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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 in Astrozyten

4.1.1. Übersicht und Fragestellung

Charakteristische neuropathologische Merkmale der Alzheimer-Krankheit sind senile Plaques, die von aktivierten Astrozyten und Mikroglia umgeben sind. Astrozyten sind in der Lage, im aktivierten Zustand zahlreiche Zytokine und Wachstumsfaktoren zu sekretieren, die zu einer Verstärkung inflammatorischer Prozesse führen können. Neben diesen bereits gut untersuchten sekretorischen Faktoren produzieren Astrozyten im aktivierten Zustand noch zahlreiche Immunrezeptoren, dessen Expressionsverhalten in Astrozyten im Hinblick auf die Alzheimer-Krankheit noch wenig charakterisiert ist. Von besonderer Bedeutung für die Alzheimer-Pathogenese ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1, da es mit amyloidogenen Ablagerungen im Hirn von Alzheimer-Patienten assoziiert vorliegt ( Akiyama et al., 1993 ; Eikelenboom et al., 1994 ; Verbeek et al., 1994 ). ICAM-1 gehört zur Immunglobulin-Superfamilie der Adhäsionsrezeptoren, deren Liganden die 2-Integrine LFA-1 (leukocyte function-associated antigen) und MAC-1 (macrophage antigen) sind. Welche Rolle ICAM-1 in der Alzheimer-Pathogenese spielt, ist bisher noch nicht untersucht worden. Um einen ersten Hinweis auf eine mögliche pathophysiologische Rolle des ICAM-1 in der Alzheimer-assoziierten Neuroinflammation zu erhalten, wurde die astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Mitogene untersucht, die für die Alzheimer-Pathogenese von Bedeutung sind (siehe Einleitung, Kap. 1.4.).

4.1.2. ICAM-1 als Marker für die astrozytäre Aktivität

Wie einige Veröffentlichungen belegen, wird ICAM-1 auch unter Zellkulturbedingungen von Astrozyten exprimiert ( Frohman et al., 1989 ; Kuppner et al., 1990 ). Mit Hilfe von primär kultivierten Astrozyten konnte bereits gezeigt werden, daß Lipopolysaccharide sowie die Zytokine TNF und IL1 die ICAM-1-Expression verstärken ( Ballestas & Benveniste, 1995 ). Die in diesem Kapitel beschriebenen Experimente sollten prüfen, ob die ICAM-1-Expression in der astrozytären Zellinie CCF-STTG1 durch die Zytokine IL1 oder TNF, die mit amyloidogenen Ablagerungen assoziiert sind, beeinflußbar ist, und inwieweit diese Zellen für die Untersuchung der astrozytären Aktivität geeignet sind.

Für die immunzytochemische Untersuchung der ICAM-1-Expression wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) auf Poly-L-Lysin-beschichteten Glasplättchen kultiviert. Die Zellen wurden bei einer 50 %igen Konfluenz mit 100 U IL1/ml oder 50 ng TNF/ml für 18 h behandelt (siehe 3.3.10.). Anschließend wurde eine immunzytochemische Färbung mit dem monoklonalem Antikörper anti-human-ICAM-1 durchgeführt (siehe 3.4.18.). Wie aus Abb. 6 hervorgeht, ist eine starke ICAM-Färbung in Astrozyten zu beobachten, die mit IL1 und TNF behandelt wurden.

Um die immunzytochemischen Ergebnisse zu verifizieren, wurde die Expression von ICAM-1 mittels Immunpräzipitation nachgewiesen. Zu diesem Zweck wurden CCF-STTG1-Zellen während einer metabolischen Markierung mit jeweils 200 µCi [³⁵S]-Methionin (siehe 3.3.7.) für 6 h mit 100 U IL1/ml oder 50 ng TNF/ml in Markierungsmedium behandelt (siehe 3.3.10.). Nachdem die Zellen in der Zellkulturschale lysiert wurden, erfolgte die Immunpräzipitation von ICAM-1 aus dem Zellysat mit anti-Maus-IgG-gekoppelter Protein A-Sepharose (1:40 anti-human-ICAM-1; siehe 3.4.5. und 3.4.7.). Anschließend wurden die hitzedenaturierten, auf gleiche Proteinmenge angeglichenen Immunpräzipitate in einem 10 %igem Tris-/Tricin-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (siehe 3.4.9.). Nach Fixierung und Trocknung des Gels erfolgte die Exposition auf einem Phosphorscreen und die autoradiographische Analyse der Immunpräzipitate (siehe 3.4.13.). Ein repräsentatives Ergebnis der ICAM-1-Analyse ist in Abb. 7 dargestellt. Im Zellysat TNF- und IL1-behandelter Astrozyten zeigte sich deutlich eine immun-

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Abb. 6 : Immunzytochemische Detektion von ICAM-1 in Astrozyten, die mit unterschiedlichen Mitogenen für 18 h behandelt wurden (freundlicherweise von G. Bodewitz, Schering AG, zur Verfügung gestellt). A. unbehandelte CCF-STTG1-Zellen, B. CCF-STTG1-Zellen, mit 100 U IL1/ml behandelt, C. CCF-STTG1-Zellen mit 50 ng TNF/ml behandelt. Antikörper : MAk anti-human-ICAM-1 (1:1000). Vergrößerung : 400fach.

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Abb. 7 : Immunpräzipitation des ICAM-1
Autoradiographie des gelelektrophoretisch aufgetrenntem, mit anti-human-ICAM-1 immunpräzipitiertem, ³⁵S-markiertem ICAM-1 aus Zellysat unbehandelter (Kontrolle) und Zytokin-behandelter (100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml) humaner Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1). Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker)

Die aus immunzytochemischen und biochemischen Analysen gewonnenen Daten zeigten, daß die Zytokine IL1 und TNF die ICAM-1-Expression humaner Astrozytom-Zellen verstärken. ICAM-1 stellt somit ein Markerprotein für die astrozytäre Aktivität dar, die mit der Alzheimer-Pathogenese assoziiert ist.

4.1.3. Quantifizierung des ICAM-1 durch einen Zell-basierenden ELISA

Zur Quantifizierung der ICAM-1-Expression wurde ein ELISA im Mikrotiterplatten-Format entwickelt, der auf immunzytochemischen Techniken basiert. Mit Hilfe des ELISA’s kann die Expression von Membran-assoziiertem ICAM-1 in Paraformaldehyd-fixierten Zellen semiquantitativ nachgewiesen werden. Um die Streuung der Einzelwerte zu ermitteln, wurde der Mittelwert (MW) der Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm aus 8facher Bestimmung unbehandelter sowie Zytokin-behandelter Zellen berechnet, die Standardabweichung (SD) und der daraus resultierende Variationskoeffizient (VK in [%]= (SD/MW) x 100) ermittelt (siehe Tab. 4). Humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) wurden in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert, nach einem Mediumwechsel mit 100 U IL1/ml oder 20 ng TNF/ml für 18 h behandelt (siehe 3.3.10.) und im ICAM-1-ELISA analysiert (siehe 3.4.16).

Die Ergebnisse des ICAM-1-ELISA’s korrelierten mit den Befunden aus immunzytochemischen und biochemischen Analysen der ICAM-1-Expression (siehe 4.1.2.). Die Zytokine IL1 und TNF verstärkten die ICAM-1-Expression humaner Astrozytom-Zellen. Der ELISA zeigte eine geringe Standardabweichung und einen niedrigen Variationskoeffizienten unter 10 %.

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Tab. 4 : Ermittlung der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten des ICAM-1-ELISA‘s

Behandlung der Zellen mit	MW	SD	VK in [%]
Kontrolle	0,536	0,034	6,3
100 U IL1/ml	1,037	0,082	7,9
20 ng TNF/ml	1,188	0,099	8,3

4.1.4. Astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Zytokin-Konzentrationen

Um die ICAM-1-Expression in Astrozyten näher zu charakterisieren, wurde die Konzentrations-abhängigkeit der Zytokin-Wirkung untersucht. Hierfür wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert, nach 24 h mit 0,75 bis 200 U IL1/ml oder mit 10 bis 50 ng TNF/ml in frischem Kultivierungsmedium für 18 h behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert (siehe 4.1.3.). Das Ergebnis dieser Analyse ist in Abb. 8 dargestellt.

Die Behandlung der Astrozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen von IL1 und TNF über einen Zeitraum von 18 h führte zu einer dosisabhängigen ICAM-1-Stimulation. IL1 verstärkte bereits ab einer sehr geringen Konzentration von 0,75 U/ml die Expression von ICAM-1 um den Faktor 2,0 bis maximal um den Faktor 3,1 ab 50 U IL1/ml (siehe Abb. 8-1). Bei einer geringen Konzentration von 10 ng TNF/ml wurde die ICAM-1-Expression um das 2,3fache verstärkt, während eine konstante stimulierte ICAM-1-Expression um den Faktor 2,9 erst ab einer Konzentration von 40 ng TNF/ml erreicht wurde (siehe Abb. 8-2).

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Abb. 8 : Expression des ICAM-1 in Abhängigkeit von der IL1- und TNF-Konzentration
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 0,75; 1,56; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 U IL1/ml (1) bzw. mit 10, 20, 30, 40 und 50 ng TNF/ml (2) für 18 h behandelt und im ICAM-1-ELISA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils drei unabhängigen Experimenten und die daraus resultierende Standardabweichung berechnet.

(1)
(2)

4.1.5. Zeitverlauf der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression

Um den zeitlichen Verlauf der verstärkten ICAM-1-Expression nach Behandlung humaner Astrozytom-Zellen mit Zytokinen zu verfolgen, wurden die Zellen für 2, 4, 8, 14, 18, 24, 48 und 72 h mit 100 U IL1/ml oder 50 ng TNF/ml behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert. Die Auswertung der ELISA-Daten ist in der Abb. 9 dargestellt.

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Abb. 9 : Zeitverlauf der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1/ml bzw. 50 ng TNF/ml für 2, 4, 8, 14, 18, 24, 48 und 72 h behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils 3 Meßwerten berechnet und der Mittelwert der Zytokin-aktivierten Zellen vom Mittelwert der Kontrollzellen (nicht behandelt) subtrahiert. Diese Daten waren in zwei weiteren Experimenten reproduzierbar.

Eine maximale ICAM-1-Expression war durch die Behandlung der Zellen mit IL1 nach 18 h erreicht und zeigte ab diesem Zeitpunkt wieder eine langsame Verringerung der Expression. Die Behandlung der Zellen mit TNF führte zu einer ersten maximalen ICAM-1-Expression nach 18 h und zeigte ab diesem Zeitpunkt eine Verringerung der Expression. Nach 24 h war durch die Behandlung mit TNF ein zweiter Anstieg der ICAM-1-Expression zu beobachten, der nach 72 h noch nicht beendet war.

4.1.6. Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß verschiedener Mitogene

Um zu untersuchen, inwieweit neben TNF und IL1 weitere Mitogene die Fähigkeit besitzen, astrozytäres ICAM-1 zu verstärken, wurden die beiden astrozytären Zellinien CCF-STTG1 und H4 mit verschiedenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren behandelt, die für die Alzheimer-Pathogenese von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden CCF-STTG1- und H4-Zellen bis zur Konfluenz in Mikrotiterplatten kultiviert und nach einem Mediumwechsel mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml, 100 U IFN/ml, IFN mit TNF, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml und 2 ng TGF/ml für 18 h behandelt (siehe 3.3.10.) und anschließend die ICAM-1-Expression im ELISA gemessen (siehe 3.4.16.). Um zu untersuchen, inwieweit die Substanzen einen Einfluß auf die Wachstumsverhalten der Zellen ausüben, wurde nach der Behandlungszeit ein MTS-Test zur

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Abb. 10 : Einfluß verschiedener Mitogene auf die Expression des ICAM-1 in CCF-STTG1-Zellen
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml, 100 U IFN/ml, 50 ng TNF/ml mit 100 U IFN/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGF/ml für 18 h behandelt und anschließend im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Es wurde der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten gebildet und die Standardabweichung errechnet.

(1) MTS-Test

(2) ICAM-1-ELISA

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Abb. 11 : Einfluß verschiedener Mitogene auf die Expression des ICAM-1 in H4-Zellen
H4-Zellen wurden mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml, 100 U IFN/ml, 50 ng TNF/ml mit 100 U IFN/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGF/ml für 18 h behandelt und anschließend im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Es wurde der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten gebildet und die Standardabweichung errechnet.

(1) MTS-Test

(2) ICAM-1-ELISA

Das Wachstumsverhalten der Zellen wurde durch Behandlung mit den Zytokinen und Wachstumsfaktoren geringfügig beeinflußt (siehe Abb. 10-1, 11-1). Dagegen wurde die Expression von ICAM-1 zum Teil stark verändert (siehe Abb. 10-2, 11-2). Wiederum zeigten IL1 und TNF eine starke Stimulation der ICAM-1-Expression um den Faktor 1,9 bzw. 2,5, jedoch war die stärkste Stimulation durch die kombinierte Gabe von TNF und IFN (Faktor 2,8)

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4.1.7. Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß von physiologischem A-Protein

Um zu überprüfen, ob die astrozytäre ICAM-1-Expression durch amyloidogene Ablagerungen verursacht oder verstärkt werden kann, wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) mit konditionierten Medien von Neuroblastom-Zellen (Sy5y) behandelt, die in hohen Mengen A-Protein in den Medienüberstand sekretieren. Im Vergleich zu Sy5y-Zellen, die stabil mit pCEP4/APP751 transfiziert sind, kann die stärkste A-Sekretion in Sy5y-Zellen beobachtet werden, die stabil mit pCEP4/APP751sw (sw, schwedische Mutation) transfiziert sind ( Urmoneit, 1996 ). Im konditioniertem Medium von Sy5y-Wildtypzellen ließ sich unter den verwendeten experimentellen Bedingungen kein A nachweisen (siehe Ergebnisse, 4.2.5.).

CCF-STTG1-Zellen wurden in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert und nach einem Mediumwechsel (Kultivierungsmedium für Sy5y-Zellen) mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml und 50 ng TNF/ml mit 100 U IFN/ml sowie kombiniert mit konditionierten Medien von Sy5y-Wildtypzellen und stabil transfizierten Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen (1:2 verdünnt) behandelt. Nach 19 h wurde das Wachstumsverhalten der Zellen im MTS-Test und die ICAM-1-Expression im ELISA analysiert. Die Meßdaten sind in Abb. 12 dargestellt.

Abb. 12 : Einfluß des A-Proteins auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml oder 50 ng TNF/ml und 100 U IFN/ml in Kombination mit konditionierten Medien von Sy5y-, Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen für 19 h behandelt. Anschließend wurden die Zellen im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Im Diagramm ist der Mittelwert aus jeweils vier Meßwerten und die daraus resultierende Standardabweichung dargestellt.

(1) MTS-Test	(2) ICAM-1-ELISA

Weder das Wachstumsverhalten (siehe Abb. 12-1) noch die ICAM-1-Expression (siehe Abb. 12-2) der CCF-STTG1-Zellen wurden signifikant durch physiologisches A-Protein aus konditionierten Medienüberständen von Sy5y-, Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen verändert. Auch durch weitere Experimente, in denen die astrozytäre ICAM-1-Expression durch

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4.1.8. Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia

Wie aus vorangegangenen Experimenten hervorgeht, besitzt A-Protein keinen signifikanten Einfluß auf die astrozytäre ICAM-1-Expression. Amyloidogene Ablagerungen im Hirn von Alzheimer-Patienten weisen neben aktivierten Astrozyten auch eine starke Assoziation mit aktivierten Mikroglia auf. Verschiedene Forschungsgruppen konnten zeigen, daß Mikroglia durch aggregiertes A, nicht jedoch durch monomeres A stark aktiviert werden können ( Meda et al., 1995 ; Lorton, 1997 ). Die durch A-Protein aktivierten Mikroglia sekretieren zahlreiche Zytokine, die die astrozytäre Aktivität beeinflussen könnten. Um zu überprüfen, inwieweit die astrozytäre ICAM-1-Expression eine Folgereaktion der A-induzierten Mikroglia-Aktivität sein könnte, wurden humane Astrozytom-Zellen unter Einfluß konditionierter Medienüberstände A-aktivierter Mikroglia auf ICAM-1-Expression analysiert. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml oder mit konditionierten Medienüberständen unbehandelter bzw. A-aktivierter Mikroglia (1:2) für 18 h behandelt (die Medienüberstände wurden freundlicher-weise von Dr. U. Mönning zur Verfügung gestellt). Mikroglia wurden aus dem Gesamthirn der Ratte (P3) isoliert und für 2 bis 5 Tage in Gegenwart von monomerem A(1-42) bzw. aggregiertem A(1-42) kultiviert. Die konditionierten Medienüberstände wurden gesammelt und bei -20^oC gelagert. Die Analyse der ICAM-1-Expression erfolgte im ICAM-1-ELISA.

Wie aus Abb. 13 ersichtlich ist, verstärkten konditionierte Medienüberstände A-aktivierter Mikroglia die ICAM-1-Expression humaner Astrozytom-Zellen. Eine mit den Zytokinen IL1 oder TNF vergleichbare Stimulation der ICAM-1-Expression wurde durch Behandlung der Astrozyten mit Medienüberständen von Mikroglia erreicht, die mit aggregiertem A(1-42) behandelt wurden. Konditioniertes Medium von Mikroglia, die mit monomerem A-Protein behandelt wurden, verstärkten nur leicht die astrozytäre ICAM-1-Expression. Diese Daten weisen darauf hin, daß die astrozytäre ICAM-1-Expression eine Folgereaktion mikroglialer Aktivierung ist.

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Abb. 13 : Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1/ml, 50 ng TNF/ml (TNF) oder mit konditionierten Medienüberständen von Mikroglia (MG-KM) für 18 h behandelt und im ICAM-1-ELISA analysiert. Primäre Mikroglia wurden unbehandelt für 2 Tage kultiviert oder mit monomerem A(1-42) (Aßmono.) bzw. mit aggregiertem A(1-42) (Aßaggreg.) für 2 und 5 Tage kultiviert. Im Diagramm ist der Mittelwert aus jeweils 6 Meßwerten und die daraus resultierende Standardabweichung dargestellt. Diese Daten waren in drei weiteren Experimenten reproduzierbar.

4.1.9. Pharmakologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression

Astrozyten können die Alzheimer-Pathogenese erheblich verstärken, da sie im aktivierten Zustand zahlreiche Amyloidogenese-fördernde Substanzen sekretieren (z.B. -1-Antichymotrypsin, Apolipoprotein, Komplement-Faktoren). Für das veränderte Proteinex-pressionsmuster aktivierter Astrozyten sind Signaltransduktionswege verantwortlich, die durch IL1 oder TNF innerhalb einer Neuroinflammation ausgelöst werden können. Um den Signaltransduktionsweg der Astrozyten-Aktivierung näher zu charakterisieren, der zur verstärkten ICAM-1-Expression führt, wurden verschiedene pharmakologische Substanzen eingesetzt, die die Aktivität verschiedener Enzyme beeinflussen (siehe Tab. 5).

In einem ersten Experiment wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1), die in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert wurden, zunächst mit den Zytokinen IL1 oder TNF für 18 h stimuliert und anschließend mit den in Tab. 5 aufgeführten Substanzen für weitere 18 h behandelt. Die darauffolgende Messung der ICAM-1- Expression im ICAM-1-ELISA zeigte keine Hemmung der IL1- und TNF-Stimulation (ohne Abb.). In dem darauffolgenden Experiment wurde versucht, die astrozytäre ICAM-1-Expression durch Vorbehandlung mit den Signaltransduktionswegen-beeinflussenden Substanzen zu hemmen. Zu diesem Zweck wurden humane Astrozytom-Zellen für 1 h mit den pharmakologischen Substanzen vorbehandelt und anschließend für weitere 18 h mit 100 U IL1/ml bzw. 50 ng

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Tab. 5 : Übersicht der verwendeten Hemmstoffe und Aktivatoren von Enzymen

	Substanz	Wirkung	Konzentration
Protein- kinasen- Hemmstoffe	K-252a	Serin-/Threonin-Kinasen-Hemmstoff : cAMP- und cGMP-abh. PK (Ki=18-20 nM) MLCK (Ki = 17 nM) PKX (Ki = 25 nM)	50 nM
	Herbimycin A	Protein-Tyrosin-Kinase-Hemmstoff	100 nM
	Bisindolylmaleimid	PKC-Hemmstoff (Ki = 10 nM)	10 nM
	H-89,Dihydro-chlorid	PKA (Ki = 48 nM)	50 nM
	KT5823	PKG (Ki = 234 nM)	250 nM
	KT5926	allgemeiner Kinasen-Hemmstoff : CaM Kinase II (Ki = 4,4 nM) MLCK (Ki = 18 nM)	20 nM
Enzym- Hemmstoffe	Wortmannin	irreversibler Hemmstoff der PI3-Kinase (IC50 = 5 nM)	10 nM
	Rolipram	cAMP-spezifische Phosphodiesterase IV (IC50 = 1 µM)	1 µM
Enzym-aktivatoren	Forskolin	aktiviert die Adenylatzyklase	10 µM

Die Proteinkinase-Hemmstoffe K-252a und Bisindolylmaleimid sowie der Phosphodiesterase-Hemmstoff Rolipram beeinflußten geringfügig das Wachstumsverhalten der Zellen (ohne Abb.). Im Gegensatz dazu zeigten sich große Unterschiede in der ICAM-1-Expression (siehe Abb. 14-1). Die Vorbehandlung der Zellen mit K-252a, Rolipram und Forskolin führte zu einer deutlichen Verringerung der ICAM-1-Expression nach Behandlung der Zellen mit den Zytokinen IL1 oder TNF. Die prozentuale Hemmung der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression wurde nach folgender Formel berechnet :

Für die Berechnung der prozentualen Hemmung der ICAM-1-Expression wurden die Meßwerte des ICAM-1-ELISA’s mit den Meßwerten des MTS-Tests normalisiert.

Abb. 14 : Einfluß von Enzym-Hemmstoffen auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
(1) CCF-STTG1-Zellen wurden für 1 h mit den o.g. pharmakologischen Substanzen inkubiert, für 18 h mit 100 U IL1/ml oder 50 ng TNF/ml behandelt und im ICAM-1-ELSIA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils drei unabhängigen Experimenten und die daraus resultierende Standardabweichung ermittelt. (2) Es wurde die prozentuale Hemmung der Zytokin-stimulierten ICAM-1-Expression berechnet. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten.

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(1)
(2)

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Aus den dargestellten Ergebnissen geht hervor, daß pharmakologische Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, die astrozytäre ICAM-1-Expression vermindern, nicht aber eine schon bestehende Astrozyten-Aktivität beeinträchtigen.

4.1.10. Physiologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression

Durch Zellkulturexperimente konnte gezeigt werden, daß die astrozytäre ICAM-1-Expression durch Veränderung der intrazellulären cAMP-Konzentration beeinflußt werden kann. Es ist vorstellbar, daß in vivo die astrozytäre ICAM-1-Expression ebenfalls über die Regulation der cAMP-Konzentration moduliert werden kann. Da von bestimmten Prostaglandin-Rezeptoren bekannt ist, daß sie mit cAMP-assoziierten Signaltransduktionswegen gekoppelt sind ( Coleman et al., 1994 ), kämen Liganden der entsprechenden Prostaglandin-Rezeptoren, die Prostaglandine PGD2 und PGE2, als mögliche physiologische Modulatoren der astrozytären ICAM-1-Expression in Betracht. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden verschiedene Prostaglandine in ihrer Wirkung auf die astrozytäre ICAM-1-Expression untersucht.

Humane Astrozytom-Zellen wurden zunächst mit 1 µM PGE2 und 1 µM PGD2-Analoga für 1 h vorbehandelt und anschließend für 18 h mit 100 U IL1/ml oder 50 ng TNF/ml aktiviert. Die Ergebnisse aus der Messung der Zellvitalität (MTS-Test) und ICAM-1-Expression (ICAM-1-ELISA) sind in Abb. 15 graphisch dargestellt.

Prostaglandine beeinflußten geringfügig das Wachstumsverhalten der Zellen (siehe Abb. 15-1), dagegen zeigten diese einen signifikanten Einfluß auf die ICAM-1-Expression (siehe Abb. 15-2). Prostaglandin E2 (PGE2) führte zu einer 68 %igen, PGD2-Analoga zu einer 58 %igen Hemmung der ICAM-1-Expression nach Behandlung der Zellen mit IL1 (siehe Abb. 15-3). Ebenso wie PGE2 verminderte auch die PGD2-analoge Substanz die TNF-induzierte astrozytäre ICAM-1-Expression. Im Vergleich zu TNF-behandelten Zellen war jedoch die Hemmung der ICAM-1-Expression in IL1-aktivierten Zellen deutlich stärker ausgeprägt. In einem vergleichbaren Experiment konnte eine zu PGE2 vergleichbare Hemmung der astrozytären ICAM-1-Expression nach Behandlung mit Zytokinen mit PGE1 beobachtet werden, dagegen zeigte PGF2 keinen Effekt (ohne Abb.).

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Abb. 15 : Einfluß von Prostaglandinen auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden für 1 h mit 1 µM PGE2 und 1 µM PGD2-Analoga in Mikrotiterplatten behandelt und anschließend für 18 h mit 100 U IL1/ml bzw. 50 ng TNF/ml stimuliert. Es wurden mit dem MTS-Test die Vitalität der Zellen (1) und mit dem ICAM-1-ELISA die ICAM-1-Expression (2) analysiert. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (3) Es wurde die prozentuale Hemmung der Zytokin-stimulierten ICAM-1-Expression berechnet (Formel siehe 4.1.9.). Hierfür wurden die Meßdaten des ICAM-1-ELISA’s auf die Meßwerte des MTS-Tests normalisiert.

(1)
(2)
(3)

4.1.11. Astrozytäre Sekretion des Prostaglandin E2

Da in der Literatur beschrieben ist, daß Astrozyten in der Lage sind, Prostaglandine zu synthetisieren ( Fontana et al., 1982 ; DuBois et al., 1986 ), wurde untersucht, inwiefern die Zytokine IL1 und TNF im Vergleich zu konditionierten Medienüberständen aktivierter Mikroglia die astrozytäre PGE2-Sekretion beeinflussen. Zu diesem Zweck wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) mit 50 U IL1/ml, 10 ng TNF/ml und konditioniertem Medium A-aktivierter Mikroglia (Mikroglia wurden für 5 Tage mit aggregiertem A behandelt; siehe Kap. 4.1.8.) für 5 Tage behandelt und die konditionierten Medienüberstände im PGE2-ELISA analysiert (siehe 3.4.15.).

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Abb. 16 : PGE2-Sekretion aktivierter Astrozyten
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 50 U IL1/ml, 10 ng TNF/ml oder mit konditioniertem Medium A-aktivierter Mikroglia (1:2, MG-KM) mit und ohne Cyclooxygenase-Hemmstoff Fluosilit für 5 Tage behandelt. Das konditionierte Medium der Zellen wurde im PGE2-ELISA analysiert. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten und wurden anhand des jeweiligen mitgeführten PGE2-Standards (ohne Abb.) berechnet.

Wie in Abb. 16 deutlich zu sehen ist, verstärkten IL1 und konditioniertes Medium aktivierter Mikroglia die astrozytäre PGE2-Sekretion um das 13fache, TNF um das 3fache. Zur Kontrolle der Spezifität des ELISA’s wurde Fluosilit, ein Hemmstoff der Cyclooxygenase II (COXII), mitgeführt. Die Cyclooxygenase II ist ein Schlüsselenzym der Prostaglandin-Synthese. Die Behandlung der Zellen mit Fluosilit führte zu einer beinahe vollständigen Hemmung der verstärkten PGE2-Sekretion.

Diese Beobachtung läßt natürlich die Frage entstehen, warum die Astrozyten-Aktivität nicht durch die eigene Prostaglandin-Sekretion unterdrückt werden kann. Da eine Hemmung der ICAM-1-Expression nur durch Vorbehandlung mit Prostaglandinen erreicht werden konnte, läßt sich vermuten, daß Prostaglandine nur die Astrozyten-Aktivierung, nicht aber eine schon bestehende Aktivität vermindern können (siehe auch 4.1.9.). In vivo könnten Prostaglandine jedoch eine räumliche Ausbreitung der Astrozyten-Aktivierung verhindern.

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4.2. Untersuchungen zur Expression und Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

4.2.1. Übersicht und Fragestellung

Der Hauptbestandteil seniler Plaques im Hirn von Alzheimer-Patienten ist das A-Protein, das durch amyloidogene Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) entsteht (siehe Einleitung, 1.3.). Obwohl viele Daten darauf hinweisen, daß Neurone die Hauptproduzenten des A-Proteins (A) sind, ist bis heute noch nicht untersucht worden, inwieweit aktivierte Astrozyten zur Alzheimer-assoziierten Amyloidogenese beitragen. Das Ziel der im folgenden Kapitel beschriebenen Experimente bestand zum einen darin zu untersuchen, inwieweit Astrozyten im Vergleich zu Neuronen in der Lage sind, amyloidogene APP-Fragmente zu bilden, und zum anderen, welchen Einfluß Zytokine und Wachstumsfaktoren auf die amyloidogene APP-Prozessierung astrozytärer Zellen besitzen.

4.2.2. APP-Prozessierung in Astrozyten

Um die astrozytäre APP-Prozessierung zu untersuchen, wurden verschiedene Astrozyten-Zellinien und primäre Astrozyten herangezogen. Als Vergleich dienten primäre neuronale Zellen sowie Hirngewebe der Ratte. Als Kontrolle für die elektrophoretische Mobilität der APP-Isoformen sowie proteolytischer APP-Fragmente wurden stabil transfizierte H4-Zellen eingesetzt, die die APP-cDNA mit der schwedischen Mutation exprimieren (H4/APP695sw, H4/APP751sw; siehe auch 4.2.6.).

Es wurden primäre Astrozyten aus dem Gesamthirn (siehe 3.3.1.) sowie primäre Neurone aus dem Cerebellum der Ratte (siehe 3.3.2.) isoliert. Für die biochemische Untersuchung des Hirngewebes wurde Rattenhirn (P3), wie in 3.4.1. beschrieben, lysiert. Primäre Astrozyten wurden am Tag 14 und primäre Neurone am Tag 8 nach der Isolierung geerntet und lysiert (siehe 3.4.2.). Die Lyse der astrozytären Zellinien CCF-STTG1 und H4 sowie stabil transfizierter H4/APP695sw- und H4/APP751sw-Zellen erfolgte in der Zellkulturschale (siehe 3.4.2.). Die gelösten Proteine aus den Zellysaten wurden mit Aceton gefällt, in 8 M Harnstoff und Probenpuffer hitzedenaturiert (siehe 3.4.4.) und im 10 %igen Tris-/Tricin-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (siehe 3.4.9.). Das konditionierte Medium der Zellen wurde mit einem Antikörper immunpräzipitiert (siehe 3.4.6.), der sekretorisches APP erkennt (anti-FdAPP), und die hitzedenaturierten Immunpräzipitate gelelektrophoretisch aufgetrennt (7,5 % Tris/ Glycin-Gel, siehe 3.4.8.). Anschließend wurden die proteolytischen APP-Fragmente im Western-Blot mit folgenden primären Antikörpern über Chemolumineszenz (siehe 3.4.14.) nachgewiesen:

MAk 22C11 :	erkennt alle postranslational modifizierten und nichtmodifizierten APP-Isoformen (APP, nichtmodifiziert; APP*, posttranslational modifiziert) in Zellysaten sowie sekretorisches APP im konditionierten Medium (secAPP)
anti-CT :	erkennt Carboxy-terminale Fragmente, die nach - und -Sekretase-aktivität (CT; nicht-amyloidogenes Fragment ohne vollständige A-Sequenz) und nach -Sekretaseaktivität (A4CT; amyloidogenes Fragment mit vollständiger A-Sequenz) entstehen.

Ein repräsentatives Ergebnis der APP-Analyse ist in Abb. 17 dargestellt. In allen analysierten Zellen sind Amyloid-Vorläuferproteine im Molmassenbereich 95 bis 130 kDa nachweisbar (siehe Abb. 17B-1). Im Vergleich zu Neuronen-spezifischem APP sind in Astrozyten durch den Antikörper 22C11 Amyloid-Vorläuferproteine als Banden mit einer höheren Molmasse nachweisbar : Hauptbestandteil der Amyloid-Vorläufer-proteine in Astrozyten sind Formen mit einer Molmasse von ca. 103 und 130 kDa. In neuronalen Zellen sind Amyloid-Vorläuferformen

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Das amyloidogene Fragment A4CT war ausschließlich in primären Neuronen sowie im Lysat des Rattenhirns in signifikanten Mengen nachweisbar (siehe Abb.17B-1). Im Lysat primärer Astrozyten und humaner Astrozyten-Zellinien konnte kein A4CT nachgewiesen werden. Nicht-amyloidogene C-terminale Fragmente waren in allen Zellen zu sehen, allerdings traten besonders bei astrozytären Zellinien (CCF-STTG1, H4) zahlreiche C-terminale Fragmente auf. Die heterogene Vielfalt C-terminaler Fragmente astrozytärer Zellen konnte auch mit einem weiteren polyklonalem Antikörper (anti-APP/CT, Serotec) nachgewiesen werden (ohne Abb.).

Das zelltypspezifische APP-Expressionsmuster astrozytärer und neuronaler Zellen spiegelte sich auch in der Sekretion von APP in den Medienüberstand wider (siehe Abb. 17B-2). Es war deutlich zu erkennen, daß Zellen astrozytären Ursprungs verstärkt APP-Isoformen mit hoher Molmasse sekretieren (APP751), während primäre Neurone vorwiegend APP mit niedrigerer Molmasse ausschleusen (APP695). In konditionierten Medienüberständen primärer Astrozyten war kaum APP nachweisbar. In einem weiteren Experiment wurde mit Hilfe einer metabolischen Markierung der Zellen mit [³⁵S]-Methionin untersucht (siehe 3.3.7.), ob im konditionierten Medienüberstand primärer Neurone und primärer Astrozyten das A-Protein mit dem polyklonalen Antikörper anti-A(2-43) nachweisbar ist. Es konnte jedoch weder im Medium der Neurone noch im Medium der Astrozyten A-Protein nachgewiesen werden (ohne Abb.).

Durch die vergleichende Analyse der astrozytären und neuronalen APP-Prozessierung konnte gezeigt werden, daß hauptsächlich Neurone signifikante Mengen des amyloidogenen Fragmentes A4CT bilden. Hingegen wiesen Astrozyten eine größere Heterogenität in der APP-Prozessierung zu nicht-amyloidogenen C-terminalen Fragmenten auf.

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Abb. 17 : Nachweis proteolytischer APP-Fragmente von Astrozyten und Neuronen
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. (1) Western-Blot gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit Aceton gefällten Lysate von Rattenhirn, primären Astrozyten (Astrozyten), primären Neuronen (Neurone) und humanen astrozytären Zellinien (CCF-STTG1-, H4-, H4/APP695sw-, H4/APP751sw-Zellen). Es wurden APP-Isoformen und proteolytische Fragmente der APP-Prozessierung nachgewiesen. C-terminale, nicht-amyloidogene Fragmente (CT) wurden mit polyspezifischem anti-CT, posttranslational modifizierte (APP*) und nichtposttranslational modifizierte (APP) APP-Isoformen mit MAk 22C11 nachgewiesen. (2) Sekretorisches APP (secAPP) wurde in immunpräzipitierten, konditionierten Medienüber-ständen nach gelelektrophoretischer Auftrennung im Western-Blot mit MAK 22C11 nachgewiesen. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard angegeben.

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4.2.3. Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen A-Protein

Um die A-Sekretion von Astrozyten untersuchen zu können, wurden monoklonale Antikörper gegen A-Protein auf ihre Fähigkeit überprüft, A(1-40) oder A(1-42) aus Medienüberständen zu präzipitieren. Für diese Analyse wurden stabil transfizierte Sy5y/APP751sw-Zellen (sw, schwedische Mutation) eingesetzt, die A-Protein in hohen Mengen in den Medienüberstand sekretieren (siehe auch 4.2.5.). Für die A-Analyse war eine metabolische Markierung der Zellen mit [³⁵S]-Methionin notwendig (siehe 3.3.7.). Die monoklonalen Antikörper anti-A(1-6), anti-A(1-40) und anti-A(1-42) wurden jeweils über anti-Maus-IgG an Protein A-Sepharose gekoppelt (siehe 3.4.7.) und für die Immunpräzipitation der Medienüberstände eingesetzt (siehe 3.4.5.). Nach elektrophoretischer Auftrennung der hitzedenaturierten Immunpräzipitate in einem 12 %igem Tris-/Bicin-/Harnstoff-Gel (siehe 3.4.11.) wurden die Proteine im Gel fixiert, das Gel getrocknet und anschließend auf einem Phosphorscreen exponiert. Die autoradiographische Analyse erfolgte mit Hilfe des Phosphorimagers (siehe 3.4.13.). Als Kontrolle für die elektrophoretische Mobilität der Peptide A(1-40) und A(1-42) wurden jeweils 0,5 µg A-Peptid (Fa. Bachem) eingesetzt und nach elektrophoretischer Auftrennung mit Coomassie Blue angefärbt (siehe 3.4.12.).

Die Autoradiographie ist in Abb. 18 dargestellt. Der monoklonale Antikörper anti-A(1-6), der gegen den N-Terminus von A gerichtet ist, präzipitierte sowohl A(1-40) als auch A(1-42). Die monoklonalen Antikörper anti-A(1-40) und anti-A(1-42) sind beide gegen den C-Terminus des A gerichtet. Anti-A(1-40) präzipitierte spezifisch A(1-40) mit einer Molmasse von 6,5 kDa, während anti-A(1-42) spezifisch A(1-42) mit einer Molmasse von 5,5 kDa erkannte. Aus vergleichbaren Untersuchungen von Immunpräzipitaten, die im Gradientengel (6,5 bis 16,5 Tris/Tricin) oder in NuPAGE-Gelen (4-12 % Tris/Bicin) elektrophoretisch aufgetrennt wurden, ging hervor, daß der Antikörper anti-A(1-6) sowohl A als auch sekretorisches APP nach -Sekretase-aktivität präzipitiert, und die monoklonalen Antikörper anti-A(1-40) und anti-A(1-42) neben A auch das nicht-amyloidogene Fragment p3 präzipitieren (ohne Abb.).

Abb. 18 : Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen A-Protein
Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit den o.g. monoklonalen Antikörpern immunpräzipitierten, ³⁵S-markierten A aus konditionierten Medienüberständen von Sy5y/APP751sw-Zellen. A-Peptide (1-40) und (1-42) wurden über Coomassie Blue-Färbung detektiert. Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in einem 12 %igen Tris-/Bicin-/Harnstoff-Gel. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker).

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4.2.4. Nachweis der -Sekretaseaktivität in transfizierten Astrozyten

Um die amyloidogene APP-Prozessierung in Astrozyten besser verfolgen und damit auch das amyloidogene Zwischenprodukt A4CT nachweisen zu können, das nach -Sekretaseaktivität entsteht, wurden Astrozyten mit verschiedenen APP-cDNA transfiziert. Da bekannt ist, daß die schwedische Mutation, die N-terminal der -Sekretaseschnittstelle lokalisiert ist (Aminosäureaustausch KM NL), zu einer verstärkten -Sekretaseaktivität führt (siehe auch Einleitung, Kap. 1.2.), wurden die Zellen sowohl mit APP-cDNA als auch mit APPsw-cDNA (sw, schwedische Mutation) transfiziert.

CCF-STTG1- und H4-Zellen wurden, wie in 3.3.9. beschrieben, mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695, pCEP4/APP751, pCEP4/APP695sw und pCEP4/APP751sw (siehe Material, Kap. 2.10.) transient transfiziert. Zum Vergleich wurden humane Neuroblastom-Zellen (Sy5y) und stabil transfizierte Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen herangezogen. Die Analyse der APP-Prozessierung erfolgte nach metabolischer Markierung für 6 h mit 200 µCi [³⁵S]-Methionin (siehe 3.3.7.). Danach wurden APP-Fragmente (A4CT, CT) mit polyklonalem anti-A4CT aus den Zellysaten immunpräzipitiert und nach elektrophoretischer Auftrennung im Gradientengel (6,5 - 16,5 % Tris/Tricin) in einer Autoradiographie nachgewiesen. Sekretorisches APP aus dem Medienüberstand wurde durch Immunpräzipitation mit polyklonalem anti-FdAPP vergleichbar zu den Lysatimmunpräzipitaten aufgearbeitet. Auf diese Weise konnten ”de novo“-synthetisiertes APP und APP-Fragmente im Zellysat und konditioniertem Medium identifiziert werden.

Anhand des Nachweises der APP-Isoformen im Zellysat und konditioniertem Medium konnte die Expression der transfizierten APP-cDNA in allen Zellen nachgewiesen werden (siehe Abb. 19B-1, -2). Astrozytäre Zellen, die mit APP695- oder APP751-cDNA transfiziert waren, zeigten deutlich eine verstärkte Akkumulation C-terminaler Fragmente (CT, siehe Abb. 19B-1). Die Transfektion der Zellen mit APPsw-cDNA, die die schwedische Mutation enthielt (APP695sw, APP751sw), führte sowohl in Neuronen als auch in Astrozyten zur Bildung von A4CT. A4CT ist ein Zwischenprodukt der amyloidogenen APP-Prozessierung und entsteht nach proteolytischer Aktivität der -Sekretase (siehe Abb. 20A). Dieses Ergebnis konnte in drei weiteren Experimenten sowie mit transfizierten primären Astrozyten verifiziert werden (ohne Abb.).

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Abb. 19 : APP-Prozessierung transfizierter Astrozyten und Neurone
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. Autoradiographie astrozytärer Zellen (CCF-STTG1, H4) und Neuroblastom-Zellen (Sy5y), die mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695 (APP695), pCEP4/APP695sw (APP695sw), pCEP4/APP751 (APP751) oder pCEP4/APP751sw (APP751sw) transfiziert wurden. Die [³⁵S]-Methionin markierten, anti-A4CT-immunpräzipitierten Zellysate (1) wurden im Gradientengel elektrophoretisch aufgetrennt, die anti-FdAPP-präzipitierten Medienüberstände (2) im 7,5 %igen Laemmli-Gel. Es wurde die gesamte Proteinmenge auf das Gel aufgetragen.

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4.2.5. Nachweis der -Sekretaseaktivität in transfizierten Astrozyten

Nachdem gezeigt werden konnte, daß neben den Neuronen auch Astrozyten über eine -Sekretaseaktivität verfügen (siehe 4.2.4.), sollte nun untersucht werden, inwiefern Astrozyten eine -Sekretaseaktivität aufweisen. Nur durch Aktivität der -Sekretase kann letztendlich lösliches A-Protein entstehen (siehe Abb. 20A), das dann von den Zellen in den Medienüberstand sekretiert werden kann. Im Hinblick auf den C-Terminus des A wurden unterschiedlich lange A-Proteine publiziert ( Zhong et al., 1994 ; Citron et al., 1996 ), die als A(1-40) und A(1-42) bezeichnet werden. Die Aktivität der -Sekretase kann auch anhand des Fragmentes p3 nachgewiesen werden, das nach proteolytischer Aktivität der -Sekretase und -Sekretase bei der nicht-amyloidogenen APP-Prozessierung entsteht (siehe Abb. 21A). Zum Nachweis von A(1-40), A(1-42) und p3 wurden die Medienüberstände der in Kap. 4.2.4. beschriebenen transfizierten Zellen (CCF-STTG1-, H4- und Sy5y-Zellen) mit den monoklonalen Antikörpern anti-A(1-40) und anti-A(1-42) immunpräzipitiert. Hierfür wurden die monoklonalen Antikörper zuvor über anti-Maus-IgG an Protein A-Sepharose gekoppelt. Nach elektrophoretischer Auftrennung der gesamten Proteinmenge der Immunpräzipitate erfolgte die Analyse der APP-Fragmente mittels Autoradiographie.

Wie aus Abb. 20B-1 ersichtlich ist, sind sowohl transfizierte als auch nicht-transfizierte astrozytäre Zellen in der Lage, signifikante Mengen A(1-40) zu bilden. Hingegen konnte in konditioniertem Medium von Wildtyp-Neuroblastom-Zellen (Sy5y) kein A(1-40) nachgewiesen werden.

Die Expression von APP695- oder APP751-cDNA führte in CCF-STTG1- und H4-Zellen zu einer verstärkten Sekretion des p3-Fragmentes. Alle Zellen, die mit APP695sw- bzw. APP751sw-cDNA transfiziert waren, zeigten eine verstärkte Sekretion des A(1-40), während die Sekretion des nicht-amyloidogenen Fragmentes p3 leicht abnahm.

Die Analyse der A(1-42)-Sekretion zeigte (siehe Abb. 20B-2), daß geringe Mengen A(1-42) ausschließlich in konditionierten Medienüberständen von H4- und Sy5y-Zellen nachweisbar waren, die die APP-cDNA mit der schwedischen Mutation exprimierten (APP695sw, APP751sw). Das nicht amyloidogene Fragment p3 konnte mit anti-A(1-42) hier nicht gezeigt werden. Diese Befunde konnten in drei weiteren Experimenten reproduziert werden.

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Abb. 20 : A-Sekretion transfizierter Astrozyten und Neuronen
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. Autoradiographie von metabolisch mit [³⁵S]-Methionin markierten, mit (1) anti-A(1-40) und (2) anti-A(1-42) immunpräzipitierten Medienüberständen astrozytärer Zellen (CCF-STTG1, H4) und Neuroblastom-Zellen (Sy5y), die mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695 (APP695), pCEP4/APP695sw (APP695sw), pCEP4/APP751 (APP751) oder pCEP4/APP751sw (APP751sw) transfiziert wurden. Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin).

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Abb. 21 : Verhältnis [A(1-40):p3] transfizierter Astrozyten und Neuronen
Das Diagramm zeigt das Verhältnis [A(1-40):p3], das nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie (Abb. 20B-1) mit densitometrischen Meßeinheiten, die mit den Meßwerten der radioaktiven Einbaurate normalisiert wurden, berechnet wurde. CCF-STTG1-, H4- und Sy5y-Zellen wurden mit den o.g. APP-cDNA transiziert.

Im Vergleich zu APP-cDNA-exprimierenden Zellen führte die Expression der APPsw-cDNA, die in ihrer Sequenz die schwedische Mutation enthält (APP695sw, APP751sw) zu einem erhöhten Verhältnis [A(1-40):p3]. Desweiteren war auffällig, daß sich das Verhältnis [A(1-40):p3] astrozytärer Zellen in Abhängigkeit von der überexprimierten APP-Isoform veränderte. Astrozyten, die mit der APP695sw-cDNA transfiziert waren, sekretierten bedeutend mehr A(1-40) als Zellen, die mit APP751sw-cDNA transfiziert waren.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß astrozytäre und neuronale Zellen gleichermaßen in der Lage sind, die amyloidogene APP-Prozessierung durchzuführen. Der Nachweis des amyloidogenen Fragmentes A und des nicht-amyloidogenen Fragmentes p3 im konditionierten Medium transfizierter Astrozyten ließ auf das Vorhandensein einer -Sekretaseaktivität in Astrozyten schließen. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß neben den Neuronen auch Astrozyten durch Sekretion von A-Protein direkt zu den amyloidogenen Ablagerungen, dem neuropathologischen Merkmal der Alzheimer-Krankheit, beitragen können.

4.2.6. APP-Prozessierung stabil transfizierter H4-Zellen

Um die astrozytäre amyloidogene APP-Prozessierung besser verfolgen zu können, wurden H4-Zellen stabil mit APP695- und APP695sw-cDNA transfiziert (siehe 3.3.9.) und die proteolytischen Fragmente der APP-Prozessierung, wie in 4.2.4. und 4.2.5. beschrieben, nachgewiesen. Die Zellen wurden mit jeweils 150 µCi [³⁵S]-Methionin metabolisch markiert und

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anti-A4CT :	erkennt APP und C-terminale Fragmente im Zellysat
anti-FdAPP :	erkennt sekretorisches APP im konditionierten Medium
anti-A(1-40) :	erkennt spezifisch A(1-40) und p3 im konditionierten Medium
anti-A(1-42) :	erkennt spezifisch A(1-42) und p3 im konditionierten Medium

Die in Abb. 22 dargestellte Autoradiographie der elektrophoretisch aufgetrennten Immunpräzipitate korrelierte mit den Befunden aus Kap. 4.2.4 und 4.2.5., in denen die Analyse transient transfizierter H4-Zellen beschrieben ist. In H4-Zellen, die stabil mit APP695- und APP695sw-cDNA transfiziert waren, konnten deutlich die C-terminalen Fragmente A4CT und CT nachgewiesen werden (siehe Abb. 22A). Die Sekretion von APP (secAPP) war in beiden Transfektanten vergleichbar (siehe Abb. 22B-1), allerdings zeigten sich deutliche Unterschiede in der A-und p3-Sekretion (siehe Abb. 22B-2). H4/APP695-Zellen sekretierten große Mengen an p3 und A(1-40), dagegen sekret-ierten H4/APP695sw-Zellen vorwiegend A(1-40). Dieses Sekretionsverhalten spiegelte sich auch in der Sekretion von A(1-42) bzw. p3 wider (siehe Abb. 22B-3).

Abb. 22 : APP-Prozessierung stabil transfizierter H4-Zellen
Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, immunpräzipitierter, [³⁵S]-markierten APP-Fragmenten aus Zellysaten (A) und konditionierten Medien (B) von H4-Zellen: nichttransfizierte H4-Zellen (Wildtyp), transfizierte H4/pCEP4-APP695- (APP695) und H4/pCEP4-APP695sw-Zellen (APP695sw). Das Zellysat wurde mit anti-A4CT (A), das konditionierte Medium mit anti-FdAPP (1), anti-A(1-40) (2) und anti-A(1-42) (3) immunpräzipitiert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in NuPage-Gelen. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker).

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4.2.7. Untersuchung der APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten

Ausgehend von der Überlegung, daß aktivierte Astrozyten eine veränderte amyloidogene APP-Prozessierung aufweisen könnten, wurden die mit APP695sw-cDNA stabil transfizierten H4-Zellen mit verschiedenen Mitogenen behandelt, die mit den amyloidogenen Ablagerungen assoziiert sind. Die Zellen wurden in Gegenwart von 100 U IL1/ml, 20 bzw. 50 ng TNF/ml, 100 U IFN/ml, 20 oder 50 ng TNF/ml mit 100 U IFN/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGF/ml metabolisch mit jeweils 100 µCi [³⁵S]-Methionin für 4 h markiert (siehe 3.3.10). Nach Lyse der Zellen wurden Zellysat und konditioniertes Medium für die Immunpräzipitation mit folgenden Antikörpern eingesetzt :

anti-A4CT, anti-A(1-40), anti-A(1-42) : siehe S. 77, Kap. 4.2.6.

anti-A(1-6) : erkennt sekretorisches APP nach -Sekretaseaktivität (secAPP) und A im konditioniertem Medium

Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin).

Die Abb. 23 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer autoradiographische Analyse der proteolytischen APP-Fragmente im Zellysat Mitogen-behandelter Zellen. Die Behandlung der Zellen mit Mitogenen führte zu einer geringfügigen Beeinflussung der APP-Expression und Prozessierung zu nicht-amyloidogenen C-terminalen Fragmenten (CT) und amyloidogenem A4CT (Abb. 23A). Die stärksten Effekte waren in Zellen sichtbar, die mit IL1, TNF oder TNF mit IFN behandelt wurden. Unter Einfluß dieser Zytokine akkumulierten nicht-amyloidogene C-terminale Fragmente in den Zellen. Um diese Beobachtung zu verdeutlichen, wurde das Verhältnis von CT zu A4CT nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie mit der Software ImageQuant berechnet und in Abb. 23B graphisch dargestellt. Die Behandlung der Zellen mit den Zytokinen IL1, TNF und TNF mit IFN führte zu einem erhöhtem Verhältnis von CT zu A4CT und spiegelt damit die verstärkte -Sekretaseaktivität bei der nicht-amyloidogenen APP-Prozessierung wider. Diese Befunde waren in zwei weiteren Experimenten reproduzierbar.

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Abb. 23 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen - Analyse der Zellysate
A. H4/APP695sw-Zellen wurden mit 100 U IL1/ml, 20 bzw. 50 ng TNF/ml (TNF/20 bzw. TNF/50), 100 U IFN/ml, 20 oder 50 ng TNF/ml mit 100 U IFN/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF /ml oder 2 ng TGF/ml für 4 h während einer metabolischen Markierung mit [³⁵S]-Methionin behandelt. Die gesamte Proteinmenge der mit anti-A4CT präzipitierten Lysatüberstände wurde im NuPage-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographisch analysiert. B. Das Diagramm zeigt das Verhältnis [CT:A4CT], das nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie mit der Software ImageQuant berechnet wurde. Die auf gleiche radioaktive Einbaurate (siehe 3.3.7.) korrigierten densitometrischen Meßwerte der Kontrollzellen wurden gleich 1,0 gesetzt. Werte > 1,0 = Zellen zeigen verringerte -Sekretaseaktivität, Werte < 1,0 = Zellen zeigen verstärkte -Sekretaseaktivität.

A.
B.

Die autoradiographische Analyse der proteolytischen APP-Fragmente im konditioniertem Medium Mitogen-behandelter Zellen ist in Abb. 24 dargestellt. Das oben beschriebene

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Um die aus den Autoradiographien hervorgehenden Beobachtungen deutlicher darzustellen, wurden diese einer densitometrischen Analyse mit der Software ImageQuant unterzogen. Es wurden die Verhältnisse

[secAPP-alpha:A]:	sekretorisches APP nach -Sekretaseaktivität (nicht-amyloidogener APP-Prozessierungsweg) zu A (amyloidogener APP-Prozessierungsweg)
[A:p3] :	A(1-40) (amyloidogener APP-Prozessierungsweg) zu p3 (nicht-amyloidogener APP-Prozessierungsweg)

und die gemessenen densitometrischen Einheiten an sekretiertem A(1-42) berechnet und graphisch in Abb. 25 dargestellt.

Das Verhältnis [secAPPalpha:A] veränderte sich signifikant nach Behandlung der Zellen mit Zytokinen (Abb. 26-1). Besonders deutlich veränderte sich im Vergleich zur Kontrolle ([secAPPalpha:A] = 1,0) das Verhältnis [secAPPalpha:A] um den Faktor 3,2 nach Behandlung der Zellen mit 50 ng TNF/ml mit 100 U IFN/ml. Das Verhältnis [p3:A(1-40)] nahm um den Faktor 1,9 zu, wenn die Zellen mit 50 ng TNF/ml in Kombination mit 100 U IFN/ml behandelt wurden (Abb. 25-2). Dieser Effekt war von der TNF-Konzentration abhängig.

Zusammenfassend zeigen die hier dargestellten Ergebnisse, daß Astrozyten, die durch die Zytokine IL1, TNF und TNF mit IFN aktiviert wurden, verstärkt den nicht-amyloidogenen APP-Prozessierungsweg durchführen, der durch Akkumulation nicht-amyloidogener Fragmente (CT), verstärkte Sekretion des APP nach -Sekretaseaktivität und verstärkte Sekretion des nicht-amyloidogenen p3-Fragmentes bei gleichzeitig verringerten A-Sekretion gekennzeichnet ist.

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Abb. 24 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen - Analyse der konditionierten Medienüberstände
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege B. Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit den Antikörpern anti-A(1-6) (1), anti-A(1-40) (2) und anti-A(1-42) (3) immunpräzipitierter ³⁵S-markierter APP-Fragmente aus konditionierten Medien Mitogen-behandelter H4/APP695sw-Zellen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin). Sekretorisches APP nach -Sekretase-aktivität (secAPP).

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Abb. 25 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen
Die Diagramme zeigen das Verhältnis [secAPP:A] (1), [p3:A(1-40)] (2) und die gemessenen, densitometrischen Einheiten der A(1-42)-Sekretion (3), die nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographien (Abb. 24) berechnet wurden. Die auf gleiche radioaktive Einbaurate korrigierten Werte der Kontrollzellen wurden gleich 1,0 gesetzt (1, 2). Werte > 1,0 = nicht-amyloidogene APP-Prozessierung, Werte < 1,0 = amyloidogene APP-Prozessierung.

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(2)
(3)

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