert. Die Zellsuspension des trypsinisierten Gewebes wurde mit dem zweifachen Volumen DMEM-Medium versetzt und anschließend mittels einer 10 ml-Pipette trituiert. Die dissoziierte Zellsuspension wurde über ein Zellsieb (Maschenweite 0,2 µm, Falcon) filtriert, und das Filtrat für 10 min bei 150xg (bei RT) zentrifugiert. Das Zellsediment wurde vorsichtig in DMEM-Medium resuspendiert und pro Hirn auf je eine Kulturflasche (75 cm2 Kulturfläche, Cellstar Greiner) mit DMEM-Medium verteilt. Nach 18-24 h Inkubation bei 37oC in 5 % CO2 und 95 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre im Zellkulturschrank erfolgte ein Mediumwechsel mit frischem DMEM-Medium, und im Verlauf der weiteren Kultivierung ein Mediumwechsel alle 2 bis 3 Tage. Bei verstärktem Wachstum von Mikroglia auf dem Astrozyten-Monolayer konnten diese durch leichtes Trypsinisieren oder durch eine zweistündige Inkubation der Kulturflaschen auf einem Orbitalschüttler abgelöst werden. Durch diese Kultivierungsbedingungen ließen sich weitgehend homogene Astrozyten-Kulturen gewinnen, die nach 1 bis 2 Wochen mit Substanzen behandelt (siehe 3.3.11.) und biochemisch analysiert werden konnten.

3.3.2. Isolierung und Kultivierung primärer Neurone

( Levi et al., 1984 ; modifiziert)

Lösungen :

Poly-L-Lysin-Lösung :

100 mg Poly-L-Lysin/ml in PBS

HBSS-1-Lösung :

Hank‘s gepufferte Salzlösung, ohne Ca2+ und Mg2+

HBSS-2-Lösung :

Hank‘s gepufferte Salzlösung, mit Ca2+ und Mg2+

Trypsin/DNase-Lösung :

1 % w/v Trypsin, 0,1 % w/v DNase ( 0,5 g Trypsin, 25 ml 0,2 % w/v DNase, mit HBSS-1 auf 50 ml auffüllen)

DNase-Lösung :

0,1 % w/v DNase-Lösung (100 mg DNase in 100 ml HBSS-1)

BME-Medium :

450 ml BME, 50 ml Pferdeserum, 5 ml 2,5 M KCl, 2 mM L-Glutamin, 2 ml Penicillin-/Streptomycin-Lösung

Zunächst wurden die Zellkulturschalen vorbereitet: Hierzu wurden am Vortag der Präparation die Schalen (d = 6 cm) mit einer Poly-L-Lysin-Lösung bedeckt und über Nacht bei 4oC inkubiert. Unmittelbar vor Beginn der Präparation wurden die beschichteten Schalen zweimal mit sterilem Wasser und einmal mit BME-Medium gewaschen, und jeweils 1 ml BME-Medium in die Schalen vorgelegt.

Für die Präparation von Neuronen wurden Cerebelli von P3-Ratten genommen. Hierzu wurde das Gehirn, wie unter 3.3.1. beschrieben, entnommen, das Cerebellum vom Gesamthirn abgetrennt und in HBSS-2 auf Eis gelagert. Nach Entfernung der Meningen wurde das Gewebe mittels Skalpell grob zerkleinert, in ein Falcon-Röhrchen mit 500 µl Trypsin/DNase-Lösung pro Cerebellum überführt und für 8 min bei 37oC im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde das Gewebe dreimal mit HBSS-1 gewaschen. Nach Abnahme des letzten Überstandes erfolgte die Trituation des Gewebes mit 400 µl DNase-Lösung pro Cerebellum zunächst mit einer 5 ml-Pipette, anschließend mit einer feuergeglätteten Pasteurpipette und als letztes mit einer ausgezogenen, feuergeglätteten Pasteurpipette. Die so vereinzelten Zellen wurden nach Zugabe von vierfachem Volumen BME-Medium für 10 min bei 50xg (4oC) zentrifugiert. Nach wiederholtem Waschen mit BME-Medium wurden die Zellen vorsichtig in BME-Medium resuspendiert. Ein Aliquot der Zellsuspension wurde für die Zellzahlbestimmung in der Schilling-Zählkammer verwendet. Danach wurde die Zellsuspension mit BME-Medium auf eine Zelldichte


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von ca. 1 x 105 Zellen/ml verdünnt und zu je 1 ml auf die vorbereiteten Schalen verteilt. Nach 30 min Inkubation bei 37oC im Zellkulturschrank wurde dieses Medium vollständig abgenommen und durch frisches BME-Medium ersetzt. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt, indem 1 ml des konditionierten Mediums aus der Zellkulturschale abgenommen und 1 ml frisches BME-Medium mit 2 µM Cytosinarabinosid hinzugegeben wurde. Die Zugabe des Zytostatikums Cytosinarabinosid in der Endkonzentration von 1 µM diente der Unterdrückung der glialen Proliferation und wurde immer bei einem Mediumwechsel alle 2 bis 3 Tage dem Medium zugesetzt.

3.3.3. Kultivierung von Zellinien

Die Kultivierung der Zellinien CCF-STTG1, H4 und Sy5y erfolgte bei 37oC in 5 % CO2 und 95 % wasserdampfgesättigte Atmosphäre in einem Zellkulturschrank (Heraeus). Die nachfolgenden Angaben beziehen sich auf Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm (Primaria, Falcon). Alle Zellkulturarbeiten wurden unter einer sterilen Werkbank mit sterilen Lösungen durchgeführt.

Kultivierungsmedien für die Zellinien:

CCF-STTG1:

450 ml DMEM-Medium, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin-/ Streptomycin-Lösung

H4 :

450 ml DMEM-Medium, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin-/ Streptomycin-Lösung

Sy5y :

225 ml MEM-Medium, 225 ml Nutrient-Mixture-Ham’s F12-Medium, 50 ml FCS, 5 ml nicht essentielle Aminosäure-Lösung, 2 ml Penicillin-/Streptomycin-Lösung

Die Zellinie CCF-STTG1 wurde aus einem Astrozytom (Grad IV) einer 68jährigen kaukasischen Frau isoliert. Bei der humanen Neurogliom-Zellinie H4 handelt es sich um ein Neurogliom eines 37jährigen kaukasischen Mannes. Die humane adrenerge Neuroblastom-Zellinie SH-Sy5y ist ein Subklon der Zellinie SK-N-SH ( Biedler et al., 1973 ) und stammt aus dem Rückenmark einer jungen Frau. Alle Zellinien wurden mit dem MycoTect-Kit (Life Technologies) auf Mykoplasmen-Kontamination untersucht und als Mykoplasmen-frei identifiziert.

Das Kultivierungsmedium wurde alle 2 bis 3 Tage gegen frisches, auf 37oC vorgewärmtes Medium ausgetauscht. Bei einer Konfluenz von 90 bis 100 % wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung von der Zellkulturschale abgelöst und vereinzelt, indem die Zellen einmal mit PBS gewaschen und dann 5 bis 15 min in 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung bei 37oC im Zellkulturschrank inkubiert wurden. Durch Zugabe von 8 ml Kultivierungsmedium wurde die Trypsinierung gestoppt und die Zellen auf neue Zellkulturschalen in einer Verdünnung von 1:2 bis 1:10 (je nach Zelldichte und Zelltyp) verteilt.

3.3.4. Kultivierung stabil transfizierter Zellinien

Die Kultivierung der stabil transfizierten Sy5y-Zellen mit den Konstrukten pCEP4/ SPA4CT, pCEP4/APP751 oder pCEP4/APP751sw erfolgte wie in 3.3.3. beschrieben, jedoch mit einem Selektionsmedium (225 ml MEM, 225 ml Nutrient Mixture Ham’s F12, 50 ml FCS, 5 ml nicht essentielle Aminosäure-Lösung, 2 ml Penicillin-/Streptomycin-Lösung und 300 µg Hygromycin B/ml).

Die Kultivierung der mit den Konstrukten pCEP4/SPA4CT, pCEP4/APP695, pCEP4/APP695sw, pCEP4/APP751 oder pCEP4/APP751sw stabil transfizierten humanen Neurogliom-Zellen H4 wurde ebenso wie unter 3.3.3. beschrieben mit einem Selektionsmedium (450 ml DMEM, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin-/Streptomycin-Lösung und 500 µg Hygromycin B/ml) durchgeführt.


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3.3.5. Kryokonservierung eukaryotischer Zellen

Die Zellen sollten in der logarithmischen Phase (80 bis 90 % Konfluenz) eingefroren werden. Alle Angaben beziehen sich auf Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und von der Zellkulturschale entweder durch Abspülen mit Kultivierungsmedium oder durch Trypsinierung mit Trypsin-EDTA-Lösung (wie unter 3.3.3. beschrieben) abgelöst und in Falcon-Röhrchen überführt. Nach anschließender Zentrifugation (10 min bei 100xg, RT) wurde das Zellsediment vorsichtig in 1 ml Einfriermedium mit Glyzerol (Life Technologies) pro Zellkulturschale resuspendiert und in ein Kryo-Schraubkappengefäß (1-2 ml) gefüllt. Die Zellsuspension wurde 1 h auf Eis inkubiert, für 18 bis 24 h bei -20oC und dann für weitere 18 bis 24 h bei -80oC gelagert (die Zellen sollten gleichmäßig und langsam abkühlen). Am nächsten Tag wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff (-192oC) überführt und dort gelagert.

3.3.6. Auftauen kryokonservierter eukaryotischer Zellen

Die eingefrorenen Zellen im Kryo-Schraubkappengefäß wurden direkt vom flüssigen Stickstoff in ein 37oC-Wasserbad überführt, aufgetaut, in 10 ml Kultivierungsmedium aufgenommen und auf eine Zellkulturschale (d = 10 cm) verteilt. Am nächsten Tag erfolgte Mediumwechsel mit dem entsprechendem Kultivierungsmedium.

3.3.7. Metabolische Markierung von Zellen mit L-[35S]-Methionin

Lösungen :

Markierungsmedium : MEM-Medium (ohne L-Glutamin, Methionin), 2 mM L-Glutamin

Zum Nachweis von Proteinen in Zellen und Kulturüberständen wurden die Proteine metabolisch durch Einbau von radioaktiv markiertem L-[35S]-Methionin markiert. Hierdurch wurde eine qualitative und quantitative Analyse der Proteinsyntheseleistung kultivierter Zellen möglich.

Die Zellen wurden in einer Zellkulturschale mit 6 cm Durchmesser bei einer 70 bis 90%igen Konfluenz für die radioaktive Markierung eingesetzt. Hierzu wurden die Zellen zweimal mit dem Methionin-freien Markierungsmedium gewaschen und mit 1,5 ml Markierungsmedium für 30 min bei 37oC in 5 % CO2 und 95 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre im Zellkulturschrank inkubiert. Nach dieser Vorinkubation, in der die Zellen aufgrund des Methionin-Mangels hungern sollten, wurde diesem Medium 150-300 µCi L-[35S]-Methionin (< 1000 Ci/mM) zugesetzt. Nach einer 3-4 stündigen Inkubation der Zellen im Zellkulturschrank (37oC, 5 % CO2 und 95 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre) konnten die Zellen dann entweder nach der Zellernte oder direkt in der Zellkulturschale (siehe 3.4.2.) lysiert werden. Das konditionierte Medium und der Lysatüberstand wurden bei -20oC bis zur weiteren Analyse aufbewahrt. Für eine quantitative Auswertung wurden 5 µl des Lysatüberstandes mit Aceton gefällt, das Präzipitat nach Zentrifugation (10 min, 13.000xg, 4oC) in 1 ml Szintillationsflüssigkeit aufgenommen und die Einbaurate von [35S] im Szintillationsmeßgerät (LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter) bestimmt.

3.3.8. Bestimmung der Zellvitalität durch Messung der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen (MTS-Test)

Zur Bestimmung der Zellvitalität wurde die Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen mit Hilfe des ”CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay“ oder auch kurz ”MTS-Test“ der Firma Promega gemessen. Dieser Test mißt die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenasen lebender Zellen, die das Substrat MTS (3-(4,5-Dimethylthiozol-2-yl)-5-(3-carboxymeth-oxyphenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)2H-tetrazoliumsalz) mit Hilfe des Elektronenfängers PMS (Phenazin-Methosulfat) zu Formazan umwandeln. Die Umsetzung von MTS zu Formazan kann


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photometrisch bei einer Wellenlänge von 490 nm gemessen werden und ist direkt proportional zur Anzahl an lebenden Zellen in der Mikrotiterplatte.

Nachdem die Zellen in einer Mikrotiterplatte (96well) kultiviert wurden, erfolgte nach entsprechender Behandlung der Zellen mit Substanzen ein Mediumwechsel mit dem Kultivierungsmedium zu je 100 µl pro Vertiefung. Danach wurden jeweils 20 µl Substratlösung (2 ml MTS + 100 µl PMS) zu den Zellen gegeben und bis zu einer ausreichenden Farbreaktion im Zellkulturschrank bei 37oC in 5 % CO2 und 95 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 nm im ELISA-Reader (Dynatech MR5000) gemessen.

3.3.9. Transfektion eukaryotischer Zellen

Für die Transfektion eukaryotischer Zellen wurden kationische Liposomen eingesetzt. Hierbei reagieren positiv geladene Liposome ( Felgner et al., 1987 ) spontan mit der DNA oder RNA und bilden Komplexe, die mit der Zellmembran fusionieren und durch Endozytose in die Zelle gelangen. Aus dieser Fusion resultiert eine Aufnahme und Expression der DNA.

Lösungen :

Kultivierungmedium :

450 ml DMEM-Medium, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin-/ Streptomycin-Lösung

Selektionsmedium :

500 µg Hygromycin B/ml Kultivierungmedium

Die Transfektionseffizienz von humanen Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1), humanen Neurogliom-Zellen (H4) und primären Astrozyten wurde mit Hilfe des Konstruktes pCEP4/SEAP optimiert, wobei die Sekretion von SEAP (sekretorische alkalische Phosphatase) mit Hilfe des SEAP-Nachweissystems (siehe 3.4.17.) detektiert wurde. Bei der Zellinie CCF-STTG1 wurde ermittelt, daß in 6 cm-Zellkulturschalen bei 4 µg DNA und 24 µl Lipofektin (Life Technologies) die Transfektionseffizienz am höchsten ist, während bei der Zellinie H4 die höchste Transfektionseffizienz durch Zugabe von 4 µg DNA und 16 µl Lipofektin erfolgte. Bei primären Astrozyten wurde eine maximale Transfektion bei 2 µg DNA und 8 µl Lipofektin erreicht. Ein weiteres Kriterium für die optimale Expression der DNA war eine 60 bis 70 %ige Konfluenz der Zellen. Als DNA wurden die APP-Konstrukte eingesetzt, die in Kapitel 2.9. beschrieben sind.

Die Transfektionen wurden immer in 6 cm-Zellkulturschalen durchgeführt. Zunächst wurden DNA und Lipofektin getrennt voneinander in jeweils 750 µl Opti-Mem-1-Medium in einem Polystyrolröhrchen verdünnt, anschließend vereinigt und für 30 min bei RT vorinkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit Opti-Mem-1-Medium gewaschen, um das FCS aus dem Kultivierungsmedium zu entfernen. Danach wurde der DNA-Lipofektin-Ansatz auf die Zellen gegeben und für 5 h im Zellkulturschrank bei 37oC in 5 % CO2 und 95 % wasserdampf-gesättigter Atmosphäre inkubiert. Anschließend erfolgte ein vollständiger Mediumwechsel mit dem Kultivierungsmedium. Nach 24 h wurde erneut das Medium gewechselt und nach weiteren 24 bis 48 h bei einer transienten Transfektion die Proteinexpression analysiert bzw. bei einer stabilen Transfektion das Selektionsmedium zu den Zellen gegeben. Unter Selektionsdruck wurden damit die DNA-exprimierenden Zellen bis zur Konfluenz kultiviert, wobei die notwendige Konzentration des Selektionsmarkers vorher getestet wurde. Auf eine Zellklonierung konnte aufgrund des episomal replizierenden Konstruktes pCEP4 verzichtet werden.

3.3.10. Behandlung der Zellen mit Substanzen

Für die Behandlung von Zellen mit Substanzen wurden diese 1 bis 2 Tage vorher mit gleicher Zellzahl auf die jeweiligen Zellkulturschalen ausgesät. Nach Erreichen einer ca. 90 % bis 100 %igen Konfluenz erfolgte ein Mediumwechsel mit dem entsprechenden Kultivierungsmedium und die Inkubation mit den Substanzen für 18 bis 24 h bei einem Endvolumen von


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1,5 ml bei Zellkulturschalen mit d = 6 cm

1,0 ml bei Zellkulturschalen mit d = 3 cm

200 µl pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte (96well).

Bei metabolischer Markierung wurden die Zellen bereits während der Hungerphase mit den Substanzen behandelt. Die Substanzen wurden gemäß der Herstellervorschrift angesetzt und gelagert.

3.4. Protein-Analytik

3.4.1. Aufarbeitung des Gewebematerials

Lösungen :

Lysepuffer :

50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 % v/v Triton X-100, 1 % v/v NP-40, 1/25 Volumen 25fach Protease- Inhibitor-Mix

25fach Protease-Inhibitor-Mix-Lösung :

1 Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette in 2 ml Lysepuffer (inhibiert verschiedene Serin-, Cystein-, Metallo-proteinasen sowie Calpaine)

Das grob zerkleinerte, tiefgefrorene Gewebe wurde auf Eis aufgetaut und mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer pro 200 mg Gewebe mittels eines Mikropistills (Eppendorf) homogenisiert. Nach einer 30 minütigen Inkubation auf Eis wurde das lysierte Material bei 4oC und 5000xg für 10 min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde für weitere Analysen bei -20oC gelagert.

3.4.2. Aufarbeitung des Zellkulturmaterials

Lösungen :

Mediumpuffer :

250 mM Tris/HCl, pH 8,0, 5 % v/v Triton X-100, 5 % v/v NP-40, 1/10 Volumen 10fach Protease-Inhibitor-Mix

Lysepuffer :

siehe 3.4.1.

10fach Protease-Inhibitor-Mix-Lösung :

1 Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette in 5 ml Mediumpuffer

Weniger stark adhärente Zellen wie z.B. Sy5y-Zellen wurden im konditionierten Medium abgeschabt, zentrifugiert (5 min, 80xg, 4oC) und das Zellsediment in 200 bis 400 µl eiskaltem Lysepuffer resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Stark adhärente Zellen wie z.B. primäre Astrozyten und Neurone, CCF-STTG1- und H4-Zellen wurden in der Zellkulturschale lysiert. Hierfür wurden 200 bis 400 µl eiskalter Lysepuffer zu den mit PBS gewaschenen Zellen gegeben und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach Abzentrifugieren der Zellkerne (10 min, 5000xg, 4oC) wurde der Lysatüberstand für weitere Analysen bei -20oC aufbewahrt. Das konditionierte Medium wurde mit 1/10 Volumen 10fachem Protease-Inhibitor-Mix versetzt und bei -20oC gelagert.

3.4.3. Bestimmung der Proteinkonzentration

Lösungen :

Lösung A* :

1 ml Lösung A + 20 µl Lösung S


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Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mittels DC Protein Assay (Bio Rad). Zu 25 µl Proteinlösung wurden 125 µl Lösung A* und 1 ml Lösung B pipettiert. Nachdem die Probe gut durchmischt wurde (Vortex), erfolgte eine Inkubation dieses Ansatzes für 15 min bei Raumtemperatur. Die Extinktion wurde bei 750 nm in einem UV/VIS Spektrometer Lambda 2 von Perkin Elmer ermittelt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte anhand einer Eichgerade mit Gamma-Globulin oder BSA bekannter Konzentration.

3.4.4. Proteinfällung mit Aceton

Lösungen :

Probenpuffer 3fach :

186 mM Tris/HCl, pH 6,8, 6 % w/v SDS, 6 % v/v beta-Mercaptoethanol, 30 % v/v Glyzerol, 0,03 % w/v Bromphenolblau

Der Lysatüberstand wurde mit 5 bis 6fachem Volumen eiskaltem Aceton versetzt und für 30 min bei -80oC inkubiert. Nach anschließender Zentrifugation (10 min, 13000xg, 4oC) wurde der Überstand verworfen und das Sediment in 8 M Harnstoff gelöst. Nach Zugabe von Probenpuffer wurde die Proben für 30 min bei 57oC hitzedenaturiert und konnten nach Abkühlung auf RT für die Gelelektrophorese (siehe 3.4.8. bis 3.4.11.) eingesetzt werden.

3.4.5. Immunpräzipitation radioaktiv markierter Proteine

( Mönning et al., 1990 , Mönning et al., 1992 )

Die Immunpräzipitation (IP) beruht auf der hohen spezifischen Affinität der Fab-Region von Antikörpern zu dem entsprechenden Antigen ( Dobbenstein et al., 1979 ). Die Immunpräzipitation eignet sich deshalb besonders gut zur Anreicherung eines bestimmten Proteins aus einer heterogenen Proteinsuspension. Die Präzipitation des Antikörper-Antigen-Komplexes kann durch Protein A-Sepharose erfolgen.

Lösungen :

PBS-SDS :

PBS, pH 7,5, 0,4 % w/v SDS,

Waschpuffer A :

10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,4 % v/v NP-40, 0,4 % v/v Triton X-100

Waschpuffer B :

10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5 % v/v NP-40

Waschpuffer C :

10 mM Tris/HCl, pH 7,5

Protein-A Sepharose :

100 mg Protein A-Sepharose/ml TBST

TBST :

10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % v/v Tween 20

Probenpuffer 3fach :

186 mM Tris/HCl, pH 6,8, 6 % w/v SDS, 6 % w/v beta-Mercaptoethanol, 30 % v/v Glyzerol, 0,03 % w/v Bromphenolblau

Der nach der Lyse von metabolisch markierten Zellen erhaltene Lysatüberstand (siehe 3.4.2.) wurde 1:2 mit PBS-SDS-Lösung verdünnt, und das konditionierte Medium mit 1/10 Volumen 10fachem Proteasen-Inhibitor-Mix-Lösung (siehe 3.4.2.) und 1/100 Volumen 20 % SDS-Lösung versetzt. Konditioniertes Medium und Lysatüberstand wurden für 2 h einer Vorpräzipitation mit jeweils 10 µl Präimmunserum und 50 µl Protein A-Sepharose unterzogen, um unspezifisch


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bindende Proteine abzutrennen. Nach Zentrifugation (5 min, 3000xg) wurde das Sediment aus der Vorpräzipitation verworfen. Die Hauptpräzipitation erfolgte nach Zugabe von Antikörper (1:150 anti-FdAPP, 1:100 anti-A4CT, 1:150 anti-Abeta(1-6), 1:150 anti-Abeta(1-40), 1:150 anti-Abeta(1-42)) und 30 µl Protein A-Sepharose bzw. anti-IgG-Maus-gekoppelter Protein A-Sepharose bei Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (siehe 3.4.7.) für 1,5 h bei RT im Überkopfschüttler. Anschließend wurde die mit den Immunkomplexen beladene Protein A-Sepharose durch Zentrifugation sedimentiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde die Protein A-Sepharose dreimal mit 750 µl Waschpuffer A, zweimal mit 750 µl Waschpuffer B und einmal mit 750 µl Waschpuffer C gewaschen. Durch Zugabe von 3fach Probenpuffer und Aufkochen (10 min, 95oC) erfolgte die Elution der Immunkomplexe und die Dissoziation der Immunglobuline von ihren Antigenen. Nach Zentrifugation der Proben (10 s, 700xg) wurde der Überstand für die Gelelektrophorese eingesetzt.

3.4.6. Immunpräzipitation nicht-radioaktiv markierter Proteine

Die Immunpräzipitation nicht-radioaktiv markierter Proteine erfolgte wie in Kapitel 3.4.5. beschrieben. Auf die intensive Waschprozedur der an Protein A-Sepharose gekoppelten Immunkomplexe wurde jedoch verzichtet. Stattdessen wurde die mit Antikörper und Antigen beladene Protein A-Sepharose dreimal mit PBS gewaschen. Auf die Vorpräzipitation mit Präimmunserum wurde verzichtet. Nach elektrophoretischer Auftrennnung der reduzierten, denaturierten Proben im Polyacrylamid-Gel wurden die Proteine immunologisch im Western-Blot analysiert (siehe 3.4.14.).

3.4.7. Herstellung von anti-IgG-Maus-gekoppelter Protein A-Sepharose

Da Protein A-Sepharose zu Antikörpern der IgG1-Klasse nur eine geringe Affinität aufweist, wurde bei Immunpräzipitation mit monoklonalen Antikörpern dieser IgG-Klasse ein ”Spacer“-Antikörper an die Protein A-Sepharose gekoppelt, der gegen Maus IgG gerichtet ist.

Es wurden 30 µl Protein A-Sepharose mit 30 µl PBS, 10 µl polykolonalem Kaninchenserum anti-Maus-IgG und 10 µl monoklonalem Antikörper für 1 h im Überkopfschüttler inkubiert und nach dreimaligem Waschen mit PBS wieder auf ein Gesamtvolumen von 30 µl mit TBST aufgefüllt.

3.4.8. Tris-/Glycin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidelelektrophorese (SDS-PAGE) ermöglicht die Auftrennung von Proteinen entsprechend ihrem Molekulargewicht in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS) ( Weber & Osborn, 1969 ). Sie erfolgt als vertikale Flachbett-Elektrophorese ( Studier, 1973 ) in einem diskontinuierlichem Puffersystem nach dem Prinzip von Laemmli ( Laemmli, 1979 ).

Lösungen :

Acrylamidlösung :

30 % w/v Acyrlamid, 0,8 % w/v N,N-Methylbisacrylamid

Laufpuffer :

20 mM Tris/HCl, 150 mM Glycin, 0,08 % w/v SDS

7,5 %-Trenngel :

7,5 ml Acrylamidlösung, 5,6 ml 2 M Tris/HCl, pH 8,8, 16,6 ml Bidest, 150 µl 20 % w/v SDS, 100 µl 15 % w/v APS, 10 µl TEMED

5 %-Sammelgel :

1,7 ml Acrylamidlösung, 1,3 ml 1 M Tris/HCl, pH 6,8, 7,0 ml Bidest, 50 µl 20 % w/v SDS, 50 µl 15 % w/v APS, 5 µl TEMED

Für die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen mit einer Molmasse von 50 bis 150 kDa ist ein 7,5 %iges Trenngel geeignet. Das Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten (20 x


25

20 cm) gegossen, die durch Kunststoff-Spacer einen Abstand von 1 mm hatten (Aufbau Biorad). Das Trenngel wurde bis zur Polymerisation mit Isopropanol oder 0,1 % SDS überschichtet. Danach wurde das Sammelgel gegossen, in das der Probenkamm eingeschoben wurde. Nach Polymerisation des Sammelgels wurden die in Probenpuffer reduzierten, denaturierten Proben aufgetragen und für 4 bis 6 h bei 180 V oder über Nacht bei 60 V gelelektrophoretisch aufgetrennt. Als Molmassenstandards wurde eine vorgefärbte Proteinmischung von Sigma oder Life Technologies (siehe 2.4.) verwendet.

3.4.9. Tris-/Tricin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die SDS-Gelelektrophorese nach dem Prinzip von Schägger und Jagow ( Schägger & Jagow, 1987 ) ist besonders für die Auftrennung von Peptiden geeignet. Die Acrylamidkonzentration der verwendeten Trenngele variiert mit dem Molekulargewicht der zu analysierenden Proteine. Ein 10 %iges Trenngel erreicht eine gute Auftrennung von Proteinen mit einer Molmasse bis zu 10 kDa, während ein 16,5 %iges Trenngel noch Proteine mit einer Molmasse von 3 kDa gut auftrennt. Für eine gute Auftrennung im Molmassenbereich von 3 bis 180 kDa wurde ein Gradientengel (6,5 bis 16,5 %iges Trenngel) gegossen.

Lösungen :

Acrylamid-Trenngel-Lösung :

48 % w/v Acrylamid, 1,5 % w/v N,N-Methyl-bisacrylamid

Acrylamid-Sammelgel-Lösung :

46,5 % w/v Acrylamid, 3 % w/v N,N-Methylbis- acrylamid

Gelpuffer :

3 M Tris/HCl, pH 8,5, 0,3 % w/v SDS

Kathodenlaufpuffer :

0,1 M Tris, 0,1 M Tricin, 0,1 % SDS, pH 8,3

Anodenlaufpuffer :

0,2 M Tris/HCl, pH 8,9

6,5 %iges Trenngel :

siehe Tab. 3

10 %iges Trenngel :

siehe Tab. 3

16,5 %iges Trenngel :

siehe Tab. 3

10 %iges Spacergel :

3 ml Acrylamid-Sammelgel-Lösung, 5 ml Gelpuffer, 7 ml Bidest, 50 µl 15 % w/v APS, 5 µl TEMED

4 %-Sammelgel :

1,0 ml Acrylamid-Sammelgel-Lösung, 3,1 ml Gel-puffer, 8,4 ml Bidest, 100 µl 15 % w/v APS, 10 µl TEMED

Das Gießen des 6,5 und 10 %igen Trenngels erfolgte wie in 3.4.8. beschrieben. Bei dem 16,5 %igen Trenngel wurde zunächst das Trenngel und anschließend gleich ein 10 %iges Spacergel gegossen und mit Isopropanol oder 0,1 % SDS überschichtet. Nach der Polymerisation des Trenn- bzw. Spacergels wurde das Sammelgel gegossen und der Probenkamm eingeschoben.


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Tab. 3 : Zusammensetzung der Tris-/Tricin-Trenngele

6,5 % Trenngel

10 % Trenngel

16,5 % Trenngel

Gesamtvolumen

30 ml

30 ml

30 ml

Acrylamid-Trenngel-Lösung

-

-

10,0 ml

Acrylamid-Sammelgel-Lösung

4,0 ml

6,1 ml

-

Gelpuffer

10,0 ml

10,0 ml

10,0 ml

Glyzerol (70 %)

3,2 ml

3,2 ml

3,2 ml

Bidest

12,8 ml

10,7 ml

6,8 ml

15 % w/v APS

100 µl

100 µl

100 µl

TEMED

10 µl

10 µl

10 µl

Nach Polymerisation des Sammelgels wurden die in Probenpuffer reduzierten, denaturierten Proben aufgetragen und über Nacht bei 80 V gelelektrophoretisch aufgetrennt. Als Molmassenstandard für den hohen Molmassenbereich wurden vorgefärbte Proteinmischungen von Sigma (35 bis 190 kDa) oder Life Technologies (26,6 bis 180 kDa) verwendet, für den niedrigen Molmassenbereich eine vorgefärbte Proteinmischung von Life Technologies (2,3 bis 43 kDa).

3.4.10. Tris-/Bicin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit dem NuPage-System

Bei der SDS-PAGE mit NuPage-Gelen handelt es sich um ein von der Firma Novex entwickeltes Fertig-Minigelsystem, das auf dem Puffersystem Bistris/HCl (pH 6,4) basiert und als Laufpuffer MES (2-Morpholinoethansulfonsäure) für eine gute Auftrennung von Proteinen mit geringem Molmasse (3 bis 185 kDa) oder MOPS (3-Morpholinopropansulfonsäure) für eine gute Auftrennung von Proteinen mit größerer Molmasse (12 bis 188 kDa) verwendet. Für die elektrophoretische Auftrennung mit dem NuPage-System wurden Gradientengele mit einer Acrylamidkonzentration von 4 bis 12% verwendet.

Lösungen :

MES-Anodenlaufpuffer :

50 mM MES, 50 mM Tris-Base, 0,1 % w/v SDS, 1,025 mM EDTA, pH 7,3

MOPS-Anodenlaufpuffer :

50 mM MOPS, 50 mM Tris-Base, 0,1 % w/v SDS, 1,025 mM EDTA, pH 7,7

Kathodenlaufpuffer :

MES- oder MOPS-Anodenlaufpuffer mit 1/400 Volumen NuPage Antioxidant

Die in Probenpuffer reduzierten, denaturierten Proben wurden auf ein NuPage-Gradientengel aufgetragen und mit MES-enthaltenen Laufpuffer für 35 min bei 200 V und mit MOPS-enthaltenen Laufpuffer für 50 min bei 200 V elektrophoretisch aufgetrennt. Als Molmassen-standard wurde eine vorgefärbte Proteinmischung von der Firma Novex (MultiMark Multi-colored Standard, 3 bis 185 kDa) eingesetzt.


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3.4.11. Tris-/Bicin-/Harnstoff-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Das Puffersystem nach Wiltfang et al. ( Wiltfang et al., 1991 ) verwendet Bicin und Sulfat als Trägerion und Bistris und Tris als Gegenion. Mit den üblichen gelelektrophoretischen Methoden wie z.B. SDS-Page nach Laemmli ( Laemmli, 1979 ) oder nach Schägger und Jagow ( Schägger & Jagow, 1987 ) kann keine Trennung der Abeta-Peptide (1-40) bzw. (1-42) erreicht werden. Wird jedoch ein Tris-/Bicin-Gel mit Harnstoff verwendet, so wird eine elektrophoretische Trennung der Abeta-Peptide (1-40) und (1-42) erreicht ( Klaffki et al., 1996 ), wobei das Peptid Abeta(1-42) im Gelsystem mit Harnstoff schneller als das Peptid Abeta(1-40) läuft. Die elektrophoretische Beweglichkeit von kleinen Polypeptiden wird stark von ihrer Tertiärstruktur beeinflußt ( Wiltfang et al., 1991 ). Vermutlich wird durch die Anwesenheit von SDS und Harnstoff im Trenngel eine unterschiedliche Tertiärstruktur der (1-40)- bzw. (1-42)-Peptide ausgebildet, so daß das Laufverhalten der beiden Peptide nicht nur durch das Molekulargewicht, sondern auch durch ihre Tertiärstruktur beeinflußt wird und sich somit deutlich voneinander unterscheidet.

Lösungen :

Trenngelpuffer 4fach :

1,6 M Tris, 0,4 M H2SO4, pH 8,5

Spacergelpuffer 2fach :

0,8 M Bistris, 0,2 M H2SO4, pH 6,7

Sammelgelpuffer 2fach :

0,72 M Bistris, 0,32 M Bicin, pH 7,7

Acrylamidlösung :

57 % w/v Acrylamid, 3 % w/v N,N-Methylbisacrylamid

Probenpuffer 2fach :

0,72 M Bistris, 0,32 M Bicin, 2 % w/v SDS, 30 % w/v Saccharose, 5 % v/v 2-Mercaptoethanol, 0,01 % w/v Brom-phenolblau

Kathodenlaufpuffer :

0,2 M Bicin, 0,1 M NaOH, 0,25 % w/v SDS, pH 8,2

Anodenlaufpuffer :

0,2 M Tris, 0,05 M H2SO4, pH 8,1

12 %-Trenngel :

2,0 ml Acrylamidlösung, 2,5 ml Trenngelpuffer 4fach, 100 µl 10 % w/v SDS, 4,2 g 7 M Harnstoff, auf 10 ml Endvolumen mit Bidest einstellen, 40 µl 10 % w/v APS, 5 µl TEMED

Spacergel :

200 µl Acrylamidlösung, 1 ml Spacergelpuffer 2fach, 20 µl 10 % w/v SDS, 770 µl Bidest, 8 µl 10 % w/v APS, 2 µl TEMED

Sammelgel :

1,5 ml Sammelgelpuffer 2fach, 375 µl Acrylamidlösung, 30 µl 10 % w/v SDS, 1,068 ml Bidest, 24 µl 10 % w/v APS, 3 µl TEMED

Das Trenngel wurde zwischen zwei Glasplatten (8,5 x 8,5 cm), die durch Kunststoff-Spacer einen Abstand von 0,75 mm hatten, bis zu einer Höhe von max. 54 mm gegossen. Das Trenngel wurde bis zur Polymerisation mit Isopropanol oder 0,1 % SDS überschichtet. Danach wurde das Spacergel bis zu einer Höhe von max. 5 mm gegossen.

Bis zum Auspolymerisieren wurde das Spacergel mit Isopropanol oder 0,1 % SDS überschichtet. Danach wurde das Sammelgel gegossen, in das dann der Probenkamm eingeschoben wurde. Nach Auspolymerisieren des Sammelgels wurden die im oben angegebenen Probenpuffer reduzierten, denaturierten Proben aufgetragen und zunächst für 10 bis 15 min bei 10 mA/Gel und anschließend für ca. 1 h bei 20 bis 24 mA/Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Als Referenz für (1-40)- und (1-42)-Peptid wurden jeweils synthetische Abeta Peptide von der Firma Bachem bei jedem Gellauf eingesetzt. Nach dem Gellauf wurde zur Detektion der synthetischen Peptide das Gel mit Coomassie Blue gefärbt (siehe 3.4.12.).


28

3.4.12. Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen mit Coomassie Blue

( Neuhoff et al., 1988 )

Lösungen :

Fixierer-Lösung :

0,25 % v/v Glutaraldehyd in 0,4 M Borat-/Phosphat-Puffer, pH 6,2

Färber-Lösung :

5 % w/v Coomassie Brilliant blue G250

Entfärber-Lösung :

10 % v/v Methanol, 7,5 % v/v Essigsäure

Geldry-Lösung :

30 % v/v Ethanol, 5 % v/v Glyzerol

Das Gel wurde nach der Elektrophorese für 30 min in Fixierer-Lösung unter leichtem Schütteln inkubiert, und nach 2maligem Waschen mit Bidest in Färber-Lösung für 5 min inkubiert. Nach mehrmaligem Entfärben des Gels mit Entfärber-Lösung wurde das Gel für 15 min in Geldry-Lösung inkubiert und anschließend auf einem Vakuumtrockner (BioRad) bei 80oC getrocknet.

3.4.13. Autoradiographie mit Phosphorimager

Zur Analyse der 35S-markierten Proteine wurde im Anschluß an die SDS-Page dieser Proteine das Gel für 1 h in Fixierer-Lösung (30 % v/v Methanol, 7 % v/v Essigsäure, 63 % Bidest) inkubiert und anschließend für 2 h auf einem Vakuumtrockner (BioRad) bei 80oC getrocknet. Das getrocknete Gel wurde dann für max. 3 Tage auf einem PhosphorScreen (Molecular Dynamics) exponiert, mittels Phosphorimager detektiert und densitometrisch durch die Software ImageQuant analysiert.

3.4.14. Western-Transfer-Analyse (Western-Blot)

( Towbin et al., 1979 )

Lösungen :

Transferpuffer I :

20 mM Tris, 150 mM Glycine, 20 % v/v Methanol

Transferpuffer II :

25 mM Bicin, 25 mM Bistris, 1,025 mM EDTA, pH 7,2, 1/1000 Vol. NuPage Antioxidant

TBST :

10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % v/v Tween 20

Absättigungs-Puffer :

1 % w/v Milchpulver in TBST

Chemolumineszenzlösung :

20 ml Lösung A, 20 ml Lösung B (NEN Life Science)

Entfärber-Puffer :

62,5 mM Tris/HCl, pH 6,7, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 2 % w/v SDS

Die in einer analytischen SDS-Page aufgetrennten Proteine wurden durch Elektrotransfer auf eine Nitrocellulose-Membran (Schleicher & Schuell, Maschenweite 0,45 µm) übertragen. Der Transfer von Tris-/Glycin- oder Tris-/Tricin-Gelen (siehe 3.4.8. und 3.4.9.) erfolgte in einer Trans-Blot-Apparatur (Biorad) für 5 h bei 4oC und einer Stromstärke von 240 mA in Transferpuffer I. Der Western-Blot von Tris-/Bicin-Gelen (siehe 3.4.10.) erfolgte in einem Blotmodul der Firma Novex für 2 h bei 4oC und einer Spannung von 25 V in Transferpuffer II.

Die freien Bindungsstellen der aus der Western-Blot-Apparatur entnommenen Membran wurden für 1 h bei RT mit Absättigungspuffer inkubiert. Danach wurde die Membran über Nacht mit dem in Absättigungspuffer verdünntem Antiserum bei 4oC inkubiert (1:10000 MAk 22C11, 1:7000 anti-CT, 1:5000 anti-Synaptophysin, 1:5000 anti-NF-68). Um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen, wurde die Membran mehrmals mit TBST gewaschen. Die Nachweis


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gebundener Antikörper erfolgte für 1 h bei RT mit Peroxidase-gekoppelten Schaf-anti-Maus- bzw. Schaf-anti-Kaninchen-Antikörper (1:5000 in Absättigungspuffer). Nach mehrmaligem Waschen der Membran mit TBST wurde die Färbereaktion durchgeführt. Für die Detektion eines Peroxidase-gekoppelten, sekundären Antikörpers wurde die zuvor kurz angetrocknete Membran für 1 min in Chemolumineszenz-Lösung inkubiert und nach erneutem Antrocknen in einer Filmkassettte zusammen mit einem Film (NEN Life Science) für max. 18 h exponiert. Die Entwicklung des Film erfolgte im Hyperprocessor (Amersham).

Die Detektion von primär gebundenen Antikörpern mit Hilfe von Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörpern über Chemolumineszenz-Reaktion ist reversibel, d.h. man kann die an der Membran gebundenen Antikörper wieder entfernen (strippen). Hierzu wurde die Membran für 30 min in Entfärber-Puffer bei 57oC inkubiert und anschließend ausgiebig mit TBST gewaschen. Danach wurde die Membran wie oben beschrieben erneut abgesättigt, mit primären Antikörper über Nacht inkubiert und über Bindung des sekundären Antikörpers entwickelt.

3.4.15. Nachweis von Prostaglandin E2

Für die quantitative Bestimmung von Prostaglandin E2 (PGE2) im konditioniertem Medium wurde ein Enzymimmunoassay (EIA)-Kit von Amersham eingesetzt. Es handelt sich hierbei um einen kompetitiven EIA mit einer Nachweisgrenze von 2,5 bis 320 pg PGE2, bei dem anti-Maus-IgG adsorptiv an die Wand der Mikrotiterplatten-Vertiefungen gebunden ist. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatten werden nacheinander konditioniertes Medium, Peroxidase-gekoppeltes PGE2 und anti-PGE2 gegeben. Dabei kommt es zu einer Kompetition von nicht-markiertem und markiertem PGE2 um den Antikörper. Je höher die Konzentration an PGE2 im Medienüberstand ist, desto weniger bindet Peroxidase-gekoppeltes PGE2, gebunden an anti-PGE2 an die Mikrotiterwand. Für die Quantifizierung des PGE2 im Mediumüberstand wurde ein Standard mitgeführt. Als Substrat für die Peroxidase wurde TMB (3,3‘,5,5‘-tetramethylbenzidinhydrogen peroxid) eingesetzt. Die Messung der Absorption erfolgt bei einer Wellenlänge von 630 nm im ELISA-Reader (Dynatech MR5000).

3.4.16. ICAM-1-ELISA

Für den semi-quantitativen Nachweis des interzellulären Adhäsionsmolekül ICAM-1 in astrozytären Zellen wurde ein Verfahren entwickelt, das auf immunhistochemischer Technik basiert. Hierbei werden Zellen in einer Mikrotiterplatte (96well) kultiviert und mit Substanzen behandelt. Nach entsprechender Induktionszeit werden die Zellen, nachdem diese zweimal mit PBS gewaschen wurden, an der Mikrotiterplattenwand fixiert, und nach Permeabilisierung mit Triton X-100 in Absättigungspuffer mit dem Antikörper anti-ICAM-1 inkubiert. Über einen biotinylierten sekundären Antikörper anti-IgG wird das Avidin-Peroxidase-Verstärkersystem von Vectastain Elite ABC Kit und ABTS als lösliches Substrat verwendet.

Lösungen :

PBS-Glycin :

PBS mit 0,1 % w/v Glycin

PBST :

PBS mit 0,2 % v/v TritonX-100

PBST-BSA :

PBST mit 1 % w/v BSA

PBST-BSA-NS :

PBST-BSA mit 1,5 % v/v Pferdeserum (Vector Lab.)

Avidin-POD :

1:100 Lösung A und 1:100 Lösung B in PBST für 30 min vorinkubieren (Vector Laboratories)

ABTS :

1 mM 2,2‘Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfat] in 0,1 M Phosphat-/Citrat-Puffer, pH 4,3, 0,002 % v/v H2O2


30

Für den ICAM-1-ELISA wurden die mit Substanzen behandelten Zellen in einer Mikrotiterplatte (96well) nach entsprechender Induktionszeit an der Wand der Mikro-titerplattenvertiefung mit je 50 µl 4 % w/v Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei RT fixiert und anschließend einmal mit je 100 µl PBS-Glycin und zweimal mit je 100 µl PBS gewaschen. Nach Absättigung der freien Bindungsstellen an der Mikrotiter-plattenwand bzw. gleichzeitiger Permeabilisierung der fixierten Zellen mit jeweils 100 µl PBST-BSA-NS für 1 h bei RT wurden je 50 µl MAk anti-human-ICAM-1 (1:10000 in PBST-BSA-NS) zugegeben. Die Inkubation des primären Antikörpers erfolgte in einer feuchten Kammer bei 4oC für 18 h. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde der sekundäre Antikörper anti-Maus-IgG-Biotin (1:200 in PBST-BSA-NS) zu je 50 µl in die Vertiefungen gegeben und für 1 h bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST erfolgte dann die Zugabe von je 50 µl Avidin-POD. Nach 30 min bei RT wurden die Vertiefungen erneut dreimal mit PBST gewaschen. Anschließend wurde die Substratreaktion mit je 50 µl ABTS durchgeführt. Die Messung der Absorption erfolgte bei einer Wellenlänge von 405 nm im ELISA-Reader (Dynatech MR5000).

3.4.17. Nachweis sekretorischer alkalischer Phosphatase

Lösungen :

SEAP-Puffer 2fach : 2 M Diethanolamin, 1 mM MgCl2, 20 mM L-Homoarginin, pH 9,6

Für den Nachweis von sekretorischer alkalischer Phosphatase (SEAP) wurde das konditionierte Medium für 1 h bei 65oC inkubiert, um die endogenen alkalischen Phosphatasen zu inaktivieren. Nach Abkühlen der Proben auf RT wurden jeweils 100 µl konditioniertes Medium und 100 µl 2facher SEAP-Puffer in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben und mit je 20 µl 120 mM p-Nitrophenolphosphat in 1fach SEAP-Puffer als Substrat bis maximal über Nacht im Zellkulturschrank bei 37oC in 5 % CO2 und 95 % wasserdampfgesättigter Atmosphäre inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgte dann bei einer Wellenlänge von 405 nm im ELISA-Reader (Dynatech MR5000).

3.4.18. Immunzytochemischer Nachweis des ICAM-1

Die immunzytochemische Detektion von ICAM-1 in astrozytären Zellen erfolgte nach dem gleichen Testprinzip wie der ICAM-1-ELISA. Die Zellen wurden jedoch auf Poly-L-Lysin-beschichteten Glas-Plättchen (Karl Hecht GmbH, Sondheim) kultiviert. Die Beschichtung mit Poly-L-Lysin erfolgte durch eine Inkubation der runden Deckgläser mit 100 mg Poly-L-Lysin/ml in PBS über Nacht bei 4oC. Nach dreimaligem Waschen der Glas-Plättchen mit PBS wurden die Zellen darauf ausgesät und entsprechend mit Substanzen behandelt. Danach wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und nach Zugabe des primären Antikörpers (1:1000 MAk anti-human-ICAM-1) konnte dieser über das Avidin-Peroxidase-System (Vectastain Elite ABC Kit, Maus IgG) wie in 3.4.16. beschieben detektiert werden. Als unlösliches Substrat für die Peroxidase wurde jedoch DAB (1,3 mM Diaminobenzidin [3,4,3‘,4‘-Tetraaminobiphenyltetrahydrochlorid] in PBS mit 0,02 % v/v H2O2) verwendet. Die Substratreaktion wurde durch mehrmaliges Waschen mit PBS beendet.


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