Meyboom, Astrid: Untersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Präparationen

Ein rekonstituiertes System aus Surfactant Protein A und Lipiden erfordert die Reinigung und Präparation der einzelnen Komponenten, die in den folgenden Abschnitten beschrieben wird. Eine Liste der verwendeten Chemikalien und deren Bezugsquellen befindet sich im Anhang.

3.1.1. Surfactantpräparation

Die Reinigung von Lungensurfactant erfolgt aus Schlachthofmaterial unter leichter Modifikation einer in der Literatur beschriebenen Methode .

Die Lungen von Schafen oder Rindern werden entnommen, sobald es der Schlachtprozess zuläßt und auf Eis transportiert. Nach Entfernung von anhängenden Geweberesten werden die Lungen bis zu dreimal mit eisgekühltem TBS-Puffer (5 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4; Volumen in Abhängigkeit von der Lungengröße - Schaf: ca. 1 l, Rind: ca. 1,5 l) unter leichtem Bewegen des gefüllten Organs gespült. Dazu läßt man den Puffer über die Luftröhre ein- und auslaufen. Der sich in der Lunge ansammelnde Puffer kann mit einer Spritze oder Saugflasche an- bzw. abgesaugt werden. Die erhaltene Lavage sollte möglichst milchig-trüb und blutfrei sein. Zellen und Gewebereste werden durch zehnminütige Zentrifugation der Lavage bei 1200 x g, 4 °C entfernt. Anschließend wird die zellfreie Lavage bei 27500 x g und 4 °C ca. 3 h zentrifugiert, um surfactanthaltige Partikel zu sedimentieren. Der klare Übstand wird dekantiert und kann als Ausgangsmaterial für die Präparation von SP-D genutzt werden. Auf das surfactanthaltige Pellet gibt man nach der Zentrifugation erneut zellfreie Lavage und verfährt wie zuvor beschrieben, bis die gesamte Lavage zentrifugiert ist.

Das surfactanthaltige Pellet wird in ca. 50 ml Bromid-Puffer (5 mM Tris, 150 mM NaCl, 1,64 M NaBr, 5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, pH 7,4) suspendiert und mit einem Dounce-Homogenisator zerkleinert. Das entstandene Homogenat wird bei 100000 x g und 4 °C mindestens 6 Stunden zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befindet sich das Surfactant als dünne Schicht auf der Oberfläche der bromidhaltigen Lösung. Man entnimmt diese vorsichtig mit einem Spatel und suspendiert sie mit etwa 10 ml bis 15 ml TBS-Puffer (5 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) im Dounce-Homogenisator.


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Nach Homogenisation wird die Suspension auf ca. 50 ml verdünnt und bei 100000 x g und 4 °C ca. 60 Minuten zentrifugiert. Um Natriumbromid vollständig zu entfernen, wird das entstandene Surfactantpellet erneut in TBS-Puffer (5 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4) aufgenommen und wie zuvor beschrieben, homogenisiert und zentrifugiert. Das gereinigte Surfactant wird in 3 ml bis 5 ml destilliertem Wasser aufgenommen und der Proteingehalt bestimmt. Damit eine nachfolgende SP-A Präparation lohnt, sollte der Proteingehalt bei etwa 2,5 mg/ml liegen. Bei geringeren Proteinkonzentrationen empfiehlt sich die Isolation von SP-A aus mehreren Surfactantpräparaten.

Aus Rattenlungen wird Surfactant auf entsprechende Weise durch Spülen der Lunge mit 10 ml bis 15 ml Puffer isoliert.

3.1.2. SP-A - Präparation

Die Präparation von Ratten- und Schaf-SP-A wurde in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Paul Stevens, Abteilung Neonatologie der Charité durchgeführt, die Präparation von Rinder-SP-A erfolgte im Institut für medizinische Physik und Biophysik der Charité.

In destilliertem Wasser gelöstes Surfactant wird durch eine 25 G Nadel bei Raumtemperatur zügig in stark gerührtes 1-Butanol eingespritzt. Die Endkonzentration sollte 30:1 (Volumen Butanol : mg Protein) betragen. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. SP-A fällt als weißer Niederschlag aus, während sich die Lipide sowie die hydrophoben Surfactantproteine B und C im Butanol lösen. Durch Zentrifugation (3000 x g, 30 Minuten, 4 °C) wird das SP-A von der Butanolphase getrennt. Diese entfernt man nach Beendigung der Zentrifugation vorsichtig mit einer Spritze. Die SP-A-haltigen Pellets werden nochmals in 20 ml bis 25 ml Butanol aufgenommen, geschüttelt, vereinigt und zentrifugiert (3000 x g, 30 Minuten, 4 °C). Nach dem vorsichtigen Abnehmen des Überstandes wird das Pellet unter leichtem Stickstoffstrom getrocknet, bis kein Butanolgeruch mehr wahrnehmbar ist. Beim Eintrocknen sollte das Zentrifugenglas, in dem sich SP-A befindet, mit Parafilm abgedeckt werden, da das Protein als Pulver mit dem Stickstoffstrom verblasen werden kann. Das Protein wird in OGP-Puffer (20 mM Octyl-beta-D-glycopyranosid, 100 mM NaCl, 10 mM HEPES) aufgenommen (ca. 12 ml / 10 mg Surfactant), mit dem Dounce-Homogenisator homogenisiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend zentrifugiert man die Suspension 45 Minuten bei 100000 x g, 15 °C. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das proteinhaltige Pellet zweimal -wie


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beschrieben- durch Homogenisation mit einem Dounce-Homogenisator in OGP-Puffer und anschließender Zentrifugation (45 Minuten bei 100000 x g, 15 °C) gewaschen. Das erhaltene Protein-Pellet wird in einem kleinen Volumen 5 mM Trispuffer, pH 7,4 (hergestellt aus Tris-HCl und Tris-Base, ohne Titration) aufgenommen. Ausgehend vom Surfactant-Proteingehalt, sollte die Proteinkonzentration mindestens 2,5 mg/ml betragen. Das Protein wird 24 h bis 48 h gegen 5 mM Trispuffer dialysiert. Anschließend wird die Lösung bei 130000 x g, 4 °C 30 Minuten zentrifugiert. Das gereinigte SP-A befindet sich im Überstand. Nach einer Proteinbestimmung wird das Protein aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Die Haltbarkeit beträgt mehrere Monate.

Kontrolle der Präparate

Die Proteinbestimmung nach Bradford erfolgte in allen Fällen mit dem Bio-Rad-Proteinassay und Serumalbumin als Standard (Microassay-Methode nach Angaben des Herstellers). Die Reinheit der SP-A Präparation wurde mit einer SDS-Gelelektrophorese nach Lämmli überprüft (Abbildung 3.1).

Abbildung 3.1: SDS-Gelelektrophorese (12% Acrylamid) von Rinder- und Schaf-SP-A unter reduzierenden Bedingungen

Die unter reduzierenden Bedingungen durchgeführte Elektrophorese zeigt nach der Färbung mit Serva Blue (0,1% Serva-Blue R in 40% Methanol, 10% Essigsäure) ein fast identisches Bandenmuster für Rinder- und Schaf-SP-A. Erkennbar ist in beiden Präparaten eine Hauptbande mit einem Molekulargewicht von 33 kD bis 36 kD, die das


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glykosylierte Monomer darstellt. Darunter ist bei ca. 28 kD die deglykosylierte Untereinheit des SP-A zu sehen. SP-A Dimere haben ein Molekulargewicht um 67 kD.

3.1.3. Präparation von Liposomen

Die Lipide wurden, sofern nicht vom Hersteller als Stammlösung bezogen, in Chloroform/Methanol 2/1 gelöst und in der gewünschten Zusammensetzung gemischt. Sehr häufig werden bei den Messungen sog. DPPC-Mix-Liposomen verwendet, deren Zusammensetzung mit 55% Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), 25% Phosphatidylcholin aus Eigelb (EiPC), 10% Phosphatidylglycerol (PG) und 10% Cholesterin dem Phospholipidgemisch des Lungensurfactants ähnelt. Die Anteile der Lipide in den Liposomen sind stets in Gewichtsprozenten angegeben.

Unter Einsatz einer Vakuumzentrifuge (Eppendorf) wird bei einem Vakuum von 20 mbar bis 30 mbar und Raumtemperatur das Lösungsmittel entzogen und ein Lipidfilm gebildet. Die Lipidfilme werden nach Zugabe von Tris-Puffer (100 mM NaCl, 50 µM EGTA, 5 mM Tris, pH 7,4) unter Schütteln im Eppendorf-Thermostaten bei 50 °C hydratisiert.

Zur Herstellung von Liposomen mit einem Durchmesser um 200 nm werden aus der Suspension zunächst durch Ultraschall (8 x 15 s, Bandelin Sonoplus BM 70 Desintegrator mit Mikrospitze) kleine unilamellare Vesikel (SUV) hergestellt. Durch zehnmaliges Einfrieren und Auftauen erhält man multilamellare Vesikel (MLV). Diese werden durch eine Polycarbonatmembran mit 200 nm Porengröße unter Verwendung eines Liposo-Fast Extruders bei einer Temperatur von 50 °C extrudiert (40 x), wobei unilamellare Liposomen entstehen .

Bei der Präparation von Liposomen mit einem Durchmesser von 50 nm wird die nach dem Hydratisieren erhaltene Suspension ohne weitere Vorbehandlung bei 50 °C durch zwei Polycarbonatmembranen mit einem Porendurchmesser von 50 nm extrudiert.

Phosphatidylcholinbestimmung

Zur Bestimmung des Lipidgehaltes wurde eine Cholinbestimmung nach Stewart mit DPPC als Standard durchgeführt . Der Stewart-Assay eignet sich zur Bestimmung des Phosphatidylcholingehalts von Proben in Gegenwart von anorganischem Phosphat. Man nutzt die Eigenschaft von Lipiden mit Ammoniumeisen(III)thiocyanat in organischer Lösung einen farbigen Komplex zu bilden. Da die Komplexbildung von der


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Kopfgruppe des Phospholipids abhängt, eignet sich die Methode nicht zur Analyse von Proben, die ein unbekanntes Gemisch verschiedener Phospholipide enthalten. Insbesondere Phosphatidylglycerol wird beim Stewart-Assay nicht erfaßt. Da in den durchgeführten Experimenten der Cholingehalt von Liposomen bekannter Zusammensetzung bestimmt wird, ist diese einfache Methode zur Quantifizierung des Cholins geeignet.

Durchführung

Als Reagenzlösung dient eine wäßrige Lösung von 0,1 M Eisenchlorid und 0,4 M Ammoniumthiocyanat. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur mehrere Monate haltbar. Standardproben werden durch Verdünnen einer Lipidlösung von 0,1 mg/ml DPPC in Chloroform hergestellt. Dazu pipettiert man in 10 ml Glasröhrchen folgende Ansätze (Doppelbestimmung):

Lipid

0 ml

0,1 ml

0,2 ml

0,4 ml

0,6 ml

0,8 ml

1 ml

Chloroform

2 ml

1,9 ml

1,8 ml

1,6 ml

1,4 ml

1,2 ml

1 ml

Reagenz

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

Von den zu bestimmenden Proben werden entsprechende Ansätze hergestellt.

Alle Proben werden mit einem Vortex-Mixer 15 s geschüttelt und anschließend 10 Minuten bei 2700 rpm (Heraeus Biofuge 15 R, Rotor HSA 4100) zentrifugiert. Im Photometer wird die optische Dichte der unteren Chloroformphase bei 485 nm gegen den Chloroformblindwert gemessen und die Konzentration der Proben anhand der Eichkurve ausden Standards ermittelt. Bei ausgewählten Proben erfolgte eine elektronenmikroskopische Analyse der Liposomenpräparation. Dargestellt sind Liposomen nach Extrudern durch 200 nm und 50 nm Membranen und Färbung mit Uranylacetat (Abbildung 3.2).


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Abbildung 3.2: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Liposomen
Dargestellt sind DPPC-Mix-Liposomen, die durch eine 50 nm (links) bzw. 200 nm (rechts) Membran extrudiert wurden. Die Präparate wurden an der Luft getrocknet, anschließend wurde eine Negativfärbung mit Uranylacetat durchgeführt. Die eingezeichneten Balken (---) entsprechen 250 nm.

Abschätzung der Liposomenkonzentration

Aus der Lipidkonzentration wurde die Konzentration an Liposomen in der Lösung anhand folgender Annahmen abgeschätzt, um eine grobe Vorstellung von der Anzahl der reagierenden Teilchen zu erhalten. Die in der Arbeit genannten Liposomenkonzentrationen geben also stets nur näherungsweise Auskunft über die Konzentration an Liposomen. Diese wurde über folgende Rechnung bestimmt: Als Grundlage diente die Oberfläche des Liposoms bei einem Durchmesser, der der verwendeten Porengröße der Membran entsprach. Außerdem wurden näherungsweise innere und äußere Oberfläche als gleich groß aufgefaßt. Als Fläche eines Lipidmoleküls wurden 0,5 nm² zugrundegelegt . Damit erhielt man ca. 500000 Lipidmoleküle für ein Liposom mit einem Durchmesser von 200 nm und 31000 Lipidmoleküle für ein Liposom mit einem Durchmesser von 50 nm. Die Liposomenkonzentration ergab sich durch Division der Lipidkonzentration durch die Zahl der Lipidmoleküle pro Liposom.


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3.2. Methoden

Ziel der Arbeit war die Analyse der SP-A/Liposomen-Interaktion. Die Untersuchung der Wechselwirkungen erfolgte durch den vergleichenden Einsatz der Resonant Mirror Spektroskopie und der kinetischen Lichtstreuung. Zur Kontrolle der SP-A Präparate wurde außerdem ein photometrischer Aggregationstest verwendet.

Die zum Start der Interaktion erforderliche Calciumzugabe erfolgte stets in Form von Calciumchlorid, das in Wasser oder Puffer gelöst wurde, so daß Ca2+- und Cl--Ionen in hydratisierter Form vorlagen. Auch bei der Beschreibung calciumabhängiger Prozesse ist im Folgenden, sofern nicht anders vermerkt, stets eine Abhängigkeit von der Konzentration an Ca2+-Ionen gemeint.

3.2.1. Photometrischer Aggregationstest

Bei der photometrischen Untersuchung kolloidaler Lösungen kommt es zur Schwächung des eingestrahlten Lichtes bei Lichtabsorption durch chromophore Gruppen, durch Lichtstreuung an Partikeln aber auch durch apparative Faktoren wie Reflexion und Brechung an Küvetten. Durch Referenzmessungen mit identischen Küvetten können die apparativen Faktoren weitgehend ausgeschlossen werden. Photometrische Trübungsmessungen, die bei einer Wellenlänge von 400 nm durchgeführt werden, dienen als klassischer ”Aggregationstest“ zur indirekten Untersuchung der Wechselwirkung zwischen SP-A und Liposomen über die durch SP-A ausgelöste Liposomenaggregation. Sie bieten eine einfache Möglichkeit zur Kontrolle der Aktivität der SP-A Präparation. Nach Inkubation von SP-A und Liposomen wird die Interaktion durch Zugabe von Calcium gestartet. Dabei werden in der Regel 2,5 mM bis 5 mM Calcium verwendet. Die SP-A abhängige, calciuminduzierte Aggregation der Liposomen führt zu einer Schwächung des eingestrahlten Lichtes durch zunehmende Streuung an den sich bildenden Aggregaten. Die Extinktion nimmt zu. In dieser Arbeit wurde der Aggregationstest zur Kontrolle der SP-A Präparate und als Referenzmethode eingesetzt. Dazu wurde ein Diodenarrayspektralphotomenter der Firma Hewlett-Packard verwendet.


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3.2.2. Kinetische Lichtstreuung

3.2.2.1. Meßprinzip

Trifft Licht auf Materieteilchen, so wird es gestreut. Diese Beobachtung ist in unserem Leben häufig, z.B. ist der Lichtkegel eines Autoscheinwerfers bei Nebel aufgrund von Streuung auch von der Seite sichtbar.

Die elektrische Feldstärke einer Lichtwelle führt beim Auftreffen auf ein Teilchen zu einer Kraft, die negative Ladungen (z. B. Elektronen) in die eine Richtung und positive Ladungen (z. B. Atomkerne) in die entgegengesetzte Richtung bewegt. Dadurch wird ein elektrischer Dipol induziert, der sich mit der sich verändernden Feldstärke der Lichtwelle ebenfalls periodisch ändert. Ein solcher oszillierender Dipol sendet elektromagnetische Strahlung in alle Richtungen aus, die sogenannte Streustrahlung.

3.2.2.2. Apparativer Aufbau

Die verwendete Meßanordnung entspricht der von Hofmann und Emeis entwickelten Apparatur (Abbildung 3.3).

Als Meßlicht dient das von eine Leuchtdiode emittierte Licht der Wellenlänge 820 nm (Hitachi HLR 60R), das auf eine Küvette mit einer Schichtdicke von 10 mm fokussiert wird. Das von der Probe in der Küvette ausgesandte Streulicht fällt aufgrund einer Ringblende nur im Winkelbereich von 14° bis 18° auf zwei Fresnellinsen und wird von diesen auf den Detektor (großflächige PIN-Diode) fokussiert. Die erhaltenen Signale werden elektronisch verstärkt und mit einem Digitaloszilloskop (Nicolet 4094 C) aufgezeichnet. Die Speicherung der Daten erfolgt mit Hilfe eines Computers (Pyramid). Im Verlauf dieser Arbeit wurde das Digitaloszilloskop Nicolet 4094 C durch ein Digitalspeicheroszilloskop Nicolet 420 ersetzt, das den Einsatz des Computers an der Meßanordnung erübrigte.


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Abbildung 3.3: Messung der kinetischen Lichtstreuung
Schematische Darstellung der Apparatur, LED: Leuchtdiode, UV: UV-Blitz, RB: Ringblende, FL: Fresnellinse

Für die Intensität des Streulichts I(Q) ist die Rayleigh-Debye Näherung anzunehmen, mit den Brechungsindices n und no der streuenden Teilchen und der Pufferlösung, in der die streuenden Teilchen gelöst sind sowie mit dem Volumen V der Teilchen und einer Streufunktion P(Q), die von der Form der streuenden Teilchen abhängt.

3.2.2.3. Versuchsdurchführung

SP-A und Liposomen werden in der Küvette in Puffer suspendiert und durch Calcium zur Reaktion gebracht. Der Reaktionsstart kann entweder durch Calciumzugabe von Hand oder durch Freisetzung von Calcium aus einem photolabilen Chelator DM-Nitrophen mit Hilfe eines UV-Blitzes erfolgen (UV-Blitz: JLM-E, Rapp, Optoelektronik, Hamburg, bei Verwendung maximaler Ladespannung: 385 V, max. Energie pro Puls: 257 J). Vor Beginn der Messung wird die Differenz zwischen Streulicht und Meßlicht auf Null abgeglichen. Daher werden im Verlauf der Messung nur Intensitätsänderungen registriert, die auf eine Veränderung der Probe zurückzuführen sind.


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Zur Untersuchung von Liposomen, deren Brechungsindex sich nur geringfügig von dem des Puffers unterscheidet und deren Durchmesser unter der Wellenlänge des anregenden Lichtes liegt, gilt für die Intensität des Streulichts (DeltaIS, gemessen in Volt) in erster Näherung die Rayleigh-Debye-Näherung (Abbildung 3.3). Bei den verwendeten Meßbedingungen und der Beobachtung kleiner Aggregate wird die Intensität des gestreuten Lichts durch V² dominiert. Die Bildung von Aggregaten aus N Liposomen erhöht das Streulicht proportional zu N², während gleichzeitig die Gesamtzahl der streuenden Teilchen proportional zu 1/N abnimmt. Damit erweisen sich die Lichtstreusignale als Monitor für die durchschnittliche Zahl der Liposomen pro Aggregat.

3.2.2.4. Caged Calcium

Die Messung der calciumabhängigen Reaktion zwischen SP-A und Liposomen mit hoher Zeitauflösung erfordert einen störungsfreien Reaktionsstart. Dazu verwendet man einen photolabilen, inerten Calciumchelator, DM-Nitrophen. Dieser komplexiert im Puffer vorhandenes und ggf. zugesetztes Calcium. Bei Photolyse mit einem UV-Blitz sinkt die Affinität des Ca2+/DM-Nitrophen-Komplexes (caged Calcium) von 5 * 10-9 M auf 3 * 10-3 M, so daß Ca2+-Ionen schnell und homogen in die Lösung abgegeben werden . So kann die Interaktion zwischen SP-A und Liposomen ohne Störung des Systems durch Rühren etc. gestartet werden.

3.2.3. Resonant Mirror Spektroskopie

Die Resonant Mirror Spektroskopie gehört zu einer Gruppe spektroskopischer Oberflächenmethoden, die sich in den letzten Jahren etabliert haben. Der Vorteil der Verwendung von Oberflächenmethoden liegt in der Verringerung der benötigten Probenmengen des mühevoll präparierten Proteins. Man unterscheidet zwischen der Plasmonenresonanzspektroskopie (surface plasmon resonance) mit einer Goldschicht an der Oberfläche und der Resonant Mirror Spektroskopie, die einen Wellenleiter verwendet. Beide Methoden beruhen auf dem evaneszenten Feld, das an einer totalreflektierenden Oberfläche auftritt.


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3.2.3.1. Meßprinzip

Das zu den Messungen verwendete Gerät FPC-0001 der Firma Affinity Sensors erfordert Küvetten mit einem Volumen von max. 250 µl, auf deren Quarzboden verschiedene Schichten aufgedampft sind.

Aus einem Dioden-Laser fällt linear polarisiertes Licht der Wellenlänge 670 nm im Winkelbereich zwischen 8° und 12° auf den Boden der Küvette (Abbildung 3.4). Beim Eintritt des Lichtstrahls in den Quarzblock und beim Übergang vom optisch dichteren Quarzblock in die optisch dünnere Kopplungsschicht findet Brechung statt. Ab einem bestimmten Winkel, dem sog. kritischen Winkel, erfolgt Totalreflektion und die Lichtwellen werden zurückgeworfen.

Das elektrische Feld der reflektierten Lichtwelle setzt sich innerhalb des optisch dünneren Mediums fort. Das Feld nimmt exponentiell ab und wird als Evaneszenzfeld bezeichnet. Die auf dem Quarz befindliche optische Kopplungsschicht ist in ihrer Dicke etwa so groß wie die Durchdringungsfähigkeit des evaneszenten Feldes. Die Totalreflektion an der Grenzfläche zwischen der Quarzschicht und der optischen Kopplungsschicht erfolgt nicht vollständig. Denn ein Teil des Lichtes setzt sich durch die optische Kopplungsschicht fort und gelangt in den Wellenleiter, der einen hohen Brechungsindex aufweist. In diesem setzt sich das Licht durch Totalreflektion fort und baut wiederum ein Evaneszenzfeld auf.

Das Auftreten von Totalreflektion im Wellenleiter ist unter anderem abhängig vom Einstrahlwinkel, der Schichtdicke des Wellenleiters, seines Brechungsindexes sowie des Brechungsindex in der Region des evaneszenten Feldes, der Sensorschicht. Die Sensorschicht hat eine Dicke von etwa 250 nm, so daß nur Reaktionen beobachtet werden können, die direkt an der Oberfläche ablaufen.

Durch die Kopplung von Proteinen, z.B. SP-A, an die Sensoroberfläche und deren Interaktion mit Liposomen, verändert sich der Brechungsindex in der Sensorschicht oberhalb des Wellenleiters und damit der Winkel, in dem Licht eingestrahlt werden muß, damit Totalreflektion im Wellenleiter stattfindet.

Aus dem Wellenleiter austretendes Licht ist -im Gegensatz zu direkt reflektiertem Licht- in seiner Polarisationsrichtung um 90° gedreht. Das aus dem Wellenleiter austretende Licht wird am Detektor registriert. Durch einen Rückkopplungsmechanismus wird der Winkel ermittelt, unter dem das Licht in die Leiterschicht gelangt ist. Meßgröße ist der sogenannte Resonanzwinkel, der bei


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konstant bleibendem Versuchsaufbau nur von Änderungen des Brechungsindex in der Sensorschicht abhängt.

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Resonant Mirror Spektroskopie

3.2.3.2. Versuchsdurchführung

Die Oberfläche der zu den Messungen verwendeten Küvetten, d.h. der Wellenleiter, ist in unterschiedlichen Ausführungen kommerziell erhältlich. Zur Durchführung der Versuche wurde das Protein mit dem homobifunktionellen Crosslinker Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS³) auf einer planaren Aminosilanoberfläche immobilisiert. Die Kopplung von SP-A, wie auch alle Messungen, wurden, soweit nicht anders beschrieben, bei 15 °C und einer Rührereinstellung von 50 (halbmaximale Geschwindigkeit) durchgeführt.

SP-A wurde nach der Präparation in Tris-Puffer gelagert. Da die Immobilisation über Aminogruppen erfolgte, war es erforderlich unter Verwendung eines Mikrokonzentrators (Microcon-100, Amicon), Tris- gegen Phosphatpuffer auszutauschen.


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Mit dem verwendeten 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,8 wurde auch die zum Versuch eingesetzte Küvette vor Versuchsbeginn etwa 30 Minuten äquilibriert. Anschließend wurde die Küvettenoberfläche 10 Minuten mit 200 µl 1 mM BS³ aktiviert und fünfmal mit je 200 µl Phosphatpuffer gewaschen. Nach Zugabe des umgepufferten SP-A beobachtete man einen Anstieg des Resonanzwinkels (Abbildung 3.5). Die Kopplungsreaktion wurde über einen Zeitraum von ca. 10 Minuten durchgeführt. Zum Reaktionsstop wurde die Oberfläche fünfmal mit je 200 µl Phosphatpuffer gewaschen.

Unbesetzte Bindungsstellen wurden mit 1 M Ethanolamin, pH 8,3 blockiert. Zum Abschluß der Kopplungsreaktion wurde die Küvette mit immobilisiertem SP-A fünfmal mit 200 µl Phosphatpuffer und fünfmal mit 200 µl 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA (Meßpuffer) gewaschen.

Nach der Kopplung des Proteins wurde die Reaktion zwischen SP-A und den in der Küvette suspendierten Liposomen durch Zugabe von Calciumchloridlösung gestartet. Aufgrund der Immobilisierung des Proteins und des raschen Abfalls des evaneszenten Feldes oberhalb des Wellenleiters ist die Resonant Mirror Spektroskopie eine geeignete Methode, um die Bindung von Liposomen unabhängig von der Aggregationsreaktion zu untersuchen.

Die durch Calciumionen induzierte Reaktion zwischen SP-A und Liposomen ist nach der Zugabe von Calciumchelatoren reversibel. Nach der Messung einer reversiblen Bindungsreaktion wurde häufig ein Waschschritt mit 10 mM EDTA, 10 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,4 durchgeführt, um Lipid- und Calciumreste zu entfernen und die unspezifische Bindung zu reduzieren. Das Detergenz wurde durch mehrmaliges Waschen mit dem Meßpuffer aus der Küvette entfernt.


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Abbildung 3.5: Kopplung von SP-A an die Küvettenoberfläche
Dargestellt sind die Meßdaten sowie das während der Messung aufgezeichnete Meßprotokoll.


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3.3. Methodenapplikation

Als Ausgangspunkt der Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen SP-A und Liposomen als Liganden diente der in der Literatur beschriebene Aggregationstest für natives SP-A . Analoge Trübungsmessungen wurden zur Kontrolle der Aktivität der SP-A Präparate durchgeführt. Dabei wird die Absorptionsänderung einer Probe aus SP-A und Liposomen bei 400 nm vor und nach Zugabe von millimolaren Calciumkonzentrationen gemessen. Kontrollversuche ohne SP-A oder mit höherer Konzentration an BSA zeigen, daß in Abwesenheit des Surfactantproteins keine Reaktion erfolgt (Abbildung 3.6). Zu allen beschriebenen Untersuchungen wurden, sofern nicht anders vermerkt, Liposomen verwendet, die die Zusammensetzung des natürlichen Lungensurfactants imitieren (sog. DPPC-Mix-Liposomen, bestehend aus 55% DPPC, 25% EiPC, 10% PG, 10% Cholesterin, Angaben in Gewichtsprozent). Es wurden Messungen mit SP-A-Präparaten aus Lungen von Ratte, Rind und Schaf durchgeführt.

Abbildung 3.6: SP-A vermittelte Liposomenaggregation in Photometrie und kinetischer Lichtstreuung
Einer Liposomensuspension in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA werden zunächst das Protein, anschließend 4,5 mM Calcium zugesetzt. Jede Zugabe ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die finale Konzentration beträgt 613 µM Lipid (50 nm DPPC-Mix-Liposomen), 10 nM SP-A und 333 nM BSA.


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3.3.1. Kinetische Lichtstreuung

Die Bedingungen der in der Küvette des Spektralphotometers durchgeführten Trübungsmessungen sind direkt auf die Lichtstreuapparatur übertragbar (Abbildung 3.6). Die kinetische Lichtstreuung ist analog zum Aggregationstest ein Monitor der gesamten Interaktion, d.h. bei manueller Zugabe von Calcium beobachtet man i. w. die SP-A induzierte Liposomenaggregation. Ein Vorteil der Lichtstreuung gegenüber der Photometrie ist

  1. die hohe zeitliche Auflösung der Signale und
  2. das geringere Probenvolumen (für die Photometrie werden minimal 400 µl Probe benötigt, für die Lichtstreuung nur 200 µl).

Um das in der hohen Zeitauflösung liegende Potential der Lichtstreuung zu nutzen, ist allerdings eine Modifikation des Aggregationstests erforderlich. Durch die Störung des Systems bei manueller Calciumzugabe ist eine Zeitauflösung im Millisekundenbereich und die Detektion geringer Änderungen der Streulichtintensität nicht möglich. Daher wurde zur Messung der Startphase DM-Nitrophen als photolabiler Calciumchelator verwendet. Durch einen UV-Blitz werden Calciumionen aus der Verbindung freigesetzt und homogen in der Küvette verteilt, was einen Reaktionsstart in Suspension ermöglicht.

3.3.2. Resonant Mirror Spektroskopie

Als Methode zur Untersuchung der Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A wurde die Resonant Mirror Spektroskopie in die Messungen einbezogen. Ein Vorteil dieser Methode liegt in der äußerst geringen Menge des zu immobilisierenden Proteins (minimal 0,3 µg). Über den homobifunktionellen Crosslinker BS³ wird SP-A kovalent an die Aminosilanoberfläche gebunden und steht für mehrere Messungen zur Verfügung. Untersucht man die Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A mit der Resonant Mirror Spektroskopie, so ist die Meßgröße der Resonanzwinkel. Eine Zunahme des Resonanzwinkels indiziert eine Akkumulation des Reaktionspartners in der etwa 200 nm dicken Sensorschicht bei anderweitig konstant bleibenden Bedingungen. Die Ursache für die Veränderung des Resonanzwinkels ist eine Änderung des Brechungsindex, die im Meßsystem durch die Bindung der Liposomen an SP-A hervorgerufen werden kann.


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In der Literatur gibt es bisher keine Beschreibung von Anwendungen der Resonant Mirror Spektroskopie zur Untersuchung von SP-A-Interaktionen. Daher ist eine sorgfältige Kontrolle bezüglich der Funktionalität des immobilisierten Proteins und der Spezifität der gemessenen Signale erforderlich. Es wurden sowohl Küvetten ohne SP-A (blanke Oberfläche) als auch Küvetten, auf deren Oberfläche das Protein nach Immobilisation hitzedenaturiert wurde, in Kontrollexperimente einbezogen.

Dabei zeigt sich, daß die Versuchsbedingungen des Liposomenaggregationstests mit Zugabe von millimolaren Calciumkonzentrationen nicht ohne weiteres auf die Resonant Mirror Spektroskopie übertragbar sind. Millimolare Calciumkonzentrationen ermöglichen die Adsorption von Liposomen an der Küvettenoberfläche und führen zu unspezifischen Signalen (Abbildung 3.7).

Abbildung 3.7: Spezifische und unspezifische Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A bei Zugabe unterschiedlicher Calciumkonzentrationen
In jedem Versuch wurden in der Küvette 100 µl 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 vorgelegt (1) und 10 µl 10 mg/ml Liposomen (90% DPPC, 10% Cholesterin), in entsprechendem Puffer suspendiert, hinzugefügt (Liposomendurchmesser ca. 50 nm, Lipidkonzentration 1230 µM) (2). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 185 µM bzw. 1,85 mM Ca
2+ gestartet (3) und war reversibel bei Zugabe von 185 µM EDTA bzw. 9 mM EDTA (4). Anschließend wurde einmal mit 10 mM EDTA, 10 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,4 und mehrmals mit Puffer gewaschen (5). Die Versuchsdurchführung war für die drei dargestellten Küvetten identisch.


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Bei Verwendung geringer Calciumkonzentrationen im mikromolaren Bereich ist die SP-A-Spezifität der Reaktion hingegen deutlich erkennbar (Abbildung 3.7). Dargestellt sind jeweils zwei hintereinander durchgeführte Versuche mit verschiedenen Calciumkonzentrationen, die in drei verschiedenen Küvetten durchgeführt wurden. Bei Zugabe mikromolarer Calciumkonzentrationen (185 µM, erste Zugabe) erkennt man nur in Gegenwart von nativem SP-A ein Bindungssignal. Bei millimolaren Calciumkonzentrationen (1,85 mM, zweite Zugabe) tritt unabhängig von Anwesenheit oder Zustand des immobilisierten Proteins ein Signal auf, welches das durch SP-A hervorgerufene Signal überlagert. Betrachtet man eine Messung mit mikromolaren Calciumkonzentrationen genauer, so zeigen die in Abbildung 3.8 dargestellten Messungen jeweils den typischen Verlauf eines Experiments mit der Resonant Mirror Spektroskopie. Vorgelegt wurde im ersten Versuch eine Küvette mit nativem, immobilisierten SP-A und Puffer. Bei der Zugabe von Liposomen wird eine geringe Änderung des Brechungsindex registriert. Diese tritt vor allem bei hohen Liposomenkonzentrationen und bei der erstmaligen Benutzung der Küvetten mit gekoppeltem SP-A auf. Nach der Calciumzugabe kommt es zu einem starken Anstieg des Resonanzwinkels, der die Bindung der Liposomen an das SP-A zeigt.

Abbildung 3.8: Kontrollexperimente zur Resonant Mirror Spektroskopie
Reaktion von immobilisiertem Schaf-SP-A mit 676 µM Lipid (Durchmesser der Liposomen 50 nm, Zusammensetzung: 89% DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium.


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Die Liposomen werden durch das immobilisierte Protein an der Oberfläche der Küvette gebunden und führen zu einem Anstieg des Brechungsindex in der Sensorschicht. Die Zugabe von Calciumchelatoren, wie EDTA oder EGTA, führt zu einer raschen Abnahme des Resonanzwinkels, als Indikator der Dissoziation der Liposomen vom SP-A bei niedriger Calciumkonzentration. Durch erneute Zugabe von Calcium kann nach der Dissoziation erneut eine Assoziationsreaktion gestartet werden, die wiederum reversibel ist.

Das Auftreten reversibler Bindungssignale bei mikromolaren Calciumkonzentrationen ist charakteristisch für das ternäre System aus SP-A, Calcium und Liposomen. Fehlt einer der Reaktionspartner oder liegt denaturiertes SP-A vor, erfolgt keine Reaktion. Als Kriterium für die Qualität dieser Oberflächenmethode wurde die Proportionalität des Meßsignals zur Menge des an der Oberfläche immobilisierten Proteins unter konstanten Versuchsbedingungen untersucht. Es wurde eine Linearität zwischen Meßsignal und Kopplungssignal in einem breiten Konzentrationsbereich, unter Verwendung verschiedener SP-A Präparate, festgestellt (Abbildung 3.9).

Abbildung 3.9: Abhängigkeit des Meßsignals von der Menge des immobilisierten Proteins
Aufgetragen ist der durch die Kopplung von SP-A an die Küvettenoberfläche erhaltene Resonanzwinkel (Kopplungssignal) gegen den Resonanzwinkel, der für die jeweilige Küvette bei Reaktion mit durchschnittlich 387 µM Lipid (min. 363 µM, max. 418 µM Phosphatidylcholin, Liposomendurchmesser ca. 50 nm, 90% DPPC, 10% Cholesterin) nach Zugabe von 90 µM Calcium bestimmt wurde. Zur Kopplung wurden zwischen 0,3 µg und 30 µg SP-A eingesetzt.


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Die Reproduzierbarkeit der Experimente ist bei hintereinander durchgeführten Messungen gut (Abbildung 3.10), allerdings ist eine Alterung des immobilisierten Proteins bei mehrmaligen Messungen oder Lagerung zu beobachten.

Abbildung 3.10: Reproduzierbarkeit der Messungen
Dargestellt sind die Original-Meßdaten ohne Korrektur der Basislinie.
Links: Vier Messungen der Bindung von 200 nm DPPC-Mix-Liposomen (588 µM Lipid) an immobilisiertes Schaf-SP-A nach Zugabe von 87 µM Calcium.
Rechts: Immobilisiertes Ratten-SP-A reagiert mit Liposomen in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium. Die Reaktion ist reversibel durch Zugabe von 500 µM EDTA und kann durch Zugabe einer äquimolaren Calciummenge wieder gestartet werden.

Zur Kopplung wurden zwischen 0,3 µg und 30 µg Protein (0,5 pmol bis 5 pmol) eingesetzt. Die Kopplungsreaktion verläuft nicht vollständig. Aus der Höhe des Kopplungssignals kann man, nach den Angaben des Herstellers, lediglich näherungsweise die insgesamt immobilisierte Proteinmenge berechnen. Sie beträgt in den dargestellten Experimenten zwischen 0,01 und 0,04 pmol. Ein weiteres Problem der Messungen besteht darin, daß die Menge an aktivem, d.h. lipidbindendem Protein, an der Küvettenoberfläche nicht genau bekannt ist.


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Fri May 21 11:47:05 1999