Kernekewisch, Michaela: Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 und zur Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Untersuchungen zur Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1 in Astrozyten

4.1.1. Übersicht und Fragestellung

Charakteristische neuropathologische Merkmale der Alzheimer-Krankheit sind senile Plaques, die von aktivierten Astrozyten und Mikroglia umgeben sind. Astrozyten sind in der Lage, im aktivierten Zustand zahlreiche Zytokine und Wachstumsfaktoren zu sekretieren, die zu einer Verstärkung inflammatorischer Prozesse führen können. Neben diesen bereits gut untersuchten sekretorischen Faktoren produzieren Astrozyten im aktivierten Zustand noch zahlreiche Immunrezeptoren, dessen Expressionsverhalten in Astrozyten im Hinblick auf die Alzheimer-Krankheit noch wenig charakterisiert ist. Von besonderer Bedeutung für die Alzheimer-Pathogenese ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1, da es mit amyloidogenen Ablagerungen im Hirn von Alzheimer-Patienten assoziiert vorliegt ( Akiyama et al., 1993 ; Eikelenboom et al., 1994 ; Verbeek et al., 1994 ). ICAM-1 gehört zur Immunglobulin-Superfamilie der Adhäsionsrezeptoren, deren Liganden die beta2-Integrine LFA-1 (leukocyte function-associated antigen) und MAC-1 (macrophage antigen) sind. Welche Rolle ICAM-1 in der Alzheimer-Pathogenese spielt, ist bisher noch nicht untersucht worden. Um einen ersten Hinweis auf eine mögliche pathophysiologische Rolle des ICAM-1 in der Alzheimer-assoziierten Neuroinflammation zu erhalten, wurde die astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Mitogene untersucht, die für die Alzheimer-Pathogenese von Bedeutung sind (siehe Einleitung, Kap. 1.4.).

4.1.2. ICAM-1 als Marker für die astrozytäre Aktivität

Wie einige Veröffentlichungen belegen, wird ICAM-1 auch unter Zellkulturbedingungen von Astrozyten exprimiert ( Frohman et al., 1989 ; Kuppner et al., 1990 ). Mit Hilfe von primär kultivierten Astrozyten konnte bereits gezeigt werden, daß Lipopolysaccharide sowie die Zytokine TNFalpha und IL1beta die ICAM-1-Expression verstärken ( Ballestas & Benveniste, 1995 ). Die in diesem Kapitel beschriebenen Experimente sollten prüfen, ob die ICAM-1-Expression in der astrozytären Zellinie CCF-STTG1 durch die Zytokine IL1beta oder TNFalpha, die mit amyloidogenen Ablagerungen assoziiert sind, beeinflußbar ist, und inwieweit diese Zellen für die Untersuchung der astrozytären Aktivität geeignet sind.

Für die immunzytochemische Untersuchung der ICAM-1-Expression wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) auf Poly-L-Lysin-beschichteten Glasplättchen kultiviert. Die Zellen wurden bei einer 50 %igen Konfluenz mit 100 U IL1beta/ml oder 50 ng TNFalpha/ml für 18 h behandelt (siehe 3.3.10.). Anschließend wurde eine immunzytochemische Färbung mit dem monoklonalem Antikörper anti-human-ICAM-1 durchgeführt (siehe 3.4.18.). Wie aus Abb. 6 hervorgeht, ist eine starke ICAM-Färbung in Astrozyten zu beobachten, die mit IL1beta und TNFalpha behandelt wurden.

Um die immunzytochemischen Ergebnisse zu verifizieren, wurde die Expression von ICAM-1 mittels Immunpräzipitation nachgewiesen. Zu diesem Zweck wurden CCF-STTG1-Zellen während einer metabolischen Markierung mit jeweils 200 µCi [35S]-Methionin (siehe 3.3.7.) für 6 h mit 100 U IL1beta/ml oder 50 ng TNFalpha/ml in Markierungsmedium behandelt (siehe 3.3.10.). Nachdem die Zellen in der Zellkulturschale lysiert wurden, erfolgte die Immunpräzipitation von ICAM-1 aus dem Zellysat mit anti-Maus-IgG-gekoppelter Protein A-Sepharose (1:40 anti-human-ICAM-1; siehe 3.4.5. und 3.4.7.). Anschließend wurden die hitzedenaturierten, auf gleiche Proteinmenge angeglichenen Immunpräzipitate in einem 10 %igem Tris-/Tricin-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (siehe 3.4.9.). Nach Fixierung und Trocknung des Gels erfolgte die Exposition auf einem Phosphorscreen und die autoradiographische Analyse der Immunpräzipitate (siehe 3.4.13.). Ein repräsentatives Ergebnis der ICAM-1-Analyse ist in Abb. 7 dargestellt. Im Zellysat TNFalpha- und IL1beta-behandelter Astrozyten zeigte sich deutlich eine immun-


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Abb. 6 : Immunzytochemische Detektion von ICAM-1 in Astrozyten, die mit unterschiedlichen Mitogenen für 18 h behandelt wurden (freundlicherweise von G. Bodewitz, Schering AG, zur Verfügung gestellt). A. unbehandelte CCF-STTG1-Zellen, B. CCF-STTG1-Zellen, mit 100 U IL1beta/ml behandelt, C. CCF-STTG1-Zellen mit 50 ng TNFalpha/ml behandelt. Antikörper : MAk anti-human-ICAM-1 (1:1000). Vergrößerung : 400fach.


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reaktive Bande im erwarteten Molmassenbereich (85 bis 180 kDa). Unbehandelte Astrozyten zeigten dagegen nur eine schwache immunreaktive Bande.

Abb. 7 : Immunpräzipitation des ICAM-1
Autoradiographie des gelelektrophoretisch aufgetrenntem, mit anti-human-ICAM-1 immunpräzipitiertem, 35S-markiertem ICAM-1 aus Zellysat unbehandelter (Kontrolle) und Zytokin-behandelter (100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml) humaner Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1). Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker)

Die aus immunzytochemischen und biochemischen Analysen gewonnenen Daten zeigten, daß die Zytokine IL1beta und TNFalpha die ICAM-1-Expression humaner Astrozytom-Zellen verstärken. ICAM-1 stellt somit ein Markerprotein für die astrozytäre Aktivität dar, die mit der Alzheimer-Pathogenese assoziiert ist.

4.1.3. Quantifizierung des ICAM-1 durch einen Zell-basierenden ELISA

Zur Quantifizierung der ICAM-1-Expression wurde ein ELISA im Mikrotiterplatten-Format entwickelt, der auf immunzytochemischen Techniken basiert. Mit Hilfe des ELISA’s kann die Expression von Membran-assoziiertem ICAM-1 in Paraformaldehyd-fixierten Zellen semiquantitativ nachgewiesen werden. Um die Streuung der Einzelwerte zu ermitteln, wurde der Mittelwert (MW) der Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm aus 8facher Bestimmung unbehandelter sowie Zytokin-behandelter Zellen berechnet, die Standardabweichung (SD) und der daraus resultierende Variationskoeffizient (VK in [%]= (SD/MW) x 100) ermittelt (siehe Tab. 4). Humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) wurden in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert, nach einem Mediumwechsel mit 100 U IL1beta/ml oder 20 ng TNFalpha/ml für 18 h behandelt (siehe 3.3.10.) und im ICAM-1-ELISA analysiert (siehe 3.4.16).

Die Ergebnisse des ICAM-1-ELISA’s korrelierten mit den Befunden aus immunzytochemischen und biochemischen Analysen der ICAM-1-Expression (siehe 4.1.2.). Die Zytokine IL1beta und TNFalpha verstärkten die ICAM-1-Expression humaner Astrozytom-Zellen. Der ELISA zeigte eine geringe Standardabweichung und einen niedrigen Variationskoeffizienten unter 10 %.


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Tab. 4 : Ermittlung der Standardabweichung und des Variationskoeffizienten des ICAM-1-ELISA‘s

Behandlung der Zellen mit

MW

SD

VK in [%]

Kontrolle

0,536

0,034

6,3

100 U IL1beta/ml

1,037

0,082

7,9

20 ng TNFalpha/ml

1,188

0,099

8,3

4.1.4. Astrozytäre ICAM-1-Expression in Abhängigkeit unterschiedlicher Zytokin-Konzentrationen

Um die ICAM-1-Expression in Astrozyten näher zu charakterisieren, wurde die Konzentrations-abhängigkeit der Zytokin-Wirkung untersucht. Hierfür wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert, nach 24 h mit 0,75 bis 200 U IL1beta/ml oder mit 10 bis 50 ng TNFalpha/ml in frischem Kultivierungsmedium für 18 h behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert (siehe 4.1.3.). Das Ergebnis dieser Analyse ist in Abb. 8 dargestellt.

Die Behandlung der Astrozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen von IL1beta und TNFalpha über einen Zeitraum von 18 h führte zu einer dosisabhängigen ICAM-1-Stimulation. IL1beta verstärkte bereits ab einer sehr geringen Konzentration von 0,75 U/ml die Expression von ICAM-1 um den Faktor 2,0 bis maximal um den Faktor 3,1 ab 50 U IL1beta/ml (siehe Abb. 8-1). Bei einer geringen Konzentration von 10 ng TNFalpha/ml wurde die ICAM-1-Expression um das 2,3fache verstärkt, während eine konstante stimulierte ICAM-1-Expression um den Faktor 2,9 erst ab einer Konzentration von 40 ng TNFalpha/ml erreicht wurde (siehe Abb. 8-2).


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Abb. 8 : Expression des ICAM-1 in Abhängigkeit von der IL1beta- und TNFalpha-Konzentration
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 0,75; 1,56; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 und 200 U IL1beta/ml (1) bzw. mit 10, 20, 30, 40 und 50 ng TNFalpha/ml (2) für 18 h behandelt und im ICAM-1-ELISA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils drei unabhängigen Experimenten und die daraus resultierende Standardabweichung berechnet.

(1)

(2)

4.1.5. Zeitverlauf der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression

Um den zeitlichen Verlauf der verstärkten ICAM-1-Expression nach Behandlung humaner Astrozytom-Zellen mit Zytokinen zu verfolgen, wurden die Zellen für 2, 4, 8, 14, 18, 24, 48 und 72 h mit 100 U IL1beta/ml oder 50 ng TNFalpha/ml behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert. Die Auswertung der ELISA-Daten ist in der Abb. 9 dargestellt.


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Abb. 9 : Zeitverlauf der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml bzw. 50 ng TNFalpha/ml für 2, 4, 8, 14, 18, 24, 48 und 72 h behandelt und anschließend im ICAM-1-ELISA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils 3 Meßwerten berechnet und der Mittelwert der Zytokin-aktivierten Zellen vom Mittelwert der Kontrollzellen (nicht behandelt) subtrahiert. Diese Daten waren in zwei weiteren Experimenten reproduzierbar.

Eine maximale ICAM-1-Expression war durch die Behandlung der Zellen mit IL1beta nach 18 h erreicht und zeigte ab diesem Zeitpunkt wieder eine langsame Verringerung der Expression. Die Behandlung der Zellen mit TNFalpha führte zu einer ersten maximalen ICAM-1-Expression nach 18 h und zeigte ab diesem Zeitpunkt eine Verringerung der Expression. Nach 24 h war durch die Behandlung mit TNFalpha ein zweiter Anstieg der ICAM-1-Expression zu beobachten, der nach 72 h noch nicht beendet war.

4.1.6. Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß verschiedener Mitogene

Um zu untersuchen, inwieweit neben TNFalpha und IL1beta weitere Mitogene die Fähigkeit besitzen, astrozytäres ICAM-1 zu verstärken, wurden die beiden astrozytären Zellinien CCF-STTG1 und H4 mit verschiedenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren behandelt, die für die Alzheimer-Pathogenese von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden CCF-STTG1- und H4-Zellen bis zur Konfluenz in Mikrotiterplatten kultiviert und nach einem Mediumwechsel mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml, 100 U IFNgamma/ml, IFNgamma mit TNFalpha, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml und 2 ng TGFbeta/ml für 18 h behandelt (siehe 3.3.10.) und anschließend die ICAM-1-Expression im ELISA gemessen (siehe 3.4.16.). Um zu untersuchen, inwieweit die Substanzen einen Einfluß auf die Wachstumsverhalten der Zellen ausüben, wurde nach der Behandlungszeit ein MTS-Test zur


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Bestimmung der Lebendzellzahl durchgeführt (siehe 3.3.8.). Die Meßdaten dieser Analyse sind in Abb.10 und 11 graphisch dargestellt.

Abb. 10 : Einfluß verschiedener Mitogene auf die Expression des ICAM-1 in CCF-STTG1-Zellen
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml, 100 U IFNgamma/ml, 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGFbeta/ml für 18 h behandelt und anschließend im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Es wurde der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten gebildet und die Standardabweichung errechnet.

(1) MTS-Test

<b> </b>

(2) ICAM-1-ELISA


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Abb. 11 : Einfluß verschiedener Mitogene auf die Expression des ICAM-1 in H4-Zellen
H4-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml, 100 U IFNgamma/ml, 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGFbeta/ml für 18 h behandelt und anschließend im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Es wurde der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten gebildet und die Standardabweichung errechnet.

(1) MTS-Test

(2) ICAM-1-ELISA

Das Wachstumsverhalten der Zellen wurde durch Behandlung mit den Zytokinen und Wachstumsfaktoren geringfügig beeinflußt (siehe Abb. 10-1, 11-1). Dagegen wurde die Expression von ICAM-1 zum Teil stark verändert (siehe Abb. 10-2, 11-2). Wiederum zeigten IL1beta und TNFalpha eine starke Stimulation der ICAM-1-Expression um den Faktor 1,9 bzw. 2,5, jedoch war die stärkste Stimulation durch die kombinierte Gabe von TNFalpha und IFNgamma (Faktor 2,8)


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zu beobachten. Alle anderen Mitogene zeigten nur einen geringen Einfluß auf die Expression von ICAM-1. Die Behandlung von H4-Zellen mit den o.g. Zytokinen und Wachstumsfaktoren führte zu einer ähnlichen Stimulation von ICAM-1 (siehe Abb. 11).

4.1.7. Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß von physiologischem Abeta-Protein

Um zu überprüfen, ob die astrozytäre ICAM-1-Expression durch amyloidogene Ablagerungen verursacht oder verstärkt werden kann, wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) mit konditionierten Medien von Neuroblastom-Zellen (Sy5y) behandelt, die in hohen Mengen Abeta-Protein in den Medienüberstand sekretieren. Im Vergleich zu Sy5y-Zellen, die stabil mit pCEP4/APP751 transfiziert sind, kann die stärkste Abeta-Sekretion in Sy5y-Zellen beobachtet werden, die stabil mit pCEP4/APP751sw (sw, schwedische Mutation) transfiziert sind ( Urmoneit, 1996 ). Im konditioniertem Medium von Sy5y-Wildtypzellen ließ sich unter den verwendeten experimentellen Bedingungen kein Abeta nachweisen (siehe Ergebnisse, 4.2.5.).

CCF-STTG1-Zellen wurden in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert und nach einem Mediumwechsel (Kultivierungsmedium für Sy5y-Zellen) mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml und 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml sowie kombiniert mit konditionierten Medien von Sy5y-Wildtypzellen und stabil transfizierten Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen (1:2 verdünnt) behandelt. Nach 19 h wurde das Wachstumsverhalten der Zellen im MTS-Test und die ICAM-1-Expression im ELISA analysiert. Die Meßdaten sind in Abb. 12 dargestellt.

Abb. 12 : Einfluß des Abeta-Proteins auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml oder 50 ng TNFalpha/ml und 100 U IFNgamma/ml in Kombination mit konditionierten Medien von Sy5y-, Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen für 19 h behandelt. Anschließend wurden die Zellen im MTS-Test (1) und ICAM-1-ELISA (2) analysiert. Im Diagramm ist der Mittelwert aus jeweils vier Meßwerten und die daraus resultierende Standardabweichung dargestellt.

(1) MTS-Test

(2) ICAM-1-ELISA

Weder das Wachstumsverhalten (siehe Abb. 12-1) noch die ICAM-1-Expression (siehe Abb. 12-2) der CCF-STTG1-Zellen wurden signifikant durch physiologisches Abeta-Protein aus konditionierten Medienüberständen von Sy5y-, Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen verändert. Auch durch weitere Experimente, in denen die astrozytäre ICAM-1-Expression durch


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aggregiertes Abeta-Protein (Schering AG, Berlin) beeinflußt werden sollte (ohne Abb.), konnte kein direkter Zusammenhang zwischen amyloidogenen Ablagerungen und astrozytärer ICAM-1-Expression beobachtet werden.

4.1.8. Astrozytäre ICAM-1-Expression unter Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia

Wie aus vorangegangenen Experimenten hervorgeht, besitzt Abeta-Protein keinen signifikanten Einfluß auf die astrozytäre ICAM-1-Expression. Amyloidogene Ablagerungen im Hirn von Alzheimer-Patienten weisen neben aktivierten Astrozyten auch eine starke Assoziation mit aktivierten Mikroglia auf. Verschiedene Forschungsgruppen konnten zeigen, daß Mikroglia durch aggregiertes Abeta, nicht jedoch durch monomeres Abeta stark aktiviert werden können ( Meda et al., 1995 ; Lorton, 1997 ). Die durch Abeta-Protein aktivierten Mikroglia sekretieren zahlreiche Zytokine, die die astrozytäre Aktivität beeinflussen könnten. Um zu überprüfen, inwieweit die astrozytäre ICAM-1-Expression eine Folgereaktion der Abeta-induzierten Mikroglia-Aktivität sein könnte, wurden humane Astrozytom-Zellen unter Einfluß konditionierter Medienüberstände Abeta-aktivierter Mikroglia auf ICAM-1-Expression analysiert. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml oder mit konditionierten Medienüberständen unbehandelter bzw. Abeta-aktivierter Mikroglia (1:2) für 18 h behandelt (die Medienüberstände wurden freundlicher-weise von Dr. U. Mönning zur Verfügung gestellt). Mikroglia wurden aus dem Gesamthirn der Ratte (P3) isoliert und für 2 bis 5 Tage in Gegenwart von monomerem Abeta(1-42) bzw. aggregiertem Abeta(1-42) kultiviert. Die konditionierten Medienüberstände wurden gesammelt und bei -20oC gelagert. Die Analyse der ICAM-1-Expression erfolgte im ICAM-1-ELISA.

Wie aus Abb. 13 ersichtlich ist, verstärkten konditionierte Medienüberstände Abeta-aktivierter Mikroglia die ICAM-1-Expression humaner Astrozytom-Zellen. Eine mit den Zytokinen IL1beta oder TNFalpha vergleichbare Stimulation der ICAM-1-Expression wurde durch Behandlung der Astrozyten mit Medienüberständen von Mikroglia erreicht, die mit aggregiertem Abeta(1-42) behandelt wurden. Konditioniertes Medium von Mikroglia, die mit monomerem Abeta-Protein behandelt wurden, verstärkten nur leicht die astrozytäre ICAM-1-Expression. Diese Daten weisen darauf hin, daß die astrozytäre ICAM-1-Expression eine Folgereaktion mikroglialer Aktivierung ist.


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Abb. 13 : Einfluß konditionierter Medienüberstände aktivierter Mikroglia auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 50 ng TNFalpha/ml (TNF) oder mit konditionierten Medienüberständen von Mikroglia (MG-KM) für 18 h behandelt und im ICAM-1-ELISA analysiert. Primäre Mikroglia wurden unbehandelt für 2 Tage kultiviert oder mit monomerem Abeta(1-42) (Aßmono.) bzw. mit aggregiertem Abeta(1-42) (Aßaggreg.) für 2 und 5 Tage kultiviert. Im Diagramm ist der Mittelwert aus jeweils 6 Meßwerten und die daraus resultierende Standardabweichung dargestellt. Diese Daten waren in drei weiteren Experimenten reproduzierbar.

4.1.9. Pharmakologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression

Astrozyten können die Alzheimer-Pathogenese erheblich verstärken, da sie im aktivierten Zustand zahlreiche Amyloidogenese-fördernde Substanzen sekretieren (z.B. alpha-1-Antichymotrypsin, Apolipoprotein, Komplement-Faktoren). Für das veränderte Proteinex-pressionsmuster aktivierter Astrozyten sind Signaltransduktionswege verantwortlich, die durch IL1beta oder TNFalpha innerhalb einer Neuroinflammation ausgelöst werden können. Um den Signaltransduktionsweg der Astrozyten-Aktivierung näher zu charakterisieren, der zur verstärkten ICAM-1-Expression führt, wurden verschiedene pharmakologische Substanzen eingesetzt, die die Aktivität verschiedener Enzyme beeinflussen (siehe Tab. 5).

In einem ersten Experiment wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1), die in Mikrotiterplatten bis zur Konfluenz kultiviert wurden, zunächst mit den Zytokinen IL1beta oder TNFalpha für 18 h stimuliert und anschließend mit den in Tab. 5 aufgeführten Substanzen für weitere 18 h behandelt. Die darauffolgende Messung der ICAM-1- Expression im ICAM-1-ELISA zeigte keine Hemmung der IL1beta- und TNFalpha-Stimulation (ohne Abb.). In dem darauffolgenden Experiment wurde versucht, die astrozytäre ICAM-1-Expression durch Vorbehandlung mit den Signaltransduktionswegen-beeinflussenden Substanzen zu hemmen. Zu diesem Zweck wurden humane Astrozytom-Zellen für 1 h mit den pharmakologischen Substanzen vorbehandelt und anschließend für weitere 18 h mit 100 U IL1beta/ml bzw. 50 ng


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TNFalpha/ml aktiviert. Für die quantitative Auswertung der ICAM-1-Hemmung durch diese Substanzen wurde eine Vitalitätsbestimmung (MTS-Test) durchgeführt (siehe 3.3.8.). Die Analyse der ICAM-1-Expression erfolgte im ICAM-1-ELISA.

Tab. 5 : Übersicht der verwendeten Hemmstoffe und Aktivatoren von Enzymen

Substanz

Wirkung

Konzentration

Protein- kinasen- Hemmstoffe

K-252a

Serin-/Threonin-Kinasen-Hemmstoff :

darr cAMP- und cGMP-abh. PK (Ki=18-20 nM)

darr MLCK (Ki = 17 nM)

darr PKX (Ki = 25 nM)

50 nM

Herbimycin A

Protein-Tyrosin-Kinase-Hemmstoff

100 nM

Bisindolylmaleimid

darr PKC-Hemmstoff (Ki = 10 nM)

10 nM

H-89,Dihydro-chlorid

darr PKA (Ki = 48 nM)

50 nM

KT5823

darr PKG (Ki = 234 nM)

250 nM

KT5926

allgemeiner Kinasen-Hemmstoff :

darr CaM Kinase II (Ki = 4,4 nM)

darr MLCK (Ki = 18 nM)

20 nM

Enzym-

Hemmstoffe

Wortmannin

irreversibler Hemmstoff der PI3-Kinase

(IC50 = 5 nM)

10 nM

Rolipram

darr cAMP-spezifische Phosphodiesterase IV

(IC50 = 1 µM)

1 µM

Enzym-aktivatoren

Forskolin

aktiviert die Adenylatzyklase

10 µM

Die Proteinkinase-Hemmstoffe K-252a und Bisindolylmaleimid sowie der Phosphodiesterase-Hemmstoff Rolipram beeinflußten geringfügig das Wachstumsverhalten der Zellen (ohne Abb.). Im Gegensatz dazu zeigten sich große Unterschiede in der ICAM-1-Expression (siehe Abb. 14-1). Die Vorbehandlung der Zellen mit K-252a, Rolipram und Forskolin führte zu einer deutlichen Verringerung der ICAM-1-Expression nach Behandlung der Zellen mit den Zytokinen IL1beta oder TNFalpha. Die prozentuale Hemmung der Zytokin-verstärkten ICAM-1-Expression wurde nach folgender Formel berechnet :

Für die Berechnung der prozentualen Hemmung der ICAM-1-Expression wurden die Meßwerte des ICAM-1-ELISA’s mit den Meßwerten des MTS-Tests normalisiert.

Abb. 14 : Einfluß von Enzym-Hemmstoffen auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
(1) CCF-STTG1-Zellen wurden für 1 h mit den o.g. pharmakologischen Substanzen inkubiert, für 18 h mit 100 U IL1beta/ml oder 50 ng TNFalpha/ml behandelt und im ICAM-1-ELSIA analysiert. Es wurde der Mittelwert aus jeweils drei unabhängigen Experimenten und die daraus resultierende Standardabweichung ermittelt. (2) Es wurde die prozentuale Hemmung der Zytokin-stimulierten ICAM-1-Expression berechnet. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten.


43

(1)

(2)


44

Wie aus Abb. 14-1 hervorgeht, beeinflussen cAMP-erhöhende Substanzen besonders stark die astrozytäre ICAM-1-Expression. Die stärksten Effekte zeigten Forskolin und Rolipram. Forskolin verhinderte zu 69 %, Rolipram zu 50 % die astrozytäre ICAM-1-Expression nach Behandlung der Zellen mit IL1beta (siehe Abb. 14-2). Die Hemmung der ICAM-1-Expression nach Behandlung der Zellen mit TNFalpha zeigte ähnliche Ergebnisse, wobei die Verringerung der IL1beta-verstärkten ICAM-1-Expression deutlich stärker war. Forskolin bewirkt eine Aktivierung der Adenylatzyklase, die die Synthese von cAMP aus ATP katalysiert, wodurch eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration ausgelöst wird. Rolipram hemmt die Aktivität der cAMP-spezifischen Phosphodi-esterase IV, die cAMP zu inaktivem AMP hydrolysiert und bewirkt damit ebenfalls eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration. Die Substanz K-252a, die durch Hemmung cAMP-abhängiger Proteinkinasen die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöht, verringerte die ICAM-1-Expression um 29 %.

Aus den dargestellten Ergebnissen geht hervor, daß pharmakologische Substanzen, die die intrazelluläre cAMP-Konzentration erhöhen, die astrozytäre ICAM-1-Expression vermindern, nicht aber eine schon bestehende Astrozyten-Aktivität beeinträchtigen.

4.1.10. Physiologische Beeinflussung der astrozytären ICAM-1-Expression

Durch Zellkulturexperimente konnte gezeigt werden, daß die astrozytäre ICAM-1-Expression durch Veränderung der intrazellulären cAMP-Konzentration beeinflußt werden kann. Es ist vorstellbar, daß in vivo die astrozytäre ICAM-1-Expression ebenfalls über die Regulation der cAMP-Konzentration moduliert werden kann. Da von bestimmten Prostaglandin-Rezeptoren bekannt ist, daß sie mit cAMP-assoziierten Signaltransduktionswegen gekoppelt sind ( Coleman et al., 1994 ), kämen Liganden der entsprechenden Prostaglandin-Rezeptoren, die Prostaglandine PGD2 und PGE2, als mögliche physiologische Modulatoren der astrozytären ICAM-1-Expression in Betracht. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden verschiedene Prostaglandine in ihrer Wirkung auf die astrozytäre ICAM-1-Expression untersucht.

Humane Astrozytom-Zellen wurden zunächst mit 1 µM PGE2 und 1 µM PGD2-Analoga für 1 h vorbehandelt und anschließend für 18 h mit 100 U IL1beta/ml oder 50 ng TNFalpha/ml aktiviert. Die Ergebnisse aus der Messung der Zellvitalität (MTS-Test) und ICAM-1-Expression (ICAM-1-ELISA) sind in Abb. 15 graphisch dargestellt.

Prostaglandine beeinflußten geringfügig das Wachstumsverhalten der Zellen (siehe Abb. 15-1), dagegen zeigten diese einen signifikanten Einfluß auf die ICAM-1-Expression (siehe Abb. 15-2). Prostaglandin E2 (PGE2) führte zu einer 68 %igen, PGD2-Analoga zu einer 58 %igen Hemmung der ICAM-1-Expression nach Behandlung der Zellen mit IL1beta (siehe Abb. 15-3). Ebenso wie PGE2 verminderte auch die PGD2-analoge Substanz die TNFalpha-induzierte astrozytäre ICAM-1-Expression. Im Vergleich zu TNFalpha-behandelten Zellen war jedoch die Hemmung der ICAM-1-Expression in IL1beta-aktivierten Zellen deutlich stärker ausgeprägt. In einem vergleichbaren Experiment konnte eine zu PGE2 vergleichbare Hemmung der astrozytären ICAM-1-Expression nach Behandlung mit Zytokinen mit PGE1 beobachtet werden, dagegen zeigte PGF2alpha keinen Effekt (ohne Abb.).


45

Abb. 15 : Einfluß von Prostaglandinen auf die astrozytäre ICAM-1-Expression
CCF-STTG1-Zellen wurden für 1 h mit 1 µM PGE2 und 1 µM PGD2-Analoga in Mikrotiterplatten behandelt und anschließend für 18 h mit 100 U IL1beta/ml bzw. 50 ng TNFalpha/ml stimuliert. Es wurden mit dem MTS-Test die Vitalität der Zellen (1) und mit dem ICAM-1-ELISA die ICAM-1-Expression (2) analysiert. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. (3) Es wurde die prozentuale Hemmung der Zytokin-stimulierten ICAM-1-Expression berechnet (Formel siehe 4.1.9.). Hierfür wurden die Meßdaten des ICAM-1-ELISA’s auf die Meßwerte des MTS-Tests normalisiert.

(1)

(2)

(3)

4.1.11. Astrozytäre Sekretion des Prostaglandin E2

Da in der Literatur beschrieben ist, daß Astrozyten in der Lage sind, Prostaglandine zu synthetisieren ( Fontana et al., 1982 ; DuBois et al., 1986 ), wurde untersucht, inwiefern die Zytokine IL1beta und TNFalpha im Vergleich zu konditionierten Medienüberständen aktivierter Mikroglia die astrozytäre PGE2-Sekretion beeinflussen. Zu diesem Zweck wurden humane Astrozytom-Zellen (CCF-STTG1) mit 50 U IL1beta/ml, 10 ng TNFalpha/ml und konditioniertem Medium Abeta-aktivierter Mikroglia (Mikroglia wurden für 5 Tage mit aggregiertem Abeta behandelt; siehe Kap. 4.1.8.) für 5 Tage behandelt und die konditionierten Medienüberstände im PGE2-ELISA analysiert (siehe 3.4.15.).


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Abb. 16 : PGE2-Sekretion aktivierter Astrozyten
CCF-STTG1-Zellen wurden mit 50 U IL1beta/ml, 10 ng TNFalpha/ml oder mit konditioniertem Medium Abeta-aktivierter Mikroglia (1:2, MG-KM) mit und ohne Cyclooxygenase-Hemmstoff Fluosilit für 5 Tage behandelt. Das konditionierte Medium der Zellen wurde im PGE2-ELISA analysiert. Die angegebenen Werte repräsentieren den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten und wurden anhand des jeweiligen mitgeführten PGE2-Standards (ohne Abb.) berechnet.

Wie in Abb. 16 deutlich zu sehen ist, verstärkten IL1beta und konditioniertes Medium aktivierter Mikroglia die astrozytäre PGE2-Sekretion um das 13fache, TNFalpha um das 3fache. Zur Kontrolle der Spezifität des ELISA’s wurde Fluosilit, ein Hemmstoff der Cyclooxygenase II (COXII), mitgeführt. Die Cyclooxygenase II ist ein Schlüsselenzym der Prostaglandin-Synthese. Die Behandlung der Zellen mit Fluosilit führte zu einer beinahe vollständigen Hemmung der verstärkten PGE2-Sekretion.

Diese Beobachtung läßt natürlich die Frage entstehen, warum die Astrozyten-Aktivität nicht durch die eigene Prostaglandin-Sekretion unterdrückt werden kann. Da eine Hemmung der ICAM-1-Expression nur durch Vorbehandlung mit Prostaglandinen erreicht werden konnte, läßt sich vermuten, daß Prostaglandine nur die Astrozyten-Aktivierung, nicht aber eine schon bestehende Aktivität vermindern können (siehe auch 4.1.9.). In vivo könnten Prostaglandine jedoch eine räumliche Ausbreitung der Astrozyten-Aktivierung verhindern.


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4.2. Untersuchungen zur Expression und Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins APP in Astrozyten

4.2.1. Übersicht und Fragestellung

Der Hauptbestandteil seniler Plaques im Hirn von Alzheimer-Patienten ist das Abeta-Protein, das durch amyloidogene Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) entsteht (siehe Einleitung, 1.3.). Obwohl viele Daten darauf hinweisen, daß Neurone die Hauptproduzenten des Abeta-Proteins (Abeta) sind, ist bis heute noch nicht untersucht worden, inwieweit aktivierte Astrozyten zur Alzheimer-assoziierten Amyloidogenese beitragen. Das Ziel der im folgenden Kapitel beschriebenen Experimente bestand zum einen darin zu untersuchen, inwieweit Astrozyten im Vergleich zu Neuronen in der Lage sind, amyloidogene APP-Fragmente zu bilden, und zum anderen, welchen Einfluß Zytokine und Wachstumsfaktoren auf die amyloidogene APP-Prozessierung astrozytärer Zellen besitzen.

4.2.2. APP-Prozessierung in Astrozyten

Um die astrozytäre APP-Prozessierung zu untersuchen, wurden verschiedene Astrozyten-Zellinien und primäre Astrozyten herangezogen. Als Vergleich dienten primäre neuronale Zellen sowie Hirngewebe der Ratte. Als Kontrolle für die elektrophoretische Mobilität der APP-Isoformen sowie proteolytischer APP-Fragmente wurden stabil transfizierte H4-Zellen eingesetzt, die die APP-cDNA mit der schwedischen Mutation exprimieren (H4/APP695sw, H4/APP751sw; siehe auch 4.2.6.).

Es wurden primäre Astrozyten aus dem Gesamthirn (siehe 3.3.1.) sowie primäre Neurone aus dem Cerebellum der Ratte (siehe 3.3.2.) isoliert. Für die biochemische Untersuchung des Hirngewebes wurde Rattenhirn (P3), wie in 3.4.1. beschrieben, lysiert. Primäre Astrozyten wurden am Tag 14 und primäre Neurone am Tag 8 nach der Isolierung geerntet und lysiert (siehe 3.4.2.). Die Lyse der astrozytären Zellinien CCF-STTG1 und H4 sowie stabil transfizierter H4/APP695sw- und H4/APP751sw-Zellen erfolgte in der Zellkulturschale (siehe 3.4.2.). Die gelösten Proteine aus den Zellysaten wurden mit Aceton gefällt, in 8 M Harnstoff und Probenpuffer hitzedenaturiert (siehe 3.4.4.) und im 10 %igen Tris-/Tricin-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (siehe 3.4.9.). Das konditionierte Medium der Zellen wurde mit einem Antikörper immunpräzipitiert (siehe 3.4.6.), der sekretorisches APP erkennt (anti-FdAPP), und die hitzedenaturierten Immunpräzipitate gelelektrophoretisch aufgetrennt (7,5 % Tris/ Glycin-Gel, siehe 3.4.8.). Anschließend wurden die proteolytischen APP-Fragmente im Western-Blot mit folgenden primären Antikörpern über Chemolumineszenz (siehe 3.4.14.) nachgewiesen:

MAk 22C11 :

erkennt alle postranslational modifizierten und nichtmodifizierten APP-Isoformen (APP, nichtmodifiziert; APP*, posttranslational modifiziert) in Zellysaten sowie sekretorisches APP im konditionierten Medium (secAPP)

anti-CT :

erkennt Carboxy-terminale Fragmente, die nach alpha- und gamma-Sekretase-aktivität (CT; nicht-amyloidogenes Fragment ohne vollständige Abeta-Sequenz) und nach beta-Sekretaseaktivität (A4CT; amyloidogenes Fragment mit vollständiger Abeta-Sequenz) entstehen.

Ein repräsentatives Ergebnis der APP-Analyse ist in Abb. 17 dargestellt. In allen analysierten Zellen sind Amyloid-Vorläuferproteine im Molmassenbereich 95 bis 130 kDa nachweisbar (siehe Abb. 17B-1). Im Vergleich zu Neuronen-spezifischem APP sind in Astrozyten durch den Antikörper 22C11 Amyloid-Vorläuferproteine als Banden mit einer höheren Molmasse nachweisbar : Hauptbestandteil der Amyloid-Vorläufer-proteine in Astrozyten sind Formen mit einer Molmasse von ca. 103 und 130 kDa. In neuronalen Zellen sind Amyloid-Vorläuferformen


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mit einer Molmasse von ca. 95 und 108 kDa nachweisbar. Der Vergleich mit Lysaten stabil transfizierter H4/APP751sw- und H4/APP695sw-Zellen führte zur Identifizierung der zelltypspezifisch-exprimierten APP-Isoformen: Astrozyten exprimierten vorwiegend APP751, Neurone APP695. Die Heterogenität der Amyloid-Vorläuferproteine ist eine Folge posttranslationaler Modifizierungen (siehe Einleitung, S.4) : Die in Astrozyten detektierte Bande mit einer Molmasse von 103 kDa entspricht nichtmodifiziertem APP751, dagegen handelt es sich bei der Bande mit einer Molmasse von 130 kDa um posttranslational modifiziertes APP751 (APP751*). Die in Neuronen detektierte Bande (95 kDa) wurde als nichtmodifiziertes APP695 identifiziert, die Bande mit höherer Molmasse (108 kDa) als posttranslational modifiziertes APP695 (APP695*).

Das amyloidogene Fragment A4CT war ausschließlich in primären Neuronen sowie im Lysat des Rattenhirns in signifikanten Mengen nachweisbar (siehe Abb.17B-1). Im Lysat primärer Astrozyten und humaner Astrozyten-Zellinien konnte kein A4CT nachgewiesen werden. Nicht-amyloidogene C-terminale Fragmente waren in allen Zellen zu sehen, allerdings traten besonders bei astrozytären Zellinien (CCF-STTG1, H4) zahlreiche C-terminale Fragmente auf. Die heterogene Vielfalt C-terminaler Fragmente astrozytärer Zellen konnte auch mit einem weiteren polyklonalem Antikörper (anti-APP/CT, Serotec) nachgewiesen werden (ohne Abb.).

Das zelltypspezifische APP-Expressionsmuster astrozytärer und neuronaler Zellen spiegelte sich auch in der Sekretion von APP in den Medienüberstand wider (siehe Abb. 17B-2). Es war deutlich zu erkennen, daß Zellen astrozytären Ursprungs verstärkt APP-Isoformen mit hoher Molmasse sekretieren (APP751), während primäre Neurone vorwiegend APP mit niedrigerer Molmasse ausschleusen (APP695). In konditionierten Medienüberständen primärer Astrozyten war kaum APP nachweisbar. In einem weiteren Experiment wurde mit Hilfe einer metabolischen Markierung der Zellen mit [35S]-Methionin untersucht (siehe 3.3.7.), ob im konditionierten Medienüberstand primärer Neurone und primärer Astrozyten das Abeta-Protein mit dem polyklonalen Antikörper anti-Abeta(2-43) nachweisbar ist. Es konnte jedoch weder im Medium der Neurone noch im Medium der Astrozyten Abeta-Protein nachgewiesen werden (ohne Abb.).

Durch die vergleichende Analyse der astrozytären und neuronalen APP-Prozessierung konnte gezeigt werden, daß hauptsächlich Neurone signifikante Mengen des amyloidogenen Fragmentes A4CT bilden. Hingegen wiesen Astrozyten eine größere Heterogenität in der APP-Prozessierung zu nicht-amyloidogenen C-terminalen Fragmenten auf.


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Abb. 17 : Nachweis proteolytischer APP-Fragmente von Astrozyten und Neuronen
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. (1) Western-Blot gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit Aceton gefällten Lysate von Rattenhirn, primären Astrozyten (Astrozyten), primären Neuronen (Neurone) und humanen astrozytären Zellinien (CCF-STTG1-, H4-, H4/APP695sw-, H4/APP751sw-Zellen). Es wurden APP-Isoformen und proteolytische Fragmente der APP-Prozessierung nachgewiesen. C-terminale, nicht-amyloidogene Fragmente (CT) wurden mit polyspezifischem anti-CT, posttranslational modifizierte (APP*) und nichtposttranslational modifizierte (APP) APP-Isoformen mit MAk 22C11 nachgewiesen. (2) Sekretorisches APP (secAPP) wurde in immunpräzipitierten, konditionierten Medienüber-ständen nach gelelektrophoretischer Auftrennung im Western-Blot mit MAK 22C11 nachgewiesen. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard angegeben.


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4.2.3. Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Abeta-Protein

Um die Abeta-Sekretion von Astrozyten untersuchen zu können, wurden monoklonale Antikörper gegen Abeta-Protein auf ihre Fähigkeit überprüft, Abeta(1-40) oder Abeta(1-42) aus Medienüberständen zu präzipitieren. Für diese Analyse wurden stabil transfizierte Sy5y/APP751sw-Zellen (sw, schwedische Mutation) eingesetzt, die Abeta-Protein in hohen Mengen in den Medienüberstand sekretieren (siehe auch 4.2.5.). Für die Abeta-Analyse war eine metabolische Markierung der Zellen mit [35S]-Methionin notwendig (siehe 3.3.7.). Die monoklonalen Antikörper anti-Abeta(1-6), anti-Abeta(1-40) und anti-Abeta(1-42) wurden jeweils über anti-Maus-IgG an Protein A-Sepharose gekoppelt (siehe 3.4.7.) und für die Immunpräzipitation der Medienüberstände eingesetzt (siehe 3.4.5.). Nach elektrophoretischer Auftrennung der hitzedenaturierten Immunpräzipitate in einem 12 %igem Tris-/Bicin-/Harnstoff-Gel (siehe 3.4.11.) wurden die Proteine im Gel fixiert, das Gel getrocknet und anschließend auf einem Phosphorscreen exponiert. Die autoradiographische Analyse erfolgte mit Hilfe des Phosphorimagers (siehe 3.4.13.). Als Kontrolle für die elektrophoretische Mobilität der Peptide Abeta(1-40) und Abeta(1-42) wurden jeweils 0,5 µg Abeta-Peptid (Fa. Bachem) eingesetzt und nach elektrophoretischer Auftrennung mit Coomassie Blue angefärbt (siehe 3.4.12.).

Die Autoradiographie ist in Abb. 18 dargestellt. Der monoklonale Antikörper anti-Abeta(1-6), der gegen den N-Terminus von Abeta gerichtet ist, präzipitierte sowohl Abeta(1-40) als auch Abeta(1-42). Die monoklonalen Antikörper anti-Abeta(1-40) und anti-Abeta(1-42) sind beide gegen den C-Terminus des Abeta gerichtet. Anti-Abeta(1-40) präzipitierte spezifisch Abeta(1-40) mit einer Molmasse von 6,5 kDa, während anti-Abeta(1-42) spezifisch Abeta(1-42) mit einer Molmasse von 5,5 kDa erkannte. Aus vergleichbaren Untersuchungen von Immunpräzipitaten, die im Gradientengel (6,5 bis 16,5 Tris/Tricin) oder in NuPAGE-Gelen (4-12 % Tris/Bicin) elektrophoretisch aufgetrennt wurden, ging hervor, daß der Antikörper anti-Abeta(1-6) sowohl Abeta als auch sekretorisches APP nach alpha-Sekretase-aktivität präzipitiert, und die monoklonalen Antikörper anti-Abeta(1-40) und anti-Abeta(1-42) neben Abeta auch das nicht-amyloidogene Fragment p3 präzipitieren (ohne Abb.).

Abb. 18 : Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen Abeta-Protein
Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit den o.g. monoklonalen Antikörpern immunpräzipitierten, 35S-markierten Abeta aus konditionierten Medienüberständen von Sy5y/APP751sw-Zellen. Abeta-Peptide (1-40) und (1-42) wurden über Coomassie Blue-Färbung detektiert. Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in einem 12 %igen Tris-/Bicin-/Harnstoff-Gel. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker).


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4.2.4. Nachweis der beta-Sekretaseaktivität in transfizierten Astrozyten

Um die amyloidogene APP-Prozessierung in Astrozyten besser verfolgen und damit auch das amyloidogene Zwischenprodukt A4CT nachweisen zu können, das nach beta-Sekretaseaktivität entsteht, wurden Astrozyten mit verschiedenen APP-cDNA transfiziert. Da bekannt ist, daß die schwedische Mutation, die N-terminal der beta-Sekretaseschnittstelle lokalisiert ist (Aminosäureaustausch KM rarr NL), zu einer verstärkten beta-Sekretaseaktivität führt (siehe auch Einleitung, Kap. 1.2.), wurden die Zellen sowohl mit APP-cDNA als auch mit APPsw-cDNA (sw, schwedische Mutation) transfiziert.

CCF-STTG1- und H4-Zellen wurden, wie in 3.3.9. beschrieben, mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695, pCEP4/APP751, pCEP4/APP695sw und pCEP4/APP751sw (siehe Material, Kap. 2.10.) transient transfiziert. Zum Vergleich wurden humane Neuroblastom-Zellen (Sy5y) und stabil transfizierte Sy5y/APP751- und Sy5y/APP751sw-Zellen herangezogen. Die Analyse der APP-Prozessierung erfolgte nach metabolischer Markierung für 6 h mit 200 µCi [35S]-Methionin (siehe 3.3.7.). Danach wurden APP-Fragmente (A4CT, CT) mit polyklonalem anti-A4CT aus den Zellysaten immunpräzipitiert und nach elektrophoretischer Auftrennung im Gradientengel (6,5 - 16,5 % Tris/Tricin) in einer Autoradiographie nachgewiesen. Sekretorisches APP aus dem Medienüberstand wurde durch Immunpräzipitation mit polyklonalem anti-FdAPP vergleichbar zu den Lysatimmunpräzipitaten aufgearbeitet. Auf diese Weise konnten ”de novo“-synthetisiertes APP und APP-Fragmente im Zellysat und konditioniertem Medium identifiziert werden.

Anhand des Nachweises der APP-Isoformen im Zellysat und konditioniertem Medium konnte die Expression der transfizierten APP-cDNA in allen Zellen nachgewiesen werden (siehe Abb. 19B-1, -2). Astrozytäre Zellen, die mit APP695- oder APP751-cDNA transfiziert waren, zeigten deutlich eine verstärkte Akkumulation C-terminaler Fragmente (CT, siehe Abb. 19B-1). Die Transfektion der Zellen mit APPsw-cDNA, die die schwedische Mutation enthielt (APP695sw, APP751sw), führte sowohl in Neuronen als auch in Astrozyten zur Bildung von A4CT. A4CT ist ein Zwischenprodukt der amyloidogenen APP-Prozessierung und entsteht nach proteolytischer Aktivität der beta-Sekretase (siehe Abb. 20A). Dieses Ergebnis konnte in drei weiteren Experimenten sowie mit transfizierten primären Astrozyten verifiziert werden (ohne Abb.).


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Abb. 19 : APP-Prozessierung transfizierter Astrozyten und Neurone
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. Autoradiographie astrozytärer Zellen (CCF-STTG1, H4) und Neuroblastom-Zellen (Sy5y), die mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695 (APP695), pCEP4/APP695sw (APP695sw), pCEP4/APP751 (APP751) oder pCEP4/APP751sw (APP751sw) transfiziert wurden. Die [35S]-Methionin markierten, anti-A4CT-immunpräzipitierten Zellysate (1) wurden im Gradientengel elektrophoretisch aufgetrennt, die anti-FdAPP-präzipitierten Medienüberstände (2) im 7,5 %igen Laemmli-Gel. Es wurde die gesamte Proteinmenge auf das Gel aufgetragen.


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4.2.5. Nachweis der gamma-Sekretaseaktivität in transfizierten Astrozyten

Nachdem gezeigt werden konnte, daß neben den Neuronen auch Astrozyten über eine beta-Sekretaseaktivität verfügen (siehe 4.2.4.), sollte nun untersucht werden, inwiefern Astrozyten eine gamma-Sekretaseaktivität aufweisen. Nur durch Aktivität der gamma-Sekretase kann letztendlich lösliches Abeta-Protein entstehen (siehe Abb. 20A), das dann von den Zellen in den Medienüberstand sekretiert werden kann. Im Hinblick auf den C-Terminus des Abeta wurden unterschiedlich lange Abeta-Proteine publiziert ( Zhong et al., 1994 ; Citron et al., 1996 ), die als Abeta(1-40) und Abeta(1-42) bezeichnet werden. Die Aktivität der gamma-Sekretase kann auch anhand des Fragmentes p3 nachgewiesen werden, das nach proteolytischer Aktivität der alpha-Sekretase und gamma-Sekretase bei der nicht-amyloidogenen APP-Prozessierung entsteht (siehe Abb. 21A). Zum Nachweis von Abeta(1-40), Abeta(1-42) und p3 wurden die Medienüberstände der in Kap. 4.2.4. beschriebenen transfizierten Zellen (CCF-STTG1-, H4- und Sy5y-Zellen) mit den monoklonalen Antikörpern anti-Abeta(1-40) und anti-Abeta(1-42) immunpräzipitiert. Hierfür wurden die monoklonalen Antikörper zuvor über anti-Maus-IgG an Protein A-Sepharose gekoppelt. Nach elektrophoretischer Auftrennung der gesamten Proteinmenge der Immunpräzipitate erfolgte die Analyse der APP-Fragmente mittels Autoradiographie.

Wie aus Abb. 20B-1 ersichtlich ist, sind sowohl transfizierte als auch nicht-transfizierte astrozytäre Zellen in der Lage, signifikante Mengen Abeta(1-40) zu bilden. Hingegen konnte in konditioniertem Medium von Wildtyp-Neuroblastom-Zellen (Sy5y) kein Abeta(1-40) nachgewiesen werden.

Die Expression von APP695- oder APP751-cDNA führte in CCF-STTG1- und H4-Zellen zu einer verstärkten Sekretion des p3-Fragmentes. Alle Zellen, die mit APP695sw- bzw. APP751sw-cDNA transfiziert waren, zeigten eine verstärkte Sekretion des Abeta(1-40), während die Sekretion des nicht-amyloidogenen Fragmentes p3 leicht abnahm.

Die Analyse der Abeta(1-42)-Sekretion zeigte (siehe Abb. 20B-2), daß geringe Mengen Abeta(1-42) ausschließlich in konditionierten Medienüberständen von H4- und Sy5y-Zellen nachweisbar waren, die die APP-cDNA mit der schwedischen Mutation exprimierten (APP695sw, APP751sw). Das nicht amyloidogene Fragment p3 konnte mit anti-Abeta(1-42) hier nicht gezeigt werden. Diese Befunde konnten in drei weiteren Experimenten reproduziert werden.


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Abb. 20 : Abeta-Sekretion transfizierter Astrozyten und Neuronen
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege, B. Autoradiographie von metabolisch mit [35S]-Methionin markierten, mit (1) anti-Abeta(1-40) und (2) anti-Abeta(1-42) immunpräzipitierten Medienüberständen astrozytärer Zellen (CCF-STTG1, H4) und Neuroblastom-Zellen (Sy5y), die mit den Konstrukten pCEP4, pCEP4/APP695 (APP695), pCEP4/APP695sw (APP695sw), pCEP4/APP751 (APP751) oder pCEP4/APP751sw (APP751sw) transfiziert wurden. Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin).


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Um zu verdeutlichen, daß sich das Verhältnis Abeta(1-40) zu p3 nach Expression der verschiedenen APP-cDNA unterschiedlich änderte, wurden die Autoradiographien einer densitometrischen Analyse mit der Software ImageQuant unterzogen. Es wurde das Verhältnis Abeta(1-40) zu p3 berechnet und graphisch in Abb. 21 dargestellt.

Abb. 21 : Verhältnis [Abeta(1-40):p3] transfizierter Astrozyten und Neuronen
Das Diagramm zeigt das Verhältnis [Abeta(1-40):p3], das nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie (Abb. 20B-1) mit densitometrischen Meßeinheiten, die mit den Meßwerten der radioaktiven Einbaurate normalisiert wurden, berechnet wurde. CCF-STTG1-, H4- und Sy5y-Zellen wurden mit den o.g. APP-cDNA transiziert.

Im Vergleich zu APP-cDNA-exprimierenden Zellen führte die Expression der APPsw-cDNA, die in ihrer Sequenz die schwedische Mutation enthält (APP695sw, APP751sw) zu einem erhöhten Verhältnis [Abeta(1-40):p3]. Desweiteren war auffällig, daß sich das Verhältnis [Abeta(1-40):p3] astrozytärer Zellen in Abhängigkeit von der überexprimierten APP-Isoform veränderte. Astrozyten, die mit der APP695sw-cDNA transfiziert waren, sekretierten bedeutend mehr Abeta(1-40) als Zellen, die mit APP751sw-cDNA transfiziert waren.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß astrozytäre und neuronale Zellen gleichermaßen in der Lage sind, die amyloidogene APP-Prozessierung durchzuführen. Der Nachweis des amyloidogenen Fragmentes Abeta und des nicht-amyloidogenen Fragmentes p3 im konditionierten Medium transfizierter Astrozyten ließ auf das Vorhandensein einer gamma-Sekretaseaktivität in Astrozyten schließen. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß neben den Neuronen auch Astrozyten durch Sekretion von Abeta-Protein direkt zu den amyloidogenen Ablagerungen, dem neuropathologischen Merkmal der Alzheimer-Krankheit, beitragen können.

4.2.6. APP-Prozessierung stabil transfizierter H4-Zellen

Um die astrozytäre amyloidogene APP-Prozessierung besser verfolgen zu können, wurden H4-Zellen stabil mit APP695- und APP695sw-cDNA transfiziert (siehe 3.3.9.) und die proteolytischen Fragmente der APP-Prozessierung, wie in 4.2.4. und 4.2.5. beschrieben, nachgewiesen. Die Zellen wurden mit jeweils 150 µCi [35S]-Methionin metabolisch markiert und


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anschließend lysiert. APP und dessen proteolytischen Spaltprodukte wurden mit folgenden Antikörpern aus Zellysat und konditioniertem Medium immunpräzipitiert :

anti-A4CT :

erkennt APP und C-terminale Fragmente im Zellysat

anti-FdAPP :

erkennt sekretorisches APP im konditionierten Medium

anti-Abeta(1-40) :

erkennt spezifisch Abeta(1-40) und p3 im konditionierten Medium

anti-Abeta(1-42) :

erkennt spezifisch Abeta(1-42) und p3 im konditionierten Medium

Die in Abb. 22 dargestellte Autoradiographie der elektrophoretisch aufgetrennten Immunpräzipitate korrelierte mit den Befunden aus Kap. 4.2.4 und 4.2.5., in denen die Analyse transient transfizierter H4-Zellen beschrieben ist. In H4-Zellen, die stabil mit APP695- und APP695sw-cDNA transfiziert waren, konnten deutlich die C-terminalen Fragmente A4CT und CT nachgewiesen werden (siehe Abb. 22A). Die Sekretion von APP (secAPP) war in beiden Transfektanten vergleichbar (siehe Abb. 22B-1), allerdings zeigten sich deutliche Unterschiede in der Abeta-und p3-Sekretion (siehe Abb. 22B-2). H4/APP695-Zellen sekretierten große Mengen an p3 und Abeta(1-40), dagegen sekret-ierten H4/APP695sw-Zellen vorwiegend Abeta(1-40). Dieses Sekretionsverhalten spiegelte sich auch in der Sekretion von Abeta(1-42) bzw. p3 wider (siehe Abb. 22B-3).

Abb. 22 : APP-Prozessierung stabil transfizierter H4-Zellen
Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, immunpräzipitierter, [35S]-markierten APP-Fragmenten aus Zellysaten (A) und konditionierten Medien (B) von H4-Zellen: nichttransfizierte H4-Zellen (Wildtyp), transfizierte H4/pCEP4-APP695- (APP695) und H4/pCEP4-APP695sw-Zellen (APP695sw). Das Zellysat wurde mit anti-A4CT (A), das konditionierte Medium mit anti-FdAPP (1), anti-Abeta(1-40) (2) und anti-Abeta(1-42) (3) immunpräzipitiert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in NuPage-Gelen. Am linken Bildrand ist der Molmassenstandard eingezeichnet (Marker).


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4.2.7. Untersuchung der APP-Prozessierung aktivierter Astrozyten

Ausgehend von der Überlegung, daß aktivierte Astrozyten eine veränderte amyloidogene APP-Prozessierung aufweisen könnten, wurden die mit APP695sw-cDNA stabil transfizierten H4-Zellen mit verschiedenen Mitogenen behandelt, die mit den amyloidogenen Ablagerungen assoziiert sind. Die Zellen wurden in Gegenwart von 100 U IL1beta/ml, 20 bzw. 50 ng TNFalpha/ml, 100 U IFNgamma/ml, 20 oder 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF/ml oder 2 ng TGFbeta/ml metabolisch mit jeweils 100 µCi [35S]-Methionin für 4 h markiert (siehe 3.3.10). Nach Lyse der Zellen wurden Zellysat und konditioniertes Medium für die Immunpräzipitation mit folgenden Antikörpern eingesetzt :

anti-A4CT, anti-Abeta(1-40), anti-Abeta(1-42) : siehe S. 77, Kap. 4.2.6.

anti-Abeta(1-6) : erkennt sekretorisches APP nach alpha-Sekretaseaktivität (secAPPalpha) und Abeta im konditioniertem Medium

Die elektrophoretische Auftrennung der Immunpräzipitate erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin).

Die Abb. 23 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer autoradiographische Analyse der proteolytischen APP-Fragmente im Zellysat Mitogen-behandelter Zellen. Die Behandlung der Zellen mit Mitogenen führte zu einer geringfügigen Beeinflussung der APP-Expression und Prozessierung zu nicht-amyloidogenen C-terminalen Fragmenten (CT) und amyloidogenem A4CT (Abb. 23A). Die stärksten Effekte waren in Zellen sichtbar, die mit IL1beta, TNFalpha oder TNFalpha mit IFNgamma behandelt wurden. Unter Einfluß dieser Zytokine akkumulierten nicht-amyloidogene C-terminale Fragmente in den Zellen. Um diese Beobachtung zu verdeutlichen, wurde das Verhältnis von CT zu A4CT nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie mit der Software ImageQuant berechnet und in Abb. 23B graphisch dargestellt. Die Behandlung der Zellen mit den Zytokinen IL1beta, TNFalpha und TNFalpha mit IFNgamma führte zu einem erhöhtem Verhältnis von CT zu A4CT und spiegelt damit die verstärkte alpha-Sekretaseaktivität bei der nicht-amyloidogenen APP-Prozessierung wider. Diese Befunde waren in zwei weiteren Experimenten reproduzierbar.


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Abb. 23 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen - Analyse der Zellysate
A. H4/APP695sw-Zellen wurden mit 100 U IL1beta/ml, 20 bzw. 50 ng TNFalpha/ml (TNFalpha/20 bzw. TNFalpha/50), 100 U IFNgamma/ml, 20 oder 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml, 200 U IL6/ml, 10 ng bFGF /ml oder 2 ng TGFbeta/ml für 4 h während einer metabolischen Markierung mit [35S]-Methionin behandelt. Die gesamte Proteinmenge der mit anti-A4CT präzipitierten Lysatüberstände wurde im NuPage-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographisch analysiert. B. Das Diagramm zeigt das Verhältnis [CT:A4CT], das nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographie mit der Software ImageQuant berechnet wurde. Die auf gleiche radioaktive Einbaurate (siehe 3.3.7.) korrigierten densitometrischen Meßwerte der Kontrollzellen wurden gleich 1,0 gesetzt. Werte > 1,0 = Zellen zeigen verringerte beta-Sekretaseaktivität, Werte < 1,0 = Zellen zeigen verstärkte beta-Sekretaseaktivität.

A.

B.

Die autoradiographische Analyse der proteolytischen APP-Fragmente im konditioniertem Medium Mitogen-behandelter Zellen ist in Abb. 24 dargestellt. Das oben beschriebene


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Ergebnis, das aus der Analyse der Zellysate hervorging, spiegelte sich in den Befunden aus der Analyse der APP-Fragmente (secAPPalpha, Abeta, p3) im konditionierten Medium wider. Die Aktivität der alpha-Sekretase, gemessen an der Menge von alpha-sekretorischem APP, wurde besonders durch die Zytokine IL1beta, TNFalpha und TNFalpha mit IFNgamma verstärkt, während die Abeta-Sekretion unter Einfluß dieser Zytokine sich verringerte (Abb. 24B-1). Verdeutlicht wurde diese Beobachtung durch die Analyse der Abeta(1-40)- und p3-Sekretion (Abb.24B-2): Zellen, die mit den Zytokinen IL1beta, TNFalpha und TNFalpha mit IFNgamma behandelt wurden, sekretierten verstärkt das nicht-amyloidogenen p3-Fragment, während die Abeta(1-40)-Sekretion vermindert wurde. Die Analyse der Abeta(1-42)-Sekretion zeigte, daß TNFalpha mit IFNgamma am stärksten die Abeta(1-42)-Sekretion verminderte (siehe Abb. 24B-3, Abb. 25-3). Diese Befunde konnten in zwei weiteren Experimenten bestätigt werden.

Um die aus den Autoradiographien hervorgehenden Beobachtungen deutlicher darzustellen, wurden diese einer densitometrischen Analyse mit der Software ImageQuant unterzogen. Es wurden die Verhältnisse

[secAPP-alpha:Abeta]:

sekretorisches APP nach alpha-Sekretaseaktivität (nicht-amyloidogener APP-Prozessierungsweg) zu Abeta (amyloidogener APP-Prozessierungsweg)

[Abeta:p3] :

Abeta(1-40) (amyloidogener APP-Prozessierungsweg) zu p3 (nicht-amyloidogener APP-Prozessierungsweg)

und die gemessenen densitometrischen Einheiten an sekretiertem Abeta(1-42) berechnet und graphisch in Abb. 25 dargestellt.

Das Verhältnis [secAPPalpha:Abeta] veränderte sich signifikant nach Behandlung der Zellen mit Zytokinen (Abb. 26-1). Besonders deutlich veränderte sich im Vergleich zur Kontrolle ([secAPPalpha:Abeta] = 1,0) das Verhältnis [secAPPalpha:Abeta] um den Faktor 3,2 nach Behandlung der Zellen mit 50 ng TNFalpha/ml mit 100 U IFNgamma/ml. Das Verhältnis [p3:Abeta(1-40)] nahm um den Faktor 1,9 zu, wenn die Zellen mit 50 ng TNFalpha/ml in Kombination mit 100 U IFNgamma/ml behandelt wurden (Abb. 25-2). Dieser Effekt war von der TNFalpha-Konzentration abhängig.

Zusammenfassend zeigen die hier dargestellten Ergebnisse, daß Astrozyten, die durch die Zytokine IL1beta, TNFalpha und TNFalpha mit IFNgamma aktiviert wurden, verstärkt den nicht-amyloidogenen APP-Prozessierungsweg durchführen, der durch Akkumulation nicht-amyloidogener Fragmente (CT), verstärkte Sekretion des APP nach alpha-Sekretaseaktivität und verstärkte Sekretion des nicht-amyloidogenen p3-Fragmentes bei gleichzeitig verringerten Abeta-Sekretion gekennzeichnet ist.


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Abb. 24 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen - Analyse der konditionierten Medienüberstände
A. Darstellung der APP-Prozessierungswege B. Autoradiographie gelelektrophoretisch aufgetrennter, mit den Antikörpern anti-Abeta(1-6) (1), anti-Abeta(1-40) (2) und anti-Abeta(1-42) (3) immunpräzipitierter 35S-markierter APP-Fragmente aus konditionierten Medien Mitogen-behandelter H4/APP695sw-Zellen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in NuPage-Gelen (4-12 % Tris/Bicin). Sekretorisches APP nach alpha-Sekretase-aktivität (secAPPalpha).


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Abb. 25 : APP-Prozessierung aktivierter H4/APP695sw-Zellen
Die Diagramme zeigen das Verhältnis [secAPPalpha:Abeta] (1), [p3:Abeta(1-40)] (2) und die gemessenen, densitometrischen Einheiten der Abeta(1-42)-Sekretion (3), die nach densitometrischer Auswertung der Autoradiographien (Abb. 24) berechnet wurden. Die auf gleiche radioaktive Einbaurate korrigierten Werte der Kontrollzellen wurden gleich 1,0 gesetzt (1, 2). Werte > 1,0 = nicht-amyloidogene APP-Prozessierung, Werte < 1,0 = amyloidogene APP-Prozessierung.

(1)

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(3)


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Fri Jul 16 11:22:38 1999