Lange, Sven: Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.
Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden:
Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Pädagoge Sven Lange,
geb. am 30.09.1965
in Dresden

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. H. Meyer

Dekanin der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. V. Bonacic-Koutecky

Gutachter:
1. Prof. Dr. A. Herrmann
2. Prof. Dr. R. Lucius
3. Prof. Dr. W. Mohrig

Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.1998


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Zusammenfassung

Lange, Sven: Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membran-wechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets. Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, Institut für Biologie/Biophysik, Dissertation.

Ein wirksames Immunsystem erfordert das Zusammenspiel von zellulären und humoralen Komponenten, die sich in den frühen Lebensphasen der Organismen entwickeln. Die meisten Zellen, die in die Immunantwort involviert sind, leiten sich aus Stammzellen des Knochenmarks ab. Deshalb wurde bei Organismen ohne Endoskelett - den Invertebraten - keinerlei Fähigkeiten zu Immunreaktionen angenommen. Der Evolutionserfolg der Invertebraten zeigt jedoch, daß sie in der Lage sind, sich pathogenen Keimen und Parasiten erfolgreich zu widersetzen. Markant für viele immunologische Prozesse in Invertebraten ist die äußerst starke Erstreaktion (Humphreys und Reinherz, 1994). Die vorgelegten Untersuchung wurde an einer nicht induzierbaren, sondern natürlichen vorkommenden Erstreaktion (lytischen Aktivität) durchgeführt. Die Analyse des lytischen Prozesses schloß neben der Isolierung und Charakterisierung eines Hämolysins (Eiseniapore) aus Eisenia fetida fetida und eines Eiseniapore-regulierenden Faktors (ERF) - einem hier erstmals nachgewiesenen Hämolysin-Regulator bei Invertebraten - die Aufklärung der Eiseniapore-Membran-Wechselwirkung an Lipidmembranen ein. Hierbei bildeten Leakage-messungen an Liposomen mit unterschiedlicher Lipidzusammensetzung einen experimentellen Schwerpunkt. Diese Messungen ermöglichten zum einen die Identifizierung des Lipidrezeptors Sphingomyelin, der die Bindung Eiseniapores an der Targetmembran vermittelt, und zum anderen geben sie einen Hinweis auf eine spezielle Wechselwirkung von Sphingomyelin mit Cholesterol. Die Einteilung tierischer Toxine erfolgt nach Bernheimer (1996) in einer ersten Grobansprache in Sphingomyelin-inhibierbare und in Thiol-aktivierbare Proteine. Eiseniapore ist das erste beschriebene Toxin, daß sich in diese dichotome Ordnung nicht einteilen läßt, da es durch Thiolgruppen aktiviert werden kann und außerdem durch Sphingomyelin inhibierbar ist. Trotz der Fähigkeit der unmittelbaren Erkennung ohne vorherigen Kontakt gelten die Immunantworten der meisten Invertebraten als sogenannte 'langsame Immunreaktionen' (Humphreys und Reinherz, 1994). Mit den in dieser Arbeit vorgestellten Leakagemessungen werden zum ersten Mal sehr schnelle Reaktionen bei Anneliden beschrieben. Die Kinetik des Leakagevorgangs folgt einer Reaktion 2. Ordnung, woraus geschlossen werden kann, daß Eiseniapore an einem Punkt des Leakageprozesses als Dimer agiert. Die Sekundärstruktur Eiseniapores erfährt während


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der Membranbindung keine signifikante Änderung: 37% beta-sheet, 28% alpha-helix, 17% beta-turn und 18% Zufallsknäuel. Somit gehört Eiseniapore zu den wenigen membranaktiven Toxinen mit einem hohen Anteil an beta-sheet Strukturen, einer Gruppe von Proteinen, über die im Gegensatz zu den alpha-helikalen Proteinen nur sehr wenig Informationen vorliegen (van der Goot et al., 1997). Durch Elektronenmikroskopie und Elektrophorese wurde die eigentliche lytische Struktur an der Targetmembran identifiziert. Es ist eine Proteinpore, bestehend aus sechs Eiseniapore-Monomeren, die einen Tunnel in der Membran bilden, der anderen Porenformern (Komplement) gleicht. Da lytische Proteine für viele Organismen beschrieben werden konnten, wurde für die Klassifikation der gewonnenen Details untersucht, ob die membrandestabilisierenden Vorgänge jeweils analog oder homolog zu denen anderer lytischer Proteine sind. Für die lytische Aktivität in E. fetida ssp. wurde bisher eine Analogie (funktionsgleiche Struktur) zu lytischen Proteinen des Komplementsystems verneint (Roch et al., 1995). Die vorgelegten Ergebnisse zeigen jedoch, daß es für die Annahme einer Analogie von Eiseniapore mit dem lytischen Komplex des Komplements zahlreiche Anhaltspunkte gibt. Ein Indiz für die immunologische Verwandtschaft von Eiseniapore mit der Komplementkomponente C9 und des ERF mit dem Komplementregulator Vitronectin ist neben der gezeigten Kreuzreaktionen der Nachweis, daß der ERF neben der Eiseniapore- auch die Komplement-vermittelte Hämolyse inhibiert, wie auch Vitronectin die Eiseniapore- und die Komplement-induzierte Hämolyse unterdrückt. Dies demonstriert erstmals die Funktionsähnlichkeit lytischer Proteine aus den Stämmen Oligochaeta und Mammalia.
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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteEiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1Immunreaktionen bei Invertebraten<1>
1.2Abwehrreaktionen bei Anneliden am Beispiel der Lumbriciden (Regenwürmer)
1.3Membran-Wechselwirkungen lytischer Proteine
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1Hälterung der Anneliden und Gewinnung der Cölomflüssigkeit
2.2Gewinnung und Verwendung der Erythrozyten
2.3Präparative Elutions-Polyacrylamidgelelektophorese
2.4Isolierung des Vitronectins (synonym: S-Protein)
2.5Analytische Polyacrylamidgelelekrophorese (PAGE)
2.6Monospezifische Antiseren
2.7Liposomenpräparation
2.8Präparation von geschlossenen (resealed) Ghosts und Nanoerythrosomen
2.9Leakage-Assay
2.10Hämolyse Assay
2.11Charakterisierung von membranbindungs- und lytischer Aktivität von Eiseniapore
2.12Messung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz
2.13Elektronenmikroskopie
2.14Circulardichroismus/CD-Spektroskopie
2.15Osmotische Experimente
2.16Immunoblot-Analyse (Westernblot)
2.17ESR Messungen
2.18Sequenzierung Eiseniapores
3 ERGEBNISSE
3.1Reinigung und Charakterisierung eines hämolytischen Proteins aus der Cölomflüssigkeit E. f. fetidas
3.1.1Die Isolation des hämolytischen Faktors mittels präparativer Elektrophorese zeigt ein 38 kDa Protein
3.1.2Sequenzdaten Eiseniapores nach Spaltung mit einer Endopeptidase
3.1.3Die Interaktion Eiseniapores mit Erythrozyten verursacht Agglutination und Lyse
3.1.4Charakterisierung der hämolytischen Aktivität von Eiseniapore
3.1.5Der Einfluß von Kohlenhydraten auf die hämolytische und hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore ist ein Hinweis auf den Lektincharakter
3.1.6Die zwei Schritte der lytischen Wirkung Eiseniapores: die temperatur-unabhängige Bindung und die temperaturabhängige lytische Aktivität
3.2Interaktion von Eiseniapore mit Modellmembranen
3.2.1Eiseniapore induziert einen Leakage von Liposomen
3.2.2Die ultrastrukturelle Analyse der Eiseniapore-induzierten Membranläsion demonstriert die porenbildende Fähigkeit dieses Proteins
3.2.3Wie groß ist der effektive Durchmesser des Eiseniapore-Kanals in biologischen Membranen?
3.2.4Vergleichende Untersuchungen der Interaktion von Eiseniapore mit Erythrozyten, geschlossenen Ghosts und Nanoerythrosomen
3.2.5Eiseniapore bindet im Gegensatz zu lytischen Peptiden an der Liposomen-membran irrevesibel
3.2.6Welche molekularen Komponenten Sphingomyelins sind für den Leakage essentiell?
3.2.7Die Struktur von membranassoziiertem Eiseniapore
3.3Die Regulation der lytischen Aktivität
3.3.1Isolation und Charakterisierung eines Eiseniapore-regulierenden Faktors (ERF) aus der Cölomflüssigkeit von Anneliden
3.3.2Die Reinigung dem ERF funktional ähnlicher Proteine aus der Cölom- flüssigkeit verschiedener europäischer Lumbriciden
3.3.3Präparation Vitronectins/S-Proteins und der Nachweis der funktionalen Integrität
3.3.4Die Hämolyse-Regulatoren aus dem Säuger und den Oligochaeten sind funktionell austauschbar
3.3.5Heparin beeinflußt die inhibitorische Aktivität des Eiseniapore-regulierenden Faktors
3.3.6Eiseniapore/ERF und Komplement/Vitronectin sind analoge Protein-gruppen - lytische Aktivitäten in der Anwesenheit der Regulatorproteine und Antikörper
3.3.7Immunologisch homologe Komponenten bei Säugern und Invertebraten - Analyse mittels Immunoblotting
4 DISKUSSION
4.1Die humorale Abwehr bei Invertebraten
4.2Natürliche Killer-Zellen als Vermittler zytolytischer Reaktionen
4.3Isolierung und Charakterisierung von Eiseniapore
4.4Eiseniapore induziert über einen Lipid-Rezeptor einen Leakage von Liposomen
4.5Existiert neben dem Lipid-Rezeptor zusätzlich ein Protein- oder Kohlenhydrat-Rezeptor für Eiseniapore?
4.6Strukturelle Eigenschaften von Eiseniapore
4.7Wie schützt sich Eisenia fetida fetida vor der lytischen Aktivität Eiseniapores?
4.8"Warum so kompliziert?"
4.9Die Aktivität Eiseniapores wird durch Kohlenhydrate beeinflußt
4.10Eiseniapore - das erste nachgewiesene Ca2+-unabhängige lytische Lektin
4.11Die hämolytische Aktivität von Eiseniapore wird durch einen Regulator inhibiert
4.12Eiseniapore und dessen Regulator (ERF) sind immunologisch verwandt mit der Komplementkomponente C9 und dessen Regulator Vitronectin
4.13Zusammenfassende Betrachtung der eigenen Ergebnisse an Hand lytischer Proteine aus den diskutierten Arten des Taxons Eisenia fetida
Bibliographie LITERATURVERZEICHNIS
Danksagung
Lebenslauf
Anhang A Publikationen und Tagungsbeiträge
Anhang A Auswahl interdisziplinärer Titel
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1. Nicht-spezifische und spezifische immunologische Effektormechanismen (nach Janeway, 1989; Cooper et al., 1992)
Tabelle 4.1. Ein-Schritt Reinigung Eiseniapores
Tabelle 4.2. Interne Sequenzdaten von Eiseniapore nach Spaltung mit der spezifischen Endopeptidase Lys-C
Tabelle 4.3. Hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore an fixierten Erythrozyten (n=5)
Tabelle 4.4a. Charakterisierung Eiseniapores (nach Suelter, 1990) (n=7)
Tabelle 4.4b. Einfluß von Metallionen auf die hämolytische Aktivität Eiseniapores
Tabelle 4.5: Einfluß der Kohlenhydrate auf die hämolytische und hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore (n=6)
Tabelle 4.6.a. Beeinflussung der Bindung von Eiseniapore an Erythrozyten durch verschiedenen Substanzen (n=6)
Tabelle 4.6.b. Beeinflußung der lytischen Aktivität von Eiseniapore durch verschiedenen Substanzen (n=6)
Tabelle 4.7. Inhibierung der Eiseniapore-vermittelten Hämolyse durch Protektoren (n=5)
Tabelle 4.8. Der Eiseniapore-vermittelter Leakage und Membranfluidität von Liposomen mit verschiedenen Sphingolipiden (10 mol%), L/P 250:1. Das Leakageausmaß wurde 5 min nach der Zugabe Eiseniapores zu den Liposomen bestimmt. Die Konzentration des Fettsäureanalogons betrug 1 mol% der Lipidkonzentration. Die Spektren wurden in Abwesenheit Eiseniapores aufgenommen.
Tabelle 4.9. Ein-Schritt Reinigung des ERF
Tabelle 4.10. Inhibition der durch Eiseniapore vermittelten Hämolyse durch den Eiseniapore-regulierenden Faktor aus der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida
Tabelle 4.12. Inhibition der durch Komplement vermittelten Hämolyse durch Vitronectin (n=7)
Tabelle 4.13. Inhibition der durch Komplement vermittelten Hämolyse durch Regulatoren aus Anneliden (n=9)
Tabelle 4.14. Einfluß von Serum/Vitronectin auf die Eiseniapore-vermittelte Hämolyse (n=7)
Tabelle 4.15: Einfluß von Heparin auf die inhibierende Wirkung von Vitronectin und ERF (n=5)
Tabelle 4.16. Inhibitorische Wirkung von anti-C9 Antikörpern auf die hämolytische Aktivität Eiseniapores (n=4)

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1. Die Porenkonzepte vom (A) Esser (1991) und (B) Bhakdi und Tranum-Jensen (1991b). Beide Modelle wurden in der Debatte über den Mechanismus der Komplement-induzierten Lyse vorgeschlagen. Modell A demonstriert die ’leaky patch hypothesis‘; der Einbau des Porenkomplexes in die Membran induziert eine Neuordnung der Lipide, so daß die hydrophilen Kopfgruppen der Lipide einen Lipidkanal bilden. Modell B zeigt das Konzept des "protein-walled channel" (“Complement lysis: a hole is a hole“, Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991). Im Modell B bleibt der Komplex fest mit der Membran verbunden. Der Defekt in der Membran ist deshalb stabil und besitzt eine feste, definierte Größe. Die Pfeile zeigen mögliche Passagen der hydrophilen Moleküle im jeweiligen Konzept an (modifiziert nach Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991b).
Abbildung 4.1. Elutionsprofil der kontinuierlichen Elutions-Elektrophorese. Der Elutionspuffer enthielt reduzierende Agentien, um die lytische Aktivität Eiseniapores zu schützen. Probe: 8,28 mg Proteinsuspension aus der Cölomflüssigkeit für die Reinigung von Eiseniapore. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die Absorption wurde bei 280 nm gemessen. Weitere Details beschrieben in Material und Methoden.
Abbildung 4.2. Hämolyse von Erythrozyten verschiedener Säugetierarten induziert durch Eiseniapore. Der hämolytische Titer wurde mit Mikrotitrations-Assay untersucht. Der Hämolyse-Titer wurde als reziproker Wert der Verdünnung angegeben, die noch eine Hämolyse induziert (ausführlich in Material und Methoden). Der Anteil an Sphingomyelin der Erythrozyten (Fehrenbach und Jürgens, 1991) ist in Relation zu der lytischen Aktivität von Eiseniapore gezeigt.
Abbildung 4.3. Eiseniapore-induzierter Leakage von PC/SM Liposomen (SUV) bei pH 7,4, 25 °C, in Tes-Puffer (L/P = 50:1). Der Leakage wurde als Fluoreszenz über die Freisetzung des ANTS/DPX Komplexes, welcher vor der Messung in die Liposomen eingeschlossen wurde, gemessen (lambdaex = 355 nm, lambdaem = 530 nm). Die lytische Aktivität Eiseniapores wurde für verschiedene PC/SM Verhältnisse bestimmt: a, 1:0; b, 3:1; c, 1:1; d, 1:3. Zum Zeitpunkt t = 0 wurde das Protein (Endkonzentration 200 nM) zu den Liposomen (Endkonzentration 10 µM) gegeben. Um den prozentualen Anteil des Leakage zu bestimmen, wurde zum Ende eines jeden Experiments Triton X-100 gegeben (Endkonzentration 0.1 %), um eine größtmögliche Verdünnung des Fluoreszenzmarkers zu ermöglichen. Details in Material und Methoden.
Abbildung 4.4. Eiseniapore-induzierter (Endkonzentration 40 nM) Leakage von Liposomen (SUV, Endkonzentration 10 µM) verschiedener Lipidkompositionen bei pH 7,4, 25 °C, in Tes-Puffer (L/P = 250:1). PC/Chol/SM Verhältnisse: a, 1:1:0; b, 1:0:3; c, 1:1:2.
Abbildung 4.5. A, (B, folgende Seite) Kinetiken des Eiseniapore-induzierten Leakages von PS/PC/Chol/SM SUV (1:1:2:4) als eine Funktion des L/P: a, 16000:1; b, 4000:1; c, 1000:1; d, 100:1 (25 °C, Tes-Puffer, pH 7,4).
Abbildung 4.5. B, die Halbwertszeit des Eiseniapore-induzierten Leakage von PS/PC/Chol/SM SUV ( ) und von ghosts ( ) als Funktion der inversen relativen Proteinkonzentration (L/P). Die Halbwertszeit korrespondiert mit der Zeit, bei der 50% des vollständigen Leakage gemessen wurden. Die Daten für die Ghosts wurden aus den Kurven in Fig. 6A ermittelt. Die Geraden wurden durch lineare Regression gewonnen.
Abbildung 4.6. Das Ausmaß des Eiseniapore-induzierten Leakage von SUV und LUV (eingefügtes Bild) verschiedener Lipidkompositionen als Funktion des L/P. , Lipidkomposition, die die äußere Membranschicht der Humanerythrozyten nachbildet: PC/Chol/SM/PE/GA (12:17:10:3:1); , PS/PC/Chol/SM (SUV); , PS/PC/Chol/SM (LUV); , PC/Chol/SM (1:1:2); , PC/SM (1:3). Der Leakage wurde mit dem ANTS/DPX Assay bei pH 7,4 und 25°C bestimmt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Details in Material und Methoden.
Abbildung 4.7. pH- (A) und Temperatur- (B) (folgende Seite) Abhängigkeit der lytischen Aktivität von Eiseniapore. Kinetiken des Leakages ANTS/DPX enthaltender SUV (PS/PC/Chol/SM, 1:1:2:4) wurden bei verschiedenen pH-Werten gemessen, 25 °C, (A) oder bei verschiedenen Temperaturen, pH 7,4. Für Details siehe Legende von Abbildung 4.3. und Material und Methoden. Zu beachten ist die unterschiedliche Skalierung im Verleich zu Abb. 4.3, 4.4 und 4.5.
Abbildung 4.7 (B). Das L/P betrug 250:1. Für Details siehe Legende von Abbildung 4.3. und Material und Methoden. Zu beachten ist die unterschiedliche Skalierung im Verleich zu Abb. 4.3, 4.4 und 4.5.
Abbildung 4.8. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme von negativ-gefärbten Erythrozyten in der Gegenwart von Eiseniapore. Die Erythrozyten wurden für 15 min bei 25 °C (L/P = 125:1) mit Glutaraldehyd fixiert, die anschließende Negativfärbung erfolgte mit Phosphorwolframsäure.Vergrößerung 400.000x.
Abbildung 4.8. (B) Elektronenmikroskopische Aufnahme von negativ-gefärbten PC/SM/Chol-Liposomen in der Gegenwart von Eiseniapore. Die Liposomen wurden für 15 min bei 25 °C (L/P = 125:1) mit Glutaraldehyd fixiert, die anschließende Negativfärbung erfolgte mit Phosphorwolframsäure. Die Pfeile weisen auf die Seitenansichten des Eiseniapore-Komplexes hin. a, allgemeine Ansicht; b-d, ausgewählte Bilder der Seitenansicht von Eiseniapore. Vergrößerung 360.000 x (a) und 480.000 x (b-d).
Abbildung 4.9. A, Eiseniapore-vermittelter Leakage von geschlossenen Ghosts (human) als Funktion des L/P. ANTS/DPX wurde in das Lumen der Ghosts eingeschlossen. Der Leakage wurde bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die Lipidkonzentration der Ghost (10 µM) wurde unter Annahme eines Protein zu Lipid Gewichtsverhältnis bei Erythrozytenmembranen von 1:1 bestimmt; die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry gemessen. L/P: a, 16000:1; b, 4000:1; c, 1000:1; d, 100:1. Details finden sich in Material und Methoden.
Abbildung 4.9. B, Einfluß von L-alpha-Lysopalmitoylphosphatidylcholin (C 16:0) auf die Leakageaktivität von Eiseniapore. Geschlossene Ghosts wurden ohne (Kontrolle, Kurve b und d) oder mit 0.5 mol% Lysophosphatidylcholin (Kurve e und f) für 10 min bei 25 °C vorinkubiert. Die dann durchgeführte Messung der Eiseniapore-vermittelten Freisetzung von ANTS/DPX erfolgte bei verschiedenen L/P (pH 7,4, 25 °C): b und e, 4000:1; d und f, 100:1. Details finden sich in Material und Methoden.
Abbildung 4.10. Der Eiseniapore-vermittelte Leakage an unterschiedlichen liposomalen Targets: aus humanen Ghosts hergestellte Nanoerythrosomen; 100 nm (Kurve a), große unilamellare Vesikel (LUV), 100 nm (Kurve b); kleine unilamellare Vesikel (SUV), 40 nm (Kurve c). Die Lipidzusammensetzungen der LUV und SUV ist der des äußeren Monolayers von humanen Erythrozyten ähnlich (Ei-PC/Chol/SM/PE/GA (12:17:10:3:1)) und geschlossene Ghosts (Kurve d). Das molare Lipid/Protein Verhältnis betrug 250:1 (mol/mol), bei einer Eiseniaporekonzentration von 40 nM (Endkonzentration). Details, insbesondere zur Herstellung der Nanoerythrosomen: Material und Methoden)
Abbildung 4.11. Die Vorinkubation von Eiseniapore mit Liposomen verschiedener Zusammensetzung beeinflußt die ANTS/DPX Freisetzung von PC/Chol/SM-Liposmen, die nach 420 Sekunden (Pfeil) zugegeben wurden. Wenn die Vorinkubation von Eiseniapore in der Abwesenheit von Liposomen erfolgte, konnte ein signifikanter Leakage beobachtet werden (Kurve a). Ein der Kontrolle ähnlicher Leakage wurde bei der Vorinkubation von Eiseniapore mit ungelabelten PC/Chol (1:1) Liposomen gemessen (Kurve b). Kein Leakage wurde beobachtet, wenn Eiseniapore mit ungelabelten PC/Chol/SM-Liposomen (1:1:2) vorinkubiert wurde (Kurve c). Die ungelabelten Liposomen (SUV) wurden bei t = 30 s zugegeben. Während der Inkubation von Eiseniapore mit den Liposomen betrug das L/P 125:1. Nach der Zugabe von gelabelten Liposomen war es in allen Fällen L/P 250:1. Die Messungen wurden bei pH 7,4 und 25 °C durchgeführt. Details finden sich in Material und Methoden.
Abbildung 4.12. Die Bildung eines stabilen Oligomers Eiseniapores in PC/Chol/SM (1:1:2) Liposomen. Die Inkubation der Eiseniapore-Vesikel Suspension erfolgte bei pH 7,4, 25 °C. Das L/P betrug 250:1. Der anschließenden Analyse mit der SDS-PAGE (5-10%) folgte eine Silberfärbung. Bande 1, vollständige Cölomflüssigkeit (25 µg); Bande 2, Eiseniapore (2.1 µg); Bande 3, Eiseniapore nach Vorinkubation von PC/Chol/SM Liposomen (1.4 µg).
Abbildung 4.13. Erläuterungen auf Seite 69.
Abbildung 4.14. Tryptophanfluoreszenz von (A) Eiseniapore (Endkonzentration 40 nM) und (B) in der Gegenwart verschiendener Konzentrationen von PC/Chol/SM-SUV. A, das Spektrum von Eiseniapore wurde in Abwesenheit (Kontrolle) oder in der Gegenwart von 20 mM KI gemessen. B, das Spektrum von Eiseniapore wurde in der Gegenwart von PC/Chol/SM Liposomen in PBS gemessen, L/P = 125:1 (a) und L/P = 250:1 (b und c). Kurve c wurde in der Gegenwart von 20 mM KI bestimmt. Die Messungen wurden bei pH 7,4 und 25 °C durchgeführt; Anregungswellenlänge: lambdaex = 286 nm. Details finden sich in Material und Methoden.
Abbildung 4.15. Circulardichroismus-(CD) Spektren von Eiseniapore in Abwesenheit (a) und Anwesenheit (b) von PC/Chol/SM SUV (L/P = 250:1). Die Proteinkonzentration betrug 2 µM in PBS-Puffer, pH 7,4. Die Messungen wurden bei 25 °C durchgeführt. Die Daten sind in mittleren Restelliptizitäten, basierend auf einer mittleren Aminosäurerestmasse von 105, dargestellt.
Abbildung 4.16. Elutionsprofil der kontinuierlichen Elutions-Elektrophorese. Der Elutions-Puffer enthielt reduzierende Agentien, um die Aktivität des ERF zu schützen Probe: 7,8 mg Proteinsuspension aus der Cölomflüssigkeit. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die Absorption wurde bei 280 nm gemessen. Der Vergleich der Elutionsprofile von Eiseniapore- und ERF-Reinigung demonstriert die unterschiedliche Gelzusammensetzung der Säulen sowie das voneinander abweichende Säulenvolumen.
Abbildung 4.17. Die Oligochaeten (Anneliden) besitzen einen unterschiedlichen Anteil an lytischen und regulierenden Proteinen. Die Konzentrationsangaben (µg/ml) beziehen sich auf die Proteinmengen, die aus einem Milliliter Cölomflüssigkeit gereinigt werden konnten (Details in Material und Methoden). Eiseniapore, das Hämolysin aus E. f. fetida: 4,2 µg/ml, Hämolysin aus L. terrestris (2,4 µg/ml) und A. caliginosa (0,46 µg/ml). Die Regulator-Proteine: ERF (0.08 µg/ml), aus L. terrestris (0,4 µg/ml) und A. calliginosa (2,9 µg/ml).
Abbildung 4.18. Titer der Komplement- und Eiseniapore-induzierten Hämolyse in Gegenwart von Antikörpern und Regulatoren. Der reziproke Wert des Komplementtiters beträgt 256. In Gegenwart von anti-Eiseniapore Antikörpern fällt der Hämolysetiter auf 64, die Kontrolle (+) zeigt, daß in Gegenwart von anti-C9 Antikörpern nur eine Aktivität von 4 Titerstufen bleibt. Der ERF inhibiert die Komplementlyse bis auf den Titer 16, der natürliche Inhibitor des Komplements Vitronectin (Kontrolle (-)) inhibiert die Hämolyse vollständig. Die Eiseniapore-vermittelte Hämolyse erreicht einen Titer von 6144, der in Gegenwart von anti-C9 Antikörpern auf einen Hämolysetiter von 384 fällt. Der gegen Eiseniapore gerichtete Antikörper (Kontrolle (+)) vermindert die lytische Aktivität mit einem Titer von 16 nahezu vollständig. Vitronectin reduziert die Eiseniapore-induzierte Hämolyse auf den Titer 192. Der natürliche Inhibitor Eiseniapores - der ERF - vermindert die Lyse auf den Titer 4.
Abbildung 4.19. Kreuzreaktion zwischen C9 und Eiseniapore (A) und zwischen Vitronectin und ERF (B). Die Westernblots wurden mit monospezifischen, polyklonalen Antikörpern (1:1000, in PBS-Puffer verdünnt) gegen reduziertes, humanes C9 (A, rechte Bande) und humanes Vitronectin (B, rechte Bande) durchgeführt. Die elektrophoretische Trennung von 2.1 µg Eiseniapore (A, linke Bande) und 1.7 µg ERF (B, linke Bande) in der SDS-PAGE (5-10%) erfolgte unter reduzierenden Bedingungen (siehe Material und Methoden).

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Fri Sep 13 16:49:21 2002