Lange, Sven: Eiseniapore - ein dem Komplementprotein C9 analoges porenformendes Hämolysin aus Anneliden: Charakterisierung der Membranwechselwirkung und Identifizierung des molekularen Targets.

ERKENNEN HEISST VERGLEICHEN. KANT

Kapitel 4. DISKUSSION

4.1 Die humorale Abwehr bei Invertebraten

"Zellvermittelte Immunität" wurde ursprünglich als Begriff geprägt, um lokale Reaktionen gegen intrazelluläre Pathogene zu beschreiben, die durch Phagozyten


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und Lymphozyten mit ihren verschiedenen Populationen z.B. den 'natural killer' (NK)-Zellen vermittelt werden. Im Allgemeinen werden heute darunter Reaktionen verstanden, die durch die zellulären Komponenten der Immunantwort (z.B. T-Zellen und Makrophagen) verursacht werden. Zellulär- und humoral-vermittelte Prozesse können in vielen genutzten Tier- oder Gewebemodellen nicht getrennt beobachtet werden, da Zellen bei der Entstehung von Antikörpern beteiligt sind und Antikörper bedingt im Bereich der zellvermittelten Immunität als Bindeglied auftreten können<30>. Für eine getrennte Analyse der zellulär- und humoral-vermittelten Reaktionen ist es daher sinnvoll, evolutionär alte Tierstämme zu untersuchen, in denen diese beiden Reaktionen noch getrennt ablaufen, da in dem Abwehrsystem der phylogenetisch alten Stämme noch keine Antikörper zur Verfügung stehen.

In den letzten Jahren wurde dieses Antikörper-unabhängige Abwehrsystem der phylogentisch alten taxonomischen Gruppen ein Schwerpunkt der immunologischen Forschung (Humphreys und Reinherz, 1994; Armstrong et al., 1996; Blanco et al., 1997; Hubert et al., 1997; Ottaviani und Franceschi 1997; Ram et al., 1997; Smith et al. 1997; Fearon, 1997). Hierfür wurden die Tierstämme aus dem Bereich der Invertebraten verwandt, für die bereits Daten ihres Abwehrsystems vorliegen. Denn erst durch längere Testreihen in Versuchen ist es möglich, wiederkehrende, saisonal stabile und in verschiedenen Modellen konstante, immunologische Faktoren herauszuarbeiten. Es sind dreikeimblättrige Tiere vorzuziehen, da das dritte Keimblatt in der Evolution das Gewebe für die Bildung von echten Immunmodulatoren ist (Cooper et al., 1992; Sima und Vetvicka et al., 1993; Vetvicka et al., 1994), und die entsprechenden Organismen somit bereits über einen komplexen Abwehrmechanismus verfügen. Bei Vertretern folgender Stämme:

- den Nemertinen (Langlet und Bierne, 1982),

- den Anneliden (Cooper, 1986) und

- Tunicaten<31> (Raftos et al., 1987)


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konnten zum Beispiel bereits Transplantat-Unverträglichkeiten als sehr kompliziertes immunologisches Verhalten nachgewiesen werden. Diese Tiere müssen somit über ein gut entwickeltes Antikörper-unabhängiges Abwehrsystem verfügen. Von den drei genannten Stämmen, für die bereits spezifische Abwehrreaktionen gezeigt werden konnten, erfüllen die Kosmopoliten des Stammes der Anneliden die oben angeführten Voraussetzungen für das Studium des Abwehrsystems sehr gut.

Die Analyse von Vertretern eines Stammes läßt allerdings nur Aussagen über das Abwehrverhalten dieser Vertreter oder zum Teil des jeweiligen Stammes zu. Bei der Mannigfaltigkeit der wirbellosen Organismen sind Rückschlüsse auf die ’allgemeine‘ Immunologie der Invertebraten wohl nur sehr begrenzt möglich.

Das "August Krogh-Prinzip", wonach es für jedes Problem eine Tierart gibt, an der es besonders gut studiert werden kann, wurde in der vergleichenden Immunologie und Biochemie oft bestätigt (Urich, 1990). Wir denken, daß die lytische Aktivität der Anneliden in der Tierunterart Eisenia fetida ssp. -wegen des hohen Titers dieser Aktivität, den vielfältigen Voruntersuchungen und der Verfügbarkeit des Untersuchungsmaterials - am besten studiert werden kann.

4.2 Natürliche Killer-Zellen als Vermittler zytolytischer Reaktionen

Im Jahre 1976 wurde bei humanen Lymphozyten eine Subpopulation gefunden, die ohne vorausgegangene Immunisierung, sozusagen natürlich, Tumorzellen oder Virus-infizierte Zellen in vitro zytotoxisch zerstören kann. Die Zellen wurden als 'natural killer' (NK)-Zellen bezeichnet. Obwohl ein Teil des lymphatischen Systems, lassen sie sich weder den B-Lymphozyten noch den T-Lymphozyten zuordnen. Somit scheinen sie direkt, ohne Prägung durch den Thymus, aus Vorläuferzellen des Knochenmarks zu stammen. Deshalb wurde vermutet, daß NK-Zellen als unspezifischer Abwehrmechanismus phylogenetisch sehr alt sind (Monti et al., 1992; Versteeg, 1992; Kapur et al., 1994). Anfang der neunziger Jahre gelang der Nachweis der Ähnlichkeit von zytotoxischen Hämozyten der Mollusken mit der Aktivität humaner NK-Zellen (Franceschi et al., 1991). Wenige Jahre später konnte die spontane Zytotoxizität der


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Cölomozyten aus Eisenia fetida ssp. als NK-ähnliche Aktivität gegen die humane Tumorzellinie K 562 durch die morphologische Charakterisierung der Bindung von Effektor und Zielzelle gezeigt werden (Suzuki und Cooper, 1995, Quaglino et al. 1996). Die zytotoxische Aktivität wird dort von der Bildung multipler Aggregate ähnlich der Granulome begleitet. Bisher wurde dies nur in Säugern beobachtet. Granulome bestehen aus mehrkernigen Riesenzellen, Epitheloidzellen und aktivierten Makrophagen, die Infektionsherde dort abkapseln, wo antigenes Material nicht abgebaut werden kann, um es später zu lysieren.

Die zellvermittelte Lyse, die NK-Zellen im Abwehrsystem der Säuger einleiten, wird über porenbildende Proteine (wie Perforin) induziert. Für die von NK-Zellen sezernierten porenbildenden Proteine wird ein zwei-Schritt Mechanismus der Lyse vorgeschlagen: (1) Ca2+-abhängige Bindung an Phosphatidylcholin und Sphingomyelin über Phophorylkopfgruppen, die bei 0°C erfolgen kann und als Effektorzell-Zielzell-Konjugat über einen lektinähnlichen Rezeptor vermittelt wird, sowie (2) dem temperaturabhängigen Insertionsschritt, bei dem sich Kanäle in den Bilayer integrieren und nach weniger als 30 Sekunden den Lysevorgang der Zielzelle einleiten (Peitsch und Tschopp, 1991; Liu et al, 1995a,b).

Es wird zur Zeit spekuliert, ob eine in Invertebraten nachgewiesene NK-Zellen ähnliche Aktivität, von porenformenden Proteinen begleitet wird (Roch et al., 1989, Canicatti 1990, Porchet-Hennere et al., 1992). So wurden die sehr umfassend untersuchen zytotoxischen Cölomozyten des Anneliden Nereis diversicolor von mehreren Autoren - wenn bisher auch ohne Erfolg - auf immunologische Verwandtschaft mit dem humanen, porenbildenden Protein Perforin untersucht (Porchet-Hennere et al., 1992).

4.3 Isolierung und Charakterisierung von Eiseniapore

Wir haben die Wechselwirkung des von uns erstmals bis zur Homogenität gereinigten Hämolysins (Eiseniapore) von Eisenia fetida fetida mit Bilayerstrukturen von Liposomen wie auch Membranen von Erythrozyten untersucht, um mögliche funktionsanaloge Prozesse zu anderen Porenformern aufdecken und analysieren zu können. Das Hämolysin wird nach gegenwärtigem Erkenntnisstand von Cölomozyten aus der Cölomflüssigkeit sezerniert, die als


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zytotoxisch beschrieben wurden (Sekizawa et al., 1996).

Die Reinigung Eiseniapores erfolgte mittels präparativer Elutionselektrophorese. Neben dem Tetanus-Toxin ist Eiseniapore eines der sehr wenigen Proteine, die bisher nach einem solchen Trennmodus und -schema isoliert wurden (DiMari et al., 1982). Die Elutionselektrophorese gestattet oft nur geringe Ausbeuten, ermöglicht aber die Aufreinigung von Proteinen, die eine hohe Affinität zu den Trennmaterialien der klassischen Säulenchromatographie besitzen. Diese Affinität führt dazu, daß eine Elution, zum Beispiel wegen überlappender Proteinpeaks, nur in geringem Ausmaß möglich ist (van Heyningen, 1976, 1980; Bizzini, 1979; Mohrig et al., 1996). Das Überlappen der Peaks kann durch die Aggregation der Proteine an dem Säulenmaterial unterstützt werden (DiMari et al., 1982). Zu dem Trägermaterial der Elutionselektrophorese - dem Polyacrylamidgel - hingegen, besitzen die Proteine der Cölomflüssigkeit diese sehr hohe Affinität nicht, somit ist eine Isolierung der interessierenden Fraktionen möglich.

Die Aktivität, gemessen als Hämolyse von Schaferythrozyten, steigt nach der Reinigung erstaunlicher Weise an. Normalerweise fällt die Aktivität der gereinigten Proteine durch Verluste während der Reinigungsprozedur ab. Die Erhöhung der Aktivität kann mit einer Konformationsänderung Eiseniapores oder aber mit einer im Trennungsgang erfolgten Abscheidung einer inhibierenden/regulierenden Struktur erklärt werden (Ehlers und Lange, 1992; Mohrig et al., 1997).

Das gereinigte Eiseniapore wurde dem Protokoll von Suelter folgend charakterisiert (Suelter, 1990). Eiseniapore ist danach ein thiolaktivierbares Hämolysin, das in seiner lytischen Aktivität von Anionen (SO42->PO43-) und Kationen (Au3+>Fe3+>Fe2+>Zn2+) beeinflußt wird. Das Zytolysin von Spiroraphis spallanzani, von dem man annahm, es sei mit den Anneliden-Zytolysinen verwandt, ist hingegen nicht von Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen abhängig (Canicatti und Roch, 1993). Somit konnten keine Hinweise für eine funktionale Verwandtschaft erbracht werden.

Mehrere Metallionen wurden bisher in Anneliden nachgewiesen, ohne daß man um ihre physiologische oder immunologische Bedeutung wußte (Ireland, 1978, Prento, 1979). Wir haben Metallionen genutzt, die in Anneliden nachgewiesen wurden, um ihre Bedeutung für die Wechselwirkung Eiseniapore-Targetmembran als Bestandteil der Immunreaktion zu analysieren.


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Die Ionen mit der höchsten Oxidationszahl zeigten die deutlichste inhibierende Wirkung auf die lytische Aktivität Eiseniapores, was auf eine oxidative Schädigung von Eiseniapore durch die Reagenzien hindeutet. Wir konnten diese Überlegung durch unsere Beobachtung der unterschiedlichen Inhibierung des gleichen Metallions mit unterschiedlichem Oxidationsgrad belegen: Fe2+ besitzt ein geringeres inhibierendes Vermögen als Fe3+. Metallionen greifen in viele physiologische und immunologische Prozesse ein: (i) Kationen öffnen oder schließen Ionenkanäle und makromolekulare Poren (Mlinar und Enyeart, 1993, Walker et al. 1994), (ii) Au3+ induziert allergische und autoimmunologische Effekte, außerdem sind für dieses Metall inhibierende Wirkungen auf die Komplementaktivierung oder die Antikörper-abhängige Zytotoxizität beschrieben worden (Harth, 1981, Griem und Gleichmann, 1995, Griem et al. 1996) und (iii) Metallionen sind wichtig sowohl für die Stabilität als auch die Änderung der Konformation von Proteinen (Lester und Brumfeld, 1991; Arnold und Zhang 1994; Chai et al, 1995; Reagan, 1995).

Um pharmakologische Wirkstoffe, die in Liposomen transportiert werden, an Krebszellen zu schleusen und dosieren zu können, wird zur Zeit intensiv mit in Liposomen integrierten porenformenden Proteinen experimentiert. Auslösern gesucht, um den sich normaler Weise geöffneten Kanal der porenformenden Proteine gezielt zu schließen. Metallionen (z.B. Zink) sind in der Lage solche Poren zu schließen (Song et al., 1996; Russo et al., 1997; Brahe et al., 1997).

Neben der inhibitorischen Wirkung mehrerer Metallionen war die sehr starke inhibitorische Aktivität einer sehr geringen Konzentration von Au3+ auf die hämolytische Aktivität von Eiseniapore auffällig. Auch wenn für Au3+ die Reduktion der Antikörper- und Komplement-vermittelten lytischen Aktivität beschrieben wurde, gibt es noch keine Deutung für diese modulatorischen Effekte (Harth, 1981).

Für die Analyse der Membranwechselwirkung von Eiseniapore haben wir die Bindungsreaktion experimentell von der lytischen Reaktion getrennt. Die Bindung von Eiseniapore an Membranen wird durch Cu2+ gesteigert, während diese Ionen die lytische Aktivität inhibieren. Es konnte gezeigt werden, daß die zwei Schritte (Bindung und Lyse) durch unterschiedliche Faktoren beeinflußt werden können, das heißt, daß unterschiedliche Strukturen von Eiseniapore für Bindung und Lyse verantwortlich sind. Somit muß die Bindung nicht automatisch zu einer lytischen Aktion führen.


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Heparin und Lyso-PC verhindern die Bindung Eiseniapores an die Erythrozytenmembran, aber nicht die Insertion in diese. Für Perforin wurde ein ähnliches Bindungs- und Lyseverhalten beschrieben (Ishiura et al., 1990, Ojcius und Ding-E Young, 1990). Heparin und Lyso-PC verhindern ebenfalls die Bindung von Perforin an die Targetmembran, jedoch nicht den lytischen Insertionsschritt von gebundenem Perforin. Dieser Effekt wird in Zusammenhang mit dem Selbstschutz der Perforin-freisetzenden Zellen diskutiert (siehe auch Kapitel "Wie schützt sich Eisenia fetida fetida vor der lytischen Aktivität Eiseniapores?")

In Analogie zu einem anderen Mitglied der Perforin-Familie - der Komplementkomponente C9 - ist auch die Bindung von Eiseniapore nicht von Ca2+ abhängig. Die lytische Aktivität von bereits gebundenem Eiseniapore erfordert keine der untersuchten Metallionen. Vitronectin, ein Inhibitor der lytischen Aktivität von Perforin und Komplement, setzt die Bindungsaktivität, aber nicht die lytische Aktivität von Eiseniapore herab. Für die regulierende Wirkung der lytischen Aktivität des Komplements und des Perforins durch Vitronectin wird ein ähnlicher Mechanismus vermutet. Es wird diskutiert, daß durch die Anheftung von Vitronectin an die Komplement- und Perforinproteine die Bindung an die Zielmembran verhindert wird (Tschopp et al., 1987, 1990; Podack et al., 1983, 1991).

4.4 Eiseniapore induziert über einen Lipid-Rezeptor einen Leakage von Liposomen

Nachdem Bindungs- und lytische Aktivität von Eiseniapore an Erythrozyten analysiert worden sind, wurde die lytische Aktivität an Targetmembranen mit Hilfe von Liposomen studiert. Eiseniapore ist in der Lage, Bilayerstrukturen so zu stören, daß eine Freisetzung der wäßrigen Phase des Lumens der Liposomen erfolgt. Die lytische Aktivität von Eiseniapore benötigt keine anderen Faktoren der Cölomflüssigkeit und ist durch polyklonale Antikörper gegen Eiseniapore und die Komplementkomponente C9 unterdrückbar. Die Aktivität ist an die native Struktur gekoppelt, denn es kommt zu einem völligen Verlust nach Denaturierung von Eiseniapore durch Hitzebehandlung. Eine essentielle Voraussetzung für den durch Eiseniapore vermittelten Leakage der Lipidmembranen ist die Gegenwart von verschiedenen


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Sphingolipiden wie Sphingomyelin oder Galactosylceramid. Die Anwesenheit von Sphingolipiden ist eine hinreichende, womöglich eine notwendige Voraussetzung für den Leakage von Lipidmembranen. In Abwesenheit der Sphingolipide war keine Lyse von Phosphatidylcholin-Liposomen feststellbar, weder in der Gegenwart von Phosphatidylserin noch von Phosphatidylethanolamin und Cholesterol. Ein Leakage von Liposomen wurde nur in Gegenwart von Sphingomyelin beobachtet, der sein Maximum bei neutralem pH-Wert, dem natürlichen pH-Wert der Cölomflüssigkeit, und bei einer Temperatur von 37°C besaß; oberhalb dieser Temperatur verringerte sich die Aktivität wieder. Bei einem Eiseniapore ähnlichen hämolytischen Protein, dem Lektin CEL-III aus marinen Invertebraten, liegt das Maximum der lytischen Aktivität viel tiefer, es ist bei der Temperaturen von 10°C aktiver als bei 37°C (Hatakeyama et al., 1996). Beiden hämolytischen Proteinen ist somit gemeinsam, daß die Zunahme der lytischen Aktivität des Proteins nach einer bestimmten Temperaturerhöhung noch deutlich vor der Temperatur, bei der die Denaturierung erfolgt, wieder abnimmt.

Unsere weiteren detaillierteren Untersuchungen ergaben, daß folgende molekulare Merkmale der Sphingolipide notwendig für den Eiseniapore-vermittelten Leakage sind: (i) eine hydrophile Kopfgruppe wie Phosphorylcholin oder Galactosyl und (ii) das doppelkettige Rückgrat der Sphingolipide - das Ceramid.

Eine signifikante Steigerung des Eiseniapore-vermittelten Leakage von PC/SM-Vesikeln konnte in Anwesenheit von Cholesterol beobachtet werden. Cholesterol allein unterstützt die lytische Aktivität von Eiseniapore nicht; in Abwesenheit von Sphingomyelin wurde keine Markerfreisetzung beobachtet und der Leakage ist bei Austausch von Sphingomyelin durch Galactosylcerebrosid nicht erhöht. Diese Resultate implizieren eine Interaktion, vielleicht die Formation von Komplexen zwischen Cholesterol und Sphingomyelin, die für den erhöhten Leakage nach dem Einfügen von Cholesterol in PC/SM-Liposomen verantwortlich ist (Nieva et al., 1994, Moesby et al., 1995).

Cholesterol interagiert stark mit Phospholipiden, es soll dabei folgende Präferenzen zeigen: Sphingomyelin >> Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol > Phosphatidylcholin >> Phosphatidylethanolamin (Datta, 1987). Insbesondere die Studien, die eine Interaktion von Sphingolipiden wie den Gangliosiden oder den Cerebrosiden mit Cholesterol belegen, werden auch als Indikator für eine


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besondere Interaktion zwischen Sphingomyelin und Cholesterol herangezogen (Simons und Ikonen, 1997).

Slotte (1997) hingegen sieht in den bisherigen, folgenden, experimentellen Daten nur den sicheren Hinweis auf eine Differenz zwischen der Sphingomyelin- und Cholesterol-Wechselwirkung zum einen und der zwischen Phosphatidylcholin und Cholesterol zum anderen:

- Bilayer aus Cholesterol/Sphingomyelin sind für Wasser weniger permeabel als Cholesterol/Phosphatidylcholin Membranen (Barenholz, 1986)

- die Cholesteroldesorbtion in einer wäßrigen Phase ist von Sphingomyelin-haltigen Membranen geringer als die von Phosphatidylcholin-haltigen Membranen (Bittmann, 1993)

- der Kompressibilitätsmodulus in Sphingomyelin/Cholesterol Membranen ist größer als in Phosphatidylcholin/Cholesterol Membranen (Needham und Nunn, 1990)

- die Cholesterol Oxidase-Aktivität ist in Sphingomyelin-haltigen Membranen geringer als in Membranen, die Phosphatidylcholin enthalten (Mattjus und Slotte, 1994)

Es wurde vermutet, daß die OH-Gruppe des dritten C-Atoms des Sphingosinrückgrats für die spezielle Interaktion Sphingomyelin und Cholesterol verantwortlich ist (Datta, 1987). Andere Membranlipide verfügen über diese Gruppe nicht. Die Modifizierung der 3-OH Gruppe des Sphingosinrückgrats beeinflußt die Oxidation von Cholesterol - einem Indikator der Stärke der Wechselwirkung in Sphingomyelin-haltigen Membranen - aber nicht oder nur sehr wenig. Hingegen zeigt eine Variation der mit dem Amid verbundenen Fettsäurekette eine starke Veränderung der Rate der Cholesteroloxidation (Slotte, 1992, Bittman et al., 1994). Es ist daher möglich, daß diese Fettsäurekette und nicht die erwähnte OH-Gruppe für die laterale Interaktion von Cholesterol mit Sphingomyelin verantwortlich ist.

Obwohl bereits Daten vorliegen, die zeigen, wie Sphingomyelin und Cholesterol interagieren, weiß man bisher nicht, warum sie wechselwirken. Vermutlich wird die Homöostasis des phylogentisch jüngeren Cholesterols direkt vom evolutionär älteren Sphingomyelin beeinflußt.

Unsere Ergebnisse des Leakage von Sphingomyelin- und Cholesterol-haltigen Membranen geben einen deutlichen Hinweis auf die von mehreren Autoren diskutierten Sphingomyelin/Cholesterol Komplexe oder Mikrodomänen


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(Grönberg et al., 1991; Slotte, 1992; Simons and Ikonen, 1997). Ein starkes Indiz hierfür ist neben dem erhöhten Leakage von PC/SM-Liposomen nach Einbau Cholesterols vor allem die Tatsache, daß in Liposomen, in denen Sphingomyelin durch Galactosylceramid ersetzt wurde, kein erhöhter Leakage nachzuweisen ist. Das ist deshalb bedeutsam, da gezeigt werden konnte, daß Galactosylceramid im Gegensatz zu Sphingomyelin mit Cholesterol nicht spezifisch interagiert (Slotte et al., 1993).

Da mit anderen Methoden, wie der Langmuir'schen Balancetechnik an Monolayern, widersprechende Resultate zu der Cholesterol/Sphingomyelin Wechselwirkung gewonnen wurden (Smaby et al., 1996), kommt unseren Experimenten, die biologisch wirksame Faktoren nutzen, eine wichtige Bedeutung zu. Neben dem Modell der Semliki-Forest-Virus vermittelten Membranfusion, der für den Bindungsschritt Cholesterol, für das eigentliche Fusionsereignis aber Sphingomyelin benötigt (Nieva et al., 1994, Moesby et al., 1995), sind unsere Versuche zur Membraninterruption durch Eiseniapore ein weiteres biologisches Beispiel, das eine spezielle Wechselwirkungen von Sphingomyelin mit Cholesterol aufzeigt. Es ist der erste Nachweis, der eine immunologische 'Verwendung' dieser Interaktion dokumentiert.

Die Resultate unterstützen die These der essentiellen Rolle von Sphingolipiden bei dem Leakagevorgang, sie legen die Notwendigkeit von Sphingolipiden auch bei der Bindungsreaktion sehr nahe. Die Vorinkubation von Eiseniapore mit Liposomen verschiedener Lipidkompositionen ohne Sphingomyelin veränderte den folgenden Eiseniapore-vermittelten Leakage von PC/Chol/SM Liposomen nicht. Im Gegensatz dazu wurde kein Leakage von gelabelten PC/Chol/SM Liposomen gemessen, wenn Eiseniapore mit ungelabelten Liposomen gleicher Zusammensetzung vorinkubiert wurde. Diese Versuche machen deutlich, daß die Bindung von Eiseniapore an Liposomen, die Sphingolipide wie Sphingomyelin enthalten, notwendigerweise irreversibel ist. Eine Bindung von Eiseniapore an Lipidmembranen erfolgt ohne Sphingomyelin nicht, deshalb können andere Lipide - wie Cholesterol (dem Rezeptor Thiol-aktivierbarer Toxine aus Bakterien (Braun und Focareta, 1991))- als Rezeptor ausgeschlossen werden.

Weder die Anwesenheit von Phosphatidylserin noch von Phosphatidylethanolamin allein konnten PC-Liposomen für die Aktivität von Eiseniapore zugänglich machen, sie waren auch nicht notwendig für den Leakage


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von SM-Liposomen. Solange Sphingomyelin anwesend ist, bedarf es keiner weiteren Rezeptoren.

Elektrostatische Interaktionen scheinen bei dem erhöhten Eiseniapore-vermittelten Leakage der Erythrozytenmembran nachempfundene Liposomen keine herausragende Rolle zu spielen, da PC/PS Liposomen nicht lysiert wurden. Dennoch war die lytische Aktivität bei 'resealed ghost' noch höher als bei Liposomen mit der Lipidzusammensetzung der Erythrozytenmembranen. An 'resealed ghost' wurde das höchste Ausmaß von allen getesteten unilamellaren Vesikeln beobachtet<32>.

Systematische Untersuchungen zur Wechselwirkung unterschiedlicher Lipide mit Zytolysinen/Hämolysinen anderer Invertebraten liegen bisher nur sehr wenig vor. Eine Ausnahme bildet das Zytolysin A-III des marinen Wurmes Cerebratulus lacteus (Kem, 1994). Es ist das einzig isolierte Toxin aus dem 800 Arten umfassenden Stamm der Nemertinen. Wird dieses Polypeptid mit ultrabeschallten Dispersionen verschiedener Lipide vorinkubiert und anschließend dessen hämolytische Aktivität bestimmt, zeigen sich inhibitorische Effekte bestimmter Lipide. Ein Hämolysehemmung von 50% (definiert als LD50) ergibt sich schon bei geringer Konzentration von Gangliosiden (LD50: 2 µg/ml) und Sphingomyelin (LD50: 5 µg/ml Lipid). Inhibitorische Effekt sind ebenfalls bei Sphingosin (LD50: 60 µg/ml Lipid), Phosphatidylinositol (LD50: 80 µg/ml Lipid), Phosphatidylserin (LD50: 105 µg/ml Lipid) und Cerebrosid (LD50: 150 µg/ml Lipid) bestimmbar. Über 500 µg/ml Lipid sind bei Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Ceramiden und Cholesterol erforderlich, um die Hämolyse von A-III zu beeinflussen. Auch wenn die Hämolyseexperimente mit Lipiddispersionen Vorversuche darstellen, sind gewisse Aussagen über die Lipid-Peptid Interaktionen möglich. Sphingomyelin könnte neben Gangliosiden ein Lipidrezeptor für das Zytolysin A-III darstellen.

In Leakageversuchen ist der mögliche Austausch von Sphingomyelin durch Ganglioside als Rezeptor auch für Zytolysine des Stammes der Cölenteraten beschrieben worden (Macek et al., 1994, Kem, 1994). Für Eiseniapore fanden wir hierfür keine Hinweise. Sphingolipide ließen sich durch Ganglioside bei der Lyse von Liposomen als Rezeptor nicht ersetzen.


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Bei allen getesteten unilamellaren Vesikeln war für die großen unilamellaren Vesikel (LUV) ein geringerer Leakage als für die kleinen unilamellaren Vesikel (SUV) bestimmbar.

Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind Leakageexperimente mit vergleichenden Versuchen von SUV und LUV nur noch mit den lytischen Toxinen aus Cölenteraten durchgeführt worden. Hier wurde bei LUV mit vergleichbaren Konzentration ein größerer Markerausfluß als bei SUV beobachtet (Macek et al., 1994).

Die Ergebnisse der Charakterisierung von Eiseniapore als Thiol-aktivierbares Zytolysin und der Nachweis der Lipide, die notwendig sind, um einen Leakage zu induzieren, gestatten bereits eine erste Einordnung in das System der lytischen Proteine und Toxine. Bernheimer (1996) beschreibt 17 Toxine von unterschiedlicher Cölenteraten<33>, deren lytische Aktivität sämtlich durch Sphingomyelin inhibierbar ist. Überraschender Weise gibt es jedoch ein Toxin von Metridium senile, das nicht durch Sphingomyelin beeinflußt wird, es wird jedoch im Gegensatz zu allen anderen untersuchten Toxinen durch Thiolgruppen aktiviert. Bernheimer (1996) verweist auf ähnliche Ergebnisse bei den Zytolysinen von Bakterien oder den membranzerstörenden Toxinen der Arachnida (Spinnen) und schlägt wegen der Universalität dieses Phänomens über sehr große taxonomische Gruppen hinweg (Bacteria, Cölenterata und Arthropoda) eine Grobansprache der Toxine in die Familie der Thiol-aktivierbaren und die der Sphingomyelin-inhierbaren vor. Für bereits weitergehend untersuchte Toxine konnte gezeigt werden, daß Thiol-aktivierbare lytische Proteine immer von Cholesterol in ihrer lytischen Aktivität inhibiert werden können (Haque et al., 1992). Eiseniapore ist das erste beschriebene membranaktive Protein/Toxin, das sowohl durch Thiol-Gruppen aktivierbar und zugleich durch Sphingomyelin inhibierbar ist. Untersuchungen für Porenformer - Perforin, Komplementfaktoren oder antimikrobielle Peptide - in Säugern oder auch in Wirbeltieren fehlen, da man sie per Definition nicht als Toxine begreift und sie so von direkten vergleichenden Untersuchungen ausschließt. Die Kopfgruppe des Sphingomyelins wird jedoch als Rezeptor für Perforin diskutiert (Antia et al., 1992).


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4.5 Existiert neben dem Lipid-Rezeptor zusätzlich ein Protein- oder Kohlenhydrat-Rezeptor für Eiseniapore?

Für bakterielle Toxine, die enzymatisch lytisch wirken, sind Rezeptoren auf der Targetmembran beschrieben worden:

- Diphtheria-Toxin, Rezeptor: 14,5 kDa Bindungsprotein im Komplex mit einem 27 kDa Protein (Williams et al., 1990; Papini et al., 1991),

- Cholera-Toxin, Rezeptor: GM1 (Moss und Vaughan, 1988),

- Verotoxin, Rezeptor: Globotetraosylceramid (Jacewicz et al., 1991) und

- Botulinum-Neurotoxin, Rezeptor: Sialosylgruppen (Schantz und Johnson, 1992). Jedoch liegen für die porenformenden Bakterientoxine erst wenige Ergebnisse vor (referiert bei Li, 1994).

Dieser Mangel an Informationen ist jedoch nicht auf bakterielle Porenformer beschränkt. Für porenbildende Proteine aller taxonomischen Gruppen gibt es insgesamt erst wenig Kenntnisse über ihre Rezeptoren. So wurden kürzlich zwei lytische Proteine aus Eisenia fetida andrei ("Fetidine") isoliert. Für die Analyse eines möglichen Rezeptors wurden von den Autoren künftige Versuche mit Vesikeln unterschiedlicher Zusammensetzung vorgeschlagen (Milochau et al., 1997). Die von uns durchgeführten Versuche gestatten einen Ausblick auf einen möglichen Rezeptor mit einer Lipidstruktur: den Sphingolipiden. Um die Frage abzuklären, ob neben den Sphingolipiden auch eine Kohlenhydratstruktur oder ein Protein als Rezeptor existiert, nutzten wir Erythrozytenmembranen. In 'resealed ghost' (geschlossene Ghosts) wurde dazu ANTS/DPX eingeschlossen. Der Durchmesser dieser 'resealed ghosts' wurde durch Herstellung sogenannter Erythrosomen mittels Extrusion denen der LUV (Durchmesser 100 nm) angeglichen. Somit war ein direkter Vergleich zwischen der puren Lipidmembran der LUV, die die Lipidkomposition der äußere Erythrozytenmembran widerspiegelten, und der biologischen Membran der 'resealed ghost', die neben den Lipiden auch Proteine enthält, möglich. Bisher ist ein solcher Vergleich noch nicht durchgeführt worden, da man annahm, daß dieses neue Derivat aus Ghosts (Nanoerythrosomen) weitestgehend inert gegenüber membranaktiven Substanzen sei (Lejeune et al., 1997). In den durchgeführten Versuchsreihen konnte kein Unterschied im Ausmaß des Leakage bei LUV, die den äußeren Lipidlayer der Plasmamembran bei Erythrozyten nachbildeten, und Nanoerythrosomem gemessen werden. Wir gehen deshalb


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davon aus, daß ein spezieller Proteorezeptor oder eine Kohlenhydratstruktur, als Rezeptor fungiertend, nicht existiert. Es kann somit ausgeschlossen werden, daß neben Sphingolipiden als Rezeptor für Eiseniapore weitere Rezeptoren für die Wechselwirkung mit reinen Lipid- oder mit biologischen Membranen wie der Erythrozyten - der experimentiell am häufigsten genuzten Zielzelle für die Analyse lytischer Proteine - nötig sind. Die hier erstmals verwandte Methode des Leakagesvergleichs von Vesikeln gleichen Durchmessers mit biologischen proteinhaltigen und reinen Lipidmembranen, bietet auch einen Ansatz für die Beantwortung ähnlicher Fragestellungen bei anderen lytischen Proteinen/Peptiden. So konnte beispielsweise an Hand der Leakage- und Hämolyseversuche nicht abgeklärt werden, ob das alpha-Hämolysin der pathogenen E. coli Stämme über einen Rezeptor mit der Targetmembran, die auch hier die Membran von Erythrozyten ist, wechselwirkt (Ostolaza et al., 1993, 1997).

Diese Ergebnisse lassen weitreichende Schlüsse für die Invertebraten-Immunologie zu. Den Hämolysinen in Invertebraten, zu denen auch Eiseniapore zu rechnen ist, wurde bislang eine Funktion in der Abwehr von pathogenen Bakterien zugeordnet. Denn eine biologische Aktivität in Invertebraten gegen Erythrozyten von Vertebraten wäre ohne immunologischen Sinn, auch wenn ein solcher diskutiert worden ist (Roch et al., 1987). Das gereinigte Hämolysin Eiseniapore benötigt jedoch für die Interaktion mit Targetmembranen Lipid-Rezeptoren (Sphingolipide), die auf der Membran von Bakterien nicht vorkommen<34>. Hieraus ergeben sich mehrere interessante Schlußfolgerungen. Es wäre möglich, daß Eiseniapore eher den Schutz gegen Protozoen und metazoische Parasiten realisiert. Bakterien wären damit ein interessantes Objekt für das Studium weiterer möglicher Immunmechanismen, sowie zusätzlicher Eiseniapore-Rezeptoren (siehe auch Kapitel Kohlenhydratsbindungs-Eigenschaften von Eiseniapore). Außerdem ist es möglich, daß für den Schutz vor Bakterien ein spezieller -nicht mit Eiseniapore in Zusammenhang zu bringender- Mechanismus (z.B. antibakterielle Peptide auf der Hautoberfläche) existiert.

Die hier vorlegten Ergebnisse erweitern und stützen die Resultate über die


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Bedeutung der Wechselwirkung von Sphingolipiden und Hämolysinen anderer Invertebraten. Es handelt sich hierbei um die phylogenetisch sehr weit auseinanderstehenden Gruppen der Cölenterata, Echinodermata und Tunicata (Canicatti et al., 1987, Macek et al., 1994, Parrinello et al., 1995, Meinardi et al., 1995). Die Cölenterata gehören zu den frühen Gewebetieren, denen alle Protostomia folgen, die ihren Abschluß in den Arthropoden mit den Insekten finden. Der Entwicklungszweig, den die Echinodermata und Tunicata markieren, führt als Zweig Deuterostomia zu den Vertebraten mit den Säugern. Mit unseren Ergebnissen über Anneliden wird erstmals die Sphingolipid-Wechselwirkung eines lytisches Proteins von einem Organismus, der bereits über drei Keimblätter verfügt - und somit ein erster Vertreter der Protostomier, der das Organisationsniveau von sogenannten echten "Organtieren" erreicht - beschrieben.

Die Parasiten dieser Invertebraten (Cölenterata, Echinodermata) und speziell der Annelida<35> besitzen als typischen Bestandteil ihrer Lipidkomposition Sphingolipide: Ciliaten, Gregarinen (meist aus der Familie Monocystidae), Cestoden und Nematoden (Kaneshiro, 1987; Maloney und Semprevivo, 1991; Nishimura et al., 1991; Satouchi et al., 1993; Chitwood et al., 1995; Lucius und Loos-Frank, 1997). Die Membran dieser Parasiten ist somit durch Eiseniapore angreifbar; unterstützt wird diese Überlegung durch die Beobachtung, daß sie in der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida nicht überleben können. Wenn diese Parasiten aus dem Gewebe in den Cölomraum eindringen, greift ein noch nicht verstandener Abwehrmechanismus, der die Parasiten abtötet (Valembois et al., 1992; Kauschke, persönliche Mitteilung).

4.6 Strukturelle Eigenschaften von Eiseniapore

Mittels Elektronenmikroskopie konnten in Sphingomyelin-haltigen Targetmembranen regelmäßige Porenstrukturen Eiseniapores mit einem Innen- und Außendurchmesser von 2-3 nm und 10 nm sichtbar gemacht werden. Das an


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die Membran gebundene Eiseniapore formt eine aus sechs Monomeren bestehende oligomere Porenstruktur, die sehr stabil ist. Sie wird erst nach 30 Minuten kochen in der Gegenwart von reduzierenden Reagenzien zerstört. Die Stabilität der Pore in Gegenwart von Detergenzien und der - in ’osmotischen Schutzexperimenten‘ bestimmte - definierte Poreninnendurchmesser lassen die Vermutung zu, daß Eiseniapore sich als ein sogenannter “protein-walled channel“ (Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991b, siehe Einleitung, Abb.1, Modell B) in die Membran integriert.

Der von Eiseniapore induzierte Leakage von reinen Lipidmembranen und biologischen Membranen läßt sich über eine Reaktion zweiter Ordnung beschreiben, da die Halbwertzeit des Anstieges, aufgetragen gegen den reziproken Wert der Proteinkonzentration, in erster Näherung eine Gerade ergibt. Somit agiert das Protein an einen bestimmten Punkt des Leakageprozesses als Dimer.

Bei humanen antimikrobiellen Defensinen (Hristova et al., 1996), zytolytischen Toxinen der Bakterien (van der Goot et al., 1993), Enzymen (Robertson und Mathews, 1996) insbesondere den HIV-1 Proteasen (Grant et al., 1992) wird der Wechsel von der löslichen, hydrophilen zur membranassoziierten, lipophilen Konformation über eine Dimerisierung des Peptids/Proteins ermöglicht.

Es wird gegenwärtig diskutiert, ob die Struktur eines Dimers eine notwendige Voraussetzung für die Formation einer Pore ist (Hristova et al., 1996)<36>. Es wäre sogar möglich, die individuelle Herausbildung einer Pore (und die Bedeutung des Dimers) in der Phylogenese dieser Struktur wiederzufinden und zu diskutieren. Die wenigen zur Verfügung stehenden Daten gestatten nur ein einfaches Bild für die Verbindung von Aggregaten oder Poren aus Proteinmonomeren in der Evolution: (i) eine Genfusion (Gilbert, 1978) führt zu einer Verbindung von zwei Proteinen unterschiedlicher Funktion über eine Polypeptidkette, das so entstandenen primitive, geschlossene Monomer erhält eine (ii) c-Schnittstelle (c - closed) zwischen den Untereinheiten und wird so zu einem primitiven, aktiven und geschlossenen Monomer, ähnlich wie es sich in heutigen, rezenten Multidomänen-Proteinen darstellt. Das aktive Monomer


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könnte sich im Gleichgewicht mit einem (iii) Dimer befinden, welches durch Domänentausch (Piccoli und D'Alessio, 1984; Bennett et al., 1995) entsteht. Hierbei wird die Domäne als globuläres Areal - oder ein Element einer sekundären Struktur - definiert. Ein Domänentausch in einem Dimer beschreibt die Verflechtung der Domäne einer Proteinkette mit dem identische Umfeld einer gleichen Domäne eines anderen Monomers. Die (iv) rezenten, stabilen Dimere weisen für die Öffnung und Bildung von Oligomeren zusätzlich eine sogenannte o-Schnittstelle (o - open) auf (Bennett et al., 1994) (siehe auch Kapitel 5.8. "Warum so kompliziert?").

Die Sekundärstruktur Eiseniapores besteht überwiegend aus beta-Strukturen, vor allem aus beta-sheets. Über porenbildende Proteine mit einem hohen Anteil an beta-sheet ist bisher sehr wenig bekannt (van der Goot et al., 1994), auch wenn ein hoher Anteil an beta-sheet nicht ungewöhnlich für Proteine zu sein scheint, die in einer oligomeren Form mit Membranen interagieren, zum Beispiel: Poly-C9 des Komplementsystems (Podack und Tschopp, 1982), das Staphylococcus alpha-Toxin (Bhakdi und Tranum-Jensen, 1991a; ausführlich referiert: Lesieur et al., 1997), Aerolysin, dem zytolytischen Exotoxin von Aeromonas hydrophila (van der Goot et al., 1994) und das theta-Toxin von Clostridium perfringens (Perfringolysin O) (Nakamura et al., 1995). Durch Messung des CD-Spektrums wurde kein Hinweis für eine Neuordnung der Sekundärstruktur Eiseniapores, wenn eine Bindung an Sphingomyelin-haltige Membranen erfolgt, gefunden. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß eine mögliche Änderung bestimmter Proteinabschnitte durch Veränderung anderer Bereiche kompensiert wird und somit im Gesamtspektrum nicht sichtbar wird. Im Gegensatz dazu fanden wir jedoch deutliche Veränderungen der Trytophanfluoreszenz, die mit einer Neuorientierung der Tertiär- oder Quartiärstruktur bei Anwesenheit von Sphingomyelin-haltigen Membranen erklärt werden kann. Bisher wurde die Veränderung der Tertiärstruktur ohne Modifizierung der Sekundärstruktur - sie soll die energetisch günstigste sein (van der Goot et al., 1994) - nur bei der Membraninsertion von Colicin A (Lakey et al., 1991, van der Goot et al., 1991) und Aerolysin (van der Goot et al., 1992), zwei bakteriellen porenformenden Proteinen, beobachtet.


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4.7 Wie schützt sich Eisenia fetida fetida vor der lytischen Aktivität Eiseniapores?

Zeitgleich wurde von zwei Arbeitsgruppen auf die mögliche Rezeptorwirkung verbunden mit einer Funktion in der Selbst/Fremderkennung von Sphingomyelin bei den potenten Hämolysinen von Cölenteraten beziehungsweise von Anneliden hingewiesen (Meinardi et al., 1995; Lange et al., 1995). Obwohl die Lipidanalyse verschiedener Gewebemembranen der Anneliden noch nicht abgeschlossen ist, scheint es, daß Sphingolipide in Membranen von Anneliden nur gering oder nicht vertreten sind (Karnosky, 1969; Albro et al., 1992; Hori and Sugita, 1993). Das Nervensystem der Anneliden, welches den Cölomraum mit dem dort gebildeten lytisch aktivem Eiseniapore passiert, ist im Gegensatz zu anderen Wirbellosen, bei denen Sphingomyelin eine Hauptkomponente des Nervensystems bildet, völlig frei von Sphingomyelin (Okamura, 1985a). Ein anderer Rezeptor Eiseniapores, Galactosylceramid, ist im Nervengewebe von Anneliden durch andere Ceramide ersetzt worden (Okamura, 1985b). Bei jüngeren Nachweisen von Galactosylceramiden in Anneliden, wie dem mit Eisenia fetida fetida oder Lumbricus terrestris eng verwandten Pheretima asiatica (Tanaka et al. 1996), stammen die Tiere aus kommerziellen Unternehmen und es können keine Aussagen über Hälterung und Nahrungszusammensetzung gemacht werden. So fehlt genau den Arbeiten, in denen der Nachweis von Gangliosiden oder Ceramiden gelang, ein Hinweis auf eine vorgeschaltete Diät der Tiere. Es wurden immer Tiere mit ihrem Darminhalt, einschließlich der bakteriellen, pflanzlichen und tierischen Rückstände, homogenisiert, was keine eindeutige Analyse gestattet.

Die lytische Aktivität von Eiseniapore wird - wie bei Perforin - durch Lysolipide herabgesetzt. In Lipidkomposition von Anneliden konnten ungefähr 5,5% Lysolipide (bezogen auf die Gesamtlipidmenge) nachgewiesen werden (Albro et al., 1992). Damit sind sie in Anneliden die dritthäufigste Phospholipidfraktion. Der inhibierende Effekt von Lysolipiden auf die Perforin-vermittelte Hämolyse wird im Zusammenhang mit dem Selbstschutz der Perforin-sezernierenden Zellen diskutiert.

Die biochemisch aufwendige Modifizierung bestimmter körpereigener Lipide, die sich dann von den Lipiden des Target unterscheidet, scheint für die selbst/fremd-Erkennung in der Evolution nur wenig verfolgt zu sein. Eine


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Ausnahme bilden die Vertreter des Stammes Cölenterata, sie produzieren Zytolysine, die als Lipidrezeptor das bei ihren potentiellen Gegnern vorhandene Sphingomyelin nutzen (Macek et al., 1994). Sie selbst schützen sich nicht durch Abwesenheit dieses Lipids, sondern mittels Substituierung durch ein Phosphonoanaloga. Da Phosphonosphingolipide mit dem Toxin nicht interagieren, ermöglichen sie so eine Selbst/Fremdselektivität (Meinardi et al. 1995) und so den Schutz vor den eigenen Toxinen.

Insgesamt scheint es schwierig, vergleichende biochemische Überlegungen der zytolytischen Proteine mit einem phylogenetischen Entwicklungssystem der Lipide abgleichen zu wollen. In jedem Tierstamm sind einzelne Lipide so stark modifiziert worden, daß man von eigenständigen chemischen Strukturen sprechen kann, die kaum einen entwicklungsgeschichtlichen Zusammenhang erkennen lassen. Viele Lipide lassen sich außerdem auch nicht durchgängig in der Entwicklungsgeschichte nachweisen. Dies belegt beispielsweise die "eigentümliche Verbreitung" (Urich, 1990) der Ganglioside, sie kommen nur in Echinodermaten und dann Millionen Jahre später wieder in den Wirbeltieren vor. Dies macht es unmöglich, einen Stammbaum der Ganglioside zu skizzieren. Nachweise von Gangliosiden in Lumbricus terrestris sind vermutlich mit der Nahrungszusammensetzung der gehälterten Tiere erklärbar; Hinweise für eine in vivo Produktion als endogene Lipide fehlen bei den Anneliden wie auch bei allen anderen Protostomiern (Albro et al., 1992; Albro et al., 1993).

4.8 "Warum so kompliziert?"

Mit dieser Frage schloßen Parker et al. (1996) ihre umfassende Analyse über das Aerolysin - einem bakteriellen kanalformenden Protein. Die Autoren bezogen sich insbesondere auf die Größe und die verschiedenen Domänen des Proteins. Diese Frage scheint deshalb berechtigt, da Peptide, wie das aus nur 7 Aminosäuren bestehende extrem kleine Subtilysin von Bacillus subtilis, hinreichende zytolytische Wirkung besitzen, obwohl sie nicht einmal die notwendige Anzahl von 21 Aminosäuren besitzen, die mindestens erforderlich sind, um die Membran zu durchspannen (Hemminga, et al. 1992). Warum entstanden bereits mit den ersten, komplexen Gewebetiere (Eumetazoa) -ein rezenter Vertreter ist z.B. die Cnidarie Physalia physalia ("Portugiesische


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Galeere")- riesige Zytolysine (240 000 Dalton bei Physalia), wenn auch sehr kleine Peptide als sogenannte 'low cost products' ausreichend lytisch wirken konnten (Bernheimer, 1996)?

Eine befriedigende Antwort ist vermutlich erst möglich, wenn die vergleichende Sichtweise durch eine phylogenetische erweitert wird. Die Untersuchungen der letzten Jahre zeigten, daß poren- oder kanalbildende Mechanismen der Membranpermeabilisierung die in der Natur favorisierten sind und in vielen pathogenen Vorgängen eine herausragende Rolle spielen. Das Problem der Regulation des Prozesses der Kanalbildung und der Schutz vor Autolyse durch Inhibitoren rückt deshalb gegenwärtig in das Zentrum des Interesses (Canicatti, 1990; Franceschi et al., 1991; Milochau et al., 1997; Leippe, 1997). Die von Parker et al. (1996) zitierte Frage ließe sich unter anderem in dem Sinne beantworten, daß in der Evolution der Schritt vom einfachen, membranaktiven Peptid zum komplexen, membranaktiven Protein gegangen werden mußte, um in höher spezialisierten Organismen Effekte der Aktivierung, Regulation und Inhibierung der porenbildenden und lytischen Aktivität zu ermöglichen. Diese Überlegung wird durch folgende Beobachtung gestützt: Wie bei der Reinigung von Eiseniapore ist in der Literatur auch für einzelne andere lytische Proteine beschrieben worden, daß ihre Aktivität nach der Reinigung erhöht ist.

Bei dem alpha-Hämolysin von Escherichia coli (Nistiar et al., 1991) wurde eine Steigerung der Aktivität beobachtet. Eine Steigerung um das 31.6-fache über drei Reinigungsschritte wurde für das 40-kDa Hämolysin von Strongylcentrotus nudus beschrieben (Osada et al., 1993). Es wird eine Konformationsänderung des lytischen Proteins, vor allem aber die Abtrennung eines regulierenden Mechanismus‘ oder eines Inhibitors durch die Reinigungsprozedur diskutiert. Für lytische Peptide sind im Gegensatz zu den lytischen Proteinen keine durch die Reinigung bedingten Aktivitätssteigerungen beschrieben worden.

Diesen Resultaten folgend, erscheint die Anwesenheit eines Regulators bei Anneliden wahrscheinlich. Milochau et al. (1997) charakterisierten die hämolytische Aktivität der gesamten Cölomflüssigkeit im Vergleich mit den isolierten hämolytischen Proteinen (Fetidine) von Eisenia fetida andrei. Die Autoren diskutieren die so gewonnenen Ergebnisse<37> mit der Anwesenheit von


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anderen, nicht näher charakterisierten Molekülen in der vollständigen Cölomflüssigkeit, welche die Bindung der lytischen Proteine an die Membran verhindern.

Der von uns erstmals für Invertebraten nachgewiesenen Inhibitor der lytischen Aktivität, der 67 kDa große Eiseniapore-regulierende Faktor (Ehlers und Lange, 1992; Lange 1995; Mohrig et al., 1997), könnte für die Deutung des Verlaufes der von Milochau et al. (1997) gemessenen Dosis-Wirkungs-Kurve der Hämolyse und die Aktivitätssteigerung nach erfolgter Reinigung herangezogen werden. Dieser zum Teil stimulierbare Regulator wurde bei verschiedenen europäischen Anneliden nachgewiesen (Mohrig et al., 1997).

Proteine, die nach den bisherigen Informationen durch Regulatoren supprimiert werden, nehmen einen Molekulargewichtsbereich von 30 bis 70 Kilodalton ein. Die Entwicklung von 'gigantischen Zytolysinen', ihr Molekulargewicht liegt zwischen ungefähr 200 bis 400 Kilodalton, könnte ein Versuch gewesen sein, Einheiten zu schaffen, die nicht durch äußere Strukturen reguliert werden, sondern selbstregulierend sind (siehe auch: Parker et al., 1996). Ähnlich wie bei den kleinen lytischen Peptiden finden sich für diese sehr großen Zytolysine keine Hinweise auf regulierende Proteine.

4.9 Die Aktivität Eiseniapores wird durch Kohlenhydrate beeinflußt

Sinkora et al. (1993) identifizierten ein 38 kDa Protein mit opsonierenden Eigenschaften in der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida ssp. Wright führte den Begriff Opsonine 1903 für Serumbestandteile ein, die eine Bindung von Bakterien und partikuläre Antigene an Phagozyten vermitteln und so den sich anschließenden Prozeß der Phagozytose fördern. Gegenwärtig gelten alle Faktoren, die phagozytosefördernd oder für die Komplement-abhängige Lyse von invasiven Mikroorganismen nötig sind, als Opsonine. Es gibt Hinweise für eine Koppelung der hämolytischen und der opsonierenden Aktivität in Anneliden. Synthetische 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA)-Copolymerpartikel, die in der Cölomflüssigkeit opsoniert werden und so zu einer Erhöhung ihrer Phagozytose


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durch freie Cölomozyten führen, verringern die hämolytische Aktivität der Cölomflüssigkeit (Sinkora et al., 1993). Da für lytische Komponenten in Lumbriciden, wie Eisenia fetida fetida, ein Lektincharakter diskutiert werden kann, der in der agglutinierenden Aktivität und Zuckerspezifität einzelner Cölomflüssigkeitsfraktionen deutlich wird (Mohrig et al., 1996), ist eine Verbindung von Eiseniapore (38 kDa) und der opsonierenden Aktivität (38 kDa) möglich. Der Wirkmechanismus einer von uns diskutierten Wirkung von Eiseniapore auf pathogene, mehrzellige Parasiten der Anneliden wäre durch eine opsonierende Aktivität, die für Lektine diskutiert wird, herleitbar.

Die inhibierende Wirkung von alpha1-saurem Glykoprotein, Mucin, Glykophorin, Fetuin, der Blutgruppensubstanz A und Thyroglobin auf die lytische Aktivität von Eiseniapore stimmt mit der inhibierenden Wirkung dieser Kohlenhydratstrukturen auf das lytische Vermögen von Komponenten aus der Cölomflüssigkeit überein (Mohrig et al., 1996). Die inhibierende Wirkung der erwähnten Kohlenhydratstrukturen läßt es wahrscheinlich erscheinen, daß Eiseniapore die Fähigkeit besitzt, mit einer Neu5Ac alpha (2 3)/alpha (2 6)-Gal Sequenz als einem möglichen Rezeptor auf den Membranen von entarteten Zellen oder pathogenen Bakterien wechselzuwirken (Mercy und Ravindranath, 1993; Tsuboi et al., 1993a,b; Ray und Chatterjee, 1995). Weitere Versuche sind allerdings nötig, um die Wechselwirkung zwischen Eiseniapore und Kohlenhydratstrukturen detailliert zu analysieren.

Da hämolytisch aktive Lektine erst seit wenigen Jahren untersucht werden - die lytisch und agglutinierend wirksamen Lektine aus der Cölomflüssigkeit von Anneliden waren die ersten, für die solche Aktivitäten überhaupt nachgewiesen werden konnten (Eue et al., 1991) - befindet sich die Analyse der Wechselwirkung dieser speziellen Lektine mit Kohlenhydratstrukturen erst am Anfang. Neben Eiseniapore wurde erst ein weiteres oligomerisierendes hämolytisches Lektin beschrieben: CEL-III aus Cucumaria echinata (Hatakeyama et al., 1996). Auch dieses Lektin wirkt über eine Hexamerbildung vermutlich in Form eines Membrankanals lytisch<38>.

Das zur Oligomerisierung befähigte Eiseniapore benötigt mindestens zwei Bindungsstellen:


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- eine für die Interaktion mit der Targetmembran und

- eine weitere für die Vermittlung der Monomere zum Hexamer untereinander.

Eue (1991) konnte an der lytischen Aktivität der Cölomflüssigkeit nachweisen, das verschiedene Inhibitoren der lytischen Komponenten an jeweils unterschiedlichen Bindungsstellen (lytisches Molekül Membran, lytisches Molekül lytisches Molekül) wechselwirken. Fetuin verhindert beispielsweise die Bindung von lytischen Komponenten aus der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida an der Erythrozytenmembran. Hingegen bleibt in Gegenwart von Lumbricus terrrestris Cölomflüssigkeit, die die lytische Aktivität der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida unterdrückt (Henniger, 1990), die Bindungsfähigkeit der lytischen Moleküle von Eisenia fetida fetida trotz inhibierter lytischer Aktivität erhalten (Eue, 1991). Eue erklärt dies damit, daß Fetuin die Bindungsstelle zum Rezeptor blockiert, während Komponenten aus der Lumbricus terrrestris Cölomflüssigkeit direkt auf das lytische Zentrum der Moleküle aus der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida wirken, ohne daß die Rezeptionsfähigkeit beeinflußt wird. Durch die direkte Bindung an die lytischen Moleküle soll die für den Lysevorgang notwendige Bildung eines hochmolekularen Komplexes verhindert werden (Eue, 1991).

Die inhibierende Wirkung von Kohlenhydratstrukturen ist aber auch mit einer katalytischen Wirkung auf die lytischen Proteine erklärbar. Die Interaktionen der Bindungsstellen, die eine Oligomerisierung der Eiseniapore-Monomere (Eiseniapore Eiseniapore) ermöglichen, kann durch die Anwesenheit von bestimmten Kohlenhydraten gefördert werden. Das hämolytische Lektin CEL-III oligomerisiert beispielsweise in Anwesenheit von Kohlenhydraten auch in Abwesenheit der Targetmembranen (Hatakeyama et al., 1996). Für die transmembranalen Poren des Komplements wurde eine katalytische Wirkung von Zn2+ auf die Oligomerisierung der lytischen Komplementmonomere beschrieben (Tschopp und Nabholz, 1990).

Für die lytischen und agglutinierenden Komponenten der Cölomflüssigkeit wurde N-Acetyl-Neuraminsäure als Rezeptor in der Targetmembran diskutiert (Mohrig et al., 1996); für Eiseniapore konnten wir jedoch die Wirkung von N-Acetyl-Neuraminsäure als ein Rezeptor nicht bestätigten. Komplexe Kohlenhydratstrukturen könnten die Bindung von Eiseniapore mit den Lipid-Rezeptoren (Sphingolipide) beeinflussen, ohne selbst ein Rezeptor zu sein. Dies wird durch folgende experimentelle Daten unterstützt:


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(i) der Einbau von Gangliosiden in Liposomen führt zu keinem erhöhten Leakage und (ii) Neuramindase-behandelte Erythrozyten werden mit dem gleichen Titer lysiert wie unbehandelte Erythrozyten.

4.10 Eiseniapore - das erste nachgewiesene Ca2+-unabhängige lytische Lektin

Die von uns durchgeführten Zuckerinhibierungsversuche können als zusätzlicher Beleg für die Argumentation von Eue (1991) und Mohrig et al. (1996) über den Lektincharakter der agglutinierenden und lytischen Komponenten in Lumbriciden (Anneliden) bewertet werden. Insbesondere die vor kurzem erstmals nachgewiesene Kreuzreaktivität von lytischen und agglutinierenden Proteinen scheint ein deutliches Indiz hierfür zu sein, da eine agglutinierende Aktivität oft als charakteristisch für Lektine angesehen wird (Mohrig et al., 1996). Lektine der Vertebraten können in C- und S-Typen unterteilt werden (Drickhammer und Tayler, 1993)<39>. Den im Serum, der extrazellulären Matrix und in Membranen nachgewiesenen C-Typ Lektinen ist die Ca2+-Abhängigkeit ihrer Kohlehydrat-Interaktion gemeinsam. Die gewöhnlich intrazellulär vorkommenden Galaktose-spezifischen S-Typ Lektine binden Ca2+-abhängig an beta-Galaktoside. Viele dieser können in ihrer Aktivität durch die Gegenwart von Thiol-Gruppen stabilisiert werden.

Einige wenige Lektine, wie die Pentraxine, das C-reaktive Protein oder die Mannose-spezifischen Lektine lassen sich in die obige dichotome Ordnung schwer einfügen. Wollte man für Eiseniapore keine eigene Ordnung - mit Eiseniapore als einzigem Vertreter - festlegen, könnte es wohl am ehesten als Lektin des S-Typs aufgefaßt werden. Inbesondere die Unabhängigkeit der lytischen Aktivität von Ca2+, die es von den Pentraxinen, den C-Typ Lektinen, aber auch von den bisher nachgewiesen anderen hämolytischen Lektinen der Invertebraten (Hatakeyama et al., 1996, Armstrong et al., 1996) unterscheidet, lassen eine Zuordnung in diese Gruppe möglich erscheinen; auch wenn Wechselwirkungen mit niedermolekularen Kohlenhydraten nicht beobachtet


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werden konnten. Vor allem die bei S-Typ Lektinen speziell vorkommende Thiolabhängigkeit für die maximale Aktivität rechtfertigt diese Zuordnung. Die nicht nachzuweisende Supprimierung der lytischen Aktivität von Eiseniapore durch Neuraminsäure zum einen und die Inhibierung durch Fetuin zum anderen lassen insgesamt, wie auch die Versuche mit nicht-lytischen Lektinen von Tachypleus tridentatus und Scylla serrata zeigen, die Vermutung zu, daß freie Sialinsäuren oder Sialinsäure-haltige Oligosaccharide bei vielen Invertebraten-Lektinen keine Bindungsinteraktionen ermöglichen. Dazu bedarf es der komplexeren Strukturen der Sialoglykoproteine (Tsuboi et al., 1993).

Eiseniapore besitzt somit mindestens zwei nachgewiesene Aktivitäten, eine, die im Zusammenhang mit der (i) humoralen Abwehr (Zytolyse) und eine andere, die mit der (ii) zellulären Abwehr (Agglutination) diskutiert werden kann<40>. Eiseniapore wäre somit der erste, nachgewiesene Kandidat für die Hypothese (Sinkora et al., 1993) von der Kooperation humoraler und zellulärer Abwehr in Invertebraten.

4.11 Die hämolytische Aktivität von Eiseniapore wird durch einen Regulator inhibiert

Über regulierende und inhibierende Strukturen in der Gruppe der Invertebraten liegen bisher erst wenige Daten vor, ein eigentlicher Regulator konnte bis vor Beginn dieser Untersuchung nicht charakterisiert oder isoliert werden. Ähnlich wie bei dem Komplementsystem vermutete man eine Regulierung über biologische Halbwertszeiten der lytischen Proteine. Frei gelöst besitzt beispielsweise der naszierende C5b67-Komplex des Komplementsystems eine Halbwertszeit von 0.1 Sekunden, die Komplementkomponente C3b muß sogar innerhalb von 60 Mikrosekunden an ein Membranmolekül gebunden sein, sonst wird dieses Protein inaktiviert (Alberts et al., 1990). Für Hämolysine der Invertebraten ist ein ähnlicher Mechanismus diskutiert worden (Porchet-Hennere et al., 1992). Außerdem ist von Ca2+-abhängigen Hämolysinen ausgehend, eine regulatorische Wirkung von Ca2+ vermutet worden (Canicatti, 1990). Wie bei den


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Vertebraten wäre auch bei den Invertebraten eine Regulierung der lytischen Substanzen als Inhibierung denkbar, da die Mehrzahl der lytischen Proteine äußerst reaktiv ist und eine Stimulierung somit nicht nötig ist. Canicatti (1990) betonte jedoch, daß die wenigen vorliegenden, experimentellen Daten leider keinerlei Hypothese über die Regulation der Hämolysine oder der Autolysis bei Invertebraten gestatten.

Die hämolytische Aktivität der Cölomflüssigkeit, lytischer Komponenten oder von gereinigten Proteinen kann mit verschiedenen Methoden bestimmt werden. Diese Methoden können in Festphasen- und Flüssigphasenassays unterteilt werden. Ein Festphasenassay ist der Hämolyse-Plaque-Test, bei dem die Erythrozyten in flüssiger Agarose suspendiert und anschließend in Petrischalen ausgegossen werden. Nach Erstarrung des Erythrozyten/Agarose-Gemisches wird die zu testende Substanz auf dieses Agarosegemisch gegeben. Anschließend wird der Durchmesser der transparente Höfen lysierter Erythrozyten als Maß der hämolytischen Aktivität bestimmt. Im Gegensatz dazu ist der Hämolyse-Titrations-Test ein Flüssigphasenassay, sämtliche Komponenten liegen in einem Puffergemisch gelöst vor. Die in einer ansteigenden Verdünnungsreihe bestimmte Menge des Hämolysins, die notwendig ist, um noch eine 50%-ige Lyse der Erythrozyten zu erreichen, gilt als Hämolyse-Titer.

Wird die hämolytische Aktivität der Cölomflüssigkeit von Lumbricus terrestris und Eisenia fetida fetida mit einem Festphasenassay (Hämolyse-Plaque-Test) bestimmt, ist eine ähnliche lytische Aktivität der beiden Cölomfüssigkeiten nachzuweisen. Bei Bestimmung der lytischen Aktivität mit einen Flüssigphasenassay (Titrations-Test) zeigt sich jedoch eine deutliche Differenz zwischen den Cölomflüssigkeiten der beiden Arten (Mohrig et al., 1997). Wir haben vermutet, daß eine inhibierende Struktur in der Cölomflüssigkeit vorhanden ist, die in der Agarose durch die unterschiedliche Diffusionsgeschwindigkeit der beiden Komponenten - lytische und inhibierende - voneinander getrennt werden und so zu keiner Unterdrückung der lytischen Faktoren führen. Im Flüssigphasenassay hingegen wird dieser Inhibitor nicht von den lytischen Komponenten abgetrennt, so daß unterschiedliche Hämolyse-Titer, je nach Konzentration des Inhibitors in der betreffenden Annelidenart, der Cölomflüssigkeiten zu beobachten sind.

Der Mangel an experimentellen Daten gestattete nur ein unzureichendes Bild über die Regulierung dieser Hämolysine; im Gegensatz zu den lytischen


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Proteinen der Vertebraten wie Perforin und Komplement, bei denen eine Regulierung und Inhibierung der Autolysis durch Vitronectin/S-Protein angenommen wird (referiert bei Canicatti, 1990 und Podack et al., 1991). So wurde auch für die lytischen Proteine der Invertebraten eine ähnliche chemische Struktur postuliert, die in einem regulatorischen Mechanismus eine Rolle spielt (Tschopp und Nabholz, 1990). In dem Schwamm Microciona prolifere konnte bereits einige Jahre vorher, als die Regulatorfunktion des multifunktionalen Proteins Vitronectin noch unbekannt war, ein Strukturprotein mit einer funktionalen Ähnlichkeit zu Vitronectin nachgewiesen werden, eine immunologische und strukturelle Verwandtschaft wurde jedoch ausgeschlossen, da dieses Protein nicht mit anti-Vitronectin Antiseren reagierte (Varner et al., 1988). In Invertebraten wurden 1992 von zwei Arbeitsgruppen unabhängig voneinander Vitronectin-ähnliche Substanzen mit anti-Vitronectin Antiseren nachgewiesen (Nakashima et al., 1992, Ehlers und Lange, 1992). Mit der für humanes Vitronectin genutzten Trennmethode der Glasperlen- und Heparin-Säulenchromatographie wurde deshalb die Cölomflüssigkeit von Lumbriciden fraktioniert. Die Isolierung des Proteins bis zur Homogenität aus der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida gelang erst mit der Elutions-Elektrophorese. Das gereinigte 67-kDa Protein zeigt eine regulierende Wirkung der lytischen Aktivität Eiseniapores, wir nannten es deshalb den Eiseniapore-regulierenden Faktor (ERF). Er ist in seiner Wirkung nicht von Ca2+- und/oder Mg2+-abhängig, verliert aber nach Inkubation mit Ethanol, KSCN oder NaSCN bezeihungsweise mit KCl oder NaCl einen Teil seiner Aktivität.

Das humane Vitronectin besitzt einen Heparin-Bindungsort, der mit den cysteinreichen Bereichen von C9-Monomeren wechselwirkt. Die cysteinreichen Domänen ermöglichen die Oligomerisierung der Monomere zu einer transmembranalen Pore. Bei Maskierung dieser Domänen der Monomere durch Vitronectin ist die Assemblierung von C9-Molekülen nicht mehr möglich. Für den Eiseniapore-regulierenden Faktor konnte ein Heparin-Bindungsort nachgewiesen werden. Wird dieser mit Heparin blockiert, verliert der ERF seine inhibitorische Wirkung.

Die in Anneliden regulierenden Proteine sind, wie enzymimmunologische Verfahren zeigten, durch antigenes Material (Säuger-Erythrozyten) stimulierbar (Ehlers und Lange, 1992). Dies könnte damit erklärt werden, daß der ERF ohne antigene Strukturen auf einem niedrigen Level im Cölomraum zirkuliert. Gelangt


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invasives Material in das Cölom, erhöht sich die hämolytische Aktivität der Cölomflüssigkeit (Mohrig et al., 1997), dies kann mit einer Stimulierung der lytischen Proteine erklärt werden. Durch die höhere lytische Aktivität im Cölomraum ist auch ein erhöhter Schutz vor der Autolyse erforderlich.

Bei Vertebraten wird der Schutz vor der Auto- oder Selbstlyse durch membranständige und lösliche Faktoren gewährleistet. Ein membranständiger Faktor, der Zellen vor dem Komplementsystem schützt, ist der "homologe Restriktions-Faktor" (HRF) (Zalmann et al., 1986; Hänsch, 1988; Zalmann und Müller-Eberhardt, 1994; Hayashi et al., 1996; Koike et al., 1996; Kawano et al., 1997). Vitronectin hingegen zirkuliert frei im Plasma (Peake et al., 1996; Su, 1996; Zhuang et al., 1996; Seiffert, 1997).

Unsere Ergebnisse lassen auf ähnliche Verhältnisse (membranständiger Schutz und frei zirkulierender Schutzmechanismus) bei den Lumbriciden schließen. Die Abwesenheit von Sphingolipiden in den das Cölom passierenden Nervenbahnen kann als membranständiger Schutz angesehen werden, wohingegen ein frei zirkulierender Schutzmechanismus vor den körpereigenen lytischen Proteinen durch den Eiseniapore-regulierenden Faktor gewährleistet werden kann.

Die immunologische Nähe ergibt sich aber vor allem auch aus der demonstrierten Austauschbarkeit der Regulatorproteine aus Invertebraten und Vertebratenbereich. Aus Säugern isoliertes Vitronectin hemmt die Komplement-vermittelte Lyse von Erythrozyten fast vollständig. Das gleiche Protein unterdrückt jedoch auch die Eiseniapore-induzierte Hämolyse. Vitronectin war nicht der erste Inhibitor der Komplementlyse, der im Invertebratenbereich getestet wurde. Die bisher untersuchten Inhibitoren (Hydrazin, Zymosan und Methylamin), zeigen keine Wirkung auf die Hämolysine (Söderhall, 1982; Roch et al., 1989; Armstrong et al., 1993). Die verwandten Inhibitoren inaktivieren Komplement durch die Wirkung auf dessen Schlüsselkomponente C3. Auch wenn über eine C3 Komponente in Invertebraten spekuliert werden kann, wird in der hier vorgelegten Untersuchung die Auffassung vertreten, daß die in höheren Vertebraten charakteristische Kaskade von C3 über C4, gefolgt von den terminalen Komponenten C5 bis C9, in Invertebraten nicht zu erwarten ist. Da man gegenwärtig von folgender phylogentischer Entwicklung des Komplementsystems ausgeht: Durch Genduplikation und anschließende Mutationen entstand aus dem genetischen Material des Perforins das Protein C9.


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Aus diesem evolvierten dann die anderen terminalen Proteine des Komplements, zuerst C8, aus dem sich dann C7, gefolgt von C6, entwickelten; dieser Komplex könnte sich dann in ein bereits vorhandenes primitives Komplementsystem, welches bis dahin der Opsonierung von Mikroorganismen diente, eingegliedert haben (Podack et al., 1991; Baish et al., 1997). So besitzt Ginglymostoma serratum (Ammenhai) im terminalen Bereich seines Komplementsystems erst die Komponenten C8 und C9, alle anderen fehlen, sie wurden erst phylogentisch später entwickelt (Fuji und Murakawa, 1981; Banner und Smith, 1997.).

Aus den dargelegten stammesgeschichtlichen Gründen erwarten wir nicht, daß Inhibitoren, die C3 beeinflussen, die hämolytische Aktivität in Invertebraten inhibieren. Für den Inhibitor von C9 und Perforin (Vitronectin) hingegen konnte eine Beeinflussung des Invertebraten-Hämolysins Eiseniapore gezeigt werden. In Analogie zu diesen Experimenten wurde der Eiseniapore-regulierende Faktor auf seine Wirkung auf die Komplement-vermittelte Lyse von Erythrozyten getestet. Es konnte eine inhibierende Wirkung auf die Komplementlyse gezeigt werden. Der Inhibitor des lytischen Proteins aus Oligochaeten ist mit dem Inhibitor der Komplement-vermittelten Lyse der Säuger funktional austauschbar.

4.12 Eiseniapore und dessen Regulator (ERF) sind immunologisch verwandt mit der Komplementkomponente C9 und dessen Regulator Vitronectin

Von verschiedenen Autoren wird kreuzreagierendes Verhalten als erster Hinweis auf eine Aminosäuresequenzverwandtschaft interpretiert (referiert bei Ojcius und Young, 1991). Bei porenformenden Proteinen ist nach dem Nachweis der Kreuzreaktivität eine solche Verwandtschaft auch gezeigt worden: Polyklonale Antikörper gegen die porenformenden Proteinen von Actinobacillus pleuropneumoniae kreuzreagieren mit Überständen von Streptococcus suis, Pasteurella hemolytica und Escherichia coli. In dann folgenden Untersuchungen fand man Sequenzhomologien bei diesen Proteinen zwischen A. pleuropneumoniae und P. hemolytica von 64% Homologie oder zwischen A. pleuropneumoniae und E. coli von 44% Homologie (Braun und Focareta, 1991).

Nachdem auf Grund von Kreuzreaktionen in der Gruppe der Thiol-aktivierbaren Porenformer wie - Listeriolysin O (Listeria monozytogenes), Pneumolysin (Streptococcus pneumoniae), Streptolysin (S. pyogenes) und


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Perfringolysin (Clostridium perfringens) - eine phylogentische Verwandtschaft vermutet wurde, konnte durch Sequenzanalyse zwischen diesen Proteinen 55% und 65% Homologie gezeigt werden.

Kreuzreaktivität ist aber nicht notwendiger Weise ein Hinweis auf eine Aminosäuresequenzverwandtschaft. Was erkennt ein kreuzreagierender Antikörper? Ein Antikörper erkennt die Form einer Struktur, nicht deren Inhalt. Gegenwärtig geht man davon aus, daß Elektronenwolken - auch von proteinfreien und somit aminosäurenfreien Substanzen - durch Antiköper eher identifiziert werden als spezifische chemische Strukturen (Roitt, 1995). Somit kann ein Antikörper ein Antigen eher in seiner Gesamtheit als in seiner Zusammensetzung erkennen. Dies wird deutlich durch das Phänomen der Kreuzreaktivität belegt. Da gerade diese Argumentation widersprüchlich diskutiert wird (Braun und Focareta, 1991), soll der Beschreibung von Kreuzreaktionen an proteinfreien Substanzen an dieser Stelle größerer Raum eingeräumt werden. Ein gegen ein bestimmtes Antigen gebildeter Antikörper erkennt auch ein anderes Antigen; so kann beispielsweise durch Immunisierung mit dem Metaisomer von Aminobenzolsulfonat ein Antikörper gegen diese Substanz hergestellt werden. Wenn dieser Antikörper mit den Ortho- und Paraisomeren des Aminobenzolsulfonats, wie auch zusätzlich mit den Ortho-, Meta-, und Paraisomeren von Aminobenzolarsonat und Aminobenzolcarboxylat, die mit dem Antigen Aminobenzolsulfonat chemisch verwandt aber nicht identisch sind, in Reaktion gebracht wird, kommt es zu spezifischen Reaktionen und Kreuzreaktionen<41>- den planaren Carboxylatgruppe in Metastellung (Roitt et al., 1995)..

Zu keinen Kreuzreaktionen kommt es, wenn der Antiköper mit Arsonat- und Caboxylatgruppen in Ortho- oder Parastellung inkubiert wird. Diese


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Ergebnisse belegen eindrucksvoll, daß die Gesamtkonfiguration des Antigens ebenso wichtig wie dessen chemische Zusammensetzung ist. Die Kreuzreaktivität von Eiseniapore und C9, sowie dem ERF und Vitronectin deutet somit nicht zwingend auf eine Homologie zwischen den kreuzreagierenden Proteinen<42>. Die für eine immunologische Kreuzreaktion erforderlichen gemeinsamen oder ähnlichen antigenen Determinaten belegen eine strukturelle oder partiell strukturelle Verwandtschaft. Eine immunologische Verwandtschaft schließt jedoch eine phylogentische Verwandtschaft nicht zwangsläufig ein. So kann aus der Kreuzreaktion von Eiseniapore mit C9 und von dem Eiseniapore-regulierendem Faktor mit Vitronectin/ S-Protein auf strukturelle Gemeinsamkeiten zwischen den Proteinen aus Invertebraten mit denen aus Vertebraten geschlossen werden.

Der Begriff der immunologischen Verwandtschaft ließe sich an den einer phylogentischen Verwandtschaft binden, wenn davon ausgegangen wird, daß in der Evolution auch Formen und Strukturen ("Strukturschablonen", Creighton, 1983) weitergegeben werden. Anfang der neunziger Jahre wurde vorgeschlagen, die großen porenbildenden Proteine auf eine immunologische Verwandtschaft zu untersuchen, da so Aussagen über die Strukturen möglich wären, die notwendig für die Bildung einer Pore sind (Ojcius und Young, 1990, 1991). Mit der gezeigten Kreuzreaktivität von Eiseniapore und C9 ist erstmals eine immunologische Verwandtschaft von einer Komplementkomponente mit einem lytischen Proteinen eines Invertebraten nachgewiesen worden. Es ist neben dem Toxin des Einzellers Trypanosoma cruzi das zweite nachgewiesene zu C9 immunologisch verwandte Toxin (Andrews et al., 1990).

Die Bestimmung des N-Terminus der Aminosäuresequenz von Eiseniapore gelang nicht, da dieser blockiert war. Deshalb wurden Peptidfragmente durch enzymatische Spaltung gebildet, um diese anschließend auf Sequenzhomologien zu untersuchen. Wir konnten größere Bereich von homologen Strukturen von Eiseniapore zu Hämoglobinen von Lumbricus terrestris nachweisen; größere Bereiche sind mit Sequenzen aus Globin C und eine Fraktion mit dem Globin AIII (beide L. terrestris) identisch. Ein kleinerer Abschnitt aus Eiseniapore ist identisch mit einem Sequenzbereich aus einer


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Serin-Carboxypeptidase (E.C. 3.4.16.5.), eine Ähnlichkeit besteht außerdem zu einer Lipoxygenase (E.C. 1.13.11.12) aus Chloroplasten. Wichtig wird der Befund der Homologie zu Lumbricus terrestris Hämoglobinen durch ein interessantes Resultat von Suzuki und Riggs (1993). Sie fanden in der Struktur von Genen und Proteinen der L1-Kette des Lumbricus-Hämoglobins eine Homologie zum low-density-lipoprotein-(LDL)-Rezeptor und vermuten deshalb einen evolutionären Zusammenhang von Lumbricus-Hämoglobin und der terminalen humanen Komplementkomponente C9, einem Mitglied der Perforin-Familie. Die humane C9-Komponente und der LDL-Rezeptor sollen durch die Neukombination von Exons ("exon shuffling") - als Neukombination von funktionalen "Modulen" der Proteine - in der molekularen Evolution entstanden sein, sie gelten daher als phylogentisch verwandt (Urich, 1990). Unterstützt wird eine solche Überlegung durch eine Ähnlichkeit von 70 % einer größeren Fraktion aus Eiseniapore (Lys-Glu-Ile-Pro-Glu-Val-Ala-Asp-Leu-Phe) mit dem Protein C9 (Lys-Tyr-Ile-Pro-Glu-Ile-Ala-Glu-Leu-Tyr; Aminosäureposition: 459 - 468)<43>. Auch wenn dieser Grad der Übereinstimmung noch nicht als homolog gelten kann, gibt er neben dem bestehenden Nachweis der Kreuzreaktivität (siehe Ergebnisse, Kap. 4.18. und 4.19.) einen weiteren Hinweis auf eine immunologische Verwandtschaft, insbesondere da auch schon innerhalb der Säuger Übereinstimmungen von Vertretern der Perforin-Familie nur gering ausgeprägt sind (Komiyama et al., 1997). Insgesamt erscheint es lohnend, die begonnen Arbeiten zur Sequenzanalyse Eiseniapores fortzuführen.

Die Resultate einer immunologische Verwandtschaft von Eiseniapore und C9 führen zu wichtigen Implikationen über das Verständnis der Immunantwort von Anneliden. Ciliaten, Gregarinen (überwiegend Fam. Monocystidae), Cestoden und Nematoden, die typischen Parasiten der Anneliden, besitzen, wie bereits oben erwähnt, als typischen Bestandteil ihrer Lipidkomposition Sphingolipide (Kaneshiro, 1987; Maloney und Semprevivo, 1991; Nishimura et al., 1991; Satouchi et al., 1993; Chitwood et al., 1995). Dieses Lipide können sowohl für C9 als auch für Perforin als Rezeptor fungieren. Die Mitglieder der


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Perforin-Familie weisen neben der lytischen Aktivität auch noch eine chemotaktische Wirkung aus. Eine solche Aktivität kann auf Grund der strukturellen Verwandtschaft auch für Eiseniapore diskutiert werden. In den Cölomraum eindringende einzellige Parasiten könnten somit direkt durch transmembranale Eiseniapore-Kanäle zerstört werden. Auf mehrzellige Parasiten könnte sich der von Eiseniapore gebildete Kanal ebenfalls integrieren, aber dort, wie auch für die Mitglieder der Perforin-Familie beschrieben, eine chemotaxische Wirkung entfalten, die dann zelluläre Bestandteile des Abwehrsystems der Anneliden anlockt, um mehrzellige Parasiten einzukapseln und abzutöten.

Ein zusätzliches Indiz für eine solche Überlegung ist die Analogie von Wirkungen, die sowohl einzelne Mitglieder der Perforin-Familie als auch das vor kurzem isolierte Lysenin<44> (Sekizawa, 1997) aus der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida ssp. initiiert. Ein wichtiger biologischer Effekt der Mitglieder der Perforin-Familie ist die Fähigkeit, eine Kontraktion glatter Muskel herbeizuführen. Lysenin besitzt die gleiche Eigenschaft, noch bei sehr geringer Konzentration (~ 10-8 M) induziert es deutliche Muskelkontraktion.

4.13 Zusammenfassende Betrachtung der eigenen Ergebnisse an Hand lytischer Proteine aus den diskutierten Arten des Taxons Eisenia fetida

Das nach dem dänischen Physiologen benannte "A.-Krogh-Prinzip" besagt, daß es für jedes Problem eine Tierart gibt, an der es besonders gut studiert werden kann. Es ist bereits in der Einleitung begründet worden, warum es sinnvoll ist, an der Art Eisenia fetida ssp. die Aktivität von lytischen Proteinen in Anneliden zu studieren.

Das Vorhandensein eben dieser Art Eisenia fetida ist jedoch von Taxonomen mehrfach bezweifelt worden. Zwei sich widersprechende Thesen werden vertreten; Eisenia fetida ist ein Kosmopolit und somit eine weltweit


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nachzuweisende Art mit entsprechenden Variationen, oder Eisenia fetida (Savigny 1826) ist nicht uniform, es sind zwei Arten (oder Unterarten): Omodeo (1952) fand zwei morphologische Varianten von Eisenia fetida (Sav.), die unterschiedliche Zelltypen und -größen aufwiesen. André (1963) beschrieb darauf aufbauend, zwei Farbvarianten Eisenia fetida typica (André 1963) und Eisenia fetida unicolor (André 1963), die sich untereinander nicht fortpflanzen, da sie sterile Hybriden produzieren. Da Hybridsterilität zahlreiche Grenzfälle einschließt, genügt es heute als einziges Kriterium für eine Art jedoch nicht mehr (Futuyma, 1990). Die Typen von André (1963) wurden durch Bouché (1972) revidiert: Eisenia fetida typica (André 1963) in Eisenia fetida fetida (Bouché 1972) und Eisenia fetida unicolor (André 1963) in Eisenia fetida andrei (Bouché 1972). Jaenike (1982) hat in Auswertung der Ergebnisse von André (1963) und Bouché (1972) gefolgert, daß die Unterarten als eigene Arten aufzufassen sind. Er schlug folgende Benennung vor: Eisenia fetida (Savigny 1826) für Eisenia fetida andrei (Bouché 1972) und Eisenia unicolor (André 1963) für Eisenia fetida fetida (Bouché 1972). Diese Bezeichnung hat sich nicht durchgesetzt. Ein Grund dafür könnte sein, daß Eisenia fetida (Savigny 1826) einmal die Bezeichnung der Erstbeschreibung sein kann oder aber die Benennung für die als Art aufgewertete Unterart Eisenia fetida andrei (Bouché 1972) (= Eisenia fetida typica (André 1963)).

Da Geschwisterarten, die morphologisch kaum zu unterscheiden sind, deutlich unterschiedliche physiologische/immunologische Eigenschaften besitzen können, erlangte die Frage, ob Eisenia fetida eine uniforme Art oder mehrere Arten sind, größere Relevanz, da die kommerziell vertriebenen Eisenia fetida für viele toxikologische und biochemische Studien Bedeutung besitzen; die Resistenz von Eisenia fetida gegen toxikologisch wirksame Substanzen hängt stark von physiologischen/immunologischen Charakteristika ab (Furst et al., 1993; Ville et al., 1995). Außerdem sind in den letzten Jahren mehrfach widersprüchliche Ergebnisse zu hämolytischen, hämagglutinierenden und antibakteriellen Faktoren gewonnen worden, so daß es sinnvoll ist, sich der Frage zuzuwenden, ob Eisenia foetida taxonomisch eine einheitliche Gruppe darstellt.

Die elektrophoretische Analyse der Esterasen von Eisenia fetida zeigten erstmals auch physiologische Unterschiede der Varianten und unterstützte so die These der möglichen zwei Arten (Oien und Stenersen, 1984). Bisher fehlten weitere Analysen von physiologischen/immunologischen Unterschieden der


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Varianten. Da die lytischen Proteine aus diesen möglichen beiden Arten<45> isoliert vorliegen, können sie verglichen werden: Eiseniapore aus Eisenia fetida fetida und die Fetidine aus Eisenia fetida andrei. Wie in der Einleitung bereits dargelegt, können Eiseniapore und Fetidine auch unterschiedliche Proteine in ein und derselben Art sein; beziehungsweise könnte Eisenipore und die Fetidine auch in der jeweils anderen Species vorkommen. Im folgenden soll deshalb der Schwerpunkt auf dem Vergleich der unterschiedlichen lytischen Moleküle liegen.

Beide Proteine sind in der Lage, Säuger-Erythrozyten zu lysieren. Für Eiseniapore konnte außerdem gezeigt werden, daß es befähigt ist, in Liposomen einen Leakage zu induzieren. Für Fetidine ist, wie auch für die Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida andrei, eine bakteriostatische Wirkung gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen nachgewiesen worden (Milochau et al., 1997). Die Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida zeigt hingegen eine antibakterielle Aktivität gegen ein sehr kleines Spektrum an Mikroorganismen (Kauschke und Mohrig, 1987).

Eiseniapore reiht sich mit seiner Fähigkeit, makromolekulare Proteinporen in Targetmembranen zu integrieren, in die Gruppe der in der Evolution sehr erfolgreichen kanalbildenden Proteine ein. Die Fetidine können ebenfalls räumlich eng begrenzte, diskrete Läsionen in der Membran zu verursachen, jedoch fehlt ihnen die für Kanalbildner charakteristische Eigenschaft, die Läsion durch ringförmige Proteinporen zu induzieren und zu umschließen (Roch et al., 1989).

In ihrer lytischen Aktivität variieren die Fetidine zwischen 4°C und 45°C nicht (Roch et al., 1989), Eiseniapore hingegen ist in seiner lytischen Wirkung ein deutlich Temperatur-abhängiges Protein. Beiden lytischen Proteine ist gemeinsam, daß sie, im Gegensatz zu vielen beschriebenen Hämolysinen der Invertebraten, weder Ca2+ noch Mg2+ benötigen, um ihre maximale lytische Aktivität zu erreichen.

Deutliche Unterschiede zeigen sich in der Wirkung von Kohlenhydraten auf die lytische Aktivität der beiden Moleküle. Während Zucker, wie D-Glucose, Lactose und D-Galactose, Cellobiose die Aktivität der lytischen Proteine von Eisenia fetida andrei inhibieren (Roch et al., 1984), beeinflußt keiner der


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getesteten einfachen Zucker die lytische Aktivität Eiseniapores. Die Hemmung durch komplexe Zucker (N-Acetyl-D-Glucosamin, N-Acetyl-D-Galactosamin) ist für beide Moleküle nachzuweisen. Für lytische Fraktionen der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida ist die Wirkung von komplexen Kohlenhydratstrukturen (Fetuin, alpha1-saures Glucoprotein, Thyroglobulin) sehr detailiert analysiert worden; von diesen Untersuchungen ausgehend, ist vermutet worden, daß N-Acetyl-Neuraminsäure - beispielsweise in Form von Gangliosiden - der Rezeptor in der Targetmembran ist (Eue et al., 1991; Mohrig et al., 1996). Für die lytische Aktivität Eiseniapores konnten wir die Wirkung von Kohlenhydraten bestätigen und fanden im Zusammenhang mit der agglutinierenden Fähigkeit von Eiseniapore einen deutlichen Hinweis auf die Lektinstruktur dieses lytischen Proteins. Auch wenn für semi-gereinigte Hämolysine von Eisenia feitda andrei eine agglutinierende Aktivität demonstriert wurde (Roch et al., 1987), konnte diese Aktivität bei den Fetidinen nicht gezeigt werden, sie sind demnach keine Lektine oder Lektin-ähnliche Strukturen.

Wir fanden bei Versuchen mit Eiseniapore keine Bestätigung für die Vermutung, daß Neuraminsäuren allein oder die Ganglioside einen Rezeptor darstellen. Eine Rezeptorwirkung für Eiseniapore war nur für Sphingolipide wie Sphingomyelin und Galactosylceramid nachzuweisen. Wir können auch ausschließen, daß auf biologischen Membranen wie Erythrozyten Rezeptoren mit einer Kohlenhydrat- oder Proteinstruktur als zusätzlicher Rezeptor für Eiseniapore fungieren. Sphingolipide sind somit vermutlich obligat für lytische Aktivität Eiseniapores. Für die Fetidine sind Versuche mit Liposomen für die Analyse des Rezeptors angekündigt, die Durchführung steht jedoch aus, so daß für die Fetidine bisher kein Rezeptor nachgewiesen worden ist. Angereicherte, aber nicht gereinigte Hämolysine aus Eisenia fetida andrei lassen sich in ihrer Wirkung nicht durch Phosphorylcholinchlorid inhibieren. Die lytische Aktivität der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida ließ sich durch diese Substanz deutlich unterdrücken (Ehlers und Lange, 1992). In Versuchen mit der gereinigten lytischen Komponente Eiseniapore konnte die molekulare Struktur, auf die die Inhibierung mit Phosphorylcholinchlorid hindeutete, genauer aufgeklärt werden. Die von uns nachgewiesenen Eiseniapore-Rezeptoren Ceramidphosphocholin (= Sphingomyelin) und Galctosylceramid verweisen auf die essentielle Bedeutung hydrophiler Kopfgruppen wie Galactosyl oder Phosphorylcholin und auf die Notwenigkeit eines Ceramidrückgrates. Für


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die zwei Fetidine aus Eisenia fetida andrei wurden ungefähr 104 Moleküle pro Erythrozyt errechnet, die nötig sind, um einen 50%-ige Lyse zu induzieren (Milochau et al., 1997). Ausgehend von Arbeiten mit Mellitin, einschließlich synthetischen Analoga und dem delta-Hämolysin von Staphylococcus aureus, verwiesen die Autoren auf die Fähigkeit von Erythrozyten, 107 Toxinen pro Zelle zu binden. Diese Anzahl wurde von Milochau et al. (1997) mit der notwendig Anzahl von Toxinen, die benötigt wird, um eine Lyse einzuleiten, gleichgesetzt. Die Autoren werten die Differenz aus den maximal möglichen 107 und den realisierten 104 gebundenden Fetidinen als Hinweis auf einen Rezeptor. Wir halten jedoch die Gleichsetzung von Bindung mit Lyse für problematisch - Bindungsverhalten ist nicht kongruent mit Leakageverhalten.

Eiseniapore induziert mit 105 Molekülen pro Zelle eine 50%-ige Lyse von Schaferythrozyten, der Anteil der für die Lyse notwenigen Toxine liegt um eine Zehnerpotenz höher, es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß die Differenz von Fetidinen und Eiseniapore auf unterschiedliche, experimentelle Verfahren zurückzuführen ist.

Die lytische Aktivität der Fetidine ist im Gegensatz zu der von Eiseniapore nicht durch Heparin inhibierbar, für das eine inhibierende Wirkung auf das lytische Vermögen von Komplement in vitro (Edens et al., 1994) und vivo (Weiler et al., 1992) gezeigt wurde, auch wenn Heparin nicht zu den natürlichen Inhibitoren gehört. Für beide lytische Proteine der Anneliden ist analysiert worden, ob natürliche Inhibitoren/Regulatoren anderer lytischer Proteine (Komplement und Perforin) auf sie wirken. So sind die Fetidine wie auch Eiseniapore in ihrer hämolytischen Wirkung in Gegenwart von Komplement-Inhibitoren untersucht worden. Entsprechend dem unterschiedlichen Grundverständnis der Arbeitsgruppen von einer möglichen immunologischen Verwandtschaft von Fetidinen mit der Schlüsselkomponente C3 und von Eiseniapore mit der Komplementkomponente C9, wurden überwiegend C3-Inhibitoren in ihrer Wirkung auf Fetidine untersucht und C9-Inhibitoren für die Analyse der hämolytischen Aktivität verwandt. Lediglich Protamin, ein basisches Protein mit 30-70% Argininanteil, das die lytische Aktivität von C9 unterdrückt, wurde in seiner Wirkung auf die beiden Moleküle untersucht. Inhibitoren der C3 Komponente beeinflussen die hämolytische Aktivität der Fetidine nicht. Vitronectin, der Inhibitor von C9, unterdrückt die hämolytischen Fähigkeit von Eiseniapore hingegen deutlich. Beide lytischen


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Proteine sind mit Protamin inkubiert worden, dieses C9 inhibierende Protein unterdrückt nur die lytische Aktivität von Eiseniapore, die lytische Aktivität der Fetidine bleibt unbeeinflußt.

Mit der vorgelegten Arbeit wurde die bisher phylogentisch älteste Einheit von lytischen Protein und dessen Regulator beschrieben. In der Cölomflüssigkeit von Eisenia fetida fetida haben wir einen Eiseniapore-regulierenden Faktor identifiziert und charakterisiert. Er ist immunologisch verwandt mit Vitronectin und zeigt mit einem Heparin-bindungs Ort auch ein gleiches wichtiges chemisches Merkmal.

Während sich Eiseniapore, trotz ungewöhnlicher Eigenschaften, wie die erstmals für lytische Proteine beschriebene Thiol-Aktivierung, die mit einer Sphingomyelin-Inhibierung verbunden ist, in das System der assemblierenden, makromolekularen Proteinporen des Abwehrsystems einfügt, wird hingegen für Fetidine eine völlige Sonderstellung - auch in Bezug auf Hämolysine anderer Anneliden - angenommen. Diese Stellung der Fetidine schließt einen phylogenetischen Zusammenhang zu anderen lytischen Proteinen aus (Valembois, persönliche Mitteilung). So finden sich neben den Gemeinsamkeiten von Eiseniapore und Fetidinen eine Vielzahl von Unterschieden.

Zwischen den Arbeitsgruppen bestanden und bestehen enge Kontakte; über viele Jahre ist versucht worden, aus der Eisenia fetida fetida (= Eisenia unicolor) genannten Species Fetidine (für das semi-gereinigte Protein vormals: EFAF (Eisenia fetida andrei factor) (Roch et al., 1981) zu isolieren. Da aber - wie dargelegt - das Ausgangsmaterial (die Cölomflüssigkeit) schon deutliche biochemische Unterschiede aufweis, gelang dies nicht. Im Gegenzug war es den französischen Gruppen bisher nicht möglich, ein Eisenapore-ähnliches Molekül zu isolieren und zu charakterisieren. Dies schließt jedoch nicht aus, daß Fetidine und Eiseniapore in beiden Arten vorkommen.

Insbesondere für die geplanten toxikologischen Untersuchungen zum Ah-Rezeptor in Eisenia fetida ssp. und der Wechselwirkung ihres Abwehrsystems mit Dioxinen (Cooper, persönliche Mitteilung) sollte berücksichtig werden, daß Tiere aus einheitlichen Zuchten entnommen werden. Denn neben den bereits identifizierten Unterschieden im dem Protein-Muster der Cölomflüssigkeit, vor allen aber wegen der Tasache, daß die Individuen der beiden vermuteten Arten untereinander keine fortpfanzungsfähigen Nachkommen zeugen, könnten die Unterschiede von Komponenten des Abwehrsystems ein zusätzlicher Grund sein,


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von einem Taxon auszugehen, welches vermutlich keine homogene Gruppe darstellt.

Folgende weiterführenden Fragestellungen und Überlegungen ergeben sich aus den diskutierten Ergebnissen. Eiseniapore ist ein stark lytisch wirkendes porenfomendes Protein. In der vorlegten Arbeit wurde dies für Liposomen und Erythrozyten gezeigt. Wie für den Membranangriffskomplex des Komplements und für Perforin ist auch für Eiseniapore die physiologische/immunologische Bedeutung nicht geklärt. Weiterführende Untersuchungen mit Bakterien und Parasiten sollten Auskunft über die Bedeutung Eiseniapores geben. Die Vorversuche zu der zytotoxischen Wirkung Eiseniapores auf Tumorzellen, lassen eine Fortführung der Experimente sinnvoll erscheinen. In Anlehnung an die Versuche von Song et al. 1996 und Russo et al., 1997 sollte versucht werden, Metallionen und Enzyme zu identifizieren, die die Pore gezielt öffen und schließen.

Zur Strukturuntersuchung der Eiseniapores bietet sich die Elektronenmikroskopie an. Die Eiseinbettungstechnik der Kryoelektronenmikroskopie erhält dabei die native Struktur und könnte gegebenenfalls sogar verschiedene Funktionszustände des Proteins abbilden. Jüngere statistische und mathematische Methoden erlauben durch Bildmittelung und dreidimensionale Rekonstruktion eine Modellierung des oligomerisierten Proteins (Schatz und van Heel, 1990; Schatz et al., 1995). Das Verständnis über die Struktur Eiseniapores und seines Regulators würde durch eine Sequenzanalyse deutlich vertieft werden. Nachdem gezeigt wurde, daß Eiseniapore Sphingolipide für die Vermittlung des Leakage benötigt und das Ausmaß der Leakage durch die Anwesenheit von Cholesterol gesteigert werden kann, könnte durch Ceramide und Ceramidanaloga (siehe auch: Nieva et al., 1994; Corver et al., 1995; Moesby et al., 1995) die molekulare Struktur dieser Wechselwirkung von Sphinglipiden und Cholesterol näher beschrieben werden: Unter anderem, ob die 3-OH Gruppe und/oder die zweikettige Struktur des Ceramids für diesen Effekt verantwortlich ist (Slotte, 1996). Für die Membranwechselwirkung des Semliki-Forest-Virus, der Sphingolipide für das Fusionsereignis benötigt, konnte beispielsweise gezeigt werden, daß nur die D-Erythro-Isomere eine aktive Form darstellen.

Die gewonnenen Resultate und der Ausblick auf die weiteren


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Experimente zeigen, daß die Charakterisierung der Struktur Eiseniapores, der Membran-wechselwirkung und der Regulation der lytischen Aktivität einen wesentlichen Beitrag für das bessere Verständnis der sogenannten makromolekularen Poren allgemein leisten kann; aber einen solche Analyse erweitert auch ganz speziell unser Wissen um die immunologische Abwehr einer phylogenetisch erfolgreichen und wichtigen taxonomische Gruppe: “Earthworms have played a most important part in the history of the world.“ (Darwin, 1881).

Fußnoten:

<30>

Zytolytische T-Zell Antworten laufen beispielsweise ohne Antikörper ab. Als Adaptor können Antikörper u.a. bei der Bindung an Phagozyten oder bei der Aktivierung von Komplement fungieren.

<31>

Die Aufnahme der Tunicaten in die Gruppe der Invertebraten zeigt das Willkürliche des Systems Vertebraten/Invertebraten (siehe: Einleitung). Diese ursprünglichen Vertreter der Chordata gehören zu den Rückenmarktieren (Notoneuralia), wohingegen sich die Mehrzahl der wirbellosen Stämme bei den Bauchmarktieren (Gastroneuralia) einordnet.

<32>

Hierfür könnte auch eine mögliche labilere Membranintegrität der 'resealed ghost' verantwortlich sein.

<33>

Hierbei handelt es sich überwiegend um Vertreter der Actinia (Seeanemonen).

<34>

Für Perforin wird ebenfalls eine antibakterielle Wirkung diskutiert (Liu et al., 1995). Die bisher beschriebenen Rezeptoren Phosphatidylcholin und Sphingomyelin kommen jedoch in der bakteriellen Membran nicht vor.

<35>

Insgesamt ist die Literatur zu Parasiten von Eisenia fetida ssp. wenig umfangreich. Einige jüngere Publikationen (Edwards und Lofty, 1972; Peters und Walldorf, 1986) stehen für die Parasiten von Lumbricus terrestris (Gemeiner Regenwurm) zur Verfügung, als aktuelleste Publikation ist Lucius und Loos-Frank (1997) zu nennen.

<36>

Es kann somit spekuliert werden, ob die Porenkomplexe von Eiseniapore (EP) über ein Dimer: 6 EP 3 EP2 EP6 gebildet werden.

<37>

Der Wert der induzierten Hämolyse steigt mit der Konzentration der zugegebenen lytischen Proteine. Die Dosis-Wirkungs-Kurve zeigt bei den isolierten Proteinen einen sigmoidalen Graphen der Hämolyseaktivität, im Gegensatz dazu ist die Dosis-Wirkungs-Kurve der vollständigen Cölomflüssigkeit biphasisch mit einem kleinen Startplateau (Milochau et al., 1997).

<38>

Es wird derzeit diskutiert, inwieweit die Hämolysine von Limulus polyphemus weitere Kandidaten für porenbildende Lektine sind (Armstrong et al., 1996).

<39>

Um eine möglichst widerspruchsfreie Einordnung der einzelnen Lektine in das System zu ermöglichen, werden immer weitere Gruppen eingeführt (Vasta, 1997); die Einteilung der Lektine in hauptsächlich zwei Gruppen folgt einer traditionellen Klassifikation.

<40>

Die Agglutionation ist nicht per se ein Teil der zellulären Abwehr; Sinkora et al. (1993) diskutiert sie über ihre Funktion. Agglutinine bereiten Partikel und zelluläre Bestandteile für einen Aktivität der zelluären Abwehr auf.

<41>

Im einzelnen ergeben sich folgende Reaktionen: - der gegen Aminobenzolsulfonat gebildete Antikörper reagiert am stärksten spezifisch mit den Sulfonatgruppen in Metastellung (die eine Tetraederstruktur besitzen) und - geringer mit der Sulfonatgruppe in Orthostellung und am schwächsten, wenn sich die Sulfonatgruppe in Parastellung befindet, - der gleiche Antikörper reagiert mit dem chemischen verwandten (= kreuzreagiert): der tetraedischen Arsonatgruppe in Metastellung und

<42>

Zum Teil wird Begriff "immunologischen Homologie" für kreuzreagierende Proteine verwandt. "Homologie" ist allerdings schon zwischen Proteinen nicht einheitlich definiert.

<43>

Die sich erst in der Anfangsphase befindlichen Sequenzanalyse gestattet erst begrenzte Aussagen. Bemerkenswert ist, daß das Peptidfragment Eiseniapores die Ähnlichkeit zu C9 in dem Bereich der Aminosäureposition aufweist, der für die physiologische und hämolytische Wirkung von C9 mitverantwortlich ist.

<44>

Lysenin besitzt eine hämolytische Aktivität, die die Anwesenheit von Sphingomyelin benötigen könnte (Sekizawa, persönliche Mitteilung). Das Molekulargewicht wird von Sekizawa et al. (1996, 1997) 33 kDa angegeben. Dieses Gewicht wurde mittels Säulen-Chromatograpie bestimmt, bei einer Bestimmung mit der SDS-PAGE besitzt das gleiche Protein ein Molekulargwicht von 41 kDa (Sekizawa et al., 1996).

<45>

Da die taxonomische Benennung der Arten/Unterarten z.Z. unbefriedigend gelöst ist, werden für die bessere Darstellung ausschließlich die Bezeichnungen der Unterarten verwandt.


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