Meyboom, Astrid: Untersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen

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Kapitel 2. Grundlagen

2.1. Lungensurfactant

2.1.1. Bedeutung des Surfactants

Die Lunge des Menschen besteht aus etwa 300 Millionen miteinander verbundener Alveolen. Diese haben einen Durchmesser von je 0,2 mm bis 0,3 mm und bilden so eine Gesamtoberfläche von etwa 80 m². Die zur Atmung notwendige Flexibilität und Stabilität dieser großen Oberfläche wird einerseits durch die Eigenschaften des Lungengewebes, andererseits durch die Auskleidung der Alveolen mit einer oberflächenaktiven Schicht, dem Surfactant, gewährleistet. Das Surfactant erleichtert die Entfaltung der Lunge und stabilisiert die Alveolen bei der Ausatmung, indem es die Oberflächenspannung im Vergleich zu einer reinen Luft-Wasser-Grenzfläche auf etwa ein Zehntel reduziert. An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich -so die Modellvorstellung- aus der Surfactantschicht ein Phospholipid-Monolayer, der im Wechsel von Ein- und Ausatmung expandiert und komprimiert wird und die Oberflächenspannung dynamisch verändert. Dadurch sinkt das Risiko des Kollabierens kleiner Alveolen, die nach dem Gesetz von Laplace p=2gamma/r (gamma: Oberflächenspannung, r: Radius) bei gleicher Oberflächenspannung einen höheren Innendruck besitzen als Alveolen mit größerem Radius. Daneben schützt das Surfactant die Zellen des Lungengewebes vor dem Austrocknen und ist an der Infektabwehr, am Sekrettransport, sowie am Schutz vor Sauerstoffradikalen beteiligt , , .

2.1.2. Entwicklung der Lungensurfactant-Forschung

Die erste Mitteilung zur Existenz eines oberflächenaktiven Stoffes in der Lunge wurde durch Kurt von Neergaard veröffentlicht . Seine Untersuchungen zeigen, daß der Druck, welcher für das Füllen der Lunge mit Luft benötigt wird, größer ist, als der für das Füllen mit Wasser. Eine Erklärung seiner Ergebnisse sah von Neergard in der Stabilisierung der Alveolen durch die Erniedrigung der hohen Oberflächenspannung an der Luft-Alveolen-Grenzfläche. Allerdings blieben diese frühen Erkenntnisse lange Zeit unberücksichtigt, bis Pattle und Clements in der Lunge Faktoren entdeckten, welche


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die Oberflächenspannung reduzieren , . Diese wurden bereits im Jahr 1946 durch Thannhauser als atelektatische Faktoren bezeichnet. Thannhauser bemerkte den ungewöhnlich hohen Gehalt des Lungengewebes an Dipalmityllecithin (heutige Nomenklatur: Dipalmitoylphosphatidylcholin, DPPC), erkannte aber nicht dessen funktionelle Bedeutung . Die Arbeitsgruppe von Clements zeigte, daß aus Rinderlungen isolierte Phospholipidfraktionen die Oberflächenspannung herabsetzen und daß vergleichbare Effekte auch mit synthetischem DPPC zu erzielen sind . Nach der Entdeckung der Surfactantproteine in den siebziger Jahren wurde die Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Phospholipiden und Proteinen des Surfactants Gegenstand vieler Untersuchungen, die bis heute aktuell sind.

Die medizinische Bedeutung des Surfactantmangels, der zum Atemnotsyndrom bei Frühgeborenen führt, zeigten Avery und Mead . Eine erfolgreiche Therapie durch Applikation eines künstlichen Surfactants gelang erstmals 1980 . Seitdem werden Surfactantersatzstoffe als Therapeutika ständig verbessert, wobei Erkenntnisse über Komponenten und deren Zusammenspiel im natürlichen Surfactant bei der Entwicklung von Nutzen sind.

2.1.3. Biochemie und Funktion des Surfactants

Surfactant wird von den Typ-II-Zellen der Lunge (Typ-II-Pneumozyten) synthetisiert und in den Alveolarraum sezerniert. Daher unterscheidet man zwischen intrazellulärem Surfactant, das in Speicher- und Abbauformen in den Typ-II-Pneumozyten vorkommt, und extrazellulärem Surfactant im Alveolarraum. Letzteres kann durch Waschen der Lunge mit gepufferten, salzhaltigen Lösungen -im Vergleich zu intrazellulärem Surfactant- einfach präpariert werden. Daher beziehen sich Angaben über die Zusammensetzung von Surfactant häufig auf extrazelluläres Surfactant. Dieses ist biochemisch gesehen eine Emulsion aus Lipiden (90%), Proteinen (8%) und Kohlenhydraten, die an Proteine und Lipide kovalent gebunden sind (2%). Die Lipide des Surfactants setzen sich wiederum zu etwa 90% aus Phospholipiden zusammen. Daneben kommen -in abnehmender Reihenfolge- Cholesterin, Triacylglycerol und freie Fettsäuren vor. Etwa 70% - 80% der Phospholipide sind Phosphatidylcholine, davon mehr als die Hälfte das gesättigte Dipalmitoylphosphatidylcholin. Zwischen den Spezies sind die Unterschiede in der Lipidzusammensetzung des Surfactants gering. Bei wechselwarmen Reptilien


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verändert sich der Cholesteringehalt mit der Körpertemperatur. Eine niedrige Temperatur wird durch einen höheren Gehalt an Cholesterin ausgeglichen .

Die Phospholipide verursachen die Oberflächenaktivität des Surfactants. Deren hydrophobe Acylketten sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche in die apolare Luftumgebung gerichtet, so daß die polaren Kopfgruppen mit der wäßrigen Umgebung wechselwirken. Durch den hohen Gehalt an DPPC bildet sich -so die Modellvorstellung- während der Kompressionsphase der Ausatmung ein geordneter, rigider Monolayer, der die Oberflächenspannung herabsetzt (d.h. den Oberflächendruck erhöht). Dies führt dazu, daß fluidere, z.B. ungesättigte Phospholipidkomponenten, die dem hohen Oberflächendruck ausweichen, aus dem Monolayer verdrängt werden (squeeze out) . In vitro konnte ein solcher Effekt anhand der Verdrängung von ungesättigtem Phosphatidylglycerol (PG) aus binären Mischungen mit DPPC gezeigt werden .

Die in der Lunge vorliegenden Strukturen sind um ein Vielfaches komplexer, obwohl das Modell eines Monolayers an der Luft-Wasser-Grenzfläche die Senkung der Oberflächenspannung plausibel und in in vitro Versuchen kontrollierbar macht. Elektronenmikroskopische Aufnahmen und Messungen der Oberflächenaktivität vermitteln ein Bild von mehreren Lipidschichten, die mit der Oberfläche wechselwirken . Bevor die Phospholipide den Kontakt zwischen der Luft-Wasser-Grenzfläche bilden, der vereinfacht als Monolayer dargestellt werden kann, durchlaufen sie verschiedene morphologische Strukturen (Abbildung 2.1).

Surfactant wird von den Typ-II-Pneumozyten der Lunge produziert und intrazellulär in dichten, multilamellaren Vesikeln, den sog. Lamellarkörpern gespeichert. Die Lamellarkörper werden in den Alveolarraum ausgeschleust und dort in eine gitterartige, aus Lipiddoppelschichten bestehende Struktur umgewandelt, die als tubuläres Myelin bezeichnet wird. Tubuläres Myelin ist Hauptreservoir für das intraalveoläre Surfactant und möglicherweise auch Ausgangsstruktur für den alveolären Monolayer. Für diesen könnten allerdings auch andere intraalveoläre Membranstrukturen verantwortlich sein, da SP-A knock-out Mäuse, die aufgrund des so erzeugten Gendefektes keine tubulären Myelinstrukturen bilden können, normal atmen . Der Turnover des alveolären Monolayers erfolgt relativ schnell (ca. 4 h). Lipide werden wahrscheinlich in Form unilamellarer Vesikel wieder in die Zellen aufgenommen und rezykliert oder von Alveolarmakrophagen abgebaut .


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Abbildung 2.1: Lipidstrukturen pulmonalen Surfactants

An der Bildung und Veränderung der komplexen Lipidstrukturen sind auch die Surfactantproteine beteiligt. Die im Surfactant vorkommenden Proteine wurden von SP-A bis SP-D durchalphabetisiert und lassen sich in zwei Gruppen gliedern: Die hydrophoben Surfactantproteine B und C sowie die hydrophilen Surfactantproteine D und A .

Außer Surfactantprotein C, einem ausschließlich in der Lunge lokalisierten Protein , konnten alle Surfactantproteine auch in anderen Geweben nachgewiesen werden, z.B. im Gastrointestinaltrakt , .


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2.2. Struktur und Aufgaben der Surfactantproteine

2.2.1. Hydrophobe Surfactantproteine

Die hydrophoben Surfactantproteine SP-B und SP-C wurden von Phizackerley und Mitarbeitern entdeckt . Bemerkenswert ist, daß sich diese Proteine nur in organischen Lösungsmitteln wie Chloroform/Methanol oder Ethanol/Äther lösen, nicht aber in Wasser. Diese extreme Hydrophobizität erfordert posttranslationale Modifikationen der intrazellulären Vorstufen, um eine Synthese in Typ-II-Zellen zu ermöglichen .

2.2.1.1. SP-B

SP-B ist ein kleines, hydrophobes Surfactantprotein aus 79 Aminosäuren, das zahlreiche Cysteine enthält . Diese stabilisieren durch eine intermolekulare und drei intramolekulare Disulfidbrücken das SP-B Dimer , . Die Sekundärstruktur ist vorwiegend alpha-helikal , , , wobei die Helices einen amphipatischen Charakter aufweisen.

Die wichtigste Funktion von SP-B ist die Wechselwirkung mit dem Lipidmonolayer an der Lungenoberfläche. SP-B führt zur Insertion und zum Einbau von Lipiden in den Oberflächenfilm und stabilisiert diesen , , . Bei der Ausatmung wird die Oberfläche verkleinert und der Oberflächendruck erhöht sich. Dadurch wird SP-B mit 2-3 Lipidmolekülen aus dem Oberflächenfilm herausgedrückt . Bei der folgenden Einatmung katalysiert SP-B die Aufnahme von Phospholipiden in den Monolayer . Die Bedeutung von SP-B zeigt sich in natürlich vorkommenden Mutationen des SP-B-Moleküls, die zu schweren Atemfunktionsstörungen mit Todesfolge führen , . Daneben ist SP-B, im Zusammenwirken mit SP-A, an der Ausbildung tubulärer Myelinstrukturen beteiligt und beeinflußt die Ordnung in Phospholipidbilayern , .

2.2.1.2. SP-C

SP-C ist mit nur 35 Aminosäuren das kleinste der Surfactantproteine. 2/3 des Proteins bilden eine reguläre alpha-Helix mit zahlreichen Valinresten, die extrem hydrophob ist und einen Monolayer durchspannen kann , . Die Acylierung zweier benachbarter Cysteinreste mit Palmitinsäure erhöht den hydrophoben Charakter des Proteins und orientiert SP-C annähernd parallel zur Membran .


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Im Surfactant findet man sowohl monomere als auch dimere Formen. Es ist allerdings unklar, ob diese funktionell unterschiedlich sind. Ähnlich wie bei SP-B liegen auch die Funktionen des SP-C in der Interaktion mit Lipidschichten. SP-C beschleunigt die Aufnahme von Phospholipiden in den Monolayer und beeinflußt die Ordnung der Phospholipide in Lipidschichten .

2.2.2. Hydrophile Surfactantproteine

Die hydrophilen Surfactantproteine A und D unterscheiden sich grundlegend von den zuvor beschriebenen hydrophoben Surfactantproteinen. Bei beiden handelt es sich um große, glykosylierte, multimere, wasserlösliche Proteine, die in die Untergruppe der C-Typ-Lektine (Collektine) eingeordnet werden. SP-A und SP-D besitzen in ihren Untereinheiten einen ähnlichen Aufbau bestehend aus einer carboxyterminalen Kohlenhydraterkennungsregion (carbohydrate recognition domain, CRD) , einer Übergangsregion, einer aminoterminalen collagenartigen Domäne und einer kurzen aminoterminalen Sequenz.

2.2.2.1. SP-D

Der Nomenklatur zufolge ist SP-D ein Surfactantprotein. Im Gegensatz zu den übrigen Proteinen dieser Gruppe ist es bei der Aufreinigung überwiegend in der Lavage gelöst und nur zu 10% mit den anderen Surfactantproteinen an Lipide gebunden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen des SP-D Holoproteins mit einem Molekulargewicht von 630 kD zeigen eine regelmäßige Tertiärstruktur in Form eines Kreuzes, die dem Conglutinin ähnelt . SP-D besteht aus 12 Untereinheiten, die in vier Trimeren arrangiert sind. Das Molekulargewicht liegt bei 630 kD.

Bisher wurde eine sehr spezifische Interaktion von SP-D mit Lipiden, in Form der calciumabhängigen Bindung von Phosphatidylinositol (PI) nachgewiesen , . Etwa 3% der Surfactantlipide sind Phosphatidylinositole. Die Beteiligung von SP-D an der Surfactantregulation zeigt sich in SP-D knock-out Mäusen, bei denen es im Erwachsenenalter zu einer Anhäufung von Phospholipiden in der Lunge und zu Veränderungen an Typ-II-Zellen und Makrophagen kommt.

Außerdem ist SP-D an der Immunabwehr beteiligt. SP-D bindet an die Lipopolysaccharidoberflächen zahlreicher Bakterien und hat durch seine vier voneinander entfernten Bindungsstellen, die durch je drei CRD-Regionen gebildet werden, eine ideale Form für die Agglutination von Bakterien . Außerdem bindet SP-D mit hoher Affini-


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tät an Makrophagen und induziert dadurch die Freisetzung von Sauerstoffradikalen , .

2.2.2.2. SP-A

Das bei weitem häufigste Surfactantprotein ist SP-A, das als erstes Surfactantprotein gereinigt und dessen Primärstruktur bestimmt wurde . Die Gene für SP-A liegen beim Menschen auf dem langen Arm des Chromosoms 10 . Für die Bildung eines stabilen SP-A Moleküls werden wahrscheinlich die Produkte zweier humaner SP-A Gene benötigt . Humane SP-A RNA codiert eine Untereinheit mit 248 Aminosäuren , in der vier verschiedene Domänen zu unterscheiden sind (Abbildung 2.2):

  1. eine aminoterminale Region mit einem Cysteinrest, durch den eine Disulfidbrücke gebildet wird, die für die Struktur des oligomeren Proteins von Bedeutung ist .
  2. eine collagenartige Domäne mit sich wiederholender Gly-X-Y - Sequenz, die bei einigen Spezies ebenfalls einen Cysteinrest enthält, der an der Bildung von Disulfidbrücken beteiligt ist. Beide Strukturelemente sind für die korrekte Zusammenlagerung des aus 18 Untereinheiten bestehenden nativen Proteins entscheidend.
  3. eine "Übergangs-" oder "Nacken-" Region, die aus einer kurzen Sequenz hydrophober Aminosäuren und aus einer amphipatischen Helix besteht. Möglicherweise befindet sich in diesem Abschnitt eine Lipidbindungsstelle .
  4. eine C-terminale kohlenhydraterkennende Stelle. Diese zeigt sowohl eine strukturelle als auch eine funktionelle Ähnlichkeit mit der Gruppe der C-Typ Lektine, die Glykolipide und -proteine calciumabhängig binden . Die Struktur der CRD-Region wird durch zwei intramolekulare Disulfidbrücken gewährleistet, die einen größeren und einen kleineren Loop bilden .

Die beschriebene Struktur der SP-A Untereinheit ist speziesunabhängig und weist starke Ähnlichkeit zum Mannose bindenden Protein (MBP), einem weiteren C-Typ-Lektin, auf . Die makromolekulare Organisation des SP-A ähnelt der des Komplementproteins C1q. Beide Moleküle bestehen aus sechs Trimeren, die sich zu einer blumenstraußartigen Struktur zusammenlagern (Abbildung 2.2). Beim SP-A sind jeweils drei monomere Untereinheiten über Disulfidbrücken und die Bildung einer collagenartigen Tripelhelix durch die collagenartigen Domänen zu einem Trimer verknüpft. Die sechs Helices bilden den etwa 20 nm langen ”Stiel“ des SP-A Moleküls. Jedes Trimer besitzt einen flexiblen Knick, der auf einer Unterbrechung der collagen-


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artigen Struktur zwischen dem 13. und dem 14. Aminosäuretriplett beruht. Nach dieser Unterbrechung sind die Trimere nicht mehr nebeneinander angeordnet, sondern weisen seitlich in sechs Richtungen von der Zentralachse weg.

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines SP-A Moleküls

Diese Modellvorstellung wird durch elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigt . Computermodelle, die anhand von Informationen aus der Kristallstruktur des MBP simuliert werden können, zeigen die drei CRD-Regionen der Trimere als weitgehend eigenständige Einheiten, deren jeweilige Oberfläche nur zu 7% durch Interaktionen mit den anderen CRD des Trimers bedeckt wird . Das Molekulargewicht des multimeren Moleküls liegt bei ca. 650 kD. Die genaue Bestimmung wird durch das heterogene Molekulargewicht der Untereinheiten erschwert, das zwischen 26 und 38 kD liegt . Die Heterogenität ist auf ein unterschiedliches Ausmaß der N-Glykosylierung in der CRD-Region zurückzuführen.


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An dieser wurden zusätzlich Sialysierungen und Sulphatisierungen nachgewiesen. Weitere posttranslationale Modifikationen am SP-A sind die Hydroxylierung von Prolinresten und die N-terminale Acetylierung . SP-A wird, wie andere sekretorische Proteine, in das Lumen des rauhen endoplasmatischen Retikulums transportiert. Dabei oder anschließend kommt es zur Abspaltung eines Signalpeptids . Obwohl SP-A als das bestuntersuchte Surfactantprotein gilt, gibt es bis heute kein klares Bild für eine spezifische physiologische Rolle von SP-A. Die zahlreichen Funktionen, die dem SP-A zugeschrieben werden, lassen sich in zwei Gruppen gliedern: Immunologische Funktionen und Wechselwirkungen mit Lipiden (Abbildung 2.3).

Abbildung 2.3: Mögliche physiologische Funktionen von SP-A

Eine wichtige Gruppe von Eigenschaften des SP-A besteht in der Immunabwehr der Lunge. Diese wurden aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit des Proteins mit dem Komplementprotein C1q und der calciumabhängigen Bindung von Kohlenhydraten postuliert und alsbald nachgewiesen. SP-A wirkt als Opsonin auf Staphylococcus aureus Bakterien und Herpes simplex Viren. Es verstärkt deren Phagocytose durch Alveolarmakrophagen .


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Außerdem erhöht SP-A in vitro die Fc-Rezeptor vermittelte Phagocytose durch Monocyten und Makrophagen sowie die Complement-Rezeptor (CR1) vermittelte Phagocytose durch Makrophagen . Daneben stimuliert SP-A die Chemotaxis von Alveolarmakrophagen . Vielversprechend für die Erforschung der Bedeutung von SP-A bei der Immunabwehr ist die Untersuchung von SP-A knock-out Mäusen , an denen sich das Fehlen der Funktionen des Proteins in vivo zeigen wird.

Eine weitere Gruppe von Eigenschaften betrifft die Wechselwirkungen von SP-A mit Lipiden.

Die Lipidbindungsstelle am SP-A konnte noch nicht genau lokalisiert werden. Die Untersuchung proteolytischer Fragmente führte zu der Annahme, daß Lipide im Bereich der ”Übergangs“- oder ”Nacken“-region binden , während Kuroki et al. mit monoklonalen Antikörpern eine putative Lipidbindungsstelle in der CRD-Region lokalisierten . Mutationen im Bereich der Calciumbindungsstelle der CRD-Region vermindern gleichfalls die Interaktion mit Lipiden . Bei dieser Untersuchung stellt sich allerdings die Frage, inwiefern durch die Verhinderung der Calciumbindung die Struktur der CRD-Region soweit verändert wird, daß auch die Lipidbindung nicht mehr stattfinden kann. Daneben scheint auch die aminoterminale Region an der Lipidbindung beteiligt zu sein, da die Aufhebung der Disulfidbrücke durch Mutation von Cys 6 in Ser die Bindung von Lipiden beeinträchtigt. Gleiches gilt für die Entfernung der collagenartigen Region. Damit wurden in allen Domänen des Monomers putative Lipidbindungsstellen beschrieben .

Rekonstitutionsexperimente haben gezeigt, daß SP-A für die Bildung von tubulärem Myelin, der potentiellen Speicherform des extrazellulären, alveolären Surfactants, verantwortlich ist . In den Ecken der tubulären Myelinstrukturen konnte durch Antikörpermarkierung SP-A nachgewiesen werden . Die funktionelle Rolle des tubulären Myelins ist nach wie vor unbekannt. In SP-A knock-out Mäusen kann das Fehlen tubulären Myelins durch gesteigerte Produktion des oberflächenaktiven DPPC kompensiert werden . Für die Senkung der Oberflächenspannung spielt das tubuläre Myelin, wie auch SP-A, keine direkte Rolle.

In Zusammenhang mit der Bedeutung des SP-A für die Bildung von tubulärem Myelin wurde SP-A auch eine Funktion bei der Regulation der Insertion von Phospholipiden in den Monolayer zugeschrieben. Dafür sprechen in vitro Experimente, bei denen die


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Zugabe von SP-A zu hydrophoben Surfactantkomponenten zu einer verstärkten Adsorption von Phospholipiden in den Monolayer führt , , ,

.

SP-A ist an der Surfactanthomöostase zwischen intrazellulärem und extrazellulärem Surfactant beteiligt . An isolierten Typ-II-Pneumozyten inhibiert SP-A die Sekretion von Surfactantlipiden , . Diese Regulation hängt mit der Bindung des Proteins an Typ-II-Zellrezeptoren zusammen , die wahrscheinlich über die C-terminale Domäne erfolgt.

Darüber hinaus verstärkt SP-A an diesen Zellen die Aufnahme von Lipiden und wirkt möglicherweise an deren intrazellulärer Verpackung in Lamellarkörpern mit , , . Allerdings ist der Gehalt der Lamellarkörper an SP-A mit 1% des Gesamtproteins in diesen Vesikeln äußerst gering .

An der Oberfläche der Typ-II-Pneumozyten wurden mehrere Proteine detektiert, die SP-A mit hoher Affinität binden und an diesen Prozessen beteiligt sein können , . Dabei gibt es Hinweise auf die rezeptorvermittelte Endozytose eines SP-A/Lipid-Komplexes durch Typ-II-Pneumozyten über ein SP-A bindendes Rezeptorprotein bp55 . SP-A und Lipide werden in die Zellen aufgenommen und wahrscheinlich auf verschiedenen Wegen rezykliert (Wissel, pers. Mitteilung.), weitgehend ohne einem Abbauprozeß zu unterliegen.

Noch unterliegt das Bild von der oder den Funktionen des SP-A einem stetigen Wandel, der mit dem Wissensfortschritt einhergeht. Zur Zeit verändert sich die Meinung über die Bedeutung von SP-A in vivo, da SP-A knock-out Mäuse in einer pathogenfreien Umgebung trotz SP-A Mangels normal atmen und leben. In diesen Mäusen scheint die Funktion des Proteins für die Surfactanthomöostase entweder überschätzt worden zu sein oder sie ist redundant, so daß ein Fehlen durch andere Strukturen kompensiert werden kann. Hingegen gewinnt die Beteiligung von SP-A an der Infektabwehr der Lunge an Bedeutung.

Die Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Proteinen des Surfactantsystems ist wichtig, da ein Mangel an Surfactant die häufigste Ursache von Atemstörungen bei unreifen Frühgeborenen darstellt. Zur Therapie der Erkrankung, die eine Hauptursache neonataler Sterblichkeit bei Frühgeborenen mit einem Geburts-


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gewicht unter 1000 g darstellt, stehen natürliche tierische oder künstliche Surfactant-Präparationen zur Verfügung, die unterschiedliche Zusammensetzungen an Phospholipiden und Surfactantproteinen haben. Eine genaue Kenntnis der im Surfactant ablaufenden Prozesse, insbesondere der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Lipiden, kann langfristig zur Entwicklung wirksamerer und spezifischerer Therapien von Atemstörungen beitragen.

2.3. Ziele der Arbeit

Die geschilderten Funktionen von SP-A als einem ”Regulator der Surfactanthomöostase“ erfordern die Interaktion des Proteins mit verschiedenen Liganden, zu denen Lipide, Kohlenhydrate, Calcium und zelluläre Rezeptoren zählen. Da SP-A in der alveolären Hypophase stets mit Phospholipiden assoziiert ist , liegt seit der Entdeckung des SP-A ein Schwerpunkt der Surfactantforschung auf der Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen SP-A und Lipiden. Die zahlreichen Untersuchungen haben zu unterschiedlichen, zum Teil kontroversen Ergebnissen geführt. Einerseits wurde eine calciumunabhängige Bindung von SP-A an Phospholipidvesikel festgestellt . Andererseits ist beschrieben worden, daß die Bindung von SP-A an Phospholipiden, die auf Silikagelplatten immobilisiert wurden, nur calciumabhängig erfolgt . Als Ursachen dieser unterschiedlichen Ergebnisse werden die verschiedenen Präparationsmethoden des SP-A vermutet . Die Rolle von Calcium bei der Bindung von Lipiden an SP-A ist daher umstritten. Unstrittig ist hingegen, daß SP-A in Anwesenheit von Calcium zu einer Aggregation von Phospholipidliposomen führt und Calcium die Struktur und Stöchiometrie des gebildeten Lipid-Proteinkomplexes beeinflußt . Über die zur Aggregation notwendigen Calciumkonzentrationen existieren in der Literatur gleichfalls unterschiedliche Angaben, die zwischen 0,74 µM und 0,5 mM Ca2+ für eine halbmaximale Aggregationsreaktion schwanken. Der Mechanismus, mit dem die Aggregationsreaktion erfolgt, ist unbekannt. Diskutiert werden zwei Modelle: Zum einen die Vernetzung verschiedener SP-A/Liposomen-Komplexe via SP-A/SP-A-Interaktionen , und zum anderen die Vernetzung nebeneinanderliegender Liposomen über multivalente Lipidbindungsstellen, beispielsweise in den CRD-Regionen eines SP-A Moleküls . Diese Diskussionen werden durch die Unklarheit begünstigt, die nach


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wie vor über den Lipidbindungsort am SP-A besteht. Bei der Suche nach hydrophoben Regionen als putative Lipidbindungsstellen wurde zunächst die Übergangs- oder Neckregion favorisiert. Dies konnte durch Lipidbindung an proteolytischen Fragmenten bestätigt werden. Neuere Veröffentlichungen, die gezielte Punktmutationen in ihre Untersuchungen einbeziehen, weisen auf die Bedeutung der CRD-Region für die Lipidbindung hin. Auch die aminoterminale Region, die für die korrekte Oligomerisierung des Moleküls verantwortlich ist, hat einen Einfluß auf die Wechselwirkung mit Lipiden .

Einige der bestehenden Unklarheiten lassen sich in Form folgender Fragestellungen zusammenfassen:

Ziel der Arbeit war es, neue Informationen über die Eigenschaften der Interaktion zwischen SP-A und Lipiden zu gewinnen und daraus möglichst Antworten auf eine oder mehrere der oben formulierten Fragen zu finden.

Dazu wurden die bisher noch nicht zur Untersuchung des Surfactant Systems verwendeten biophysikalischen Meßmethoden, die Resonant Mirror Spektroskopie und die kinetische Lichtstreuung, vergleichend eingesetzt. Es galt, die Meßbedingungen zu etablieren und an die begrenzt verfügbaren Proteinmengen anzupassen.

Die methodischen Verbesserungen bei der Messung der SP-A/Lipid-Interaktion können als Grundlage für die Untersuchung anderer Liganden (Kohlenhydrate, Rezeptoren) verwendet werden oder auch direkt zur Untersuchung von rekombinantem bzw. mutiertem SP-A dienen. Besonders interessant erscheint dabei die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen SP-A und dem Rezeptor auf Typ II-Zellen, deren Untersuchung in dieser Arbeit noch nicht möglich war, da bisher keine Präparation zu nennenswerten Mengen an gereinigtem SP-A Rezeptorprotein führt.


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