Lange, Sven: Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.

37

Kapitel 3. ERGEBNISSE

3.1 Reinigung und Charakterisierung eines hämolytischen Proteins aus der Cölomflüssigkeit E. f. fetidas

3.1.1 Die Isolation des hämolytischen Faktors mittels präparativer Elektrophorese zeigt ein 38 kDa Protein

Eiseniapore wurde aus der Cölomflüssigkeit Eisenia fetida fetidas mittels präparativer, nativer Polyacrylgelelektrophorese (PAGE) isoliert. Die Cölomflüssigkeit (1.2 ml) mit einer Proteinkonzentration von 6,9 mg/ml wurde auf das Sammelgel der PAGE geladen. Der Elutionspufferfluß startete, als die Comassie-Blue Bande das Ende des Gels erreichte. Das Eluat wurde in Fraktionen von 1 ml gesammelt (Abb. 4.1.). Die Ausbeute betrug 130,2 % (siehe Diskussion) mit einem Reinigungsfaktor von 86,5 (Tabelle 4.1.). Die Proteinkonzentration des isolierten Proteins (Eiseniapore) betrug 5 µg/ml bei der Bestimmung mit Bradford-Reagenzien. Im Titrationsassay in PBS-Puffer (pH 7,4, 24 °C) lag die lytische Aktivität bei 64 hämolytische Einheiten (HU) pro Milliliter. Es konnte mit der SDS-PAGE bestätigt werden, daß das Protein bis zur Homogenität gereinigt wurde (Abb. 4.12). Das über Gewichtsmarker bestimmte Molekulargewicht Eiseniapores lag bei 38 kDa.

Tabelle 4.1. Ein-Schritt Reinigung Eiseniapores

Material

Protein

(total)

mg

Aktivität

u/ml

Aktivität

(total)

u

spezifische Aktivität u/mg

Aus-beute

%

Reinigungsfaktor

Cömlomflüssigkeit

8,28

1024

1229

148

100

1

Eiseniapore

0,125

64

1600

12800

130,2

86,5

Die hämolytische Aktivität Eiseniapores war bei 4 °C für 4 Tage stabil. Im lyophilisiertem Zustand kann das Protein für 15 Monate bei -20 °C ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.

Abbildung 4.1. Elutionsprofil der kontinuierlichen Elutions-Elektrophorese. Der Elutionspuffer enthielt reduzierende Agentien, um die lytische Aktivität Eiseniapores zu schützen. Probe: 8,28 mg Proteinsuspension aus der Cölomflüssigkeit für die Reinigung von Eiseniapore. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die Absorption wurde bei 280 nm gemessen. Weitere Details beschrieben in Material und Methoden.


38

3.1.2 Sequenzdaten Eiseniapores nach Spaltung mit einer Endopeptidase

Die Sequenzierung des N-Terminus Eiseniapores war nicht möglich, da dieser blockiert war. Deshalb wurde, wie in Material und Methoden beschrieben, Eiseniapore elektrophoretisch getrennt, geblottet und anschließend gefärbt. Nachfolgend wurde Eiseniapore aus den luftgetrockneten Blottingmembranen herausgeschnitten.

Aus den so gewonnenen Stücken (1 mm2) der Blottingmembran wurde Eiseniapore spezifisch mit Lys-C enzymatisch gespalten und in einer HPLC aufgetrennt. Die Fragmente (Tab. 4.2) wurden in einem Proteinsequenzer für die N-terminale Peptid-Sequenzierung abgebaut und einer Datenbankrecherche (FASTA und Swissprot) unterzogen. Von den mit Lys-C gewonnenen 12 Fragmenten waren fünf blockiert (nicht in der Tabelle gezeigt). Es kann vermutet werden, daß sie der Region des N-Terminus von Eiseniapore entstammen.

Tabelle 4.2. Interne Sequenzdaten von Eiseniapore nach Spaltung mit der spezifischen Endopeptidase Lys-C

Sequenz

Datenbankrecherche

Lys-Gly-Ile-Gln-Gly-Gly

Serin Carboxypeptidase

(E.C. 3.4.16.5)

Lys-Ala-His-Phe-Lys

Globin C aus L. terrestris

Lys-Val-Asp-Ser-Pro-Glu-Ser

Lipoxygenase (E.C. 1.13.11.12)

Lys-Arg-Val-Asp-Ile-Glu-His-Pro-Glu

Globin C aus L. teresstris

Lys-Ile-Pro-Asp-Asn-Tyr-Phe-Asp-Ala-Phe

Globin AIII aus L. terrestris

Lys-Ile-Gly-Phe-Gly-Arg-Leu-Leu-Leu-Thr

Globin C aus L. terrestris

Lys-Glu-Ile-Pro-Glu-Val-Ala-Asp-Leu-Phe

Globin C aus L. terrestris und Protein C9


39

3.1.3 Die Interaktion Eiseniapores mit Erythrozyten verursacht Agglutination und Lyse

Unter Verwendung von Formaldehyd-fixierten Erythrozyten konnte eine agglutinierende Aktivität von Eiseniapore nachgewiesen werden. Die höchste agglutinierende Aktivität ist mit einem Titer von 1:256 bei Humanerythrozyten (Tabelle 4.3) geringer als die schwächste lytische Aktivität (1:2530) bei Mäuserythrozyten. Deshalb wird sie im Titrationsassay bei Verwendung nicht fixierter Erythrozyten überdeckt. Eiseniapore induziert eine deutliche Hämolyse von Erythrozyten unterschiedlicher Säugerarten. Die Sensitivität der Erythrozyten gegen die lytische Aktivität Eiseniapores fällt in folgender Ordnung: Schaf-, Human-, Katzen-, Ratten- und Mäuseerythrozyten. Der gemessene Hämolysetiter korreliert mit mit dem Sphingomyelinanteil der Targetmembranen der verwendeten Erythrozyten (Abb. 4.2). Schaferythrozyten mit ihrem Anteil von 51% Sphingomyelin werden mit einem Titer von 1:8192 lysiert. Bei dem geringeren Sphingomyelinanteil von 12.1% in der Membran der Mäuseerythrozyten liegt die durch Eiseniapore induzierte Lyse bei einem Titer von 1:2530.

Tabelle 4.3. Hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore an fixierten Erythrozyten (n=5)

Species

Agglutinationstiter

Ovis domestica (Schaf)

1:32

Homo sapiens (Mensch)

1:256

Felis libyca (Katze)

1:16

Rattus rattus (Ratte)

1:128

Mus musculus (Maus)

1:16

Abbildung 4.2. Hämolyse von Erythrozyten verschiedener Säugetierarten induziert durch Eiseniapore. Der hämolytische Titer wurde mit Mikrotitrations-Assay untersucht. Der Hämolyse-Titer wurde als reziproker Wert der Verdünnung angegeben, die noch eine Hämolyse induziert (ausführlich in Material und Methoden). Der Anteil an Sphingomyelin der Erythrozyten (Fehrenbach und Jürgens, 1991) ist in Relation zu der lytischen Aktivität von Eiseniapore gezeigt.


40


41

3.1.4 Charakterisierung der hämolytischen Aktivität von Eiseniapore

Die Charakterisierung der stärksten Aktivität Eiseniapores, die lytische Wirkung auf Erythrozyten, erfolgte nach dem von Suelter (1990) ausgearbeiteten Schema der Proteincharakterisierung. Diese usprünglich für die Planung eines Reingungsschemas ausgearbeitete Prozedur wird heute vor allem für die Charakterisierung von Proteinen herangezogen (siehe Diskussion).

Diese Charakterisierung beeinhaltet die Bestimmung der Aktivität des gereinigten Proteins in der Gegenwart von Ethanol (20 %, v/v), Mercaptoethanol (50 mM), Glycerol (25 %, v/v), EDTA oder EGTA (10 mM), KCl oder NaCl (0.2 M), KSCN oder NaSCN (2 M). Außerdem wird zusätzlich die Wirkung ausgewählter Metallionen (10 mM Ca2+ oder Mg2+, 2 mM Fe2+ oder Fe3+, Ni2+, Co2+, 5 mM Zn2+ oder Cu2+ und 3 nM Au3+) und Anionen (5 mM SO42-, PO43- und CO3-) auf die Aktivität Eiseniapores untersucht.

Die Hämolyseaktivität Eiseniapores wurde an Schaferythrozyten bestimmt, da diese Erythrozyten die höchste Sensitivität gegen Eiseniapore zeigten (Kap. 4.3). Das Protokoll nach Suelter (1990) verlangt vor der Aktivitätsbestimmung eine Vorinkubation des gereinigten Proteins (Eiseniapore) mit den oben erwähnten Substanzen und Ionen für 0,5 h bei jeweils 4 °C und 37 °C (Tabelle 4.4). Beide Temperaturen sind nicht physiologisch, sie wurden genutzt, um dem Protokoll von Suelter (1990) zu folgen, da so die Möglichkeit des Vergleichens mit anderen Proteinen besteht. Um nicht nur den Einfluß dieser Substanzen auf die hämolytische Aktiviät Eiseniapores zu testen, sondern auch die Stablität in Gegenwart der Substanzen zu analysieren, ist außerdem noch eine längere Inkubation für 24 h - ebenfalls bei den beiden Temperaturen 4 °C und 37 °C - vorgesehen (Suelter, 1990). Der Kontrollwert der 100%-igen Lyse wurde durch Zugabe von (Endkonzentration 0,003%) unter den jeweiligen Inkubationsbedingungen bestimmt.

Die Inkubationen zeigten die starke Temperaturabhängigkeit der lytischen Wirkung Eiseniapores (Tab. 4.4a). Nach einer halben Stunde Inkubation bei 4 °C und 37 °C liegt die lytische Aktivität bei 22%<21> beziehungsweise 75% (Kontrolle: 100% Lyse bei Saponin Zugabe). Erfolgt die Inkubation über einen Zeitraum von 24 h, zeigt sich, daß Eiseniapore bei 4 °C stabil ist (25% lytische Aktivität), aber bei 37 °C einen Teil seiner lytischen Aktivität, die dann nur noch 12% beträgt, einbüßt. Glyzerol schützt Eiseniapore vor dieser teilweisen Inaktivierung über 24 h bei 37 °C


42

(siehe Tabelle 4.4a). Eiseniapore ist bei den untersuchten Temperaturen (4 °C und 37 °C) sowohl nach 0,5 h als auch nach 24 h resistent gegen Ethanol, es verliert seine hämolytische Aktivität nicht. Die Aktivität wurde weder nach 0,5 h noch nach 24 h bei den untersuchten Temperaturen durch die Gegenwart von 0,2 M NaCl beziehungsweise KCl beeinflußt. Eine Erhöhung der lytische Aktivität Eiseniapores konnte in Anwesenheit von SH-Gruppen nachgewiesen werden: nach 0,5 h (37 °C) steigerte sich die Aktivität in Gegenwart von 50 mM Mercaptoethanol von 75% (Kontrolle) auf 93%. EDTA oder EGTA verminderten die Aktivität von Eiseniapore erst nach einer Inkubation von 24 h; bei 4 °C vermindert die Anwesenheit von EDTA wie auch EGTA die lytische Aktivität auf 13%, die in Abwesenheit dieser Substanzen bei 25% lag (siehe oben). Bei der höheren Temperatur (37 °C) verursacht die Gegenwart von EDTA beziehungsweise EGTA einen Rückgang der Hämolyseaktivität auf 3 %.

Neben den bereits in der Substanzgruppe Salze (KCl, NaCl, KSCN und NaSCN) untersuchten Na+- und K+-Ionen wurde der Einfluß weiterer Metallionen ermittelt. Die Stabilität Eiseniapores wurde in Anwesenheit der Metallionen Ca2+ und Mg2+ weder bei 4 °C noch bei 37 °C beeinflußt. Die zum Test verwandten Metallionen hatten bei der Temperatur von 4 °C im Verlauf der kurzen Inkubation von 0,5 h keinen Einfluß<22>.


44

Tabelle 4.4a. Charakterisierung Eiseniapores (nach Suelter, 1990) (n=7)

Eiseniapore behandelt mit

hämolytische Aktivität Eiseniapores (%)

nach

 

0,5 h Inkubation bei

24 h Inkubation bei

 

4°C

37°C

4°C

37°C<23>

Puffer

21,8

74,9

24,4

11,9

2-Mercaptoethanol 50 mM

26

92,6

37,6

19,6

EDTA oder EGTA 10 mM

21,25

72,7

13

3

Glyzerol 25%

21,9

71,5

35

29,7

Ethanol 20%

24

73,5

23

11

KCl oder NaCl 0,2 M

21,3

72

19,1

10,4

KSCN oder NaSCN 2 M

22,1

65,6

18,4

5,9

Tabelle 4.4b. Einfluß von Metallionen auf die hämolytische Aktivität Eiseniapores

Eiseniapore behandelt mit

hämolytische Aktivität Eiseniapores (%)

nach

 

0,5 h Inkubation bei

24 h Inkubation bei

 

4°C

37°C

4°C

37°C

Puffer

21,8

74,9

24,4

11,9

Fe2+ 2 mM

19,5

40,4

14,6

6,5

Fe3+ 2 mM

18,7

42

9,1

2,7

Ni2+ 2 mM

20,3

18

11,7

7,4

Co 2+ 2 mM

16,4

39,2

11,4

4,6


45

Zn 2+ 5 mM

22

43

12

2,3

Cu2+ 5 mM

21,6

50,8

8

5,4

Au3+ 3 nM

19,2

10,1

0

0

Es konnten nachgewiesen werden, daß die lytische Aktivität Eiseniapores in Gegenwart von Eisen-Ionen unterdrückt wird, wobei die inhibierende Wirkung von Fe3+ höher als die von Fe2+ ist, was auf eine oxidative Zerstörung der lytischen Aktivität hinweist (Tab. 4.4b). Die inhibitorische Wirkung von Ni2+, Co2+ und Zn2+ war komplett durch Mercaptoethanol unterdrückbar, da dessen reduzierende Aktivität vermutlich vor der oxidativen Zerstörung der Metallionen schützte.Eine deutliche Inhibierung der lytischen Aktivität wurde in Gegenwart von sehr geringen Konzentration Au3+ (3 nM) bereits nach einer halben Stunde Inkubation bei 37 °C beobachtet. Die lytische Aktivität wurde nach 24 h Inkubation in Gegenwart von Au3+ vollständig zerstört.

Die untersuchten Anionen haben bis auf SO42- keinen Einfluß auf die Aktivität Eiseniapores. Sulfat-Ionen hemmen die Hämolyse jedoch erst bei einer Inkubationsdauer von 24 h: 14 % Restaktivität bei 4 °C und 5 % bei 37 °C.

3.1.5 Der Einfluß von Kohlenhydraten auf die hämolytische und hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore ist ein Hinweis auf den Lektincharakter

Verschiedene Kohlenhydratstrukturen zeigen im Titrationsassay eine Wirkung auf die hämolytische und hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore. Die Kohlenhydrate wurden in einer Konzentration von 0.1 M mit dem Puffer (PBS, pH 7,4) vorgelegt und in Anwesenheit des titrierten Proteins 30 min bei 37°C inkubiert. Das auch als "Zuckerinhibierungstest" bezeichnete Verfahren dient dem Nachweis von Strukturen, die an Proteine binden und so ihre Aktivität beeinflussen. Es wird postuliert, daß die in Lösung vorliegende Kohlenhydratstrukur identisch mit einem potentiellen, gegebenenfalls membranständigen Rezeptor ist. Die Inhibierung der hämolytischen und hämagglutinierenden Aktivität des Proteins - in diesem Falle Eiseniapore - in Anwesenheit dieser Kohlenhydrate gibt einen wichtigen Hinweis auf die Lektin/Lektin-ähnliche Struktur des untersuchten Proteins.

Die hämolytische Aktivität Eiseniapores ist durch folgende Kohlenhydrate hemmbar: 1-saures Glycoprotein, Fetuin, Blutgruppensubstanz A, Glycophorin, Mucin und Thyroglobin (Tab. 4.5). Keinen Einfluß der hämolytischen Aktivität


46

konnte in Gegenwart von L-Fucose, N-Acetyl-D-Galactose, D-Galactose, N-Acetyl-D-Glucose, D-Mannose, Mellibiose, N-Acetyl-D-Neuraminsäure und N-Acetyl-D-Glucosamin nachgewiesen werden.

Die agglutinierende Aktivität Eiseniapores wurde durch folgende der getesteten Zucker inhibiert: alpha1-saures Glucoprotein, Fetuin und N-Acetyl-D-Glucosamin. Für zahlreiche bakterielle Hämolysine (siehe Diskussion) bildet das Kondensationsprodukt aus Mannosamin und Pyruvat - die Neuraminsäure - den Rezeptor auf der Targetmembran. Deshalb haben wir als Ergänzung zu den Versuchen mit einfachen und komplexen Zuckern, auch Neuraminidase-behandelte Erythrozyten (Schaf) als Targetzellen verwandt. Nach der Behandlung zeigten die Neuraminidase-behandelten Erythrozyten weder eine verminderte oder erhöhte Sensitivität auf die hämolytische und hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore im Vergleich zu den unbehandelten Zellen.

Tabelle 4.5: Einfluß der Kohlenhydrate auf die hämolytische und hämagglutinierende Aktivität von Eiseniapore (n=6)

Kohlenhydrate

Inhibition der Titerstufen (%)

 

hämolytische Aktivität

hämagglutinierende Aktivität

1-saures Glycoprotein

87,5

98

Fetuin

98

87,5

Blutgruppensubstanz A

87,5

0

Glycophorin

87,5

0

Mucin

87,5

0

Thyroglobulin

87,5

0

N-Acetyl-D-Glucosamin

0

87,5

3.1.6 Die zwei Schritte der lytischen Wirkung Eiseniapores: die temperatur-unabhängige Bindung und die temperaturabhängige lytische Aktivität

Die lytische Aktivität von Proteinen, z.B. Perforin, kann mit Hilfe von


47

Inhibitoren der Lyse näher beschrieben werden (Ojcius und Young, 1990). Für die Charakterisierung der Bindungs- und lytischen Aktivität Eiseniapores verwandten wir folgende Inhibitoren: Vitronectin/S-Protein, Heparin, lyso-Phospatidylcholin (lyso-PC) und Metallionen (siehe auch Kap. 4.1.3.).

Wurde Eiseniapore mit den Targetzellen (Schaferythrozyten) bei 0°C inkubiert, ist keine Hämolyse nachweisbar. Werden die so behandelten Erythrozyten bei 0°C zentrifugiert und gewaschen, um die nicht gebundenen Eiseniapore-Proteine zu entfernen, ist nach einer Temperaturerhöhung auf 37°C (30 min) eine deutliche Lyse feststellbar.

Die Versuchsbedingungen wurden in den folgenden Experimenten so gewählt, daß entweder nur die Bestimmung der Bindungsaktivität oder nur der lytische Aktivität erfolgte.

Es konnte gezeigt werden, daß der Membranbindungsschritt durch Vitronectin, Heparin und lyso-PC unterdrückt wird (Tab. 4.6 a). Ca2+ und Mg2+ wie auch EGTA und EDTA beeinflußen die Bindungsaktivität von Eiseniapore nicht. Die Anwesenheit von Cu2+ hingegen führt zu einer Erhöhung der Bindungsaktivität (Bestimmung der Bindung über hämolytische Aktivität in Material und Methoden).

In den Versuchen mit membrangebundem Eiseniapore - der experimentellen Anordnung, mit der allein die lytische Aktivität bestimmt wurde - zeigte sich, daß Cu2+ die lytische Aktivität stark unterdrückt. Daß die beiden Schritte (Bindung und Lyse) durch unterschiedliche Faktoren beeinflußt werden, ist ein Hinweis auf unterschiedliche Strukturen/Eigenschaften Eiseniapores, die für Bindung und Lyse verantwortlich sind.

Tabelle 4.6.a. Beeinflussung der Bindung von Eiseniapore an Erythrozyten durch verschiedenen Substanzen (n=6)

Bedingungen des hämolytisches Systems

Hämolytische Aktivität (%)

 

+ Erythrozyten + Puffer

76,8

 

+ Erythrozyten + EDTA (oder EGTA) 1mM

71,4

 

+ Erythrozyten + Ca2+ (oder Mg2+) 1.5 mM

72,2

Eiseniapore

+ Erythrozyten + Heparin 150 I.E.

21,9

 

+ Erythrozyten + Cu2+ 1 mM

92,7


48

 

+ Erythrozyten + Vitronectin 0.4 M

15,9

 

+ Erythrozyten + ERF 0.4 M

2,7

 

+ Erythrozyten + lyso-PC 0.5 mol %

18,5

Tabelle 4.6.b. Beeinflußung der lytischen Aktivität von Eiseniapore durch verschiedenen Substanzen (n=6)

Bedingungen des hämolytisches Systems

Hämolytische Aktivität (%)

 

+ Puffer

75,1

 

+ EDTA (oder EGTA) 1 mM

69,7

 

+ Ca2+ (oder Mg2+) 1.5 mM

72,3

Eiseniapore-Erythrozyt

+ Heparin 150 I.E.

67

 

+ Cu2+ 1 mM

4,6

 

+ Vitronectin 0.4 M

70,2

 

+ ERF 0.4 M

62,4

 

+ lyso-PC 0.5 mol %

64,9

Vitronectin und Heparin unterdrücken die lytische Aktivität von bereits gebundenem Eiseniapore nur um ungefähr 5%. Lediglich bei lyso-PC und dem Eiseniapore-regulierende Faktor (ERF) ist mit ungefähr 10% Inhibition eine deutlichere Wirkung nachzuweisen. Die lytische Aktivität ist insgesamt unempfindlicher gegenüber den getesteten Substanzen als die Bindungsaktivität (Tab. 4.6 b). Die getesteten Inhibitoren, auch das natürliche Regulatorprotein Eiseniapores ERF, beeinflußen demnach verstärkt den ersten Schritt des lytischen Mechanismus' Eiseniapores - die Bindung an die Targetzelle (siehe Diskussion).

3.2 Interaktion von Eiseniapore mit Modellmembranen

3.2.1 Eiseniapore induziert einen Leakage von Liposomen

Nach der Analyse der Wechselwirkung mit biologischen Zellen (Erythrozyten) untersuchten wir die Aktivität Eiseniapores auf Modellmembranen.


49

Es konnte keine Eiseniapore-vermittelte Destabilisierung und kein folgender Leakage von Liposomen, die nur aus Phosphatidylcholin (Ei-PC) gebildet wurden, beobachtet werden (Abb. 4.3., Kurve a, pH 7,4, 25 °C, molares Lipid zu Protein Verhältnis (L/P) = 50:1 (mol/mol)). Selbst bis zu einem Lipid/Protein Verhältnis von 10:1 (mol/mol) wurde durch Eiseniapore kein Leakage induziert. Variationen der Temperatur von 10°C bis 37°C und des pH-Wertes von 4.8 bis 8.1 beeinflußten die Stabilität der PC-Membranen in Gegenwart von Eiseniapore nicht. Des weiteren wurde keine Eiseniapore-vermittelte Freisetzung von ANTS/DPX nach Einbau von Phosphatidylserin (PS) und/oder Phosphatidylethanolamin (PE) - bis zu einem Anteil von 50 mol% - in PC-Liposomen beobachtet. Wurde Ei-PC durch Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) ersetzt, konnte keine Lyse unter- oder überhalb des Phasenüberganges nachgewiesen werden. Dies belegt, daß der Phasenzustand und/oder die Membranfluidität der Lipidphase die lytische Aktivität von Eiseniapore nicht bestimmt.

Ein deutlicher, durch Eiseniapore verursachter Leakage wurde an Liposomen in Gegenwart von Sphingomyelin (SM) beobachtet (Abb. 4.3). Bei einem PC/SM Verhältnis von 3:1 liegt das Ausmaß des Leakages nach 7 min ungefähr bei 10% (L/P = 50:1). Eine Erhöhung des Leakage war nachweisbar, wenn das Lipidverhältnis (PC/SM) von 3:1 über 1:1 zu 1:3 steigt (Abb. 4.4, Kurve c und d).

Abbildung 4.3. Eiseniapore-induzierter Leakage von PC/SM Liposomen (SUV) bei pH 7,4, 25 °C, in Tes-Puffer (L/P = 50:1). Der Leakage wurde als Fluoreszenz über die Freisetzung des ANTS/DPX Komplexes, welcher vor der Messung in die Liposomen eingeschlossen wurde, gemessen (lambdaex = 355 nm, lambdaem = 530 nm). Die lytische Aktivität Eiseniapores wurde für verschiedene PC/SM Verhältnisse bestimmt: a, 1:0; b, 3:1; c, 1:1; d, 1:3. Zum Zeitpunkt t = 0 wurde das Protein (Endkonzentration 200 nM) zu den Liposomen (Endkonzentration 10 µM) gegeben. Um den prozentualen Anteil des Leakage zu bestimmen, wurde zum Ende eines jeden Experiments Triton X-100 gegeben (Endkonzentration 0.1 %), um eine größtmögliche Verdünnung des Fluoreszenzmarkers zu ermöglichen. Details in Material und Methoden.


50

Abbildung 4.4. Eiseniapore-induzierter (Endkonzentration 40 nM) Leakage von Liposomen (SUV, Endkonzentration 10 µM) verschiedener Lipidkompositionen bei pH 7,4, 25 °C, in Tes-Puffer (L/P = 250:1). PC/Chol/SM Verhältnisse: a, 1:1:0; b, 1:0:3; c, 1:1:2.

Ein Leakage von SM-haltigen Vesikeln wurde auch bei viel höheren L/P Verhältnissen gefunden (Abb. 4.4, L/P 250:1). Die Destabilisierung von PC/SM-Liposomen durch Eiseniapore war in Gegenwart von Cholesterol bei allen untersuchten L/P Verhältnissen stärker. Sowohl das Ausmaß als auch die Kinetik des Leakages war für Liposomen, die PC/Chol/SM enthielten, erhöht. Kein Leakage wurde hingegen bei PC/Chol-Vesikeln oder PS/PC/Chol-Vesikeln beobachtet.

Da Cholesterol die Membranfluidität beeinflußt, untersuchten wir, ob die Membran-Wechselwirkung von Eiseniapore durch eine Veränderung der Membranfluidität determiniert ist. Später dargestellte Beobachtungen zeigen jedoch, daß das Leakageverhalten nicht durch die Membranfluidität determiniert ist (Tab. 4.7) und bestätigen die bereits dargelegten Ergebnisse, die mit DPPC Liposomen gewonnen wurden.

Das Ausmaß des Leakage von SM haltigen Liposomen durch Eiseniapore ist in starkem Maße von dem molaren Lipid zu Protein Verhältnis (L/P) abhängig. Sowohl die Kinetik als auch das finale Ausmaß des Leakage waren erhöht, wenn die relative Proteinkonzentration, das heißt, bezogen auf die Lipidmenge, zunahm (gezeigt für PS/PC/Chol/SM (1:1:2:4), Abb. 4.7).

Für die Analyse der Kinetik bestimmten wir die Halbwertzeit des Vesikelleakage. Die Halbwertzeit wurde - bezogen auf das finale Leakageausmaß - an dem Wert der 50%-igen Lyse bestimmt. Die Abhängigkeit dieser Halbwertzeit wurde gegen die inverse Proteinkonzentration (1/Konzentration) aufgetragen. Der so erzeugte Graph folgt in erster Näherung eine linearen Funktion. Wie für PC/SM Liposomen verschiedener Zusammensetzung gezeigt wurde (Abb. 4.5b), ist das gemessene Ausmaß des Leakage auch in diesem Falle eine Funktion des molaren Lipid zu Protein Verhältnisses.

Nach dem Nachweis der hämolytische Aktivität von Eiseniapore (Abb. 4.2), analysierten wir den Leakage von Liposomen, die in ihrer Zusammensetzung der


51

Lipidkomposition von humanen Erythrozyten folgten. Die hauptsächlichen Lipidkomponenten der exoplasmatischen Membran von Humanerythrozyten sind Cholesterol, Phosphatidylcholin und Sphingomyelin (Op den Kamp, 1979, Zachowski, 1993). Außerdem sind Phosphatidylethanolamin (PE) und Ganglioside (GA) in dem äußeren Membranleaflet enthalten, während sich Phosphatidylserin (PS) fast ausschließlich in der zytoplasmatischen Membran befindet (Zachowski, 1993).

52

Abbildung 4.5. A, (B, folgende Seite) Kinetiken des Eiseniapore-induzierten Leakages von PS/PC/Chol/SM SUV (1:1:2:4) als eine Funktion des L/P: a, 16000:1; b, 4000:1; c, 1000:1; d, 100:1 (25 °C, Tes-Puffer, pH 7,4).

Um die exoplasmatische Erythrozytenmembran nachzubilden, wurden Liposomen mit der Komposition PC/Chol/SM/PE/GA (12:17:10:3:1) hergestellt. Tatsächlich wurde mit diesen Vesikeln eine hohe lytische Aktivität von Eiseniapore gemessen. Ein L/P von weniger als 260:1 ermöglichte einen Leakage von 40% nach 7 min und 25°C, noch bei 15°C wurde nach gleicher Zeit ein Leakageausmaß von 35% erreicht (Abb. 4.6).


53

Abbildung 4.5. B, die Halbwertszeit des Eiseniapore-induzierten Leakage von PS/PC/Chol/SM SUV ( ) und von ghosts ( ) als Funktion der inversen relativen Proteinkonzentration (L/P). Die Halbwertszeit korrespondiert mit der Zeit, bei der 50% des vollständigen Leakage gemessen wurden. Die Daten für die Ghosts wurden aus den Kurven in Fig. 6A ermittelt. Die Geraden wurden durch lineare Regression gewonnen.

Es ist bemerkenswert, daß Sphingolipide wie Sphingomyelin essentiell sind, um die lytische Aktivität von Eiseniapore zu ermöglichen. Weder Ganglioside (Monosialoganglioside-GM3, Disialoganglioside-GD1a und Ganglioside [Typ IV] in den Konzentrationen: 0,5 mol%, 2 mol%, 5 mol%, 8 mol% and 10 mol%) noch die Phospholipide Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin konnten Sphingolipide ersetzen. Jedoch konnte die Anwesenheit von Phosphatidylserin in Sphingomyelin-haltigen Liposomen den durch Eiseniapore induzierten Leakage erhöhen.

Um abzuklären, ob die starke Krümmung der SUV notwendig für den Leakage ist, untersuchten wir den Leakage an großen unilamellaren Vesikel (large unilamellar vesicles: LUV). Bei der Verwendung von PS/PC/Chol/SM (1:1:2:4) LUV beobachteten wir, verglichen mit SUV gleicher Zusammensetzung, eine leichte Verminderung des Leakage (Abb. 4.6). Das gibt einen Hinweis darauf, daß die starke Krümmung der Membran, wie sie bei den SUV auftritt, kein notwendiger Faktor für die Destabilisierung der Lipidmembran durch Eiseniapore ist.

Wenn Eiseniapore mit polyklonalen, monospezifischen anti-Eiseniapore Antikörpern vorinkubiert wird, ist kein Leakage von Liposomen feststellbar. Da auch eine Hitzeinaktivierung (56 °C) von Eiseniapore den völligen Verlust der lytischen Aktivität verursacht, belegt dies, daß die lytische Aktivität essentiell mit der Wirkung der nativen Konformation Eiseniapores verbunden ist.

Die Eiseniapore-vermittelte ANTS/DPX Freisetzung Sphingomyelin-haltiger Liposomen ist vom pH-Wert und der Temperatur abhängig. Wie für PS/PC/Chol/SM (1:1:2:4) Vesikel gezeigt wurde, besitzt der liposomale Leakage bei neutralem pH-Wert ein Maximum (Abb. 4.7).

Ein saurer oder ein basischer pH-Wert, pH 4.8 und pH 8.1, verminderten


54

sowohl die Kinetik, als auch das Ausmaß des Leakage. Während die Markerfreisetzung bei 10°C sehr langsam mit geringem Extent erfolgt, wurde sie nach Temperaturerhöhung schneller und erhöhte sich bis 37°C insgesamt. Überhalb von 40 °C nahmen Kinetik und Ausmaß des Leakage wieder ab.

Mittels Dünnschichtchromatographie konnten wir nachweisen, daß eine Destruktion der Lipide in den Zeiträumen der Leakageexperimente nicht stattfindet. Wir haben somit keinen Hinweis auf eine Hydrolyse unter katalytischer Wirkung einer Hydrolaseaktivität von Eiseniapore.


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Abbildung 4.6. Das Ausmaß des Eiseniapore-induzierten Leakage von SUV und LUV (eingefügtes Bild) verschiedener Lipidkompositionen als Funktion des L/P. , Lipidkomposition, die die äußere Membranschicht der Humanerythrozyten nachbildet: PC/Chol/SM/PE/GA (12:17:10:3:1); , PS/PC/Chol/SM (SUV); , PS/PC/Chol/SM (LUV); , PC/Chol/SM (1:1:2); , PC/SM (1:3). Der Leakage wurde mit dem ANTS/DPX Assay bei pH 7,4 und 25°C bestimmt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Details in Material und Methoden.


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Abbildung 4.7. pH- (A) und Temperatur- (B) (folgende Seite) Abhängigkeit der lytischen Aktivität von Eiseniapore. Kinetiken des Leakages ANTS/DPX enthaltender SUV (PS/PC/Chol/SM, 1:1:2:4) wurden bei verschiedenen pH-Werten gemessen, 25 °C, (A) oder bei verschiedenen Temperaturen, pH 7,4. Für Details siehe Legende von Abbildung 4.3. und Material und Methoden. Zu beachten ist die unterschiedliche Skalierung im Verleich zu Abb. 4.3, 4.4 und 4.5.


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Abbildung 4.7 (B). Das L/P betrug 250:1. Für Details siehe Legende von Abbildung 4.3. und Material und Methoden. Zu beachten ist die unterschiedliche Skalierung im Verleich zu Abb. 4.3, 4.4 und 4.5.

3.2.2 Die ultrastrukturelle Analyse der Eiseniapore-induzierten Membranläsion demonstriert die porenbildende Fähigkeit dieses Proteins

Die Interaktion von Eiseniapore mit Membranen kann mittels Elektronenmikroskopie, allerdings nur durch Verwendung von Glutaraldehyd-fixierten Proben, visualisiert werden. In der Gegenwart von Eiseniapore konnten wir zirkuläre Strukturen im Lipidbilayer der Liposomen beobachten. Dies beschränkte sich jedoch auf die Liposomem, in denen Sphingomyelin in der Membran enthalten war (Abb. 4.8, A). Wir vermuten, daß diese Strukturen oligomere Komplexe von Eiseniapore repräsentieren. Der Außendurchmesser der Pore lag bei ungefähr 10 nm, der Innerdurchmesser betrug 3 nm. Die Seitenansicht zeigt eine quadratische Struktur des Komplexes mit einer Höhe von 10 nm, die vom Rand der Vesikelmembran herausragt. Somit formen Eiseniaporekomplexe eine zylindrische Struktur mit einem zentralen Tunnel, welcher senkrecht zur Oberfläche der Vesikelmembran verläuft (Abb. 4.8, A: b-d). Ähnliche porenförmige Strukturen waren auch auf biologischen Membranen (Erythrozyten) zu beobachten (Abb. 4.8.B). Wegen ihrer hohen Sensitivität wurden wieder Schaferythrozyten verwandt (siehe auch Abb. 4.2). Nach der Inkubation mit Eiseniapore zeigte die Erythrozytenmembran mehrere elektronenmikroskopisch sichtbare ringförmige Strukturen (Poren) mit einem Kanal im Zentrum. Wie bei den reinen Lipidmembranen der Liposomen ist auch hier zu vermuten, daß dieser Kanalkomplex aus oligomerisierten Eiseniaporemonomeren gebildet wird.

Abbildung 4.8. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme von negativ-gefärbten Erythrozyten in der Gegenwart von Eiseniapore. Die Erythrozyten wurden für 15 min bei 25 °C (L/P = 125:1) mit Glutaraldehyd fixiert, die anschließende Negativfärbung erfolgte mit Phosphorwolframsäure.Vergrößerung 400.000x.


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Abbildung 4.8. (B) Elektronenmikroskopische Aufnahme von negativ-gefärbten PC/SM/Chol-Liposomen in der Gegenwart von Eiseniapore. Die Liposomen wurden für 15 min bei 25 °C (L/P = 125:1) mit Glutaraldehyd fixiert, die anschließende Negativfärbung erfolgte mit Phosphorwolframsäure. Die Pfeile weisen auf die Seitenansichten des Eiseniapore-Komplexes hin. a, allgemeine Ansicht; b-d, ausgewählte Bilder der Seitenansicht von Eiseniapore. Vergrößerung 360.000 x (a) und 480.000 x (b-d).


60

Die Größenverhältnisse der Pore auf der Erythrozytenmembran liegen im Bereich der Komplexe, die auf den Membranen der Liposomen sichtbar gemacht werden konnten. Sie ähneln den transmembranalen Kanälen, wie sie durch den Membranangriffskomplex (MAC) des Komplementsystems oder durch das Staphylococcus alpha-Toxin verursacht werden.

3.2.3 Wie groß ist der effektive Durchmesser des Eiseniapore-Kanals in biologischen Membranen?

Der Durchmesser einer Proteinpore kann an Hand der elektronenmikroskopischen Abbildung vermessen werden. Dies sagt jedoch wenig über den Durchmesser aus, der von diffundierenden Molekülen effektiv genutzt werden kann. Wir haben deshalb den "effektiven Durchmesser" (Bhakdi et al., 1986<24>) bestimmt, indem dem Puffer unterschiedlich große osmotische Protektoren zugesetzt wurden (siehe Material und Methoden).

Bei diesem osmotischen Schutzassay werden die Erythrozyten in einem Puffer, der osmotische Protektoren enthält, suspendiert und anschließend im Hämolyse-Titrationsassay genutzt. Wenn der Durchmesser der Protektoren über 3 nm lag, (Dextran 4, Inulin, Polyethylenglykol (PEG)), nahm der Hämolysetiter ab.

Wenn die im Test verwandten Zellen mit dem Protektoren-enthaltenden Puffer gewaschen und anschließend in Protektoren-freiem Puffer resuspendiert wurden, war eine sofortige Lyse dieser Zellen nachweisbar. Daraus kann geschlossen werden, daß weder Inulin, Dextran oder PEG die Bindung von Eiseniapore an die


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Membran inhibieren, sondern, daß sie ausschließlich als osmotische Protektoren agieren. Außerdem bestätigen die Resultate die feste Bindung von Eiseniapore an die Membran, da die Komplexe nicht durch Waschen entfernt werden konnten. Niedermolekulare Zucker wie Sucrose und Raffinose haben keinen Einfluß auf den hämolytischen Titer von Eiseniapore (Tab. 4.7).

Tabelle 4.7. Inhibierung der Eiseniapore-vermittelten Hämolyse durch Protektoren (n=5)

Kohlenhydrate

Inhibierung der Hämolyse (%)

Surcose

0

Raffinose

0

Inulin

87,5

Dextran 4

87,5

PEG 4000

93,75

3.2.4 Vergleichende Untersuchungen der Interaktion von Eiseniapore mit Erythrozyten, geschlossenen Ghosts und Nanoerythrosomen

Eiseniapore induziert eine Hämolyse von Erythrozyten verschiedener Säuger (siehe Kapitel 4.2), wobei die lytische Sensitivität der Erythrozyten mit dem Anteil an Sphingomyelin (SM) in ihren Membranen korrelierte (Abb. 4.2). Weil Eiseniapore eine Lyse von Erythrozyten und Liposomen, die eine den Erythrozyten vergleichbare Lipidzusammensetzung besitzen, verursacht, bestimmten wir mit Hilfe der ANTS/DPX Freisetzung die Kinetik und das Ausmaß des Leakages von geschlossenen Ghosts.

Die Kinetik der Markerfreisetzung war bei geschlossenen Ghosts scheller und das Leakageausmaß höher als bei Liposomen, die in ihrer Lipidzusammensetzung den geschlosssenen Ghosts ähnelten. Wir konnten bis zu dem niedrigen L/P von 16000:1 ein Leakage von 20% (nach 7 min) nachweisen. Ab einem L/P von 100:1 war der Leakage sehr hoch; bereits nach 1,5 min nach der Zugabe von Eiseniapore erreichte der Leakage 80% des Plateaus von 90% (Abb. 4.10.a).

Abbildung 4.9. A, Eiseniapore-vermittelter Leakage von geschlossenen Ghosts (human) als Funktion des L/P. ANTS/DPX wurde in das Lumen der Ghosts eingeschlossen. Der Leakage wurde bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die Lipidkonzentration der Ghost (10 µM) wurde unter Annahme eines Protein zu Lipid Gewichtsverhältnis bei Erythrozytenmembranen von 1:1 bestimmt; die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry gemessen. L/P: a, 16000:1; b, 4000:1; c, 1000:1; d, 100:1. Details finden sich in Material und Methoden.


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Abbildung 4.9. B, Einfluß von L-alpha-Lysopalmitoylphosphatidylcholin (C 16:0) auf die Leakageaktivität von Eiseniapore. Geschlossene Ghosts wurden ohne (Kontrolle, Kurve b und d) oder mit 0.5 mol% Lysophosphatidylcholin (Kurve e und f) für 10 min bei 25 °C vorinkubiert. Die dann durchgeführte Messung der Eiseniapore-vermittelten Freisetzung von ANTS/DPX erfolgte bei verschiedenen L/P (pH 7,4, 25 °C): b und e, 4000:1; d und f, 100:1. Details finden sich in Material und Methoden.

In erster Näherung ist das Verhältnis von Halbwertzeit des Eiseniapore-induzierten Leakage zur inversen Eiseniaporekonzentration als lineare Funktion darstellbar (Abb. 4.5.b). Um zu bestimmen, ob auch die Zusammensetzung der Lipidphase der geschlossenen Ghosts eine kritische Größe der Interaktion mit Eiseniapore darstellt, wurden geschlossene Ghosts mit 0,5 mol% Lyso-phosphatidylcholin (C16:0) vorinkubiert. Der spontane Einbau dieser Lipide in die Membran der geschlossenen Ghosts wurde in unserer Arbeitsgruppe mit radioaktiv gelabeltem Lyso-phosphatidylcholin gezeigt<25>. Geschlossene Ghosts, in die Lyso-phosphatidylcholin eingebaut wurde, zeigten einen deutlich niedrigeren Leakage (Abb. 4.10.b).

Ähnlich wie bei Liposomen wurde kein Leakage nach Denaturierung von Eiseniapore (30 min, 56 °C) beobachtet.

Das hohe Ausmaß des Leakage der geschlossenen Ghosts ließ folgende Vermutungen zu:

(i) ein Rezeptor auf der Erythrozytenmembran vermittelt die Wechselwirkung mit Eiseniapore,

(ii) die Größe der Targetzellen ist eine determinierende Größe des Leakage oder (iii) die geschlossenen Ghost haben eine labilere Membranintegrität, die zu einer größeren Empfindlichkeit gegenüber Eiseniapore führt.

Um die Ursache abzuklären, verglichen wir das Ausmaß des Leakage von LUV (reine Lipidmembran) mit dem Leakage von Nanoerythrosmen (biologische Membran). Letztere sind geschlossene Ghost, die so behandelt wurden, daß sie den


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gleichen Durchmesser wie LUV besitzen (siehe Material und Methoden). Die LUV bildeten in ihrer Lipidkomposition die exoplasmatische Lipidmembran der Erythrozyten (PC/Chol/SM/PE/GA (12:17:10:3:1)) nach (siehe oben). Bei der ANTS/DPX Freisetzung wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen Nanoerythrosomen und den LUV beobachtet (Abb. 4.11.). Deshalb kann die Existenz eines spezifischen Rezeptors für Eiseniapore auf der Erythrozytenmembran ausgeschlossen werden.

Da die Membrankrümmung, wie oben gezeigt, die Markerfreisetzung nicht determiniert, kann angenommen werden, daß eine labilere Membranintegrität der geschlossenen Ghost die Ursache für die beobachteten Unterschiede ist.

3.2.5 Eiseniapore bindet im Gegensatz zu lytischen Peptiden an der Liposomen-membran irrevesibel

Da der Leakage der Vesikel in einigen Versuchen auch nach 90 min noch kein endgültiges Plateau erreicht hatte, kann ein Wechsel Eiseniapores von einem bereits lysierten Vesikel zu einem noch nicht angegriffenen angenommen werden (S. Nir, persönliche Mitteilung)<26>.

Um festzustellen, ob die Bindung an Sphingomyelin-haltige Membranen reversibel ist, bestimmten wir den ANTS/DPX Leakage von Liposomen nach der Vorinkubation von Eiseniapore mit ungelabelten Vesikeln. Wurde Eiseniapore mit Sphingomyelin-freien Vesikeln (PC, PC/Chol (1:1) oder PC/PS (1:1)) für 15 min bei 25°C vorinkubiert und anschließend mit gelabelten PC/Chol/SM-Vesikeln (1:1:2) inkubiert, erfolgte eine ANTS/DPX Freisetzung, die in Ausmaß und Kinetik ähnlich der Kontrolle - einer Vorinkubation ohne Liposomen - war.

Die Vorinkubation mit PC/Chol/SM Liposomen gefolgt von einer Zugabe ANTS/DPX-gelabelter Vesikel gleicher Zusammensetzung zeigte keine Lyse. Dies führt zu der Schlußfolgerung, daß Eiseniapore irreversibel an Sphingomyelin-haltigen Liposomen bindet (Abb. 4.12.), sowie, daß Cholesterol die


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Membranbindung von Eiseniapore nicht vermitteln kann.

Abbildung 4.10. Der Eiseniapore-vermittelte Leakage an unterschiedlichen liposomalen Targets: aus humanen Ghosts hergestellte Nanoerythrosomen; 100 nm (Kurve a), große unilamellare Vesikel (LUV), 100 nm (Kurve b); kleine unilamellare Vesikel (SUV), 40 nm (Kurve c). Die Lipidzusammensetzungen der LUV und SUV ist der des äußeren Monolayers von humanen Erythrozyten ähnlich (Ei-PC/Chol/SM/PE/GA (12:17:10:3:1)) und geschlossene Ghosts (Kurve d). Das molare Lipid/Protein Verhältnis betrug 250:1 (mol/mol), bei einer Eiseniaporekonzentration von 40 nM (Endkonzentration). Details, insbesondere zur Herstellung der Nanoerythrosomen: Material und Methoden)


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Abbildung 4.11. Die Vorinkubation von Eiseniapore mit Liposomen verschiedener Zusammensetzung beeinflußt die ANTS/DPX Freisetzung von PC/Chol/SM-Liposmen, die nach 420 Sekunden (Pfeil) zugegeben wurden. Wenn die Vorinkubation von Eiseniapore in der Abwesenheit von Liposomen erfolgte, konnte ein signifikanter Leakage beobachtet werden (Kurve a). Ein der Kontrolle ähnlicher Leakage wurde bei der Vorinkubation von Eiseniapore mit ungelabelten PC/Chol (1:1) Liposomen gemessen (Kurve b). Kein Leakage wurde beobachtet, wenn Eiseniapore mit ungelabelten PC/Chol/SM-Liposomen (1:1:2) vorinkubiert wurde (Kurve c). Die ungelabelten Liposomen (SUV) wurden bei t = 30 s zugegeben. Während der Inkubation von Eiseniapore mit den Liposomen betrug das L/P 125:1. Nach der Zugabe von gelabelten Liposomen war es in allen Fällen L/P 250:1. Die Messungen wurden bei pH 7,4 und 25 °C durchgeführt. Details finden sich in Material und Methoden.


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Die Daten der SDS-PAGE können ebenfalls in die Richtung einer irreversiblen Bindung über einen SDS-resistenten Komplex interpretiert werden (Abb. 4.13.). Die irreversible Bindung des Proteins an die Membran könnte mit der Bildung eines hochmolekularen, SDS-resistenten Komplexes von Eiseniapore erklärt werden, der erst nach 30 minütigem Kochen zerstört weden kann. Der hochmolekulare Komplex hat das Gewicht von ungefähr 228 kDa und ist somit sechsmal schwerer als das Monomer (38 kDa); somit könnte sich ein Hexamer gebildet haben.

Abbildung 4.12. Die Bildung eines stabilen Oligomers Eiseniapores in PC/Chol/SM (1:1:2) Liposomen. Die Inkubation der Eiseniapore-Vesikel Suspension erfolgte bei pH 7,4, 25 °C. Das L/P betrug 250:1. Der anschließenden Analyse mit der SDS-PAGE (5-10%) folgte eine Silberfärbung. Bande 1, vollständige Cölomflüssigkeit (25 µg); Bande 2, Eiseniapore (2.1 µg); Bande 3, Eiseniapore nach Vorinkubation von PC/Chol/SM Liposomen (1.4 µg).

3.2.6 Welche molekularen Komponenten Sphingomyelins sind für den Leakage essentiell?

Durch die folgenden Experimente wurde aufgeklärt, welche strukturellen Merkmale Sphingomyelins für die Interaktion von Eiseniapore mit der Lipidmembran wichtig sind. Außerdem untersuchten wir, ob die Cholesterol-Sphingomyelin-Komplexe für die Erhöhung des Leakages beim Einbau von Cholesterol in Sphingomyelin-haltige Liposomen verantwortlich sind. Dazu wurde das Ausmaß des Leakages in der Gegenwart verschiedener Sphingolipide sowie bei mehreren Temperaturen und molaren Lipid zu Protein Verhältnissen bestimmt.

Es war nahezu das gleiche Leakageausmaß feststellbar, wenn Sphingomyelin durch Galaktosylceramid in PC Liposomen ersetzt wurde. Das einkettige Galaktosylsphingosin (Psychosin) war hingegen ineffektiv für die Vermittlung des Leakage (Tabelle 4.7). Deshalb scheint die zweikettige Struktur des Ceramids eine wesentliche Struktur der Sphingolipide bei der Vermittlung eines Leakage zu sein. Aber auch die Präsenz von Ceramid allein war nicht ausreichend, wie das Fehlen der lytischen Aktivität Eiseniapores bei Austausch von Sphingomyelin durch das doppelkettige N-Palmitoyl-D-Sphingosin zeigt. Darum scheinen die Ceramidstruktur


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wie auch der hydrophile Teil essentielle Bestandteile der Membran für einen Eiseniapore-vermittelten Leakage von Liposomen zu sein.

Keine weitere Steigerung der Markerfreisetzung wurde beobachtet, wenn Cholesterol in PC Liposomen, die Galaktosylceramid enthielten, eingebaut wurde. Im Gegensatz dazu war eine signifikante Steigerung des Leakage von PC Vesikeln, die Sphingomyelin enthielten, nach Einbau von Cholesterol bestimmbar (Tabelle 4.8). Diese Daten weisen auf eine Interaktion zwischen Cholesterol und Sphingomyelin, z.B. über die Bildung von Komplexen (siehe Diskussion), hin, die für die Steigerung der lytischen Aktivität von Eiseniapore verantwortlich sind. Für die untersuchten Liposomen maßen wir den Ordnungsparameter des ESR Membranspektrums von spingelabelten Fettsäuren I (12,3) bei 37 °C und pH 7,4 (Tabelle 4.7, Spektren nicht gezeigt).

Tabelle 4.8. Der Eiseniapore-vermittelter Leakage und Membranfluidität von Liposomen mit verschiedenen Sphingolipiden (10 mol%), L/P 250:1. Das Leakageausmaß wurde 5 min nach der Zugabe Eiseniapores zu den Liposomen bestimmt. Die Konzentration des Fettsäureanalogons betrug 1 mol% der Lipidkonzentration. Die Spektren wurden in Abwesenheit Eiseniapores aufgenommen.

Lipidzusammensetzung

Leakage-

ausmaß

(%)

Ordnungs-parameter

Phosphatidylcholin : Cholesterol : Sphingomyelin

(9 : 9 : 2)

47

0.709

Phosphatidylcholin : Sphingomyelin

(9 : 1)

25

0.630

Phosphatidylcholin : Cholesterol : Galaktosylceramida

(9 : 9 : 2)

22

0.714

Phosphatidylcholin : Galaktosylceramida

(9 : 1)

20

0.632

Phosphatidylcholin : Cholesterol : Ceramidb

(9 : 9 : 2)

0

0.715


69

Phosphatidylcholin : Ceramidb

(9 : 1)

0

0.629

Phosphatidylcholin : Cholesterol : Galaktosylsphingosinc

(9 : 9 : 2)

0

0.694

Phosphatidylcholin : Galaktosylsphingosinc

(9 : 1)

0

0.627

aTyp I; 98% -Hydroxy-Fettsäure, bN-Palmitoyl-D-Sphingosin, c1-ß-D-Galaktosyl-Sphingosin (Psychosin)

Die umseitige Abb. 4.13. gibt die Resultate der Tabelle 4.8. in Verbindung mit den Formeln der Sphingolipide wieder. Oberhalb der Formeln erscheinen die Leakagewerte (rot), für die Versuche, in denen die Sphingolipide in PC-Vesikel eingebaut waren; untenhalb: mit den in PC/Chol-Vesikel eingebauten Sphingolipiden.

Abbildung 4.13. Erläuterungen auf Seite 69.

Dieser Parameter charakterisiert die Membranfluidität. Es wird deutlich, daß die Membranfluidität nicht mit dem Leakage korreliert, daher sind die in Tabelle 4.8 dargestellten Unterschiede des Leakageausmaßes nicht auf eine veränderte Membranfluidität der Liposomen zurückzuführen. Somit kann in Übereinstimmung mit obigen Resultaten (Kap. 4.2.1) gefolgert werden, daß die Membranfluidität keine essentielle Determinante der lytischen Aktivität Eiseniapores ist.

3.2.7 Die Struktur von membranassoziiertem Eiseniapore

Das Fluoreszenzspektrum der Tryptophangruppen wurde durch Anregung Eiseniapores bei 286 nm untersucht (Abb. 4.13). Möglicherweise sind die Tryptophangruppen im ungebundenen Eiseniapore in einer hydrophoben Region eingesenkt. Diese Überlegung wird durch das Fluoreszenzmaximum von 333 nm unterstützt, das für eine apolare Umgebung charakteristisch ist.


70

In Gegenwart des polaren, wäßrigen Quenchers Kaliumiodid<27> (Endkonzentration 20 mM), der vornehmlich mit Tryptophangruppen in polarer Umgebung wechselwirkt, ist eine Verminderung der Fluoreszenz von circa 8 % meßbar. Es tritt jedoch keine Veränderung der Fluoreszenz, sowohl der Intensität als auch der Lage, in Gegenwart der Liposomen ein, die kein Sphingomyelin enthalten.

Hingegen war ein deutlicher Abfall der Fluoreszenz bei Zugabe von PC/Chol/SM Liposomen zu beobachten (Abb. 4.13.b). Das Wellenlängenmaximum verschob sich dann nur geringfügig zu 335 nm. Nach der Membranbindung von Eiseniapore erfolgte eine größere Fluoreszensunterdrückung durch Kaliumiodid; die Fluoreszenzintensität nahm in Anwesenheit von Kaliumiodid im Vergleich zur Kontrolle um 30% ab.

Abbildung 4.14. Tryptophanfluoreszenz von (A) Eiseniapore (Endkonzentration 40 nM) und (B) in der Gegenwart verschiendener Konzentrationen von PC/Chol/SM-SUV. A, das Spektrum von Eiseniapore wurde in Abwesenheit (Kontrolle) oder in der Gegenwart von 20 mM KI gemessen. B, das Spektrum von Eiseniapore wurde in der Gegenwart von PC/Chol/SM Liposomen in PBS gemessen, L/P = 125:1 (a) und L/P = 250:1 (b und c). Kurve c wurde in der Gegenwart von 20 mM KI bestimmt. Die Messungen wurden bei pH 7,4 und 25 °C durchgeführt; Anregungswellenlänge: lambdaex = 286 nm. Details finden sich in Material und Methoden.


71

Das CD-Spektrum von Eiseniapore wurde in Ab- und Anwesenheit von Liposomen bestimmt. Hierbei wurden sowohl Sphingomyelin-haltige als auch reine PC-Vesikel verwandt. Es konnte keine Veränderung des CD-Spektrums nach Zugabe von Vesikeln mit und ohne Sphingomyelin beobachtet werden (Abb. 4.14). Die Sekundärstruktur von Eiseniapore besaß folgende Zusammensetzung: 37% beta-sheet, 28% alpha-helix, 17% beta-turn und 18% Zufallsknäuel.

Abbildung 4.15. Circulardichroismus-(CD) Spektren von Eiseniapore in Abwesenheit (a) und Anwesenheit (b) von PC/Chol/SM SUV (L/P = 250:1). Die Proteinkonzentration betrug 2 µM in PBS-Puffer, pH 7,4. Die Messungen wurden bei 25 °C durchgeführt. Die Daten sind in mittleren Restelliptizitäten, basierend auf einer mittleren Aminosäurerestmasse von 105, dargestellt.


72

3.3 Die Regulation der lytischen Aktivität

3.3.1 Isolation und Charakterisierung eines Eiseniapore-regulierenden Faktors (ERF) aus der Cölomflüssigkeit von Anneliden

Das Ausgangsmaterial der Proteinfraktionierung war eine gepoolte Cölomflüssigkeit aus 100 Anneliden der Unterart E. f. fetida. Nach Zentrifugation (15.000 x g, 10 min) wurde die Cölomflüssigkeit von zellulären Bestandteilen getrennt. Der so gewonnene Überstand (1.13 ml) mit einem Proteingehalt von 6.9 mg/ml wurde auf das Sammelgel der Prep-Cell Apparatur (Bio-Rad, USA) gegeben.

Der Fluß des Elutionspuffers startete, als die gefärbte Proteinbande den Boden der Gelsäule erreichte. Das Eluat wurde in 1 ml-Fraktionen gesammelt. Tabelle 4.9 zeigt die 260-fache Aufreinigung des Eiseniapore-regulierenden Faktors (ERF). Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Reagenzien mit einem Wert von 0.0235 mg/ml bestimmt.

Tabelle 4.9. Ein-Schritt Reinigung des ERF

Material

Protein

(total)

mg

Aktivität

u/ml

Aktivität

(total)

spezifische Aktivität

u/mg

Ausbeute

%

Reinigungs-faktor

Cölom-flüssigkeit

7,8

48

72

9,2

100

1

ERF

0,024

12

56

2400

78

259

Nachweis der inhibitorischen Aktivität: Die Wirkung des Eiseniapore-regulierenden Proteins (ERF) wurde im Titrations-Assay nachgewiesen. Eiseniapore induziert im Elutionspuffer (siehe Material und Methoden) einen Titer von 1:6144, dieser fällt in Gegenwart des ERF (Endkonzentration 15 nM) um 93,75% auf den Titer von 1:384 (Tabelle 4.10.). Die Reinheit des ERF wurde durch Silberfärbung des SDS-Gels nachgewiesen (Abb. 4.17).


73

Tabelle 4.10. Inhibition der durch Eiseniapore vermittelten Hämolyse durch den Eiseniapore-regulierenden Faktor aus der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida

hämolytisches System

Titerstufe der Hämolyse

Eiseniapore

1:6144

Eiseniapore + ERF

1:384

Abbildung 4.16. Elutionsprofil der kontinuierlichen Elutions-Elektrophorese. Der Elutions-Puffer enthielt reduzierende Agentien, um die Aktivität des ERF zu schützen Probe: 7,8 mg Proteinsuspension aus der Cölomflüssigkeit. Die Flußrate betrug 1 ml/min, die Absorption wurde bei 280 nm gemessen. Der Vergleich der Elutionsprofile von Eiseniapore- und ERF-Reinigung demonstriert die unterschiedliche Gelzusammensetzung der Säulen sowie das voneinander abweichende Säulenvolumen.

Das Regulatorprotein (ERF) ist bei Raumtemperatur sehr instabil, die Hälfte seiner inhibierenden Aktivität verliert es bereits nach ungefähr 12 Stunden. Die Substanzen und Ionen, die nach dem Protokoll der Proteincharakterisierung von Suelter (1990) zu verwenden sind, beeinflussen bereits zum größten Teil die Aktivität von Eiseniapore (siehe "Charakterisierung von Eiseniapore"), so daß eine isolierte Charakterisierung von ERF kaum möglich war. Außerdem fiel die Aktivität des ERF in den Kontrollen bei 37 °C so drastisch ab, daß keine Aktivität mehr nachgewiesen werden konnte. Dieser Aktivitätsverlust war im Gegensatz zu Eiseniapore nicht durch Glyzerol zu kompensieren.

3.3.2 Die Reinigung dem ERF funktional ähnlicher Proteine aus der Cölom- flüssigkeit verschiedener europäischer Lumbriciden

Ausgehend von der postulierten Ähnlichkeit (siehe Diskussion) des Anneliden-Inhibitors aus der Cölomflüssigkeit und Vitronectins aus Säugerseren, wurde die Cölomflüssigkeit analog dem Serum behandelt, aus dem Vitronectin isoliert werden soll. Nach dem Verfahren von Nakashima et al. (1992) wurde die Cölomflüssigkeit der Anneliden Eisenia fetida ssp., L. terrestris und A. caliginosa mit eine Heparin-Säule fraktioniert, anschließend über Nacht im Kühlschrank dialysiert und im Test verwandt.


74

Die Fraktionen wurden auf ihre inhibierende Wirkung der lytischen Aktivität von Eiseniapore getestet. Aus allen untersuchten Arten konnten Fraktionen mit inhibierender Wirkung isoliert werden. Mit dieser ursprünglich für die Reinigung des multifunktionellen Proteins Vitronectin ausgearbeiteten Trennmethode können jedoch nicht alle Begleitproteine vollständig entfernt werden, es ist aber im Gegesatz zur Elutionselektrophorese mit dieser säulenchromatographischen Trennung eine Konzentrierung des zu isolierenden Proteins möglich.

Es konnte im Vergleich der unterschiedlichen Anneliden gezeigt werden, daß A. caliginosa die höchste Konzentration des Inhibitors besitzt, während E. f. fetida hat von den drei untersuchten Arten den geringsten Anteil des Regulators hat (Abb. 4.16). Allerdings sind die Inhibitorkonzentrationen sehr starken saisonalen Effekten unterworfen.

Abbildung 4.17. Die Oligochaeten (Anneliden) besitzen einen unterschiedlichen Anteil an lytischen und regulierenden Proteinen. Die Konzentrationsangaben (µg/ml) beziehen sich auf die Proteinmengen, die aus einem Milliliter Cölomflüssigkeit gereinigt werden konnten (Details in Material und Methoden). Eiseniapore, das Hämolysin aus E. f. fetida: 4,2 µg/ml, Hämolysin aus L. terrestris (2,4 µg/ml) und A. caliginosa (0,46 µg/ml). Die Regulator-Proteine: ERF (0.08 µg/ml), aus L. terrestris (0,4 µg/ml) und A. calliginosa (2,9 µg/ml).

3.3.3 Präparation Vitronectins/S-Proteins und der Nachweis der funktionalen Integrität

Vitronectin wurde nach zitierter Methode (Kap. 4.3.2) isoliert und dialysiert. Um die funktionelle Integrität des von uns isolierten Vitronectins/S-Proteins (Endkonzentration 15 nM) auszuweisen, untersuchten wir den Einfluß auf die Komplement-vermittelte Hämolyse. Die durch Komplement induzierte Hämolyse wurde durch das isolierte Vitronectin/S-Protein beeinflußt. In dessen Gegenwart wird die Komplementlyse um 4 Titerstufen - das heißt um 93.75% - unterdrückt (Tab. 4.12.).


75

Tabelle 4.12. Inhibition der durch Komplement vermittelten Hämolyse durch Vitronectin (n=7)

hämolytisches System

Titerstufe der Hämolyse

Komplement

1:256

Komplement +

Vitronectin/S-Protein

1:16

3.3.4 Die Hämolyse-Regulatoren aus dem Säuger und den Oligochaeten sind funktionell austauschbar

Das gewonnene Material aus Säugerserum (Vitronectin) und der Cölomflüssigkeit (Anneliden-Inhibitor) wurde in seiner inhibierenden Wirkung im jeweils anderen System getestet (siehe Material und Methoden). Es zeigte sich, daß der Invertebraten-Regulator (Endkonzentration jeweils 15 nM) in der Lage ist, die Komplement-vermittelte Hämolyse zu unterdrücken (Tab. 4.13). Die inhibitorische Wirkung von Lumbricus terrestris- und Eisenia fetida fetida-Inhibitor ist identisch.

Tabelle 4.13. Inhibition der durch Komplement vermittelten Hämolyse durch Regulatoren aus Anneliden (n=9)

hämolytisches System

Titerstufe der Hämolyse

Komplement

1:256

Komplement +

Regulator aus E. f. fetida (=ERF)

1:32

Komplement +

Regulator aus L. terrestris

1:32

Der Inhibitor der terminalen Komplementkomponenten, das Vitronectin, inhibiert die Eiseniapore-vermittelte Hämolyse um 87.5%. Wenn Vitronectin durch dekomplementiertes Serum ausgetauscht wurde, verstärkte sich die inhibierende


76

Wirkung um 93.75%, was auf zusätzliche inhibierende Substanzen hindeutet.<28>

Tabelle 4.14. Einfluß von Serum/Vitronectin auf die Eiseniapore-vermittelte Hämolyse (n=7)

hämolytisches System

Titerstufen der Hämolyse

Eiseniapore

1:6144

Eiseniapore + Vitronectin

1:768

Eiseniapore + dekomplementiertes Serum

1:384

3.3.5 Heparin beeinflußt die inhibitorische Aktivität des Eiseniapore-regulierenden Faktors

Für Vitronectin wurde ein basischer Heparin-Bindungsort beschrieben (Preissner et al., 1989), der sich an die cysteinreiche Domäne der Komplementkomponente C9 anlagert und dadurch die Oligomerisierung und die folgende Bildung einer Proteinpore verhindert. Wenn der Heparin-Bindungsort mit Heparin maskiert wird, kann dieser nicht mehr mit den Proteinmonomeren interagieren und verliert so seine inhibierende Aktivität. Auf Grund der Funktionsgleichheit von Vitronectin und dem ERF haben wir untersucht, ob Heparin


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die inhibierende Wirkung des ERF beeinflußt.

105 Internationale Einheiten (I.E.) Heparin/ml<29> im Ansatz wurden im Puffer vorgelegt, dann 30 min bei 37 C mit Eiseniapore und dem ERF inkubiert und anschließend Targetzellen (2% Erythrozyten vom Schaf in PBS-Puffer) zugegeben. Sowohl die inhibitorische Wirkung von Vitronectin (Kontrolle), als auch die des ERF läßt sich durch Heparin einschränken (Tab. 4.15).

Tabelle 4.15: Einfluß von Heparin auf die inhibierende Wirkung von Vitronectin und ERF (n=5)

hämolytisches System

inhibitorische Aktivität des Regulatorproteins (%)

Eiseniapore + Vitronectin

86

Eiseniapore + Vitronectin und Heparin

29

Eiseniapore + ERF

87.5

Eiseniapore + ERF und Heparin

25

3.3.6 Eiseniapore/ERF und Komplement/Vitronectin sind analoge Protein-gruppen - lytische Aktivitäten in der Anwesenheit der Regulatorproteine und Antikörper

Die natürlichen Inhibitoren/Regulatoren der lytischen Proteine, beim Komplement das Vitronectin und bei Eiseniapore der Eiseniapore-regulierende Faktor (ERF), zeigen in dem gewählten Titrationsassay eine deutlich inhibitorische Aktivität auf die hämolytische Aktivität (Tab. 4.10 und 4.12). Da eine


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immunologische und funktionale Verwandtschaft von Vitronectin und ERF gezeigt werden konnte, untersuchten wir, ob sich diese auch in einer funktionalen Wirkung der jeweiligen Antikörper niederschlägt. Nach dem kreuzreagierendes Verhalten von anti-C9 Antiserum und Eiseniapore nachgewiesen werden konnte, wurde der funktionalen Einfluß dieser Antikörper untersucht (Abb. 4.18). Dazu wurden Antikörper, die gegen humanes C9 gerichtet sind, in einer Verdünnung von 1:500 und 1:10 in PBS vorgelegt, das in diesem Puffer titrierte Eiseniapore wurde für 30 min bei 37°C inkubiert. Der anschließend bestimmte Hämolysetiter Eiseniapores fällt in Gegenwart von anti-C9 Antiserum in einer 1:500 Verdünnung um 50%. In einer Verdünnung von 1:10 wurde die hämolytische Wirkung Eiseniapores fast vollständig um 96.8% unterdrückt (Tab. 4.16). In der zusammenfassenden Darstellung (Abb. 4.18) ist die Inhibition Eiseniapores bei einer anti-C9 Antikörper Verdünnung von 1:100 dargestellt.

Abbildung 4.18. Titer der Komplement- und Eiseniapore-induzierten Hämolyse in Gegenwart von Antikörpern und Regulatoren. Der reziproke Wert des Komplementtiters beträgt 256. In Gegenwart von anti-Eiseniapore Antikörpern fällt der Hämolysetiter auf 64, die Kontrolle (+) zeigt, daß in Gegenwart von anti-C9 Antikörpern nur eine Aktivität von 4 Titerstufen bleibt. Der ERF inhibiert die Komplementlyse bis auf den Titer 16, der natürliche Inhibitor des Komplements Vitronectin (Kontrolle (-)) inhibiert die Hämolyse vollständig. Die Eiseniapore-vermittelte Hämolyse erreicht einen Titer von 6144, der in Gegenwart von anti-C9 Antikörpern auf einen Hämolysetiter von 384 fällt. Der gegen Eiseniapore gerichtete Antikörper (Kontrolle (+)) vermindert die lytische Aktivität mit einem Titer von 16 nahezu vollständig. Vitronectin reduziert die Eiseniapore-induzierte Hämolyse auf den Titer 192. Der natürliche Inhibitor Eiseniapores - der ERF - vermindert die Lyse auf den Titer 4.

Anti-Eiseniapore Antikörper (1:500) unterdrücken die Komplement-vermittelte Hämolyse, der Komplementtiter von 1:256 wird in Gegenwart der Eiseniapore Antikörper um drei Titersufen auf 64 inhibiert.

Tabelle 4.16. Inhibitorische Wirkung von anti-C9 Antikörpern auf die hämolytische Aktivität Eiseniapores (n=4)

Eiseniapore und Antiserum

Inhibition der Hämolyse (%)


79

Eiseniapore + anti-C9 Antiserum (1:500)

50

Eiseniapore + anti-C9 Antiserum (1:10)

96,8

3.3.7 Immunologisch homologe Komponenten bei Säugern und Invertebraten - Analyse mittels Immunoblotting

Ein Immunostaining Eiseniapores und des ERF wurde mit Hilfe des Westernblots erreicht.

Abbildung 4.19. Kreuzreaktion zwischen C9 und Eiseniapore (A) und zwischen Vitronectin und ERF (B). Die Westernblots wurden mit monospezifischen, polyklonalen Antikörpern (1:1000, in PBS-Puffer verdünnt) gegen reduziertes, humanes C9 (A, rechte Bande) und humanes Vitronectin (B, rechte Bande) durchgeführt. Die elektrophoretische Trennung von 2.1 µg Eiseniapore (A, linke Bande) und 1.7 µg ERF (B, linke Bande) in der SDS-PAGE (5-10%) erfolgte unter reduzierenden Bedingungen (siehe Material und Methoden).

Die Proteine wurde zunächst unter reduzierenden Bedingungen in der SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose-Membranen (blots) transferriert. Die danach sequentiell aufgetragenen Antikörper gegen humanes C9 und Vitronectin/S-Protein kreuzreagierten mit den aus dem Anneliden isolierten Eiseniapore und dessen Regulator (ERF) (Abb. 4.19.).


Fußnoten:

<21>

Im Text erscheinen die gerundeten Werte, in der Tabelle sind die nicht gerundeten Werte aufgeführt.

<22>

Die Daten über die Wirkung der Metall-Ionen auf die Aktivität eines Proteins gehören nicht zum ursprünglichen Protokoll nach Suelter (1990). Sie sind deshalb sinnvoll, da die meisten Hämolysine der Invertebraten, so auch die Hämolysine von Eisenia fetida andrei (Roch et al., 1989), über die Wirkung einzelner Metall-Ionen beschrieben wurden und so eine vergleichende Betrachtung ermöglichen. Diese Resultate werden in der Diskussion ausführlich besprochen.

<23>

Die Temperaturen folgen dem Protokoll von Suelter (1990), um einen Vergleich mit anderen Proteinen zu ermöglichen (die Temperaturen sind nicht physiologisch).

<24>

In der zitierten Arbeit wurde erstmals diese Technik für die Bestimmung des effektiven oder funktionalen Durchmessers bei Porenbildnern des Komplementsystems angewandt (aktuellere Arbeiten: Mangel et al., 1995; Fehrenbach et al., 1996)

<25>

B. Baljinnyam, B. Schroth-Diez, A. Herrmann, unpublizierte Ergebnisse

<26>

Ein solches Verhalten konnte für viele lytische Peptide gezeigt werden (siehe auch: Nicol et al., 1996).

<27>

ältere Nomenklatur Kaliumjodid

<28>

Vergleiche dazu auch: Eue (1991), Dissertation; S. 95 ff, Die Wirkung von high density lipoproteins (HDL) auf die hämolytische Aktivität der Eisenia foetida Cölomflüssigkeit und Tschopp et al. (1986) über die Wirkung von HDL auf die Aktivität von poly-C9 und Perforin.

<29>

105 I.E./ml Heparin hemmen die hämolytische Aktivität von Komplement und Eiseniapore nicht.


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Fri Sep 13 16:49:21 2002