Lange, Sven: Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.

Kapitel 1. EINLEITUNG

1.1 Immunreaktionen bei Invertebraten<1>

'Wer einmal an der Pest erkrankt ist, infiziert sich nie wieder.' Entweder der Mensch stirbt oder ist sein Leben lang frei von dieser Infektion. In beiden Fällen bleibt die Erkrankung ein singuläres Ereignis. Diese mittelalterliche Beobachtung wurde mit dem Begriff Immunität (lat. immunis - frei von) versehen. Schon zum Ende des vergangenen Jahrhunderts weitet Metschikoff 1879 mit Studien über das Abwehrverhalten von Seesternlarven die Immunologie auf den Bereich der Wirbellosen (Invertebraten) aus. Burnet und Fenner wiesen 1949 darauf hin, daß sämtliche Organismen mit tierischer Ernährung notwendigerweise die Fähigkeit zur "Fremderkennung" besitzen müssen, um selbst synthetisierte von aufgenommenen Molekülen zu unterscheiden.

Die Fremderkennung wird bei Mäusen<2> und Menschen, den immunologisch am besten untersuchten Organismen, vor allem über Antikörper (Immunoglobuline) und T-Zell-Rezeptoren (TCR) vermittelt. Die TCR - als antikörperähnliche Proteine auf der Membranoberfläche der T-Zellen - werden jedoch im Gegensatz zu den


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Antikörpern nicht sezerniert. Die T-Zell-Immunantwort wird direkt auf der Membranoberfläche der T-Zelle über den Rezeptor ausgelöst. Die T-Zellen sind die Träger der zellulären Immunantwort. Die humoralen Immunantwort (siehe auch Kap. 2.2 und Diskussion) wird im wesentlichen über Antikörper vermittelt, auch wenn sich die humorale Immunantwort nicht auf Antikörper reduzieren läßt. Die Antikörper der höheren Säugetieren lassen sich in fünf Klassen (IgA, IgD, IgE, IgG und IgM) mit jeweils typischen physikochemischen Eigenschaften einteilen. In einem Milliliter Humanblut zirkulieren ständig 1016 Antikörper (Friemel und Brock, 1990). Diese haben eine primär neutralisierende Wirkung auf eindringende Keime wie Viren und bakterielle Toxine. Aber sie wären nahezu bedeutungslos, wenn sich ihre Wirkung gegen fremde, immunogene Moleküle (= Antigene) nicht auf sekundäre Effektorfunktionen erweitern würde. Die Aktivierung des Komplement (Es komplementiert die Wirkung der Antikörper.) ist einer der wichtigsten solcher Effektormechanismen. Das Komplement ist kein einzelnes Protein, sondern es besteht aus einer Gruppe von ungefähr 20 Proteinen, die sich kaskadenartig aktivieren und so Entzündungsreaktionen vermitteln, in deren Folge fremde Zellen und Bakterien lysiert werden können (Colten und Rosen, 1992, Tayler, 1992; Schieren und Hänsch, 1993; Nicholson-Weller und Halperin, 1993; Green und Vermeulen, 1994; Tschopp und French, 1994; Birmingham, 1995; Lokki et al., 1995)<3>. Die proinflammatorischen und lytischen Eigenschaften des Komplements erfordern eine strenge Regulation. Die terminalen lytischen Komponenten werden unter anderem durch den homologen Restriktionsfaktor (HRF) und Vitronectin reguliert. Vitronectin kann an mehreren Orten der Komplementkaskade wirken, so unterdrückt es beispielsweise die Polymerisation von C9-Monomeren zur makromolekularen Pore. Vitronectin ist vermutlich das phylogentisch ältere Regulatorprotein, da es im Gegensatz zum HRF auch die hämolytische Aktivität von Perforin inhibiert, welches als das stammesgeschichtlich ursprünglichste Protein der sogenannten Perforin-Familie<4> gilt.


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Antikörper vermitteln auch direkt als vielseitige Adaptoren -sozusagen als Verbindungsstücke- zwischen dem Mikroorganismus und dem Phagozyten, wenn ein Infektionserreger nicht erkannt werden kann. Da Immunoglobuline die Integrität und Individualität von Organismen ermöglichen, bedeutet der Ausfall der Antikörper-Synthese oder auch nur der Mangel von Antikörpern schwere pathogene Veränderungen. Beim Menschen erlangt ein Defizit der Antikörperproduktion schnell klinische Bedeutung, beispielsweise folgen schon einem Mangel allein an IgA Allergien oder auch maligne Tumoren (Peter, 1991; Zenone et al., 1996).

Somit könnte vermutet werden, daß ein Abwehrsystem, das ohne Antikörper wirkt, dem Organismus nur geringe Überlebenschancen ermöglicht. Dem ist jedoch nicht so. Die Antikörper-unabhängige Immunität ist für alle Stämme der in der Evolution äußerst erfolgreichen Wirbellosen (Invertebraten) typisch. Die Leistungsfähigkeit dieses Antikörper-unabhängigen Systems wird beispielsweise dadurch demonstriert, daß in den Stämmen der Wirbellosen, die über eine allogene Immunerkennung verfügen, noch keine Tumoren beschrieben werden konnten (Roitt et al., 1995, auch: Kaiser, 1993; De Boeck und Kirsch-Volders, 1997). Weiterhin gestattet es den Invertebraten die Besiedlung aller Lebensräume, einschließlich der für Vertebraten und Säuger nicht zugänglichen Extremreservoire (Harvel, 1990a). Das Innere der wirbellosen Tiere ist ebenso "steril" (Urich, 1990) wie das der Wirbeltiere, obwohl die Gefahr der Kontamination keinesfalls geringer ist. Ein 'erfolgreiches Überleben' bezieht sich bei den sogenannten niederen Organismen jedoch nicht nur auf die größere Anzahl der besiedelten Lebensräume, sondern auch auf die phylogenetisch längere Dauer des Überlebens (Sima und Vetvicka, 1993).

Der sogenannte "another viewpoint" (Cooper et al., 1992) der Invertebraten-Immunologie auf die Probleme der Immunologie erfolgte bisher, von einigen gut untersuchten Insektengruppen abgesehen, an sehr einfachen Organismen, oft an den ersten Gewebetieren in der Evolution überhaupt (referiert bei Macek et al., 1994). Vom phylogenetischen Standpunkt aus sind Untersuchungen an den zweikeimblättrigen Organismen (Porifera (Schwämme), Cnidaria (Nesseltiere) und Ctenophora (Rippenquallen)) nicht problemlos, da erst mit dem evolutionären Auftauchen des dritten Keimblattes (Mesoderm) - beginnend bei den Plathelminthes (Plattwürmer) - das eigentliche Gewebe für die Bildung von immunologischen Faktoren zur Verfügung stand. Bei den untersuchten zweikeimblättrigen Organismen kann zum einen nicht immer zweifelsfrei geklärt werden, ob die untersuchten


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Faktoren überhaupt einen direkten Bezug zur Abwehr haben (Mangel et al., 1992; Smith und Davidson, 1994; Zhang et al., 1997); zum anderen haben die Faktoren einen völlig anderen phylogenetischen/ontogenetischen Ursprung, was eine Betrachtung unter den Gesichtspunkten der vergleichenden Immunologie erschwert<5> (Harvell, 1990b).

Trotz dieser stammesgeschichtlichen 'Vorgabe' werden seit Anfang der neunziger Jahre selbst lytische Systeme der Mikroorganismen als immunologische Faktoren dieser Organismen gesehen: Die Selbstschutz-Mechanismen, die einen Angriff der eigenen lytischen Proteinen verhindern sollen, werden von mehreren Autoren als eine Form der Immunität der einzelligen Organismen aufgefaßt (Engelke et al., 1994; Kuipers et al., 1993; Reis et al. 1994; Venema et al., 1994; Abee 1995; Siegers und Entian, 1995; Siger et al., 1996). Die Annahme von Immunreaktionen in


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einzelligen Organismen ist jedoch sehr weitgehend.

Es kann nicht erwartet werden, daß sich einzelne immunologische Fähigkeiten in der Evolution kontinuierlich entwickeln. Die Phylogenie der Selbst/Fremd-Erkennung demonstriert dies eindrucksvoll: Porifera (Schwämme) und Cnidaria (Nesseltiere) gelten als die "primitivsten Stämme der Invertebraten" (Harvell, 1990b), jedoch verfügen sie als marine, oft koloniebildende Invertebraten über gut ausgebildete Mechanismen der


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allogenen und xenogenen Gewebeabstoßung. Diese Fähigkeiten sollen beispielsweise die Fusion einzelner Individuen untereinander verhindern. Bei den höherentwickelten Insekten und Mollusken, mit ihren bereits stark differenzierten Immunsystemen hingegen, sind diese Fähigkeiten schwach oder gar nicht ausgebildet (Lackie, 1986; Harvell, 1990), da die Wahrscheinlichkeit, daß es bei den solitären und mit einem Chitinpanzer umgebenden Insekten zu Gewebekontakten untereinander kommt, sehr gering ist. Dieser Teil der Selbst/Fremd-Erkennung brächte den Insekten daher keinen selektiven Vorteil und wurde im Laufe der Evolution aufgegeben.

Die immunologische Erkennung und Abstoßung wird bei Invertebraten über zytotoxische/zytolytische Reaktionen gewährleistet. Die Träger solcher Reaktionen sind vermutlich NK-Zellen<6>-ähnliche Strukturen, die membranzerstörende Proteine sezernieren. Ein deutlicher Unterschied zu den Vertebraten ist jedoch die Dauer, die diese Reaktionen in Invertebraten einnehmen. Diese sogenannten langsamen Immunreaktionen gelten für die Mehrzahl der Immunreaktionen in Invertebraten als typisch (Humphreys und Reinherz, 1994). Sequenzhomologien membranzerstörender Proteine sind innerhalb der Wirbeltierstämme gut untersucht. So sind die Membrantoxine im Gift der Klapperschlange (Crotalus atrox) homolog mit den membranaktiven Enzymen aus dem Rinderpankreas (Maraganore und Heinrikson, 1987). Solche Übereinstimmungen sind jedoch nicht nur auf Wirbeltiere beschränkt. Sogar Pflanzenproteine (Thionine<7>), die mit membranangreifenden Faktoren aus dem Immunsystem höherer Vertebraten homolog sind, wurden beschrieben (Oka, 1992).


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Auch für das umfassendste Effektorsystem - das Komplement - wird über ein Vorhandensein in Invertebraten seit über drei Jahrzehnten intensiv spekuliert (Day et al.


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Immunsystem höherer Vertebraten homolog sind, wurden beschrieben<8> (Oka et al., 1970, Bertheussen, 1982, 1984; Enghild et al., 1990; Smith und Davidson, 1994). Mit dem Nachweis eines Proaktivators für die Komplementkomponente C3 bei Pfeilschwanzkrebsen (Limulus polyphemus) begann eine umfassende Suche nach Präformen des Komplementsystems bei Wirbellosen (Armstrong und Quigley, 1987). 1990 konnte wiederum bei Limulus polyphemus ein alpha2-Macroglobulin - ein Mitglied der Proteinfamilie, die auch die Komplementkomponenten enthält - nachgewiesen werden (Enghild et al., 1990). Dieses Protein ist aber für die lytische Aktivität des Serums nicht notwendig (Armstrong et al., 1993). Der Nachweis von einzelnen Komponenten, die sich zur Perforinfamilie (= terminale Komplementproteine und Perforin) homolog verhalten, steht noch aus (Cooper et al., 1992; Komiyama et al., 1997)<9>.

Komplement kann über zwei Wege aktiviert werden. Der sogenannte klassische Weg wird über Antikörper-Antigen-Komplexe ausgelöst. Der alternative Weg wird unter anderem durch Polysaccaride aus der Membran/der Zellwand von Mikroorganismen, Zellen mit niedrigem Neuraminsäuregehalt, Polyanionen und virusinfizierte Zellen direkt ausgelöst. Er ist somit unspezifisch (Bitter-Suermann und Hadding, 1991).

Nach ihrer Spezifität gegenüber dem Antigen werden die Abwehrmechanismen in einen spezifischen (synonym antizipatorischen oder adaptiven) und einen unspezifischen (synonym nicht-antizipatorischen oder angeborenen, auch: Resistenz) Mechanismus unterteilt. Beide Reaktionen wirken in Vertebraten nicht isoliert. Der spezifische von Antikörpern abhängige Mechanismus wird von unspezifischen begleitet. Letzterer galt allerdings gegenüber den spezifischen Prozessen als weniger bedeutend ("unintelligent, indiscreet and


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obsolescent" (referiert bei Fearon, 1997)). Neuere Ergebnisse zeigen hingegen, daß unsere Vorstellung vom zentralen Moment der spezifischen Immunreaktion - der Bildung der Antikörper und T-Zell-Rezeptoren, initiiert durch eine antigene Determinante - äußerst unzureichend ist, sowie, daß bestehende Hypothesen Defizite aufweisen (Fearon, 1997).

Fearon (1997) spekuliert, daß die spezifische Erkennung des Antigens und die nachfolgende Bildung der Antikörper vermutlich von dem unspezifischen Teil der Immunität abhängig sein könnte<10>, was deutlich über die Vorstellung der einfachen Wechselwirkung dieser beiden Immunantworten hinaus geht. Das Wissen über die nicht-antizipatorische Immunreaktion ist sehr begrenzt. Ihre Vernetzung mit der antizipatorischen Immunreaktion erschwerte eine separate Analyse. In Invertebraten scheint allein die nicht-antizipatorische, unspezifische Immunantwort vorzukommen, sie sind deshalb ein geeignetes Modell für die Untersuchung dieser Prozesse. Janeway (Tabelle 1) wies darauf hin, daß sich das zytolytische Effektorsystem der höheren Vertebraten in die Wirkungen der (i) unspezifischen, natürlichen Killer-Zellen und der (ii) spezifischen, zytolytischen T-Zellen teilt.

Die natürlichen Killer-Zellen können als die evolutionäre Vorstufe der zytolytischen T-Zellen aufgefaßt werden, wie auch der unspezifische, alternative Weg der Komplementkaskade der Vorläufer der spezifischen, klassischen Komplementaktivierung ist. Die unspezifischen Mechanismen erkennen ihre Zielzelle nicht an einem hochspezifischen bestimmten Epitop (= antigene Determinante), sondern sie wechselwirken mit einem breiten unspezifischen Spektrum an Substanzen (z.B. Polysaccharide der Bakterien- (LPS) oder Hefezellenmembran (Zymosan) oder in der mikrobiellen Zellwand verankerte Mannose).

Die immunologische Erkennung ist in den letzten Jahren zum Schlüssel der Analyse von Immunreaktionen geworden. So ist sie auch der entscheidende Punkt für die Unterteilung der Abwehr von Vertebraten (anticipatory immune responses)


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und Invertebraten (non-anticipatory immune responses)<11>. Während die Abwehr der Vertebraten die Selbst/Fremd-Erkennung über extrem individuelle Epitope realisiert, werden durch das Abwehrsystem der Invertebraten sogenannte 'heterophile Antigene' (wie bei der unspezifischen Abwehr der Vertebraten: z.B. LPS, Zymosan oder Mannose) erkannt. Für die nicht-spezifischen Effektormechanismen der Vertebraten konnten auch Nachweise in Invertebraten erbracht werden, so für das C-reaktive Protein (Robey und Liu, 1983; Armstrong et al., 1993) und die Phagozytose (Ottaviani und Franceschi, 1997). Außerdem sind lytische Aktivitäten in Invertebraten beschrieben worden, die von einigen Autoren in ihrer Funktion als Komplement-ähnlich eingestuft werden (Tabelle 1) (Bertheussen, 1983; Canicatti und Ciulla, 1987, 1988).

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Tabelle 1. Nicht-spezifische und spezifische immunologische Effektormechanismen (nach Janeway, 1989; Cooper et al., 1992)

Nicht-spezifische Effektormechanismen

Spezifische Effektormechanismen

alternative Komplementkaskade

Antikörper + klassische Komplementkaskade

Phagozytose

Antikörper + Fc-Rezeptor induzierte Phagozytose

C-reaktives Protein

spezifische Antikörper gegen Phosphocholinanteile in der Membran

Makrophagenaktivierung

T-Zell abhängige Aktivierung der Makrophagen

natürliche Killer-Zellen

zytolytische T-Zellen

Nachdem indirekte Nachweise für eine NK-Zellen-ähnliche Aktivität im Bereich der Invertebraten bei Mollusken gelangen (Franceschi et al., 1991), wurde für bestimmte Zellen der Anneliden eine Ähnlichkeit mit NK-Zellen beschrieben (Quaglino et al., 1996). Eine immunologische Verwandtschaft der von NK-Zellen sezernierten Proteine - ermittelt über kreuzreagierendes Verhalten mit anti-Perforin-Antikörpern - konnte bei den zytolytischen Zellen der Anneliden bisher nicht nachgewiesen werden (Porchet-Henneré et al., 1992). Außerdem wurde mittels Elektronenmikroskopie bei Anneliden (Lumbriciden) nach den für NK-Zellen typischen, tunnelbildenden Proteinen - jedoch ohne Erfolg - gesucht (Roch et al., 1989).

Sowohl bei den lytischen Proteinen der Vertebraten der zellulären Immunität (z.B. NK-Zellen: Perforin), den lytischen Proteinen der humoralen Immunität (z.B. terminale Komplementkomponenten, Poly-C9), als auch den Hämolysinen der Invertebraten ist die physiologische Bedeutung nicht abschließend geklärt. Die Zuordnung dieser Proteine in den Bereich der immunologischen Abwehr ist, trotz der Attraktivität des Modells der immunrelevanten Lyse, nicht frei von einer gewissen Willkür. An dieser Situation haben die seit kurzem zur Verfügung stehenden "Perforin knock-out"- und "Perforin-Mangel"-Mäuse (Atkinson et al., 1995; Clark et al., 1995; Kägi et al., 1995) wenig geändert. Es gibt jedoch erste Indizien, die unter anderem für eine Beteiligung dieses lytischen Proteins an der Eliminierung von


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Tumorzellen und von nicht-zytopathischen Viren sprechen (Kägi et al., 1996).

1.2 Abwehrreaktionen bei Anneliden am Beispiel der Lumbriciden (Regenwürmer)

Lumbriciden, die nach der revidierten Taxonomie von Hrabe (1983) und Brinkhurst (1984) die Stammform der Oligochaeten<12> repräsentieren, von denen alle anderen Vertreter dieser Gruppe abzweigen, sind sehr interessante Organismen für vergleichende immunologische Untersuchungen. Sie verfügen bereits über Abwehrmechanismen, die sich entsprechend der klassischen Nomenklatur der Immunologie in humorale (lat. umor=Flüssigkeit, hier im Sinne von frei gelösten Substanzen, z.B. Hämolysine) und zelluläre Strategien (z.B. phagozytierende Zellen) einteilen lassen (siehe auch Diskussion, Kap. 5.1). Sie gehören zu den ersten Organismen in der Stammesentwicklung, die eine immunologische Erkennung und sogar ein immunologisches Gedächtnis<13> aufzeigen (Du Pasquier, 1992). Oligochaeten, speziell die Familie der Lumbriciden, standen wegen verschiedener immunologischer Fähigkeiten im Zentrum des Interesses. Hier ist vor allem die Fähigkeit zur Abstoßung von Geweben zu nennen (referiert bei Klein, 1997). Seitens der Ökologie wurde darauf aufmerksam gemacht, daß Lumbriciden wie Eisenia fetida ssp. (Mistwurm) auf Grund ihrer Abwehrfähigkeiten in speziellen Räumen (z.B. Kadaver) leben können. Insbesondere diese Lebensräume beherbergen vielfältige aggressive Mikroorganismen und werden deshalb nur durch ausgewählte


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mehrzellige Organismen besiedelt.

Zentraler Ort des Abwehrgeschehens der Anneliden ist das Cölom mesodermalen Ursprungs, das im Gegensatz zu allen anderen Geweben und Flüssigkeiten im Tier bis auf marginale Ausnahmen frei von Parasiten ist.

Die zelluläre Abwehr wird von verschiedenen Cölomozyten realisiert, die die Phagozytose und nachfolgend die Einkapselung von Pathogenen vermitteln (Sima und Vetvicka, 1993). Die Cölomozyten der Lumbriciden sind ein Teil des Abwehrsystems und an folgenden Reaktionen beteiligt:

Im Gegensatz zu den Phagozytoseprozessen der Vertebraten sind bei den Anneliden keine Sauerstoffmetaboliten (O2, O2-, OH, OCl- und H2O2) bei der intrazellulären Abtötung der phagozytierten Mikroorganismen beteiligt (Bilej et al., 1991). Einige Befunde bei Lumbricus terrestris (Gemeiner Regenwurm) und Eisenia fetida lassen eine opsonierende Funktion<14> einzelner Cölomflüssigkeitskomponenten vermuten (Stein et al., 1977; Laulan et al., 1988; Bilej et al., 1990; Vetvicka et al., 1997).

Die durch den zellfreien Anteil der Cölomflüssigkeit von E. fetida ssp. induzierten Aktivitäten: hämolytische, agglutinierende, mitogene, bakteriostatische, zytotoxische, und eine tumorstatische, werden der humoralen Abwehr zugeordnet (Vallier et al., 1985; Kauschke und Mohrig, 1987; Mohrig und Kauschke, 1988; Lassegues et al., 1988, 1997; Hirigoyenberry et al., 1990; Roch et al., 1991; Hrzenjak et al., 1992, 1993).

Die hämolytische Aktivität ist von allen humoralen Wirkungen der Cölomflüssigkeit die stärkste; sie reicht sogar an die hämolytische Aktivität der effektivsten Killer-Zellen (Entamoeba histolytica) des gesamten Tierreiches überhaupt heran (Rosales-Encina, 1992; Leippe, 1997). Mehrere Arbeitsgruppen


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haben sich, nach dem Nachweis der hämolytischen Aktivität in der Cölomflüssigkeit im Jahre 1968 durch Du Pasquier und Duprat, um eine nähere Charakterisierung der Aktivität bemüht (Valembois et al., 1982; Tuchkova et al., 1986; Roch et al., 1989; Hrzenjak et al., 1991; Eue et al., 1991; Bilej et al., 1995).

Die in Folge dieser Untersuchungen festgestellten Differenzen der hämolytischen Aktivität (Aktivitätstiter vor und nach Immunisierung, Inhibierung durch verschiedene Zucker oder die Temperaturabhängigkeit) der Cölomflüssigkeit in Eisenia fetida ssp. durch verschiedene Arbeitsgruppen gaben Hinweise auf die Charakterisierung unterschiedliche Moleküle (alle im Molekulargewichtsbereich um 40 kDa), beziehungsweise auf mögliche eigenständige (Unter-)Arten. Wir konnten beispielsweise die hämolytische Wirkung der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida ssp. in einer Verdünnung von 1:100.000 gleichermaßen vor und nach einer Immunisierung nachweisen, die Arbeitsgruppe um Roch (1981) gab für Erythrozyten der gleichen Spezies einen Titer von 1:4000 vor einer Immunisierung und danach von 1:32000 an. Die elektrophoretisch aufgetrennte Cölomflüssigkeit zeigt nach Überschichtung des Trenngels mit einer Erythrozyten-Agar-Suspension deutliche Lysehöfe. Roch beschrieb zwei lytische Proteine bei 40 kDa und 45 kDa (Roch et al., 1989), unsere Arbeitsgruppe identifizierte mit dieser Methode drei Hämolysinbanden mit einem Molekulargewicht von 38-40 kDa, 42 kDa und 45 kDa (Eue et al., 1991; Mohrig et al., 1996). Es ist immer wieder diskutiert worden, ob Eisenia fetida eine homogene taxonomische Gruppe darstellt. Überwiegend wird in der Literatur<15> von einer einzigen Art ausgegangen, auch wenn seit Angang der sechziger Jahre Subspecies (Eisenia fetida fetida und Eisenia fetida andrei) vorgeschlagen wurden (Andre, 1963; Bouche, 1972). Jaenike (1982) formulierte die weitergehende These: "‘Eisenia foetida’ is two species." (auch: Oien und Stenersen (1984)). Die unterschiedlichen Ergebnisse der Arbeitsgruppen zum Proteinmuster der vollständigen und fraktionierten Cölomflüssigkeit, der unterschiedlichen biochemischen Merkmale der Cölomflüssigkeit (Roch et al., 1981; Kauschke und Mohrig, 1987; Roch et al., 1989; Eue et al., 1991; Mohrig et al., 1996), sowie die Resultate von Oien und Stenersen (1984), die Hybridsterilität der sogenannten Unterarten betreffend, stützen die These der zwei Arten.

Die unterschiedlichen isolierten hämolytisch aktiven Proteinen können - isoliert betrachtet - keinen Hinweis auf mehrere Arten geben, da nicht völlig ausgeschlossen werden kann, daß sie beide in E. fetida ssp. vorkommen (ausführlich


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in Diskussion).

Die Analyse der Wechselwirkung der lytischen Aktivität mit der Zielzelle erwies sich als schwierig, da nur semi-gereinigtes Material zur Verfügung stand (Roch et al., 1986; Hrzenjak et al., 1991; Bilej et al., 1995). Die Isolierung der lytischen Proteine war auf Grund von unspezifischen Reaktionen der interessierenden Proteine mit den Trägersubstanzen der Trennmaterialien kompliziert (Mohrig et al., 1996). Sogenannte semi-gereinigte und bis zur Homogenität gereinigte Hämolysine können deutlich unterschiedliches Verhalten zeigen (Clinkenbeard et al. (1989, 1991) vs. Cruz et al. (1990)). Ab Mitte der neunziger Jahre bemühte man sich - aufgrund des größer werdenden Interesses an lytischen Peptiden/Proteinen - äußerst intensiv um die Isolierung der hochwirksamen hämolytischen Proteine der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida ssp. (Bilej et al., 1995; Lange et al., 1995; Mohrig et al., 1996; Sekizawa et al., 1996; Milochau et al., 1997; Lange et al., 1997).

Die biologische Funktion der hämolytischen Aktivität wird in der Abwehr mikrobieller Pathogene gesehen (Vaillier et al., 1985), insbesondere da die Wirbeltiererythrozyten und die untersuchten, hoch pathogenen Mikroorganismen ein gemeinsames Antigen besitzen (Roch et al., 1987). Dies ist jedoch nicht unbedingt ein überzeugender Beweis, da gerade eine Antigen-Gemeinsamkeit von nicht-pathogenen Mikroorganismen mit den lysierten Erythrozyten erwartet hätte werden können.

Es konnte jedoch bisher nicht abgeklärt werden, welches Protein für die hämolytische Aktivität verantwortlich ist. Immer wieder ist angezweifelt worden, daß ein einzelnes Protein aus der Cölomflüssigkeit die Lyse der Targetzelle induziert. Die elektrophoretische Auftrennung der Cölomflüssigkeit mit anschließender Überschichtung mit Blut-Agar erfolgte in Nativgelen, die keine Separation nach dem Molekulargewicht gestatten, so daß das Vorhandensein separierter Lysebande nicht als Hinweis für die Wirkung eines einzelnen Proteins akzeptiert wurde. Vor allem für die lytischen Moleküle mit einem sehr geringen molekularem Gewicht - wie dem Flavin-ähnlichen 2,6 kDa Peptid - wurde eine entscheidende kooperative Rolle für den Lysevorgang im Zusammenhang mit den sogenannten "großen" Hämolysinen (40-45 kDa) angenommen (Sinkora et al., 1993 und 1995; Bilej, persönliche Mitteilung).

Die hämolytische Aktivität, die zum Teil mit einer agglutinierenden verknüpft ist, zeigt sich durch Kohlenhydratstrukturen und Glykoproteine inhibierbar und genügt daher den Kriterien der Lektine oder Lektin-ähnlicher Substanzen (Roch,


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1979; Roch et al, 1986; Lassalle et al., 1993; Ville et al; 1995; Mohrig et al., 1997; Eue et al., 1997). Vor allem wegen ihres spezifischen Bindungsvermögens werden Lektine als den Antikörpern analoge Strukturen diskutiert (Ziska und Franz, 1981; Boman, 1991; Cooper et al., 1992; Du Pasquier 1992; Kauschke et al., 1997). In vivo sind Lektine in der Lage, den Kontakt von Killer-Zelle und Ziel-Zelle zu vermitteln, der im lebenden Organismus durch Antikörper ermöglicht wird. Vor kurzem konnte nachgewiesen werden, daß die Zellen, die die lytischen Proteine bei Eisenia fetida ssp. produzieren, den NK-Zellen in Form und Funktion adäquat sind. Der Nachweis porenbildender Proteine gelang jedoch nicht (Quaglino et al., 1996).

Eine Analogie wie auch eine Homologie der lytischen Aktivität bei Anneliden zu zytolytischen Strukturen der Vertebraten - wie Perforin und Komplement - wurde bisher ausgeschlossen. Die ultrastrukturelle Analyse der Läsionen der Targetmembran zeigte nicht die für das Komplement typische ringförmige Proteinporenstruktur (Roch et al., 1989). Außerdem beeinflußten Inhibitoren/Regulatoren der lytischen Komplementproteine (Protamin und Heparin) die lytische Aktivität von Cölomflüssigkeits-Fraktionen nicht (Roch et al., 1989, Canicatti, 1990). Auch Substanzen (Zymosan und Inulin), die eine regulierende Funktion speziell auf die zentrale Komplementkomponente C3 besitzen, beeinflussen die lytische Aktivität in Anneliden nicht (Quigley et al., 1984; Söderhall 1984).

Die sehr starke lytische Aktivität bei Eisenia fetida fetida warf die Frage des Schutzes vor einer Autolyse auf. Körpereigene Regulatoren, die den Selbstschutz körpereigener Zellen realisieren, konnten bei den Anneliden - wie bei allen untersuchten Invertebraten - nicht nachgewiesen werden. Von einigen Autoren wurde eine regulierende Wirkung der lytischen Aktivität durch Ca2+-Ionen angenommen (referiert bei Canicatti, 1990). Da Anneliden bereits über ein umfassendes Immunsystem verfügen, kann vermutet werden, daß sich die Einteilung der Immuneffektoren in humoral und zellulär auch bei möglichen Regulatoren als löslich und membranständig wiederfindet (Canicatti, 1990). Wobei ein membranständiger Schutz vermutlich nicht über einen membranverankerten Regulator ermöglicht wird, da dies bei lytischen Faktoren, die ohne vorherige Antigenexposition sofort mit dem Target reagieren, nicht erwartet werden kann<16>. In dem Antikörper-unabhängigen System der Anneliden muß das lytische Vermögen


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zwischen selbst und fremd unterscheiden, um ein humoraler Garant der Integrität und Individualität des Organismus zu sein. Diese Erkennung von selbst und fremd erfolgt bei den lytischen Proteinen der Invertebraten (im Gegensatz zu der immunologischen Selbstdiskriminierung bei Vertebraten) vermutlich weniger über die Anwesenheit von Strukturen, die dem Immunsystem ein ’Selbst‘ signalisieren, sondern durch die Abwesenheit von Rezeptoren (Meinardi et al., 1995). Die verfügbaren Daten gestatteten bisher jedoch keine Analyse der Wechselwirkung zwischen lytischen Proteinen und Rezeptor beziehungsweise Target.

1.3 Membran-Wechselwirkungen lytischer Proteine

Da lytische Proteine neben den Anneliden auch in anderen Organismen beschrieben wurden, liegen sehr viele Einzelinformationen vor. Die Versuche, diese Vielzahl an Informationen zu systematisieren, führte nach gegenwärtigem Erkenntnisstand zu folgenden Einteilungen:

1.) nach der Struktur der Läsion (diskrete und nicht-diskrete Membranschädigung) (Bhakdi und Tranum-Jensen, 1983, Bhakdi et al, 1996) und

2.) nach dem Mechanismus der Strukturbildung (z.B. detergensähnliche oder enzymatische Wirkung) (Rowe und Welsch, 1994)<17>.

Der Einteilung der Toxine nach ihrer Reaktion an der Membran folgend (Punkt 1.) wären die umfangreich untersuchten RTX-Toxine der gram-negativen Bakterien (Coote, 1992), das Escherichia coli Hämolysin (Moayeri und Welch, 1997) oder das humane Perforin (Cerottini und Tschopp, 1997) Proteine, die durch eine diskrete, porenförmige Membranläsion wirken. Zu der Gruppe der Toxine, die nicht-diskrete Schädigungen der Membran initiieren, gehören Mellitin (Cajal und Jain, 1997), das alpha-Toxin von Clostridium perfringens (Schoepe et al., 1997; Bunting et al., 1997) und alle Phospholipasen, beispielsweise im Schlangengift (Maraganore


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und Heinrikson, 1986).

Die morphologische Charakterisierung der Schädigung der Membran kann jedoch nicht immer eindeutig erfolgen. In ihrer Einteilung der Zytolysine orientieren sich Rowe und Welsch (1994) deshalb an dem lytischen Mechanismus des wirkenden Substrats (nach Punkt 2.), sie unterscheiden zwischen:

- einem enzymatischen Mechanismus, z.B. durch das beta-Toxins von Staphylococcus aureus (Cifrian et al., 1996; O‘Callagha et al., 1997),

- der Poren-Formation durch Proteinmonomere beispielsweise bei Streptolysin O (Boulnois et al., 1992; Sekiya et al., 1996) und

- der Aktivität Detergens-ähnlicher Zytolysine, wie sie für das hitzestabile Hämolysin von Pseudomonas aeruginosa (Johnson und Boese-Marrazzo, 1980; Burke et al., 1991) beschrieben ist.

Bakterientoxine, die als virulenten Faktor ein porenbildendes Protein besitzen, werden intensiv seit Beginn dieser Dekade analysiert: Vibrio parahaemolyticus (Honda et al., 1992) ist für 70% aller Nahrungsmittelvergiftungen in Japan verantwortlich (Raimondi et al., 1995), Streptococcus suis verursacht Arthritis, Meningitis oder Pneumonien (Jacobs et al., 1994; Higgins und Gottschalk, 1997) und Gardnerella vaginalis ist eng mit bakterieller Vaginitis verbunden (Moran et al., 1992; Pybus und Onderdonk, 1997). Diesen Proteinen ist wie anderen prominenten Porenformern (Colicin A (Jeanteur et al., 1994;), alpha-Toxin (Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991a), Aerolysin (Rossjohn et al., 1997) und Streptolysin-O (Boulnois et al., 1992)) gemeinsam, daß sie von einzelligen Organismen stammen. Über die lytischen Proteine der mehrzelligen Organismen liegen, sieht man von den Säugern ab, sehr wenig Daten vor (Mangel, 1992; Macek et al., 1994; Narat et al., 1994). Für vergleichende Untersuchungen erweist sich dies als Hindernis. Vor allem wenn sie phylogenetische Einblicke gestatten sollen, gilt ein Vergleich von mindestens drei verschiedenen Taxa als notwendig (Rieppel, 1987; Wake, 1990; Copper et al., 1992).

Gibt es neben der Funktionsähnlichkeit der Porenformer auch ein gemeinsames strukturelles Motiv? Die Frage resultierte aus der bis heute offenen Auseinandersetzung von Bhakdi und Tranum-Jensen (1991b) vs. Esser (1991) nach der Struktur der Läsion: als Proteinpore ("protein-walled channel", Bhakdi und Tranum-Jensen (1991b)) oder als Lipidpore ("leaky patch formation", Esser (1991)).

Abb. 1. Die Porenkonzepte vom (A) Esser (1991) und (B) Bhakdi und Tranum-Jensen (1991b). Beide Modelle wurden in der Debatte über den Mechanismus der Komplement-induzierten Lyse vorgeschlagen. Modell A demonstriert die ’leaky patch hypothesis‘; der Einbau des Porenkomplexes in die Membran induziert eine Neuordnung der Lipide, so daß die hydrophilen Kopfgruppen der Lipide einen Lipidkanal bilden. Modell B zeigt das Konzept des "protein-walled channel" (“Complement lysis: a hole is a hole“, Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991). Im Modell B bleibt der Komplex fest mit der Membran verbunden. Der Defekt in der Membran ist deshalb stabil und besitzt eine feste, definierte Größe. Die Pfeile zeigen mögliche Passagen der hydrophilen Moleküle im jeweiligen Konzept an (modifiziert nach Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991b).


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Ojcius und Ding-E Young (1991) haben eine Systematisierung der porenbildenden Proteine in große und kleine Porenformer vorgeschlagen. Für die kleinen porenbildenden Proteine/Peptide, zu denen Mangainin, Cecropine und das Staphylococcus delta-Toxin gehören, wurde als gemeinsames Motiv eine "rigide" (Ojcius

und Ding-E Young, 1991), dreidimensionale Struktur aus amphiphilen alpha-Helices bzw. beta-Faltblättern gefunden. Für die großen porenbildenden Proteine, mit den Vertretern Perforin oder Aerolysin, konnte kein gemeinsames Motiv nachgewiesen werden. Ohne sich auf diese Überlegungen zu beziehen, postulierte Tytler et al. (1993) als mögliches gemeinsames Motiv bei porenbildenden Proteinen, die nach der Einteilung von Ojcius und Young mehrheitlich den kleinen Porenformern zuzuordnen wären, einen Kegel als die Membran destabilisierende Struktur, der sich invers - mit dem Stumpf zuerst - in die Membran integriert. Das Modell des "umgekehrten Kegels" ist für die Störung der Bilayerstruktur der Membran durch spezifische Phospholipide (z.B. Phosphatidylserin in Gegenwart von Ca2+, Datta, 1987) gut dokumentiert.

Da sich Untersuchungen zu Porenformern größtenteils auf Säuger und auf für Säuger pathogene Einzeller fokussieren, soll mit der vorliegenden Arbeit versucht werden, ein porenbildendes Protein bei Invertebraten zu isolieren und zu charakterisieren. Des weiteren soll eine vergleichende, funktionale Untersuchung ermöglicht werden, die Daten dreier Taxa (Protozoa (beziehungsweise anderer einzelliger Organismen), Annelida und Mammalia) einschließt. Diese Anzahl von Vertretern verschiedener Stämme gilt als unterste Grenze für die Anzahl der benötigten taxonomischen Gruppen für eine vergleichende Untersuchung, unabhängig davon, ob Analogien oder Homolgien erarbeitet werden sollen. Durch


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das Fehlen von eingehenden Untersuchungen porenbildender Proteine mehrerer Taxa sind vergleichende Untersuchungen bisher nur in sehr begrenztem Maße möglich (siehe auch: funktioneller Vergleich von Porenformern zweier Taxa: Bakterien und Holothurien<18> (Hatakeyama et al., 1996)).

Außerdem kann eine Analyse von lytischen Faktoren der Anneliden unser Wissen um die bisher kaum untersuchten sogenannten schnellen Immunreaktionen bei Invertebraten bereichern. Ein Großteil der eingehend untersuchten Immunreaktionen bei Invertebraten nimmt einen Zeitraum von Tagen oder Wochen ein<19> (siehe auch: Humphreys und Reinherz, 1994 und Kapitel 2.2.). Eine Aufteilung von schnellen Reaktionen im Sekundenmaßstab lag vor Beginn dieser Arbeit für dreikeimblättrige Invertebraten nicht vor.

Das Studium der immunologischen Leistungen der Wirbellosen offenbart nicht nur einzigartige - das meint, in Vertebraten nicht vorkommende - immunologische Mechanismen wie dem Phenoloxidase-System, das über die "gerbende Wirkung" (Götz, 1988) der Phenoloxidase Pilze oder Bakterien härtet und einkapselt. Es gibt uns auch die Möglichkeit, die vielfältigen Informationen über Immunreaktionen durch die Beschreibung von analogen Prozessen zu klassifizieren. Es ist sogar möglich, Einblicke in die Evolution hochentwickelter Immunsysteme der Vertebraten zu erhalten.

Aus den dargelegten offenen Fragen ergeben sich Ziele und Aufgaben der Arbeit. Es gelang vor Beginn dieser Arbeit trotz zahlreicher Versuche nicht, ein Hämolysin der Anneliden (Erstbeschreibung durch Du Pasquier und Duprat, 1968) zu isolieren. Anhand des isolierten Proteins soll untersucht werden, ob ein Protein ausreicht, um die Lyse der Zielzelle zu induzieren. Wenn es einen kooperativen Prozeß gibt (erstmals vermutet von Roch et al., 1984), ist zu klären, ob dieser von unterschiedlichen oder gleichartigen Proteinen induziert wird. Da für die Hämolysine der Anneliden eine alpha-helicale Struktur postuliert wurde (Milochau et al., 1997, wäre die Sekundärstruktur des Proteins zu überprüfen. Für eine Klassifikation des Hämolysins muß die Struktur der Membranschädigung untersucht werden. Bisher wurde eine Analogie des Hämolysins zu C9 verneint (Roch et al., 1989; Canicatti


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1990). Im Zusammenhang mit der Analyse der Membranschädigung, wäre ein Nachweis einer immunologen Verwandtschaft ein deutlicher Hinweis für eine Analogie dieser Strukturen. Die Identifizierung der molekularen Struktur des Targets ist ein zentrales Problem, um Aussagen über die biologische Wirkung des Hämolysins treffen zu können. Liposomen sind ein geeignetes Modell um die lytische Aktivität näher zu charakterisieren. Für die Aktivität einiger Invertebraten-Hämolysine (Macek et al., 1994; Meinardi et al., 1995) wurde die Bedeutung von Sphingomyelin beschrieben, es wird vermutet, daß Sphingomyelin ein wichtiger Rezeptor für die Membranwechselwirkung dieser Proteine ist.

Ein bisher ungelöstes Problem ist der Schutz der Invertebraten vor ihren eigenen Hämolysinen. Daraus ergibt sich die Zielstellung, ein mögliche regulierende Struktur zu identifizieren und diese vergleichend zu charakterisieren.

Bisher sind die mit Eisenia fetida (ssp.) gewonnenen Resultate über die hämolytischen aktiven Komponenten oft widersprüchlich. Ein Abgleich der neu gewonnenen mit den bereits vorhandenen Daten sollte es daher ermöglichen, die Unterschiede der Moleküle näher zu charakterisieren und insgesamt aufzuklären, ob Eisenia fetida eine homogene Gruppe darstellt.


Fußnoten:

<1>

Die Definition der Immunität als Fähigkeit eines Organismus, Krankheiten zu widerstehen, folgt der erweiterten Definition von Götz (1988). Diese verzichtet bewußt auf eine Einteilung in: Resistenzmechanismen für Wirbellose und Immunreaktionen nur für Wirbeltiere. Die Einteilung wird insbesondere außerhalb des angelsächsischen Sprachraums häufig noch vorgenommen (Friemel und Brock, 1990).

<2>

Die Immunologie bildete sich historisch als Zweig der Medizin heraus, da das Objekt der Medizin -der Mensch- Experimenten nicht zur Verfügung stand, wurden Tiermodelle gesucht; so stammen heute Theorie, Konzept und Technik der Immunologie hauptsächlich aus der wissenschaftlichen Auseinandersetzung mit einer einzigen Wirbeltierart - Mus musculus (Hausmaus). Die Resultate, die an der Maus gewonnen wurden, lassen sich nur an anderen Säugern verifizieren. Die Abwehrmechanismen von über 95% aller Organismen (den Wirbellosen) sind darum nur in geringem Maße aufgeklärt (Cooper et al., 1992).

<3>

Die terminalen Komponenten C5, C6, C7, C8 und C9 oligomerisieren zu einem transmembranalen Kanal - dem lytischen Membranangriffskomplex (MAC). Die Sequenzanalyse ergab eine große Übereinstimmung der Proteine C5, C6, C7, C8 und C9 mit Perforin, dem Killerprotein bestimmter Lymphozytenpopulationen.

<4>

Dazu gehören (in der Reihenfolge ihres phylogenetischen Auftretens): Perforin, C9, C8, C7, C7 und C6. Perforin ist das kleinste und älteste Molekül (535 Aminosäuren). Das phylogentisch jüngste und komplexeste Protein ist C6 (913 Aminosäuren) (DiScipio und Hugli, 1989; Tschopp und Nabholz, 1990).

<5>

Selbstverständlich ist ein Vergleich zwischen allen taxonomischen Gruppen möglich, aber gerade vom evolutionären Standpunkt aus erscheint eine vergleichende Studie ab den dreikeimblättrigen Organismen (Triploblasten) sinnvoller. Eine natürlich vorkommende humorale Immunität wird beispielsweise erst ab den Cölomata angenommen; Prozesse wie die Phagozytose, die zum Teil zu den Abwehrprozessen gerechnet werden, finden sich im gesamten Tierreich. Dort, wo in dieser Arbeit ein allgemeiner Vergleich porenformender Proteine aller taxonomischer Gruppen erfolgt, geschieht dies unter funktionellen Gesichtspunkten.

<6>

NK-Zellen (natürliche Killer-Zellen) perforieren die Zielzelle mit porenbildenden Proteinen (Perforin) ohne vorherigen Antigenkontakt. Während dies bei Vertebraten nicht für die Mehrzahl der Immunreaktionen gilt, ist in Invertebraten die unmittelbare Erkennung ohne vorherigen Kontakt die Regel (Humphres und Reinherz, 1994)

<7>

Es wird vermutet, daß die Thionine eine Auseinanderstezung der Pflanze mit Bakterien ermöglichen (Huang et al., 1997).

<8>

Die Tatsache, daß nicht selten Domänen in ganz verschiedenen Proteinen mit übereinstimmender Sequenz gefunden wurden, hat zu der Vorstellung von der Neukombination von Genteilen durch Exonshuffling geführt. Die Theorie der Exonkombination ließ sich durch den Nachweis von acht homologen Exons (die zusammen 400 Aminosäuren codieren) im LDL-Rezeptor und im EGF-Vorläufer (epidermal growth factor), erstmals belegen. Außerdem sind mehrere der Sequenzen aus LDL-Rezeptor und EGF-Vorläufer mit der Komplementkomponente C9 homolog (Südhof, 1985).

<9>

Breitere Akzeptanz fand die These von der möglichen evolutionären Verwandtschaft zwischen dem pro-Phenoloxidase-System und Komplement (Söderhall, 1982, Johansson and Söderhall, 1996). Beide Systeme haben einen kaskadenartigen Ablauf und einzelne Komponenten werden durch proteolytische Enzyme aktiviert.

<10>

Fearon (1997) bezieht sich auf Janeways (1989) Bemerkung vom "kleinen dreckigen Geheimnis des Immunologen". Diese bezieht sich auf die experimentelle Induktion einer adaptiven Immunantwort mit Freud‘schem Adjuvant (Mineralöl, Emulgator und abgetötete Mykobakterien); im Experiment wird ein Protein erst durch das Einbringen in einen "Mineralöllösung" ein Antigen. Das "reine Antigen" muß "kontaminiert" werden, um eine spezifische Immunantwort zu induzieren. Erst wenn Effektoren der nicht-spezifischen Immunität die Mykobakterien erkennen, könne das beigemischte Antigen eine adaptive Immunantwort hervorrufen.

<11>

Auch wenn der Term "anticipatory/non-anticipatory" aus semantischen Gründen nicht durchgängig akzeptiert wird (Cooper et al., 1992), ist es erstaunlich, wie sehr die äußerst willkürliche taxonomische Einteilung von Wirbellos/Wirbeltier den zwei Formen der immunologischen Erkennung folgt. Die Wirbeltiere verfügen mit den Antikörpern über die Möglichkeit, alle theoretischen Epitope (z.B. künftig synthetisierte Antigene) spezifisch zu erkennen, die Faktoren der Wirbellosen wechselwirken hingegen mit der Gesamtheit einer chemischen Gruppe auf der Oberfläche von potentiellen Parasiten.

<12>

Außerdem existiert seit 100 Jahren die von verschiedenen Autoren (referiert bei Kämpfe (1985)) diskutierte Ansicht, daß die Anneliden an die Basis der Entwicklung der Chordatiere zu stellen sind; diese "Wurm-Theorie" sieht in metamer gegliederten, wurmähnlichen Ausgangsformen die Ur-Deuterostomia, von denen sich die Vertebraten mit den später auftretenden Säugern direkt ableiten.

<13>

Memory-effect (immunologische Gedächtnis) ist die in Folge eines Erstkontaktes erworbene Fähigkeit des Organismus, auf einen späteren Kontakt mit einem gleichen oder ähnlichen Antigen mit einem schnellen Anstieg des Antikörpertiters oder einer schnelleren Proliferation sensibilisierter Lymphozyten (memory cells) zu antworten. Das so erworbene immunologische Gedächtnis kann mittels der Lymphozyten auf einen syngenen Organismus übertragen werden. Dieser Effekt wird für Invertebraten diskutiert, Nachweise gibt es u.a. für Anneliden und Nemertinen. Über den materiellen Träger des immunologischen Gedächtnisses bei Invertebraten wird bisher nur spekuliert (Bigger et al., 1981; Cooper et al., 1992).

<14>

Zur Jahrhundertwende eingeführter Begriff für Serumfaktoren, die eine Bindung von Bakterien und partikulären Antigenen am Phagozyten vermitteln. Mohrig et al. (1984) haben dem Vorhandensein von opsonierenden Faktoren in Lumbriciden widersprochen, hingegen gilt die stimulierende Wirkung von Opsoninen aus Vertebraten (z.B. Komplement C3-Fragmente) auf die Aktivität der Phagozyten aus Regenwürmern als gesichert (Laulan et al., 1988).

<15>

Dies bezieht sich auf die physiologische und immunologische (d.h. nicht-taxonomische) Literatur.

<16>

Genauere Untersuchungen liegen für dieses Phänomen bei der Reaktion NK-Zelle/Target vor (Liu et al., 1995), eine Beeinflussung durch Proteine der Membranoberfläche ist nur bei Antikörper-abhängigen Killerzellen möglich.

<17>

Diese beiden Einteilungen schließen sich nicht aus; die erste charakterisiert die Targetmembran hinsichtlich einer eng umgrenzten (diskreten) oder nicht umgrenzten (nicht-diskreten) Schädigung, die zweite Einteilung wird nach der Verwirklichung dieser Struktur durch das Toxin vorgenommen. Es ist jedoch zu diskutieren, inwieweit bei einer Membranschädigung, die durch eine Wechselwirkung von Toxin und Membran induziert wird, eine Einteilung nach Toxinwirkung zum einen und dem Resultat an der Membran zum anderen zwingend ist. Wir folgen dieser Einteilung, da sie international akzeptiert ist und eine Klassifikation der Toxine in der Literatur nach dieser Einteilung vorgenommen wird.

<18>

Die Vertreter der Holothurioidea (Seewalzen) sind Vertreter der Deuterostomier.

<19>

So wird allogenes Material bei Echinodermaten nach 300 Tagen zerstört, bei Anneliden werden für xenogene Gewebe noch 50 Tage für eine Abstoßungsreaktion benötigt. Beim Menschen wird allogenes Material beginnend nach 48 Stunden abgestoßen, Erfahrungen mit xenogenem Material (z.B. Affenherzen) liegen zu wenig vor, um eine gesicherte Größe zu bestimmen.


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