Lange, Sven: Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.

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Kapitel 2. MATERIAL UND METHODEN

2.1 Hälterung der Anneliden und Gewinnung der Cölomflüssigkeit

In den Experimenten kamen Tiere der folgenden Lumbricidenspecies zum Einsatz: Eisenia fetida fetida (Bouche), Lumbricus terrestris (L.), Allobophora caliginosa (Sav.). Sie wurden an 16 verschiedenen Regionen in Norddeutschland kurz vor Versuchsbeginn gesammelt, um eine längere Hälterung in Kulturgefäßen zu vermeiden. Die Hälterung erfolgte bei 15 °C - 20 °C in Material des natürlichen Milieus. Die Tiere wurden vor Versuchsbeginn mit Leitungswasser gereinigt und für 48 h mit feuchtem Filterpapier abgedeckt und bei 6 °C gelagert. Die Cölomflüssigkeit wurde durch Punktierung in den Cölomraum mit einer Glaskapillare gewonnen, die kaudal vom Klitellum in das Cölom eingeführt wurde. Die von 40 Tieren gepoolte Cölomflüssigkeit wurde zentrifugiert (13.000 x g, 17 min) und der Überstand wurde sofort für die Reinigung verwandt.

2.2 Gewinnung und Verwendung der Erythrozyten

Die Gerinnung des gewonnenen Vollblutes der jeweiligen Spezies (Hammel, Kaninchen, Ratte, Katze, Mensch) wurde durch den Zusatz von Heparin<20> (CP Pharmaceutical Limited, Wrexham) verhindert. Die Erythrozyten wurden durch eine Zentrifugation (1500 x g, 20 min) bei 4 °C sedimentiert und anschließend dreimal in 0,9 % (m/v) NaCl gewaschen.

Fixierung der Erythrozyten: Zum Nachweis einer agglutinierenden Aktivität von Proteinen wurden formalinisierte Erythrozyten verwandt: zu 100 ml einer 20% (v/v) Erythrozytensuspension wurden über 60 min tropfenweise 8,14 ml einer 37% (v/v) Formaldehydlösung gegeben. Nach Inkubation von 16 h bei 4°C wurde diese Lösung viermal mit 0,9 % (m/v) NaCl gewaschen und im Test verwandt.

2.3 Präparative Elutions-Polyacrylamidgelelektophorese

Eiseniapore und der Eiseniapore-regulierende Faktor wurde mittels präparativer Elutions-Polyacrylamidgelelektophorese isoliert.

Eiseniapore: Ein modifiziertes Ornstein-Davis Puffersystem (Tris/Chlorid/Glycin) (Ornstein, 1964, Davis, 1964) wurde für die Isolierung Eiseniapores verwandt: oberer und unterer Elektrodenpuffer (25 mM Tris, 192


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Glycin), Elutionspuffer (25 mM Tris, 192 Glycin, 2 mM reduziertes Glutathion, 1,5 mM Thioglykolsäure) und Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v/v) Glycerol, 0,025% (m/v) Bromphenolblau, 2 mM reduziertes Glutathion, 2 mM Thioglykolsäure und 4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid). Durch die Zugabe von reduziertem Glutathion und Thioglykolsäure konnte die biologische Aktivität des Proteins geschützt werden. Die Monomerkonzentration für eine maximale Auflösung der Proteine wurde empirisch mit analytischen Gelen (siehe: Analytische PAGE) gewonnen. Das genutzte System, welches für die präparative Elektrophorese genutzt wurde, bestand aus einem Trenngel (38 ml Volumen Monomer von 7% (m/v) Acrylamid, 0,18% (m/v) Bisacrylamid) und einem Sammelgel (5 ml Monomer von 4% (m/v) Acrylamid, 0,106% (m/v) Bisacrylamid). Die präparative Elektrophorese (Model 491 Prep Cell, Bio-Rad, California, USA) lief für 13,5 h bei 15 W mit einer Flußrate von 1 ml/min bei einer Temperatur von 4 °C. Die Fraktionen wurden bei 4°C gesammelt und mit einer Suspension von 2% Schaferythrozytensuspension auf ihre lytische Aktivität im Mikrotiterassay getestet. Die hämolytischen Fraktionen wurden mit einer 5-10% (v/v) SDS-PAGE untersucht und die bis zur Homogenität gereinigten Proben dialysiert und lyophilisiert.

Regulatorproteine aus der Cölomflüssigkeit Anneliden: Für die Isolierung des Eiseniapore-regulierenden Faktors wurde die gleiche Prozedur wie für die Reinigung Eiseniapores verwandt. Das genutzte Gelsystem wurde wie folgt zusammengestellt: Trenngel (15 ml Monomer von 4% (m/v) Acrylamid und 0,106% (m/v) Bisacrylamid) und Sammelgel (5 ml Monomer 4% (m/v) Acrylamid und 0,106% (m/v) Bisacrylamid). Die Elutions-Elektrophorese wurde bei 15 W für 15 h bei einer Temperatur bei 4 °C durchgeführt, die Flußrate des Elutionspuffers betrug 1 ml/min. Die Fraktionen, die eine inhibierende Wirkung auf die lytische Aktivität von Eiseniapore besaßen, wurden mit einer 5-10% (v/v) SDS-PAGE untersucht. Die bis zur Homogenität gereinigten Proben wurden dialysiert und lyophilisiert.

2.4 Isolierung des Vitronectins (synonym: S-Protein)

Die Isolierung Vitronectins erfolgte mit einer Heparin-Sepharose Säule nach der Methode von Kitagaki-Ogawa (1990), modifiziert nach Nakashima et al. (1992): 1 ml Meerschweinchenserum (0,9 mg/ml) oder 1 ml Cölomflüssigkeit der entsprechenden Anneliden (4,2-6,9 mg/ml) passierten eine Säule (25 ml) mit dem Trägermaterial Heparin-Sepharose. Das Serum und die Cölomflüssigkeit passierten die Säule. Vitronectin oder der Anneliden-Regulator banden spezifisch an Heparin-Sepharose und konnten mit 0,5 M NaCl in Gegenwart von 8 M Harnstoff eluiert


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werden.

Dekomplementiertes Serum: Für einige Versuche wurde statt Vitronectin Serum oder dekomplementiertes Serum verwandt. Das Serum wurde nach der Methode von Nielsen et al. (1984) dekomplementiert. Hydrazin (0,2 M) wurde für 6 Stunden mit Serum inkubiert (37 °C), anschließend über Nacht bei 4 °C dialysiert.

2.5 Analytische Polyacrylamidgelelekrophorese (PAGE)

Die SDS-PAGE (nicht-reduzierende Bedingungen) wurde in einem 5-10% (m/v) Acrylamidgel in einer vertikalen Apparatur (Protean 2 xi Vertikal Electrophoresis Cells, Bio-Rad, California, USA) durchgeführt. Die Proben wurden durch das Mixen gleicher Volumina Probe und Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v/v) Glycerol, 2% (m/v) SDS, 5 % (m/v) beta-Mercaptoethanol), gefolgt von einem 5 minütigen Kochen, präpariert. Die Elektrophorese wurde bei 250 V und Raumtemperatur durchgeführt, die Dauer variierte je nach Probe von 2 bis 3 Stunden. Die Proteinbanden auf den Gelen wurden mit einer Färbung durch Silbernitrat nach der Methode von Heukeshoven et al. (1986) sichtbar gemacht.

2.6 Monospezifische Antiseren

Gegen Eiseniapore: Kaninchen wurden immunisiert, indem subdermal in den Tierrücken 20 µg des gereinigten Eiseniapores in Freund‘schem Adjuvant appliziert wurden. Eine zusätzliche Immunisierung wurde nach zwei Wochen wiederholt. Die Antikörper aus dem Serum wurden über eine Protein A-Sepharosesäule (Bio-Rad, California, USA) mit einer finalen Konzentration von 0,5 mg/ml gereinigt. Die Neutralisation von 80 µl Eiseniapore (5 µg/ml) erfolgte mit 40 µl Antikörper (100 µg Antikörper/ml) bei 25 °C für 20 min.

Gegen C9: Das polyklonale, gegen humanes, reduziertes C9 gerichtete Antiserum (aus dem Schaf) stammt von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland).

Gegen Vitronectin: Das polyklonale, gegen humanes Vitronectin gerichtete Antiserum (aus Kaninchen) stammt ebenfalls Calbiochem (Bad Soden, Deutschland).

2.7 Liposomenpräparation

Lipide (alle Sigma, Deisenhofen, Deutschland) der gewünschten Komposition (Gesamtkonzentration 750 µmol/l) wurden in 1 ml eines Gemisches von Chloroform/Methanol (1:1; v/v) gelöst und mit Stickstoff abgedampft. Die Lipide wurden in Tes-Puffer (100 mM NaCl, 2 mM Tes, 2 mM L-Histidin und 1 mM EDTA, pH 7,4) hydratisiert. Wenn nicht anders beschrieben, wurden kleine


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unilamellare Vesikel (small unilamellar vesicles, SUV) verwandt. Die SUV wurden durch Ultrabeschallung der Lipidsuspension auf Eis mit einem Branson-Sonifier (Danbury, USA) für 8 min präpariert. Große unilamellare Vesikel (large unilamellar vesicles, LUV) verschiedener Komposition wurden nach sechs 'Gefrier-Tau-Zyklen' mit einem Extruder (Lipex Biomembranes Inc., Vancouver, Kanada) gewonnen, indem sie durch zwei übereinander liegende Polycarbonat-Membranen (Nucleopore, USA) mit 0,1 µm Porengröße gepreßt wurden. ANTS (8-Aminonaphthalen-1,3,6-trisulfonsäure)/DPX (p-Xylen-bis-pyridiumbromid) (Molecular Probes, USA) - gefüllte Vesikel und Erythrozytenghost (siehe unten) wurden verwandt, um den Eiseniapore-induzierten Leakage von Vesikeln und 'ghost' zu messen. Der Einschluß des wasserlöslichen ANTS/DPX-Komplexes in die Vesikel und der Leakage-Assay erfolgte nach der Methode von Ellens et al. (1985). Die Vesikel enthielten 12,5 mM ANTS, 45 mM DPX, 20 mM NaCl und 10 mM Tris-HCl, pH 7,4. Die Vesikel wurden von dem nicht eingeschlossenem Material mittels Chromatographie über eine G-75 Säule mit Tes-Puffer abgetrennt. Der gleiche Puffer, aber mit 0,1 mM EDTA wurde für den Leakage-Assay genutzt.

2.8 Präparation von geschlossenen (resealed) Ghosts und Nanoerythrosomen

Geschlossene Ghosts und Nanoerytrosomen wurden nach einer Methode vom Schwoch und Passow (1978), modifiziert nach Pomorski et al. (1994), hergestellt: 2 ml einer eiskalten Suspension gewaschener Erythrozyten (90% gepackt) wurde in 1,2 mM Essigsäure, 4 mM MgSO4 und 1 mM CaCl2 (pH 3) lysiert. Nach 5 min wurden die Erythrozyten zentrifugiert, in Puffer (12,5 mM ANTS, 45 DPX, 50 mM Tris-HCl) resuspendiert und mit NaOH auf den pH-Wert von 7,4 eingestellt. Nanoerythrozyten wurden nach einer modifizierten Methode von Lejeune et al. (1994) präpariert. Ghosts wurden durch sechs aufeinanderfolgende Extrusionen durch 25 mm Polycarbonatfilter mit 1 µm Porengröße (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) mit Stickstoff erhalten. Der Extruder (ExtruderTM, Lipex Membranes Inc., Vancouver, Canada) wurde auf 37 °C temperiert. Die geschlossenen Ghosts und Nanoerythrosomen wurden von dem nicht eingeschlossenem Material wie die Liposomen (Kap. 3.7.) mittels Chromatographie über eine G-75 Säule mit Tes-Puffer abgetrennt. Der gleiche Puffer aber mit 0.1 mM EDTA wurde für den Leakage-Assay genutzt.


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2.9 Leakage-Assay

Die Leakage-Messungen wurden mit einem Shimadzu RF5001PC Spektrofluorometer (Duisburg, Deutschland) bei verschiedenen Temperaturen bei einer Anregungswellenlänge von lambdaEX = 355 nm (Spaltbreite 2 nm) und bei einer Emissionswellenlänge von lambdaEM = 530 nm (Spaltbreite 4 nm) durchgeführt, die zeitliche Auflösung betrug 0,5 Sekunden. Die Messung erfolgte in Quarzküvetten unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer. Die Freisetzung des gelösten ANTS/DPX Komplexes aus den Liposomen oder aus dem Lumen der ghosts führt zur Dissoziation des Komplexes und folgend zu einem ’dequenching‘ der Fluoreszenz des ANTS. Die Steigerung der Intensität der ANTS Fluoreszenz ist der gemessene Leakage. Zur prozentualen Bestimmung des Leakage wurde zum Ende eines jeden Experiments Triton X-100 (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zugegeben (Endkonzentration 0.1 %, v/v), was zu einer maximalen Verdünnung und Dissoziation des ANTS/DPX Komplexes (entspricht 100% Leakage) führte.

2.10 Hämolyse Assay

Die Freisetzung von Hämoglobin aus Schaf-, Katzen-, Ratten-, Maus- und Human-Erythrozyten wurde verwandt, um die zytotoxische Aktivität mittels Mikrotitrations-Technik zu bestimmen. Die lytischen Aktivitäten der Cölomflüssigkeit (25 µl) oder der Fraktionen (25 µl) der Proteinreinigung wurden durch fortlaufende Verdünnung in PBS-Puffer (150 mM NaCl, 5.8 mM NaH2PO4/Na2HPO4), gefolgt von einer Zugabe von 25 µl Erythrozyten (108 Zellen/ml), gemessen. Der Titer wurde als reziproker Wert der Verdünnung der Fraktionen angegeben, die noch eine Lyse der Erythrozyten ermöglichen.

Neben der Tirationstechnik wurde die hämolytische Aktivität über die Absorption des Hämoglobins bei 540 nm bestimmt (Hatakeyama et al., 1995). Gleiche Volumina (100 µl) von in PBS-Puffer verdünnten Eiseniapore (da Konzentrationen variieren, erfolgt die Konzentrationsangabe im jeweiligen Kapitel Ergebnisse) und einer 10 % (v/v) Erythrozytensuspension in gleichen Puffer, wurden nach der Inkubation, wenn nicht anders beschrieben, 10 min zentrifugiert (20000 x g). Die Lyse wurde bestimmt, indem die Absorption des Überstanden vermessen wurde (Zeiss PMQ Spectrophotometer, Oberpfaffenhofen, Deutschland). Alle Messungen wurden auf den Leerwert (PBS-Puffer) korrigiert, die 100% Lyse wurde durch Zugabe von 0,003% (Aldrich, Steinheim, Deutschland) bestimmt.

Der Komplementtiter des Serums von Meerschweinchen wurde in Barbiturat-Gelantine-Puffer als Immunhämolyse bestimmt. Entsprechend dem internationalen


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Standard wird diejenige Menge Serum ermittelt, die eine 50%ige Hämolyse herbeiführt. Die hier verwandte Methode folgte den WHO Richtlinien zur Bestimmung der hämolytischen Aktivität von Komplement (Friemel, 1991), die Mengen- und Konzentrationsangaben wurden diesen Vorschriften entsprechend in g/l und ml angegeben.

Lösungen. Stammlösung A: Na-5,5-diethylbarbiturat (5,1 g/l), NaCl 41,5 g/l, 1n HCl (17,3 ml), MgCl2 x 6H20 (0,51 g/l), CaCl2 x 6 H2O (0,164 g/l); Stammlösung B: 1g Gelantine in 800 ml A.dest; Gebrauchslösung (Barbituratpuffer): 1 Volumenteil Stammlösung A und 4 Volumenteile Stammlösung B mischen und pH 7,4 einstellen. Das zu untersuchende Serum wird ohne antikoagulatierende Substanzen, wie z.B. Heparin entnommen, eine Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann 10 min bei 1400 x g, 4°C, zentrifugiert. Adsorbieren des Meerschweinchen-Serums: 9 ml einer 1:10 (in Barbituratpuffer) verdünnten Serummischung werden mit 1 ml Sediment aus Hammelerythrozyten bei 4°C inkubiert. Amborzeptortitration: Die Komplementlyse wird über Antikörper vermittelt. Darum müssen die Zielzellen (Erythrozyten) erst mit einem Antikörper (Hämolysin oder Amborzeptor) sensibilisiert werden. Die Titration des Hämolysins gegen Schaferythrozyten erfolgte in einer Mikrotiterplatte, in die jeweils 25 µl Barbituratpuffer pro Titerloch ausgetropft wurden. In diesem Puffer wurde eine 1:50 Verdünnung (in Barbituratpuffer) des Amborzeptors (Sächsisches Serumwerk, Dresden, Deutschland) titriert, gefolgt von 25 µl einer Erythrozytensuspension (5x108 Zellen/ml) und der gleiche Menge einer 1:200 Barbituratpuffer-Verdünnung des Serums. Die Platte wurde eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Amborzeptorverdünnung, die gerade noch zu einer Lyse führt, wird als "hämolytische Einheit" bezeichnet. Die Sensibilisierung der Erythrozyten erfolgt durch Mischen gleicher Teile aus Erythrozytensuspension und einer Amborzeptor-verdünnung, die zwei hämolytischen Einheiten entspricht. Der Ansatz wird 30 min (37°C) inkubiert und sofort verwandt. Komplementtitration: Serum wird in Barbituratbuffer einer geometrische Verdünnungsreihe titriert. Die dann zugefügten 25 µl der sensibilisierten Hammelerythrozyten und 25 µl des Barbituratbuffer werden eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Auswertung der Platte erfogt entweder durch direktes Betrachten oder unter einem Lesegerät (siehe auch: Friemel, 1991).

2.11 Charakterisierung von membranbindungs- und lytischer Aktivität von Eiseniapore

Um die Membranbindung und lytische Aktivität von Eiseniapore an


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Schaferythrozyten zu charakterisieren, wurde der Einfluß von 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1,5 mM Ca, 1,5 mM Mg, 1 mM Cu, 150 I.E. Heparin, 0,4µM Vitronectin und 0,5 mol% Lyso-PC mittels zweier Methoden untersucht: (i) Membranbindung von Eiseniapore: Bei der Inkubation (30 min) von Eiseniapore mit Schaferythrozyten bei 0°C erfolgt nur eine Bindung an die Targetmembran, eine lytische Aktivität ist bei dieser Temperatur nicht feststellbar. Die Bindungsreaktion von Eiseniapore und Membran wurde in Gegenwart der oben aufgeführten Ionen und Substanzen getestet. Die Erythrozyten wurden anschließend mit eiskaltem (0°C) PBS-Puffer (150 mM NaCl, 5.8 mM NaH2PO4/Na2HPO4) gewaschen, um das ungebundene Protein zu entfernen. Die Bindung Eiseniapores wurde durch Hämolyse (siehe Hämolyse-Assay, Kap. 3.11.) nach Inkubation (30 min) bei 37°C bestimmt. (ii) Lytische Aktivität von Eiseniapore: Eiseniapore wurde zwecks Bindung an die Membran bei 0°C für 10 min mit Erythrozyten inkubiert und gewaschen (0 °C). Eine Lyse der Erythrozyten konnte bei diesem Schritt nicht festgestellt werden. Der Eiseniapore-Erythrozyten-Komplex wurde dann bei 37°C unter Anwesenheit der oben angeführten Ionen und Substanzen für 30 min inkubiert. Nachfolgend wurde die Eiseniapore-induzierte Hämolyse bestimmt.

2.12 Messung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz

Die Fluoreszenz wurde bei 25 °C mit einem Aminco Bownman Series 2 Luminescence Spektrometer (Rochester, NY, USA) unter Verwendung einer 10 mm Quartzküvette gemessen. Die Lösungen wurden bei Durchmischung mit einem Magnetrührer zwei Minuten temperiert. Die Intensität der Proteinfluoreszenz wurde bei einer Wellenlänge von lambdaEM = 336 nm (Spaltbreite 4 nm) gemessen, die Anregung erfolgte bei einer Wellenlänge von lambdaEX = 286 nm (Spaltbreite 2 nm). Die Spektren wurden jeweils viermal akkumuliert und mit dem Algorithmus des Softwareprogrammes des Spektrometers geglättet. Die in Proteinabwesenheit bestimmte Hintergrundintensität wurde subtrahiert. Die Lage der Maxima wurde durch Differenzieren (TableCurve 2D, Algorithmus: Savitzky-Golay) der Fluoreszenzkurven ermittelt.

2.13 Elektronenmikroskopie

Membranen der Vesikel oder ghosts wurden in Abwesenheit (Kontrolle) und Anwesenheit von Eiseniapore mit 1% Glutaraldehyd bei Raumtemperatur vorfixiert. Die Vorfixierung wurde nach 10 min durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 7,4, gestoppt. Die Proben wurden auf einen doppelten Karbonfilm gelegt und mit 1%


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Phosphowolframsäure, pH 7.0 fixiert. Zur Unterstützung wurden Kupfergrids (400 Maschen), die mit einem Karbonfilm überdeckt waren, benutzt. Die so vorbereiteten Proben wurden mit einem EM 400T Elektronenmikroskop (Phillips, Eindhoven, Niederlande) bei 80 kV und einer Vergrößerung von 60.000x und 80.000x aufgenommen.

2.14 Circulardichroismus/CD-Spektroskopie

Das CD-Spektrum wurde in geschmolzenen Silikazellen mit 1 mm Schichtdicke mit einem JASCO J-720 Spektropolarimeter aufgezeichnet. Die Temperatureinstellung erfolgte über ein Wasserbad. Das Spektropolarimeter war mit einem PC für die Datenaufnahme und -auswertung verbunden. Das Spektrum wurde in Bereich von 195 nm bis 250 nm mit einer Scangeschwindigkeit von 10 nm/min aufgenommen. Für ein Spektrum wurde die Probe dreimal gescannt. Für die Datenverarbeitung der Spektren wurde die Grundlinie subtrahiert, um anschließend mit der zum Spektropolarimeter gehörenden Software die so bearbeitenden Spektren auszuwerten. Die Proteinkonzentration betrug 3 µM in PBS-Puffer, pH 7.2.

2.15 Osmotische Experimente

Der effektive Innendurchmesser der Proteinpore, die durch Eiseniapore gebildet wurde, kann mit Hilfe von Schaferythrozyten unter Verwendung der von Bhakdi et al. (1984) und Moran et al. (1992) gewonnenen Daten über die Größe von Protektoren, bestimmt werden. Schaferythrozyten (2%, v/v) wurden in PBS-Puffer suspendiert, dem jeweils 30 mM der folgenden Substanzen zugesetzt wurde: Sucrose (effektiver molekularer Durchmesser: 0.9 nm), Raffinose (1.3 nm), Dextran 4 (3 nm), Inulin (3.5 nm), Polyethylenglycol 4000 (4 nm). Nach 30 min Inkubation (37°C) wurden 25 µl der mit Protektor behandelten Erythrozyten auf die 25 µl in einer Mikrotiterplatte titrierten Eiseniaporesuspension (Ausgangskonzentration: 5 µg/ml) gegeben. Die Hämolyse wurde nach 30 min Inkubation bei 37 °C bestimmt. Als Kontrolle, ob die verwandten Protektoren Eiseniapore direkt beeinflussen, galt folgender Test: Die Zellen wurden mit dem Puffer gewaschen, der die Protektoren enthielt, und anschließend in Protektoren-freiem Puffer resuspendiert. Bei allen im Test verwandten Protektoren war eine sofortige Lyse der Zellen nachweisbar, so daß geschlußfolgert werden kann, daß weder Inulin, Dextran oder PEG die Bindung von Eiseniapore an die Membran beeinflussen.


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2.16 Immunoblot-Analyse (Westernblot)

Das Immunoblotting wurde mit der 'semi-dry' Technik des Bio-Rad Transblott (Bio-Rad, California, USA) durchgeführt. Die elektropohoretisch separtierten Komponenten wurden vom SDS-Gel mit 3 mA/cm2 über 60 min in Tris/Glycin/Methanol Puffer (25 mM Tris-HCl, 190 mM Glycin) auf Nitrocellulose bei Raumtemperatur transferriert.

Die Nitrocellulosemembranen wurde in 10% fettfreier Milch (60 min, 24°C) inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Für die immunchemische Detektion wurde die Nitrocellulosemembran mit den primären Antikörpern (anti-C9 und anti-Vitronectin Antikörper) für 12 h bei 4°C inkubiert und dann in einer 60 minütigen Reaktion mit Peroxidiase-konjugiertem Sekundärantikörpern (SIFIN GmbH, Berlin, Deutschland) bei Raumtemperatur behandelt und anschließend mit einem Enzymsubstrat (10 mg/ml O-Phenyldiamin in Methanol 1:100 und mit 0.03% (v/v) H2O2 gelöst (alles Serva, Heidelberg, Deutschland)) entwickelt.

2.17 ESR Messungen

Um die Membranfluidität der Liposomen zu charakterisieren, wurde das ESR Membranspektrum der spinmarkierten Fettsäuren I(12,3) (5-doxyl-Stearinsäure, SIGMA, Deisenhofen, Deutschland) bestimmt. Die paramagnetische NO-Gruppe befindet sich in dem hydrophoben Membranbereich der Kopfgruppenregion der Lipide. Die Konzentration der spinmarkierten Fettsäuren betrug 1 mol% der endogenen Lipide.

Die Spektren wurden mit einem Bruker ECS 106 (Bruker, Karlsruhe, Deutschland) gemessen. Das Gerät war mit einer Temperaturkontrolle ausgestattet. Über die Spektren wurde der Ordnungsparameter bestimmt, der als Maß der Membranfluidität herangezogen werden kann (Marsh, 1981). Eine Zunahme der Fluidität bedingt eine Abnahme dieses Parameters. Der Ordnungsparameter S wurde wie folgt bestimmt:

S~=~{(A_ DLINE ~-~A _ LINE )} over {(A_{zz}~-~A_{xx})}~{a_0} over {{1 over 3}(A_ DLINE +2A_LINE )}

mit A und A als äußerer und innerer Hyperfeinaufspaltung des Spektrums. Azz (33 G) und Axx (6,95 G) sind die Hyperfeintensoren und a0 (15,10 G) ist die isotropische Hyperfeinkopplungskonstante (Schreier et al., 1978).

2.18 Sequenzierung Eiseniapores

Eiseniapore wurde mir eiskaltem Ethanol gefällt und das erhaltene Präzipitat


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mit eiskaltem Ethanol (80%) gewaschen. Der so erhaltene Rückstand wurde für die PAGE im Probenpuffer gelöst und über ein 10% Tris/Tricin Gel (0.75 mm, 6 x 9 cm für eine Stunde bei 30 V und weitere 1,7 Stunden bei 30 mA in einer Mini Protean II Zelle (BioRad) nach Schägger und von Jagow (1987) aufgetrennt. Unmittelbar nach der Trennung wurde ein 'semi-dry' Transfer (Trans-Blot SD Transfer Zelle (BioRad, CA, USA)) auf eine ProBlottTM Membran durchgeführt. Für den Transfer wurde 10 mM CAPS Puffer/10% (v/v) Methanol, pH 11 verwendet. Die Blottingzeit betrug 1,5 h bei einer konstanten Stromstärke von 1 mA/cm2. Die Membran wurde für eine Minute mit Coomassie Blue gefärbt, danach in 50% (v/v) Methanol entfärbt und getrocknet. Die anschließende spezifische enzymatische Spaltung der Eiseniapore Blotbande erfolgte mit Lys-C (Boehringer, Mannheim, Deutschland) nach Fernandez et al., 1994: 1% (v/v) hydrogenetiertes Triton X 100 wurde in dem Spaltpuffer (0.1M Tris/HCl/10% (m/v) Acetonitril, pH 8.45) mit einer zerschnittenden Eiseniapore Blotbande (1 mm2) gegeben. Die Spaltungsdauer unter Verwendung von 2µg Lys-C in 60 µl Spaltpuffer betrug 22 h bei 37°C unter leichtem Schütteln der Lösung. Der Abbruch der Reaktion erfolgte durch Ansäuern mit 10% Trifluoressigsäure. Die so erhaltene Lösung wurde direkt über die Probenschleife auf eine Umkehrphasen-Säule (mRPC C2/C18; SC2,1/10 Säule (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) injiziert und in einer HPLC Anlage (SMART, Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) aufgetrennt. Lösung A 0.1 % (v/v) TFA in A. dest, Lösung B 0.1% (v/v) TFA in Acetonitril. Der verwendete Gradient: Start bis 5 min, 5% Lösung B; 5 min bis 65 min Erhöhung auf 45% Lösung; 45 min bis 110 min, 90% Lösung B; 110 min bis 125 min konstant 90% Lösung B. Die Flußrate betrug 100 µl/min. Für die N-terminale Peptid-Sequenzierung wurden die einzelnen RP-HPLC Fraktionen direkt auf ein mit Polybren beschichtetes Glasfiber-Filter getropft und in einem automatischen Proteinsequenzierer (Model 477A/120A, Applied Biosystems, Clifton, USA) abgebaut. Die gefundenen N-terminalen Sequenzen wurden unter Verwendung des FASTA Programms und der Swissprot-Datenbank einer Recherche unterzogen.

Fußnoten:

<20>

Außer bei den Versuchen zur Bestimmung des Komplementtiters


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