Meyboom, Astrid: Untersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen

Institut für medizinische Physik und Biophysik


Dissertation
Untersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin

Dipl.- Biochem. Astrid Meyboom

Prof. Dr. Jürgen P. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. rer. nat. Klaus-Peter Hofmann
Prof. Dr. rer. nat. Andreas Herrmann
Prof. Dr. rer. nat. Hansjoachim Galla

eingereicht: 22. Oktober 1998

Datum der Promotion: 25. Februar 1999

Abstract

Surfactant protein A (SP-A) is crucial for lung function, including tubular myelin formation and lipid uptake by type II pneumocytes. Known properties of SP-A in vitro are ist Ca2+ dependent interaction with phospholipids and ist role in the aggregation of liposomes. To dissect and to analyze these processes, the SP-A was immobilized and liposome binding was measured by resonant mirror technique. Liposome aggregation was followed seperately by kinetic light scattering in suspensions. It was found that SP-A mediated binding and aggregation of liposomes depend on micromolar calcium concentrations in the range of < 20 µM, independent of the species (sheep, rat or cow) and of the phospholipid composition tested. The interaction between SP-A and liposomes shows cooperativity and reversibility. Liposomes dissociate from SP-A in < 0.3 s whereas disaggregation takes approx. 30 s. The interpretation of the results leads to a rapid and reversible reaction of three reactions: a cooperative Ca2+ dependent conformational change in SP-A, binding of Ca2+-bound SP-A to liposomes, and aggregation of the Ca2+/SP-A - bound liposomes.

With palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), the complex formation proceeds two fold slower compared to DPPC, leading to a lower final equilibrium level of SP-A/lipid interaction. Regarding the phospholipid headgroups, phosphatidylinositol (PI) and sphingomyelin (SM) interact comparable to PC, whole less interaction is seen with phosphatidylethanolamine (PE) or phosphatidylserine (PS) or with phosphatidylglycerol (PG). Thus, both headgroup and fatty acid composition determine SP-A/phospholipid interaction. However, the protein has no high specificity, neither for the polar nor for the apolar moiety of phospholipids.

Keywords:
Surfactant protein A, liposomes, light scattering, resonant mirror spectroscopy, biosensor

Zusammenfassung

Die Lungen werden von einem oberflächenaktiven Gemisch, dem Surfactant ausgekleidet, das für die Regulation der Oberflächenspannung der Alveolen und die Immunabwehr der Lunge von Bedeutung ist. Bestandteile des Surfactants sind zu 90% Lipide und zu 10% vier durchalphabetisierte Surfactantproteine A bis D, von denen SP-A das mengenmäßig häufigste darstellt. Die Funktionen dieses Proteins liegen vermutlich in der Surfactanthomöostase und dabei im Phospholipid-Turnover der Hauptkomponente des Surfactants Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und als Collektin in der Immunabwehr. In vitro ist die SP-A induzierte, calciumabhängige Liposomenaggregation eine charakteristische Eigenschaft des Proteins.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung von SP-A mit Phospholipidliposomen mit der Resonant Mirror Spektroskopie und der Nah-Infrarot-Lichtstreuung untersucht. Durch den vergleichenden Einsatz der kinetischen Methoden ist es möglich, die Bindung von SP-A an Liposomen von der Aggregationsreaktion zu unterscheiden. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß beide Reaktionen von mikromolaren Calciumkonzentrationen abhängig sind, die halbmaximale Reaktion erfolgt bei freien Calciumkonzentrationen < 20 µM. Die Ca2+-induzierte Interaktion zwischen SP-A und Liposomen zeigt eine hohe Kooperativität und ist durch Zugabe von Calciumchelatoren reversibel. Die Dissoziation der Liposomenbindung erfolgt schneller als der Zerfall der Aggregate (0,3 s vs. 30 s).

Es sind zwei Konformationen des SP-A zu unterscheiden, eine lipidbindende Form in Gegenwart von Calcium und eine nichtbindende Form. Neben Calcium können auch mikromolare Strontium- und Bariumkonzentrationen die Konformationsänderung induzieren, Magnesium hingegen nicht. Die Liposomenbindung und nachfolgende Aggregation erfolgt bei SP-A von Rind, Ratte und Schaf in gleicher Weise in Abhängigkeit von mikromolaren Calciumkonzentrationen. Die Bindungseigenschaften des SP-A zeigen eine Abhängigkeit von der Art des verwendeten Phospholipids. Dabei zeigt sich eine ”Affinität“, im Sinne einer verstärkten Wechselwirkung mit DPPC, aber die postulierte Spezifität wurde in der kinetischen Analyse nicht bestätigt. SP-A interagiert bevorzugt mit Phospholipiden, die langkettige, gesättigte Fettsäureseitenketten besitzen (DPPC, Distearoylphosphatidylcholin), sowie mit Phosphatidylcholin und ähnlichen Kopfgruppen (Sphingomyelin, Phosphatidylinositol). Da neben den Kopfgruppen auch die Seitenketten bei der Erkennung durch das Protein bedeutsam sind, liegt nahe, daß die Packungsdichte der Lipidmoleküle in den Liposomen für die Interaktion wichtig ist.

Die Ergebnisse werden als reversible, sequentielle Reaktionsfolge interpretiert:

Diese ist ein Modell für die mögliche Wirkung von SP-A bei der Surfactanthomöostase, indem das Protein als Lipidtransporter zwischen alveolärer Hypophase und Typ-II-Pneumozyten funktioniert und erklärt, wie SP-A und Liposomen gemeinsam in die Zelle aufgenommen und auf unterschiedlichen Wegen wieder ausgeschleust werden könnten.

Schlagwörter:
Surfactant Protein A, Liposomen, Lichtstreuung, Resonant Mirror Spektroskopie, Biosensor


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteUntersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen
1 Einleitung
2 Grundlagen
2.1.Lungensurfactant
2.1.1.Bedeutung des Surfactants
2.1.2.Entwicklung der Lungensurfactant-Forschung
2.1.3.Biochemie und Funktion des Surfactants
2.2.Struktur und Aufgaben der Surfactantproteine
2.2.1.Hydrophobe Surfactantproteine
2.2.1.1.SP-B
2.2.1.2.SP-C
2.2.2.Hydrophile Surfactantproteine
2.2.2.1.SP-D
2.2.2.2.SP-A
2.3.Ziele der Arbeit
3 Material und Methoden
3.1.Präparationen
3.1.1. Surfactantpräparation
3.1.2.SP-A - Präparation
3.1.3.Präparation von Liposomen
3.2.Methoden
3.2.1.Photometrischer Aggregationstest
3.2.2.Kinetische Lichtstreuung
3.2.2.1.Meßprinzip
3.2.2.2.Apparativer Aufbau
3.2.2.3.Versuchsdurchführung
3.2.2.4.Caged Calcium
3.2.3.Resonant Mirror Spektroskopie
3.2.3.1.Meßprinzip
3.2.3.2.Versuchsdurchführung
3.3.Methodenapplikation
3.3.1.Kinetische Lichtstreuung
3.3.2.Resonant Mirror Spektroskopie
4 Ergebnisse
4.1.Calciumabhängigkeit der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen
4.1.1.Messungen mit Resonant Mirror Spektroskopie
4.1.2.Kinetische Lichtstreuung
4.1.3.Einfluß der Calciumkonzentration
4.1.4.Reaktion mit anderen zweiwertigen Kationen
4.1.5.Beeinflussung der Reaktion durch Reduktionsmittel
4.2.Die Geschwindigkeit der Reaktion zwischen SP-A und Liposomen
4.3.Variation der SP-A-Konzentration
4.4.Einfluß der Lipidkonzentration
4.4.1.Messungen mit kinetischer Lichtstreuung
4.4.2.Messungen mit Resonant Mirror Spektroskopie
4.5.Reaktion von SP-A mit verschiedenen Phospholipiden
4.5.1.Vergleich zwischen DPPC und POPC
4.5.2.Die Interaktion mit verschiedenen Phosphatidylcholinen
4.5.3.Bedeutung der Kopfgruppe der Phospholipide
4.6.Interaktion zwischen SP-A und Liposomen bei 37 °C
5 Diskussion
5.1.Methodenapplikation
5.2.Calciumabhängigkeit der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen
5.3.Geschwindigkeit der Reaktion zwischen Calcium und Liposomen
5.4.Variation der SP-A-Konzentration
5.5.Einfluß der Lipidkonzentration
5.6.Reaktion von SP-A mit verschiedenen Phospholipiden
5.7.Temperaturabhängigkeit der Reaktion
5.8.Lokalisation der Lipidbindung am SP-A-Molekül
5.9.Physiologische Folgerungen
5.10.Hypothese
5.11.Ausblick
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Anhang
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 4.1:
Mathematische Anpassung der Bindungs- und Aggregationssignale in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration
Fit: f = [ A * (Ca2+) n ] / [ (Ca2+) n + K0,5 n ], A: Amplituden, n: Hill-Koeffizienten
Angegeben sind die erhaltenen Werte sowie die Standardabweichung.
Tabelle 4.2:
Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A in Abhängigkeit von der freien Calciumkonzentration
Berechnung von Hill-Koeffizienten (n) und Werten für K0,5 für die Ca2+-Kooperativität von SP-A unter Annahme von 5 µM bzw. 20 µM Calciumverunreinigung im Puffer.
Fit: f = [ A * (Ca2+) n ] / [ (Ca2+) n + K0,5 n ], A: Amplituden, n: Hill-Koeffizienten
Angegeben sind die erhaltenen Werte und die Standardabweichung.
Tabelle 4.3:
SP-A/Liposomen-Interaktion nach Photolyse von caged Calcium
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}, A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase, k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase
Die mathematische Anpassung wurde hier wie im folgenden mit dem Programm Sigma Plot 2.01 durchgeführt. Die Standardabweichung für die berechneten Parameter lag i.d.R. zwei Größenordnungen unter dem tabellierten Wert. Da hier eine beispielhafte Darstellung erfolgt, wurde auf die detaillierte Auflistung verzichtet.
Tabelle 4.4:
Effekt verschiedener SP-A-Konzentrationen auf die Aggregationsreaktion
Fit: f(x)=A*{1-exp[(-k)*t]}, A: Amplitude, k: Geschwindigkeitskonstanten
Tabelle 4.5:
Interaktion von SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen nach Blitzlichtphotolyse von caged Calcium
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}
A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase
k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase
Tabelle 4.6:
Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen auf die Aggregationsreaktion
Fit: f(x)=A*{1-exp[(-k)*t]}
A: Amplitude, k: Geschwindigkeitskonstanten
Tabelle 4.7:
Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A bei verschiedenen Lipidkonzentrationen
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}, A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase, k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase
Tabelle 4.8:
Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A - Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen bei Immobilisation von viel SP-A und Verwendung großer Liganden
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}, mit A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase, k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2.1: Lipidstrukturen pulmonalen Surfactants
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines SP-A Moleküls
Abbildung 2.3: Mögliche physiologische Funktionen von SP-A
Abbildung 3.1: SDS-Gelelektrophorese (12% Acrylamid) von Rinder- und Schaf-SP-A unter reduzierenden Bedingungen
Abbildung 3.2: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Liposomen
Dargestellt sind DPPC-Mix-Liposomen, die durch eine 50 nm (links) bzw. 200 nm (rechts) Membran extrudiert wurden. Die Präparate wurden an der Luft getrocknet, anschließend wurde eine Negativfärbung mit Uranylacetat durchgeführt. Die eingezeichneten Balken (---) entsprechen 250 nm.
Abbildung 3.3: Messung der kinetischen Lichtstreuung
Schematische Darstellung der Apparatur, LED: Leuchtdiode, UV: UV-Blitz, RB: Ringblende, FL: Fresnellinse

Für die Intensität des Streulichts I(Q) ist die Rayleigh-Debye Näherung anzunehmen, mit den Brechungsindices n und no der streuenden Teilchen und der Pufferlösung, in der die streuenden Teilchen gelöst sind sowie mit dem Volumen V der Teilchen und einer Streufunktion P(Q), die von der Form der streuenden Teilchen abhängt.
Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Resonant Mirror Spektroskopie
Abbildung 3.5: Kopplung von SP-A an die Küvettenoberfläche
Dargestellt sind die Meßdaten sowie das während der Messung aufgezeichnete Meßprotokoll.
Abbildung 3.6: SP-A vermittelte Liposomenaggregation in Photometrie und kinetischer Lichtstreuung
Einer Liposomensuspension in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA werden zunächst das Protein, anschließend 4,5 mM Calcium zugesetzt. Jede Zugabe ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die finale Konzentration beträgt 613 µM Lipid (50 nm DPPC-Mix-Liposomen), 10 nM SP-A und 333 nM BSA.
Abbildung 3.7: Spezifische und unspezifische Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A bei Zugabe unterschiedlicher Calciumkonzentrationen
In jedem Versuch wurden in der Küvette 100 µl 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 vorgelegt (1) und 10 µl 10 mg/ml Liposomen (90% DPPC, 10% Cholesterin), in entsprechendem Puffer suspendiert, hinzugefügt (Liposomendurchmesser ca. 50 nm, Lipidkonzentration 1230 µM) (2). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 185 µM bzw. 1,85 mM Ca
2+ gestartet (3) und war reversibel bei Zugabe von 185 µM EDTA bzw. 9 mM EDTA (4). Anschließend wurde einmal mit 10 mM EDTA, 10 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,4 und mehrmals mit Puffer gewaschen (5). Die Versuchsdurchführung war für die drei dargestellten Küvetten identisch.
Abbildung 3.8: Kontrollexperimente zur Resonant Mirror Spektroskopie
Reaktion von immobilisiertem Schaf-SP-A mit 676 µM Lipid (Durchmesser der Liposomen 50 nm, Zusammensetzung: 89% DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium.
Abbildung 3.9: Abhängigkeit des Meßsignals von der Menge des immobilisierten Proteins
Aufgetragen ist der durch die Kopplung von SP-A an die Küvettenoberfläche erhaltene Resonanzwinkel (Kopplungssignal) gegen den Resonanzwinkel, der für die jeweilige Küvette bei Reaktion mit durchschnittlich 387 µM Lipid (min. 363 µM, max. 418 µM Phosphatidylcholin, Liposomendurchmesser ca. 50 nm, 90% DPPC, 10% Cholesterin) nach Zugabe von 90 µM Calcium bestimmt wurde. Zur Kopplung wurden zwischen 0,3 µg und 30 µg SP-A eingesetzt.
Abbildung 3.10: Reproduzierbarkeit der Messungen
Dargestellt sind die Original-Meßdaten ohne Korrektur der Basislinie.
Links: Vier Messungen der Bindung von 200 nm DPPC-Mix-Liposomen (588 µM Lipid) an immobilisiertes Schaf-SP-A nach Zugabe von 87 µM Calcium.
Rechts: Immobilisiertes Ratten-SP-A reagiert mit Liposomen in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium. Die Reaktion ist reversibel durch Zugabe von 500 µM EDTA und kann durch Zugabe einer äquimolaren Calciummenge wieder gestartet werden.
Abbildung 4.1: Calciumabhängigkeit und Reversibilität der Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A
640 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 reagieren mit immobilisiertem Rinder-SP-A nach Zugabe von 50 µM Calcium. Die schrittweise Zugabe von EGTA führt zu einer schnellen Dissoziation der Liposomen. Der schraffierte Bereich des Resonant Mirror Signals ist im Detail vergrößert dargestellt.
Abbildung 4.2: Reversibilität der Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A Langzeitversuch
Dargestellt sind Resonant Mirror Signale der Reaktion von 50 nm DPPC-Mix-Liposomen (Konzentration an Phosphatidylcholin: 2334 µM) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 mit immobilisiertem Schaf-SP-A nach Zugabe von 90 µM Calcium. Die Reaktion ist auch nach 1,5 Stunden noch reversibel.
Abbildung 4.3: Reversibilität der Aggregationsreaktion
Die Abbildung zeigt den Verlauf der Aggregation von 1350 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) und 12 nM Schaf-SP-A in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium, gemessen mit kinetischer Lichtstreuung. Durch Zugabe von EDTA ist die Reaktion vollständig reversibel. Die Halbwertszeit der ”Disaggregation“ liegt bei etwa 18 s, der schraffierte Bereich ist vergrößert im Detail dargestellt.
Abbildung 4.4: Lichtstreusignale bei der Probenvorbereitung (A) und der Aggregationsreaktion nach Zugabe von 300 µM Calcium (B)
307 µM Lipid als 200 nm DPPC-Mix-Liposomen reagieren mit 9,1 nM SP-A unter verschiedenen Bedingungen nach Zugabe des Proteins (A) und Zugabe von 300 µM Calcium (B). Es wurden Versuche in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, pH 7,4 (ohne EDTA) und in einem Puffer mit 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 20 µM EDTA, pH 7,4 (mit EDTA) sowie Kontrollversuche in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, pH 7,4 ohne Lipid bzw. Protein durchgeführt, in denen anstelle von Protein oder Liposomen die entsprechende Flüssigkeitsmenge an Puffer ergänzt wurde.
Abbildung 4.5: Bindungs- (A) und Aggregationssignale (B) in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration
Immobilisiertes Rinder-SP-A wurde mit 640 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 durch Zugabe von Calcium zur Reaktion gebracht. Die Signalamplituden nach 200 s (Resonant Mirror Spektroskopie, A) bzw. 400 s (Lichtstreuung, B) nach Zugabe von Calcium sind gegen die zugesetzte Calciumkonzentration aufgetragen. Bei der Lichtstreuung wurde das jeweils erhaltene Meßsignal durch die Grundstreuung der Probe dividiert, daher ergaben sich für die Einheiten relative Werte (r.E.). Die Punkte wurden mit einer Hill-Gleichung angepaßt, die Parameter sind in Tabelle 4.1 zusammengefaßt.
Abbildung 4.6: Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A in Abhängigkeit von der freien Calciumkonzentration
Immobilisiertes Schaf-SP-A wurde mit EGTA gewaschen und mit 640 µM Lipid (DPPC-Mix-Liposomen, 200 nm) im 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 inkubiert. Die mit Resonant Mirror Spektroskopie aufgenommenen Signale 200 s nach Calciumzugabe sind gegen die freie Calciumkonzentration aufgetragen, die aus der Calciumverunreinigung im Puffer (A: 5 µM, B: 20 µM) und den zugesetzten EGTA und Calciumkonzentrationen berechnet wurde (Programm Chelator). Die Meßpunkte wurden mit der Hill-Gleichung gefittet, die erhaltenen Parameter sind in Tabelle 4.2 zusammengefaßt.
Abbildung 4.7: Abhängigkeit der Liposomenbindung von zweiwertigen Kationen
Dargestellt sind vier Messungen mit Resonant Mirror Spektroskopie. Immobilisiertem Schaf-SP-A mit 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 wurden 644 µM Lipid (89% DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol, 50 nm Liposomen) zugefügt. Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 50 µM zweiwertiger Kationen. Die Reaktion war nach Zugabe von 0,8 mM EDTA reversibel. Die Küvette wurde anschließend mehrmals mit Puffer gewaschen.
Abbildung 4.8: Bindung von Liposomen an immobilisiertes Schaf-SP-A in Gegenwart von DTT
Die Reaktion zwischen 80 µM Lipid, 320 µM Lipid bzw. 1280 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen, höhere Signalintensität mit steigender Lipidkonzentration) und immobilisiertem SP-A wird durch Zugabe von 70 µM Ca
2+ gestartet. Die dargestellten Messungen wurden mit Resonant Mirror Spektroskopie nacheinander in einer Küvette durchgeführt.
Abbildung 4.9: Interaktion zwischen SP-A und Liposomen nach Photolyse von caged Calcium
31 nM SP-A und 2000 µM Lipid (60 nM 50 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 7,5 µM EGTA, 78 µM Calcium, 100 µM DM-Nitrophen, pH 7,4, reagieren nach Photolyse von DM-Nitrophen mit einem UV-Blitz. Dargestellt sind Lichtstreusignale einer Messung, die mit zwei Oszilloskopen unterschiedlicher Zeitauflösung aufgenommen wurde. Unten ist der gesamte Verlauf der Aggregation dargestellt, oben dieselbe Messung mit höherer Zeitauflösung. Der Beginn der Interaktion wurde mit zwei Exponentialfunktionen
mathematisch angepaßt. Der Fit ist als schwarze, gestrichelte Linie dargestellt, er liegt genau auf den Meßwerten (durchgezogene, grüne Linie). Die Parameter für die mathematische Anpassung sind in Tabelle 4.3 (31 nM SP-A) aufgeführt.
Abbildung 4.10: SP-A/Liposomen-Interaktion nach Photolyse von caged Calcium
Messungen mit kinetischer Lichtstreuung zwischen verschiedenen SP-A-Konzentrationen (gemäß Abbildung) und 2000 µM Lipid (entsprechend 60 nM 50 nm DPPC-Mix-Liposomen). Der Reaktionsstart in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 7,5 µM EGTA, 78 µM Calcium, 100 µM DM-Nitrophen, pH 7,4 erfolgt durch Photolyse von caged Calcium. Die Signale (durchgezogene, grüne Linien) wurden mit einer Summe aus zwei Exponentialfunktionen angepaßt (gestrichelte, schwarze Linien), die Werte finden sich in Tabelle 4.3.
Abbildung 4.11: Effekt verschiedener SP-A-Konzentrationen auf die Aggregationsreaktion
Verschiedene Konzentrationen Schaf-SP-A reagieren mit 640 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) nach Zugabe von 50 µM Calcium in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4. Die mit kinetischer Lichtstreuung erhaltenen Meßsignale (durchgezogene, grüne Linien) lassen sich jeweils mit einer Exponentialfunktion anpassen (unterbrochene, schwarze Linie), deren Parameter in Tabelle 4.4 zusammengefaßt sind.
Abbildung 4.12: Interaktion von SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen nach Blitzlichtphotolyse von caged Calcium
Kinetische Lichtstreusignale der Reaktion von 20 nM Schaf-SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen (50 nm DPPC-Mix-Liposomen) nach Calciumfreisetzung aus DM-Nitrophen (Puffer 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 7,5 µM EGTA, pH 7,4, 78 µM Calcium, 100 µM DM-Nitrophen). Die Meßwerte (durchgezogene, grüne Linien) wurden durch zwei Exponentialfunktionen angepaßt, deren Parameter in Tabelle 4.5 zusammengefaßt sind (dargestellt als unterbrochene, schwarze Linien).
Abbildung 4.13: Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen auf die Aggregationsreaktion
In der kinetischen Lichtstreuung wird die Reaktion von 4,5 nM Ratten-SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium gestartet und über einen Zeitbereich von mehreren Minuten verfolgt. Die Meßsignale (durchgezogene, grüne Linien) werden mit einer Exponentialfunktion (dargestellt als unterbrochene, schwarze Linien) angepaßt, deren Werte in Tabelle 4.6 zusammengefaßt sind.
Abbildung 4.14: Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A bei verschiedenen Lipidkonzentrationen
Reaktionsstart zwischen immobilisiertem Schaf-SP-A und 50 nm Liposomen aus 80% DPPC, 10% Cholesterin, 10% a-Tocopherol, suspendiert in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EDTA, pH 7,4, durch Zugabe von 91 µM Calcium. Die Parameter für die mathematische Anpassung der mit Resonant Mirror Spektroskopie erhaltenen Signale (durchgezogene, grüne Linien) sind in Tabelle 4.7 zusammengefaßt, die Funktionen als unterbrochene, schwarze Linien dargestellt.
Abbildung 4.15: Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A - Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen bei Immobilisation von viel SP-A und Verwendung großer Liganden
Immobilisiertes Ratten-SP-A reagiert mit verschiedenen Lipidkonzentrationen (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 50 µM EGTA, 5 mM Tris, pH 7,4 nach Zugabe von 90 µM Calcium. Die mit Resonant Mirror Spektroskopie erhaltenen Meßsignale (durchgezogene, grüne Linien) wurden mit zwei Exponentialfunktionen angepaßt, deren Parameter in Tabelle 4.8 zusammengefaßt sind. In der Graphik sind die Funktionen durch schwarze, gestrichelte Linien dargestellt.
Abbildung 4.16: Reaktion von DPPC-Mix-Liposomen unterschiedlicher Konzentration mit immobilisiertem Schaf-SP-A zur Bestimmung der Gleichgewichtsamplitude
Die angegebenen Lipidkonzentrationen beziehen sich auf den Gehalt der Liposomen (Durchmesser ca. 50 nm) an Phosphatidylcholin. Die Reaktion wurde in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 durchgeführt und durch Zugabe von 91 µM Calcium gestartet.
Abbildung 4.17: Bestimmung einer apparenten Dissoziationskonstante für den SP-A/Liposomen Komplex
Die Darstellung ist an einen Scatchard-Plot angelehnt, d.h. das Signal nach der Gleichgewichtseinstellung dividiert durch die Lipidkonzentration (R
eq/conc) wird gegen die Gleichgewichtsamplitude (Req) aufgetragen. Die Steigung der Regressionsgeraden ist - KA=1/KD, KD = 2,8 µM, r²=0,9212. Die Lage des 95% Konfidenzintervalls ist im gepunkteten Kurvenpaar dargestellt.
Abbildung 4.18: Unterschiede zwischen den Wechselwirkungen von SP-A mit DPPC- bzw. POPC-Liposomen
Oben: Zeitverlauf von Lichtstreusignalen in einer Suspension von Liposomen, Schaf-SP-A und caged Calcium (Ca
2+/DM-Nitrophen) bei Start durch Photolyse von caged Calcium. Zusammensetzung der Liposomen: 90% DPPC oder POPC, 10% Cholesterin, die Konzentration an SP-A beträgt 20 nM, die an Lipid 1885 µM (60 nM Liposomen, Durchmesser ca. 50 nm), Puffer: 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 40 µM Ca2+, 8 µM EGTA, 102 µM DM-Nitrophen, pH 7,4. Im Inset ist der Reaktionsbeginn im Detail dargestellt.
Unten: Zeitverlauf der Resonant Mirror Signale bei Bindung von 20 nM DPPC- oder POPC-Liposomen (s.o.) an immobilisiertes Schaf-SP-A. Die Reaktion in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 wurde durch Zugabe von 90 µM Calcium gestartet. Im Inset ist der Beginn der Reaktion dargestellt.
Abbildung 4.19: Bindung verschiedener Phosphatidylcholin-Liposomen an immobilisiertes SP-A
Zur Messung mit Resonant Mirror Spektroskopie wurde Schaf-SP-A auf dem Sensorchip mit ca. 20 nM Liposomen (Durchmesser etwa 50 nm) aus verschiedenen Phosphatidylcholinen in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 inkubiert (Zusammensetzung der Liposomen: 80% Phospholipid -siehe Abbildung-, 10% Cholesterin, 10% a-Tocopherol). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 90 µM Calcium gestartet.
Abbildung 4.20: SP-A vermitteltes Aggregationsverhalten verschiedener Phosphatidylcholin-Liposomen
Reaktion von 1280 µM Lipid (41 nM unterschiedliche Liposomen 80% Phosphatidylcholin, 10% Cholesterin, 10% a-Tocopherol, Durchmesser 50 nm) mit 7 nM Schaf-SP-A in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA nach Zugabe von 470 µM Calcium.
Abbildung 4.21: Resonant Mirror Signale mit verschiedenen Phospholipid-Liposomen
Immobilisiertes Schaf-SP-A wurde mit verschiedenen Liposomen in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 inkubiert und durch Zugabe von 87 µM Calcium aktiviert. Es wurden ca. 590 µM Lipid (19 nM Liposomen, Durchmesser ca. 50 nm, 89% DPPS, DPPG, PE, PC, PG, PI, SM, DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol, DPPC-Mix-Liposomen) zur Reaktion gebracht. Die Rückreaktion erfolgte nach Zugabe von 400 µM EDTA.
Abbildung 4.22: Temperaturabhängigkeit der Liposomenbindung
320 µM DPPC-Mix-Liposomen (50 nm) suspendiert in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 binden bei 15 °C und 37 °C an immobilisiertes Schaf-SP-A nach Zugabe von 90 µM Calcium.
Abbildung 4.23: Einfluß der Temperatur auf die Bindung von DPPC- und POPC-Liposomen an immobilisiertes SP-A
Ca. 1230 µM DPPC in 50 nm Liposomen (Zusammensetzung: 89% DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol) bzw. POPC in 50 nm Liposomen (Zusammensetzung: 89% POPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol) in 100 µM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA reagieren nach Zugabe von 150 µM, 75 µM, 38 µM oder 16 µM Calcium (von rechts nach links) mit immobilisiertem Schaf-SP-A. Untereinander dargestellt sind jeweils drei nacheinander durchgeführte Meßreihen in einer Küvette mit Resonant Mirror Spektroskopie bei 15 °C, 37 °C und 15 °C (Messung 1, 2, 3). Die Reaktion ist durch äquimolare EDTA-Zugabe reversibel; zwischen den Einzelmessungen werden Waschschritte durchgeführt.
Abbildung 4.24: Einfluß der Temperatur auf die Aggregationsreaktion
Aggregation von 50 nm Liposomen, Zusammensetzung 89% DPPC, 10% Cholesterin, 0,1% a-Tocopherol (ca. 640 µM Lipid) und 23 nM Schaf-SP-A in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA nach Zugabe von 73 µM Calcium.
Abbildung 5.1: Hypothetische Reaktionsfolge (Schemazeichnungen)
Comicartige Darstellung des präassoziierten Komplexes (1), der Konformationsänderung und Umlagerung nach Calciumzugabe (2), der Bindung (3) und der Aggregationsreaktion (4).
Abbildung 5.2: Reaktionsschema

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Fri May 21 11:47:05 1999