Meyboom, Astrid: Untersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen

37

Kapitel 4. Ergebnisse

Eine charakteristische in vitro Reaktion von SP-A ist die calciumabhängige Liposomenaggregation. Diese ist als interessanter Einstieg zur Anwendung biophysikalischer Methoden bei der Untersuchung von Komponenten des Surfactants gewählt worden (siehe 3.3).

Die calciumabhängige Interaktion zwischen SP-A und Liposomen ist formal in zwei Teilreaktionen zerlegbar. Initial ist eine Bindungsreaktion der Liposomen an SP-A (bzw. umgekehrt) zu postulieren. Diese ist Voraussetzung für eine Aggregationsreaktion, d.h. Vernetzung der an SP-A gebundenen Liposomen.

Beide Schritte der Interaktion können in unterschiedlicher Weise die Anwesenheit von Calciumionen erfordern. Die Bindung von SP-A an Lipide (bzw. umgekehrt) wird in der Literatur sowohl als calciumabhängig als auch als calciumunabhängig dargestellt (siehe 2.3). Dieser Unterschied wird auf verschiedene Präparationsmethoden zurückgeführt . Zur SP-A induzierten Aggregation von Phospholipidliposomen ist nach den vorliegenden Erkenntnissen immer Calcium erforderlich, wenn auch in unterschiedlichen Konzentrationen.

Mit den biophysikalischen Methoden der Resonant Mirror Spektroskopie und der Lichtstreuung ist es möglich, Bindung und Aggregation als voneinander getrennte Vorgänge zu analysieren. Durch die Immobilisation von SP-A an der Küvettenoberfläche ist eine nachfolgende Aggregation nicht möglich, der Bindungsvorgang kann unabhängig von der Aggregation beobachtet werden.

4.1. Calciumabhängigkeit der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen

4.1.1. Messungen mit Resonant Mirror Spektroskopie

Die SP-A spezifische, durch mikromolare Calciumkonzentrationen ausgelöste Bindungsreaktion kann in Abhängigkeit von der freien Calciumkonzentration gesteuert werden (Abbildung 4.1). Schrittweises Hinzufügen von Calciumchelatoren während der Assoziationsphase einer Reaktion führt zunächst nicht zu einer Abnahme der


38

Signalamplitude (siehe zwei Zugaben zu Beginn der EGTA-Titration). Wahrscheinlich ist noch ausreichend Calcium für die Bindung der Liposomen an SP-A vorhanden.

Durch weitere Rücktitration von Calcium erfolgt dann eine sehr schnelle Dissoziationsreaktion. Wird das gesamte zugegebene Calcium durch eine äquimolare Menge an EGTA komplexiert, erhält man den Ausgangszustand. Das gemessene Signal sinkt dabei unter den Resonanzwinkel zu Beginn des Versuches, da die Liposomensuspension durch Zugabe der EGTA-Lösung verdünnt wird und dadurch eine geringfügige Beeinflussung des Brechungsindex der Lösung stattfindet.

Abbildung 4.1: Calciumabhängigkeit und Reversibilität der Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A
640 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 reagieren mit immobilisiertem Rinder-SP-A nach Zugabe von 50 µM Calcium. Die schrittweise Zugabe von EGTA führt zu einer schnellen Dissoziation der Liposomen. Der schraffierte Bereich des Resonant Mirror Signals ist im Detail vergrößert dargestellt.

Die beobachtete Reversibilität der von mikromolaren Ca2+-Konzentrationen abhängigen Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A bleibt über einen langen Zeitraum erhalten und ist charakteristisch für das native Protein. Auch nach mehreren


39

Stunden kann durch Zugabe von EGTA oder EDTA die Dissoziation der Liposomen ausgelöst werden. Das Meßsignal sinkt auf den Ausgangswert (Abbildung 4.2).

Abbildung 4.2: Reversibilität der Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A Langzeitversuch
Dargestellt sind Resonant Mirror Signale der Reaktion von 50 nm DPPC-Mix-Liposomen (Konzentration an Phosphatidylcholin: 2334 µM) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 mit immobilisiertem Schaf-SP-A nach Zugabe von 90 µM Calcium. Die Reaktion ist auch nach 1,5 Stunden noch reversibel.

4.1.2. Kinetische Lichtstreuung

Im Gegensatz zu Messungen mit der Resonant Mirror Spektroskopie, die ein Monitor für die Bindung von Liposomen an SP-A ist, zeigt die kinetische Lichtstreuung den gesamten Verlauf der Interaktion, d.h. Bindung und Aggregation der in Suspension befindlichen Reaktionspartner. Nach manueller Zugabe von Calcium manifestieren sich insbesondere die Aggregationssignale in einer starken Zunahme der Lichtstreuung (Abbildung 4.3), während die Liposomenbindung an SP-A durch die bei der Zugabe verursachten Störungen nicht gemessen werden kann.


40

Abbildung 4.3: Reversibilität der Aggregationsreaktion
Die Abbildung zeigt den Verlauf der Aggregation von 1350 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) und 12 nM Schaf-SP-A in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium, gemessen mit kinetischer Lichtstreuung. Durch Zugabe von EDTA ist die Reaktion vollständig reversibel. Die Halbwertszeit der ”Disaggregation“ liegt bei etwa 18 s, der schraffierte Bereich ist vergrößert im Detail dargestellt.

Die Zugabe von Calciumchelatoren (EDTA oder EGTA) im Überschuß führt zu einem Zerfall der Aggregate und die Signalintensität sinkt auf den Anfangswert. Die vollständige Reversibilität der Reaktion zeigt, daß eine Vergrößerung der Liposomen, z. B. durch SP-A induzierte Fusion, nicht stattfindet. Kontrollen ohne SP-A oder Calcium zeigen keine Änderungen der Lichtstreuung (siehe Abbildung 4.4).

Vergleicht man die Geschwindigkeit der Dissoziation der Liposomen vom immobilisierten SP-A mit dem Zerfall der Aggregate (Abbildung 4.1 und 4.3), so liegt die Halbwertszeit der Dissoziation bei etwa 0,3 s, während die Halbwertszeit der Disaggregation ca. 18 s beträgt. Die 0,3 s der Dissoziationsreaktion sind nur eine obere Grenze für den tatsächlichen Meßwert, da die Zeitauflösung des Geräts in dieser Größenordnung liegt.


41

4.1.3. Einfluß der Calciumkonzentration

Die Reaktion zwischen SP-A und Liposomen erfolgt im Bereich mikromolarer Calciumkonzentrationen. Eine genaue Quantifizierung der Calciumkonzentrationen in der Probe ist aus experimentellen Gründen schwierig, da Calciumkontaminationen in SP-A, Natriumchlorid, Wasser und Puffersubstanzen vorkommen. Photometrische Bestimmungen des Calciumgehalts mit Arsenazo III ergaben für die Calciumkonzentrationen im Puffer Werte um 20 µM. Eine Bestimmung mit Atomabsorptionsspektroskopie führte zu Konzentrationen von maximal 6 µM Calcium. Mit beiden Methoden ist die Festlegung des Nullwertes (calciumfreie Lösung) ein besonderes Problem. Daher sind Angaben zur freien Calciumkonzentration in Lösung stets mit Unsicherheiten behaftet.

Der Einfluß dieser geringen Calciumkonzentrationen in Puffer und Proben läßt sich im Lichtstreuexperiment deutlich zeigen: Bei Verwendung eines Puffers ohne Calciumchelator erfolgt ein deutlicher Anstieg der Lichtstreuintensität nach Zugabe von SP-A, der in einer Probe mit 20 µM EDTA im Puffer geringer ist. Umgekehrt erkennt man in der Probe ohne Calciumchelator nach anschließender Zugabe von 300 µM Calcium eine geringere Zunahme der Lichtstreuung bei der anschließenden Aggregationsreaktion im Vergleich zu der Liposomensuspension, die 20 µM EDTA enthält. Als Kontrollen sind Messungen ohne Liposomen sowie ohne SP-A dargestellt (Abbildung 4.4). Derartige Messungen waren ein erster Hinweis auf die Empfindlichkeit des Systems gegenüber Calciumionen.


42

Abbildung 4.4: Lichtstreusignale bei der Probenvorbereitung (A) und der Aggregationsreaktion nach Zugabe von 300 µM Calcium (B)
307 µM Lipid als 200 nm DPPC-Mix-Liposomen reagieren mit 9,1 nM SP-A unter verschiedenen Bedingungen nach Zugabe des Proteins (A) und Zugabe von 300 µM Calcium (B). Es wurden Versuche in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, pH 7,4 (ohne EDTA) und in einem Puffer mit 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 20 µM EDTA, pH 7,4 (mit EDTA) sowie Kontrollversuche in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, pH 7,4 ohne Lipid bzw. Protein durchgeführt, in denen anstelle von Protein oder Liposomen die entsprechende Flüssigkeitsmenge an Puffer ergänzt wurde.

Um unerwünschte Reaktionen im Bereich geringer Calciumkonzentrationen zu vermeiden, wurde in den Versuchen routinemäßig Puffer mit 50 µM EGTA eingesetzt, das Calciumverunreinigungen komplexiert. Untersucht man die Calciumabhängigkeit der Reaktion von SP-A und Liposomen in einem solchen Puffersystem und trägt die Amplituden von Bindungs- bzw. Aggregationssignalen nach 200 s bzw. 400 s gegen die zugesetzte Calciumkonzentration auf, so ergibt sich der in Abbildung 4.5 dargestellte Kurvenverlauf. Liposomenbindung und -aggregation werden bei Zugabe mikromolarer Calciumkonzentrationen sichtbar und zeigen einen ähnlichen Verlauf (Abbildung 4.5).


43

Abbildung 4.5: Bindungs- (A) und Aggregationssignale (B) in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration
Immobilisiertes Rinder-SP-A wurde mit 640 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 durch Zugabe von Calcium zur Reaktion gebracht. Die Signalamplituden nach 200 s (Resonant Mirror Spektroskopie, A) bzw. 400 s (Lichtstreuung, B) nach Zugabe von Calcium sind gegen die zugesetzte Calciumkonzentration aufgetragen. Bei der Lichtstreuung wurde das jeweils erhaltene Meßsignal durch die Grundstreuung der Probe dividiert, daher ergaben sich für die Einheiten relative Werte (r.E.). Die Punkte wurden mit einer Hill-Gleichung angepaßt, die Parameter sind in Tabelle 4.1 zusammengefaßt.

Tabelle 4.1:
Mathematische Anpassung der Bindungs- und Aggregationssignale in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration
Fit: f = [ A * (Ca2+) n ] / [ (Ca2+) n + K0,5 n ], A: Amplituden, n: Hill-Koeffizienten
Angegeben sind die erhaltenen Werte sowie die Standardabweichung.

Resonant Mirror Spektroskopie

Lichtstreuung

A

865 ± 13 [arc s]

4.5 ± 0.14 [rel. E.]

n

8.8 ± 1.2

5.5 ± 0.62

K0,5 [µM]

40 ± 0.6

62.7 ± 1.15


44

Etwas genauere quantitative Zusammenhänge zur Calciumabhängigkeit der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen erhält man aus Messungen mit der Resonant Mirror Spektroskopie.

Da das Protein kovalent an die Küvettenoberfläche gebunden ist, besteht die Möglichkeit, es mit hohen EGTA Konzentrationen zu waschen, um präparationsbedingt an das Protein gebundenes Calcium zu entfernen. Die Calciumkonzentration in der Küvette kann dann näherungsweise aus der Menge an Calcium und EGTA im Puffer und der zugegebenen Menge an Calcium berechnet werden.

Nimmt man die Calciumkonzentration im Puffer mit 5 µM (untere Grenze) und 20 µM (obere Grenze) an, so ergeben sich die in Abbildung 4.6 dargestellten Abhängigkeiten der Liposomenbindung von der freien Calciumkonzentration. Man erkennt einen sigmoiden Verlauf der Kurven, in Abhängigkeit von der abgeschätzten Calciumkonzentration erhält man einen Hill-Koeffizienten von 2,6 (Annahme: 5 µM, untere Grenze) bzw. 7,2 (Annahme 20 µM, obere Grenze), das auf eine Kooperativität der Untereinheiten des SP-A hinweist.

Der Umschlagsbereich zwischen Calciumkonzentrationen, bei denen eine Interaktion erfolgt und bei denen keine Reaktion beobachtet wird, ist mit 0 µM - 3 µM bzw. 9 µM - 16 µM eng. In Abhängigkeit von den vorausgesetzten Annahmen zum Calciumgehalt des Meßansatzes liegt die zur Bindung der Liposomen an immobilisiertes SP-A erforderliche halbmaximale Calciumkonzentration zwischen 8 µM und 22 µM.


45

Abbildung 4.6: Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A in Abhängigkeit von der freien Calciumkonzentration
Immobilisiertes Schaf-SP-A wurde mit EGTA gewaschen und mit 640 µM Lipid (DPPC-Mix-Liposomen, 200 nm) im 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 inkubiert. Die mit Resonant Mirror Spektroskopie aufgenommenen Signale 200 s nach Calciumzugabe sind gegen die freie Calciumkonzentration aufgetragen, die aus der Calciumverunreinigung im Puffer (A: 5 µM, B: 20 µM) und den zugesetzten EGTA und Calciumkonzentrationen berechnet wurde (Programm Chelator). Die Meßpunkte wurden mit der Hill-Gleichung gefittet, die erhaltenen Parameter sind in Tabelle 4.2 zusammengefaßt.

Tabelle 4.2:
Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A in Abhängigkeit von der freien Calciumkonzentration
Berechnung von Hill-Koeffizienten (n) und Werten für K0,5 für die Ca2+-Kooperativität von SP-A unter Annahme von 5 µM bzw. 20 µM Calciumverunreinigung im Puffer.
Fit: f = [ A * (Ca2+) n ] / [ (Ca2+) n + K0,5 n ], A: Amplituden, n: Hill-Koeffizienten
Angegeben sind die erhaltenen Werte und die Standardabweichung.

5 µM Calcium im Puffer

20 µM Calcium im Puffer

A [arc s]

413 ± 5

409 ± 5

n

2,6 ± 0,1

7,3 ± 0,5

K0,5 [µM]

7,7 ± 0,3

22,2 ± 0,3


46

4.1.4. Reaktion mit anderen zweiwertigen Kationen

Neben Calcium können auch andere zweiwertige Kationen, wie Strontium oder Barium eine Aggregationsreaktion zwischen SP-A und Liposomen induzieren . Messungen zeigen, daß auch die Bindung von Liposomen an SP-A durch mikromolare Konzentrationen an Strontium oder Barium ausgelöst werden kann (Abbildung 4.7). Die Amplitude nimmt bei konstanter Kationen- und Lipidkonzentration allerdings mit zunehmender Ordnungszahl des Ions ab. Mit Magnesium erfolgt selbst bei millimolaren Konzentrationen keine SP-A vermittelte Bindung der Liposomen an das Protein.

Abbildung 4.7: Abhängigkeit der Liposomenbindung von zweiwertigen Kationen
Dargestellt sind vier Messungen mit Resonant Mirror Spektroskopie. Immobilisiertem Schaf-SP-A mit 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 wurden 644 µM Lipid (89% DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol, 50 nm Liposomen) zugefügt. Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 50 µM zweiwertiger Kationen. Die Reaktion war nach Zugabe von 0,8 mM EDTA reversibel. Die Küvette wurde anschließend mehrmals mit Puffer gewaschen.


47

4.1.5. Beeinflussung der Reaktion durch Reduktionsmittel

Die Bindung von Liposomen an SP-A wurde in Gegenwart des Reduktionsmittels Dithiotreitol (DTT) untersucht. In der Literatur ist eine Änderung des Fluoreszenzspektrums von SP-A in Anwesenheit von Calcium beschrieben, die durch 1 mM DTT verstärkt wird . Dabei wurde festgestellt, daß die Bindung von Calcium durch DTT nicht beeinflußt wird. Die Autoren gehen allerdings davon aus, daß sich die Struktur des Komplexes aus Calcium und SP-A durch Reduktionsmittel verändert.

Messungen mit der Resonant Mirror Spektroskopie zeigen, daß die calciumabhängige Bindung der Liposomen an immobilisiertes SP-A in Anwesenheit von 1 mM DTT nicht und bei Zugabe von 10 mM DTT kaum beeinflußt wird (Abbildung 4.8). Dies gilt für verschiedene Lipidkonzentrationen.

Abbildung 4.8: Bindung von Liposomen an immobilisiertes Schaf-SP-A in Gegenwart von DTT
Die Reaktion zwischen 80 µM Lipid, 320 µM Lipid bzw. 1280 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen, höhere Signalintensität mit steigender Lipidkonzentration) und immobilisiertem SP-A wird durch Zugabe von 70 µM Ca
2+ gestartet. Die dargestellten Messungen wurden mit Resonant Mirror Spektroskopie nacheinander in einer Küvette durchgeführt.


48

4.2. Die Geschwindigkeit der Reaktion zwischen SP-A und Liposomen

Die Messung der calciumabhängigen Reaktion zwischen SP-A und Liposomen mit hoher Zeitauflösung ist nur bei störungsfreiem Reaktionsstart durch eine schnelle Calciumfreisetzung möglich. Die Photolyse von DM-Nitrophen, als photolabilem Calciumchelator, setzt nach einem UV-Blitz Calciumionen homogen in der Lösung frei und startet somit die Interaktion durch SP-A Aktivierung (Abbildung 4.9).

Abbildung 4.9: Interaktion zwischen SP-A und Liposomen nach Photolyse von caged Calcium
31 nM SP-A und 2000 µM Lipid (60 nM 50 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 7,5 µM EGTA, 78 µM Calcium, 100 µM DM-Nitrophen, pH 7,4, reagieren nach Photolyse von DM-Nitrophen mit einem UV-Blitz. Dargestellt sind Lichtstreusignale einer Messung, die mit zwei Oszilloskopen unterschiedlicher Zeitauflösung aufgenommen wurde. Unten ist der gesamte Verlauf der Aggregation dargestellt, oben dieselbe Messung mit höherer Zeitauflösung. Der Beginn der Interaktion wurde mit zwei Exponentialfunktionen
mathematisch angepaßt. Der Fit ist als schwarze, gestrichelte Linie dargestellt, er liegt genau auf den Meßwerten (durchgezogene, grüne Linie). Die Parameter für die mathematische Anpassung sind in Tabelle 4.3 (31 nM SP-A) aufgeführt.


49

Die Wechselwirkung zwischen SP-A und Liposomen zeigt sich in der Änderung des Lichtstreusignals. Untersucht man die ersten fünf Sekunden nach der Ca2+-Freisetzung genauer (Abbildung 4.9 obere Kurve), so stellt man fest, daß der Beginn der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen zwei kinetische Komponenten enthält.

Die langsamere Komponente ist mit einer großen Änderung der Lichtstreuintensität verbunden. Sie kann als Beginn der Aggregationsreaktion interpretiert werden. Diese ist über einen Zeitraum von mehreren Minuten zu beobachten (Abbildung 4.9, untere Kurve). Daneben erkennt man unmittelbar nach der Photolyse von caged Calcium ein schnelles Signal, das wahrscheinlich die rasch erfolgende Bindung des calciumaktivierten Proteins an die Liposomen widerspiegelt.

Bei geringen SP-A-Konzentrationen kann man eine Näherung für eine Reaktion pseudo erster Ordnung durchführen, die gilt, wenn die Konzentration eines Reaktanden (hier die Bindungsstellen an Liposomen) gegenüber der von aktivem SP-A groß ist und sich während der Reaktion nicht ändert. Für die initiale Reaktion zwischen SP-A an Liposomen erhält man Reaktionszeiten (1/k1) in der Größenordnung von 0,3 s bei den verwendeten nanomolaren Konzentrationen. Die genaue Anpassung durch zwei Exponentialfunktionen und das Fehlen einer Verzögerung nach dem Reaktionsstart zeigen, daß sich aktives SP-A sehr schnell bildet, an Liposomen bindet und anschließend die Aggregationsreaktion abläuft.

4.3. Variation der SP-A-Konzentration

Die zuvor (Abschnitt 4.2) anhand einer Messung dargestellte Analyse des Beginns der Interaktion und der Aggregationsreaktion wird im folgenden anhand getrennter Meßreihen mit kinetischer Lichtstreuung durchgeführt. Dabei diente die Photolyse von caged Calcium zur Charakterisierung der Interaktion zu Reaktionsbeginn und der Reaktionsstart durch manuelle Zugabe von Calcium zur Messung der Aggregationsreaktion.

Variiert man im photolytischen Reaktionsansatz mit caged Calcium die Konzentration an SP-A bei Konstanz aller übrigen Parameter, so zeigen alle Signale in den ersten fünf Sekunden der Reaktion den zuvor beschriebenen zweiphasigen Verlauf der Lichtstreusignale (Abbildung 4.10). Die Signale steigen mit zunehmender SP-A-Konzentration, ein Indiz für die Bildung von mehr bzw. größeren Aggregaten.


50

Abbildung 4.10: SP-A/Liposomen-Interaktion nach Photolyse von caged Calcium
Messungen mit kinetischer Lichtstreuung zwischen verschiedenen SP-A-Konzentrationen (gemäß Abbildung) und 2000 µM Lipid (entsprechend 60 nM 50 nm DPPC-Mix-Liposomen). Der Reaktionsstart in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 7,5 µM EGTA, 78 µM Calcium, 100 µM DM-Nitrophen, pH 7,4 erfolgt durch Photolyse von caged Calcium. Die Signale (durchgezogene, grüne Linien) wurden mit einer Summe aus zwei Exponentialfunktionen angepaßt (gestrichelte, schwarze Linien), die Werte finden sich in Tabelle 4.3.

Tabelle 4.3:
SP-A/Liposomen-Interaktion nach Photolyse von caged Calcium
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}, A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase, k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase
Die mathematische Anpassung wurde hier wie im folgenden mit dem Programm Sigma Plot 2.01 durchgeführt. Die Standardabweichung für die berechneten Parameter lag i.d.R. zwei Größenordnungen unter dem tabellierten Wert. Da hier eine beispielhafte Darstellung erfolgt, wurde auf die detaillierte Auflistung verzichtet.

c(SP-A) [nM]

A1 [V]

k1 [s-1]

A2 [V]

k2 [s-1]

8

0,01907

3,349

0,1596

0,1825

24

0,04507

3,881

0,3586

0,1616

31

0,05477

2,9030

0,3619

0,2169


51

Neben der Untersuchung der Interaktion mit hoher Zeitauflösung nach Blitzlichtphotolyse von caged Calcium wurde die Aggregationsreaktion über einen Zeitraum von mehreren Minuten in der kinetischen Lichtstreuung verfolgt. Dabei wird die Reaktion durch manuelle Calciumzugabe gestartet, so daß die ersten Sekunden der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen durch die Zugabe gestört und nicht meßbar sind. Die Bindungsreaktion ist aufgrund dieser Störungen nicht zu erkennen. Im folgenden Aggregationsprozeß werden daher vorwiegend SP-A/Liposomen-Komplexe untereinander oder mit weiteren Liposomen reagieren. Dieser Prozeß wird als eine Reaktion betrachtet (einphasiger Fit, siehe 4.4), im Gegensatz zu der durch Photolyse ausgelösten Interaktion, bei der Bindung und Aggregation ineinander übergehen (zweiphasiger Fit, siehe 4.3) und sich nicht durch einen einphasigen Reaktionsverlauf anpassen lassen. Registriert man über einen längeren Zeitraum eine Aggregationsreaktion nach manueller Calciumzugabe in einer Suspension von SP-A und Liposomen, so wird wie bei der Messung der Interaktion nach Photolyse von caged Calcium eine Abhängigkeit von der SP-A-Konzentration erkennbar (Abbildung 4.11). Höhere SP-A-Konzentrationen führen zu größeren Aggregationssignalen. Bei konstanter Lipid- und Calciumkonzentration ist das Ausmaß der Aggregation von der SP-A-Konzentration abhängig. Damit bestimmt die Menge des nach kurzer Zeit an die Liposomen gebundenen SP-A den Aggregationsprozeß.

Abbildung 4.11: Effekt verschiedener SP-A-Konzentrationen auf die Aggregationsreaktion
Verschiedene Konzentrationen Schaf-SP-A reagieren mit 640 µM Lipid (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) nach Zugabe von 50 µM Calcium in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4. Die mit kinetischer Lichtstreuung erhaltenen Meßsignale (durchgezogene, grüne Linien) lassen sich jeweils mit einer Exponentialfunktion anpassen (unterbrochene, schwarze Linie), deren Parameter in Tabelle 4.4 zusammengefaßt sind.


52

Tabelle 4.4:
Effekt verschiedener SP-A-Konzentrationen auf die Aggregationsreaktion
Fit: f(x)=A*{1-exp[(-k)*t]}, A: Amplitude, k: Geschwindigkeitskonstanten

c(SP-A)

2,4 nM

4,7 nM

6,9 nM

9,1 nM

A

2,9 V

4,4 V

5,1 V

5,5 V

k

0,0032 s-1

0,0044 s-1

0,0052 s-1

0,0061s-1

Eine mathematischer Anpassung der Lichtstreusignale mit einer Exponentialfunktion zeigt eine Zunahme der Amplituden und kon-Werte für die Aggregationsreaktion mit steigender SP-A-Konzentration. Die Vergrößerung der on-Rate erklärt sich durch die Zunahme der Konzentration an aktiviertem SP-A: Je mehr SP-A vorhanden ist, um so schneller kann es pro Zeiteinheit reagieren. Die verschiedenen Amplituden weisen darauf hin, daß die Größe und/oder Anzahl der Liposomen pro Aggregat von der Menge an SP-A in der Lösung abhängt.

4.4. Einfluß der Lipidkonzentration

4.4.1. Messungen mit kinetischer Lichtstreuung

Die Variation der Liposomenkonzentration führt zu ähnlichen Ergebnissen wie die Variation der SP-A-Konzentration. Bei Kurzzeitmessungen und Reaktionsstart durch Photolyse von caged Calcium erfolgt die Reaktion sehr rasch und die Amplitude nimmt mit zunehmender Liposomenkonzentration zu (Abbildung 4.12).


53

Abbildung 4.12: Interaktion von SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen nach Blitzlichtphotolyse von caged Calcium
Kinetische Lichtstreusignale der Reaktion von 20 nM Schaf-SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen (50 nm DPPC-Mix-Liposomen) nach Calciumfreisetzung aus DM-Nitrophen (Puffer 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 7,5 µM EGTA, pH 7,4, 78 µM Calcium, 100 µM DM-Nitrophen). Die Meßwerte (durchgezogene, grüne Linien) wurden durch zwei Exponentialfunktionen angepaßt, deren Parameter in Tabelle 4.5 zusammengefaßt sind (dargestellt als unterbrochene, schwarze Linien).

Tabelle 4.5:
Interaktion von SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen nach Blitzlichtphotolyse von caged Calcium
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}
A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase
k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase

c(Lipid)

[µM]

A1

[V]

k1

[s-1]

A2

[V]

k2

[s-1]

345

0,0049

4,106

0,1088

0,0382

693

0,0093

3,413

0,1351

0,0646

2080

0,0294

3,525

0,1639

0,2305

3465

0,0349

2,992

0,1736

0,3004


54

Auch bei der Variation der Liposomenkonzentration ist eine mathematische Anpassung mit einer Summe von zwei Exponentialfunktionen zur Beschreibung von Bindung und Aggregation möglich.

Verfolgt man nach manueller Calciumzugabe die Aggregation bei konstanter SP-A- und Lipidkonzentration über einen längeren Zeitraum, so ist eine Abhängigkeit von der Lipidkonzentration gegeben (Abbildung 4.13). Paßt man die erhaltenen Meßsignale mit einer Exponentialfunktion für die Aggregationsreaktion an, so erhält man für eine Zunahme der Konzentration an Liposomen einen Anstieg der apparenten Geschwindigkeitskonstanten, da mit steigender Liposomenkonzentration auch die Geschwindigkeit für die SP-A Bindung und Aggregation zunimmt. Außerdem ist eine Zunahme der Amplitude bei steigender Liposomenkonzentration zu erkennen, bis die SP-A-Konzentration die Aggregationsreaktion limitiert.

Abbildung 4.13: Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen auf die Aggregationsreaktion
In der kinetischen Lichtstreuung wird die Reaktion von 4,5 nM Ratten-SP-A mit verschiedenen Lipidkonzentrationen (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 nach Zugabe von 50 µM Calcium gestartet und über einen Zeitbereich von mehreren Minuten verfolgt. Die Meßsignale (durchgezogene, grüne Linien) werden mit einer Exponentialfunktion (dargestellt als unterbrochene, schwarze Linien) angepaßt, deren Werte in Tabelle 4.6 zusammengefaßt sind.


55

Tabelle 4.6:
Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen auf die Aggregationsreaktion
Fit: f(x)=A*{1-exp[(-k)*t]}
A: Amplitude, k: Geschwindigkeitskonstanten

c(Lipid) [µM]

80

130

320

640

1280

A [V]

2,72

3,81

4,56

4,20

4,30

k [s-1]

0,0005

0,0009

0,0011

0,0015

0,0021

4.4.2. Messungen mit Resonant Mirror Spektroskopie

Eine Variation der Liposomenkonzentration ist auch bei Messungen mit immobilisiertem SP-A möglich. Abbildung 4.14 zeigt eine Meßreihe mit sechs verschiedenen Lipidkonzentrationen.

Abbildung 4.14: Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A bei verschiedenen Lipidkonzentrationen
Reaktionsstart zwischen immobilisiertem Schaf-SP-A und 50 nm Liposomen aus 80% DPPC, 10% Cholesterin, 10% a-Tocopherol, suspendiert in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EDTA, pH 7,4, durch Zugabe von 91 µM Calcium. Die Parameter für die mathematische Anpassung der mit Resonant Mirror Spektroskopie erhaltenen Signale (durchgezogene, grüne Linien) sind in Tabelle 4.7 zusammengefaßt, die Funktionen als unterbrochene, schwarze Linien dargestellt.


56

Tabelle 4.7:
Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A bei verschiedenen Lipidkonzentrationen
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}, A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase, k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase

c(Lipid) [µM]

A1 [arc s]

k1 [s-1]

A2 [arc s]

k2 [s-1]

72

89

0,0826

362

0,0039

103

142

0,1144

373

0,0046

223

196

0,1577

409

0,0068

400

284

0,2496

454

0,0091

666

389

0,2928

489

0,0101

1160

461

0,4308

508

0,0096

Zu jeder Messung wurde eine Probe mit einer anderen Lipidkonzentration verwendet und durch Zugabe von Calcium gestartet. Dabei steigt das Meßsignal mit zunehmender Konzentration an Lipid bzw. Liposomen. Eine Anpassung ist bei Messungen bis 250 s durch einen zweiphasigen Fit möglich. Mit zunehmender Meßzeit wird eine mathematische Anpassung der Signale schwieriger und ungenauer. Die Reaktionsgeschwindigkeit der ersten Phase variiert nur gering mit der Liposomenkonzentration. Die Amplituden beider Phasen steigen mit zunehmender Liposomenkonzentration, wodurch eine dichtere Belegung der Oberfläche mit Liposomen bei zunehmender Lipidkonzentration angezeigt wird.

Sind an einer Küvettenoberfläche sehr viele SP-A Moleküle immobilisiert und werden große Liganden (Liposomen mit einem Durchmesser von 200 nm) verwendet, ist eine Überladung der Oberfläche zu vermeiden. Sonst kann es dazu kommen, daß beim Einsatz verschiedener Konzentrationen bereits die kleinste eingesetzte Lipidmenge ausreicht, um im Gleichgewicht die gesamte Küvettenoberfläche zu besetzen. Dann erhält man in der Summe der Amplituden beider Phasen einen konstanten Wert, der die maximal mögliche Belegung der Oberfläche mit Liposomen anzeigt (Abbildung 4.15). Bei einer solchen Messung ist eine Auswertung schwierig und wenn überhaupt, ist nur die Anfangskinetik auswertbar.


57

Abbildung 4.15: Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A - Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen bei Immobilisation von viel SP-A und Verwendung großer Liganden
Immobilisiertes Ratten-SP-A reagiert mit verschiedenen Lipidkonzentrationen (200 nm DPPC-Mix-Liposomen) in 100 mM NaCl, 50 µM EGTA, 5 mM Tris, pH 7,4 nach Zugabe von 90 µM Calcium. Die mit Resonant Mirror Spektroskopie erhaltenen Meßsignale (durchgezogene, grüne Linien) wurden mit zwei Exponentialfunktionen angepaßt, deren Parameter in Tabelle 4.8 zusammengefaßt sind. In der Graphik sind die Funktionen durch schwarze, gestrichelte Linien dargestellt.

Tabelle 4.8:
Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A - Effekt verschiedener Lipidkonzentrationen bei Immobilisation von viel SP-A und Verwendung großer Liganden
Fit: f(t)=A1*{1-exp[(-k1)*t]}+{A2*[1-exp[(-k2)*t]]}, mit A1, A2: Amplituden der ersten und zweiten Phase, k1, k2: Geschwindigkeitskonstanten der ersten und zweiten Phase

c(Lipid) [µM]

A1 [arc s]

k1 [s-1]

A2 [arc s]

k2 [s-1]

160

337

0,0449

431

0,0029

320

407

0,0751

310

0,0054

640

515

0,1050

269

0,0061

1280

587

0,1719

234

0,0082

2560

668

0,1925

180

0,0095


58

Zur Bewertung der Gleichgewichtseinstellung wurden Messungen bei Variation der Lipidkonzentration über einen langen Zeitraum durchgeführt (4000 s - 6000 s) (Abbildung 4.16).

Abbildung 4.16: Reaktion von DPPC-Mix-Liposomen unterschiedlicher Konzentration mit immobilisiertem Schaf-SP-A zur Bestimmung der Gleichgewichtsamplitude
Die angegebenen Lipidkonzentrationen beziehen sich auf den Gehalt der Liposomen (Durchmesser ca. 50 nm) an Phosphatidylcholin. Die Reaktion wurde in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 durchgeführt und durch Zugabe von 91 µM Calcium gestartet.

Zur Auswertung dient dann die Gleichgewichtsamplitude zwischen gebundenen und freien Liposomen bei unterschiedlichen Konzentrationen. Stellt man diese in einer dem Scatchard-Plot ähnlichen Auftragung gegen den Quotienten aus Amplitude und Liposomenkonzentration dar, kann man aus der Steigung die Dissoziationskonstante ermitteln (Abbildung 4.17). Sie beträgt für DPPC-Mix-Liposomen ca. 2,9 µM (Mittelwert aus 2 Messungen, 2,8 µM und 3 µM) und für DPPC-Liposomen 4,9 µM ± 0,98 µM (Mittelwert und Standardabweichung aus 5 Messungen), bezogen auf den Gehalt der Liposomen an Phosphatidylcholin.


59

Abbildung 4.17: Bestimmung einer apparenten Dissoziationskonstante für den SP-A/Liposomen Komplex
Die Darstellung ist an einen Scatchard-Plot angelehnt, d.h. das Signal nach der Gleichgewichtseinstellung dividiert durch die Lipidkonzentration (R
eq/conc) wird gegen die Gleichgewichtsamplitude (Req) aufgetragen. Die Steigung der Regressionsgeraden ist - KA=1/KD, KD = 2,8 µM, r²=0,9212. Die Lage des 95% Konfidenzintervalls ist im gepunkteten Kurvenpaar dargestellt.

4.5. Reaktion von SP-A mit verschiedenen Phospholipiden

Während SP-A Präparate verschiedener Spezies (Ratte, Schaf, Rind) keine Unterschiede im Bindungs- und Aggregationsverhalten zeigen, sind beide Reaktionen im hohen Ausmaß vom verwendeten Lipid abhängig. Eine Übersicht über die verwendeten Lipide befindet sich im Chemikalienverzeichnis.

4.5.1. Vergleich zwischen DPPC und POPC

Die Lipidspezifität der Interaktion zeigt sich besonders deutlich im Vergleich von Liposomen, die neben 10% Cholesterin zu 90% aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) bzw. Phosphatidyloleoylcholin (POPC) bestehen (Abbildung 4.18).


60

Abbildung 4.18: Unterschiede zwischen den Wechselwirkungen von SP-A mit DPPC- bzw. POPC-Liposomen
Oben: Zeitverlauf von Lichtstreusignalen in einer Suspension von Liposomen, Schaf-SP-A und caged Calcium (Ca
2+/DM-Nitrophen) bei Start durch Photolyse von caged Calcium. Zusammensetzung der Liposomen: 90% DPPC oder POPC, 10% Cholesterin, die Konzentration an SP-A beträgt 20 nM, die an Lipid 1885 µM (60 nM Liposomen, Durchmesser ca. 50 nm), Puffer: 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 40 µM Ca2+, 8 µM EGTA, 102 µM DM-Nitrophen, pH 7,4. Im Inset ist der Reaktionsbeginn im Detail dargestellt.
Unten: Zeitverlauf der Resonant Mirror Signale bei Bindung von 20 nM DPPC- oder POPC-Liposomen (s.o.) an immobilisiertes Schaf-SP-A. Die Reaktion in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 wurde durch Zugabe von 90 µM Calcium gestartet. Im Inset ist der Beginn der Reaktion dargestellt.


61

Untersucht man die Reaktion in der Lichtstreuung unmittelbar nach Reaktionsstart durch Photolyse von caged Calcium und registriert man den Verlauf der Aggregationsreaktion, so zeigt sich, daß die Interaktion zwischen SP-A und POPC-Liposomen von Anfang an nur zu halb so großen Lichtstreusignalen führt, wie die Interaktion zwischen SP-A und DPPC-Liposomen. Daher unterscheidet sich die Palmitoyloleoylform des Phosphatidylcholins in der Affinität, die sich in der Verminderung der Amplitude unter sonst identischen Bedingungen widerspiegelt. Die bei geringerer Zeitauflösung aufgenommenen Lichtstreusignale dokumentieren den Verlauf der Aggregationsreaktion. Dabei wird deutlich, daß der Beginn der Interaktion zwischen SP-A und den DPPC- bzw. POPC-Liposomen die Aggregation bestimmt. Der Aggregationsprozeß selbst trägt nicht viel zur Spezifität der Wechselwirkung bei. Die mit der Resonant Mirror Spektroskopie aufgenommenen Bindungssignale zeigen qualitativ dieselbe Differenz zwischen den beiden Phosphatidylcholinen. Daher wurde diese Methode zur genaueren Charakterisierung der Lipidspezifität von SP-A verwendet.

4.5.2. Die Interaktion mit verschiedenen Phosphatidylcholinen

Untersucht man die Bindung verschiedener Phosphatidylcholine an immobilisiertes SP-A, so zeigt sich, daß mit Liposomen aller verwendeten Choline eine calciumabhängige, SP-A spezifische, reversible Bindung erfolgt. Kontrollversuche mit denaturiertem SP-A haben ergeben, daß die unspezifischen Wechselwirkungen der verschiedenen Liposomen im Vergleich zum Bindungssignal gering sind.

Paßt man die erhaltenen Bindungssignale über den zuvor beschriebenen zweiphasigen Fit an, so erhält man für alle Choline (mit Ausnahme des Distearoylphosphatidylcholins, DSPC) eine ähnliche Reaktionsgeschwindigkeit in der ersten Phase der Reaktion (DPPC: 0,1586 s-1, EiPC: 0,1694 s-1, Dioleoylphosphatidylcholin, DOPC: 0,1563 s-1, Dilauroylphosphatidylcholin, DLPC: 0,2 s-1, POPC: 0,1608 s-1, Lysooleoyphosphatidylcholin, OPC: 0,1553 s-1 für Liposomenkonzentrationen um 20 nM, gegeben sind die Mittelwerte aus fünf Messungen bei einer Anpassung der Meßwerte der ersten 200 s). Nur DSPC zeigt bei diesen Konzentrationen gegenüber allen anderen Cholinen eine deutlich verminderte Geschwindigkeit (DSPC: 0,096 s-1).

Größere Unterschiede beobachtet man hingegen bei der Amplitude des Meßsignals zwischen den gemessenen Cholinen (Abbildung 4.19). Dies zeigt einen Einfluß der Lipidzusammensetzung der Liposomen auf die Geschwindigkeit des Zerfalls der


62

SP-A/Lipid-Komplexe. Bei fünf unabhängig voneinander durchgeführten Messungen nahm die Amplitude des Signals in der Reihenfolge DSPC>DPPC>EiPC>DOPC >DLPC>POPC>OPC ab, wobei die Unterschiede zwischen DLPC und DOPC gering sind. Um die Amplituden besser miteinander vergleichen zu können, wurde die Amplitude der ersten Phase für DPPC auf 100% normiert. Dann ergaben sich für die anderen Phosphatidylcholine folgende Meßwerte: DSPC: 134, DPPC: 100, EiPC: 65, DOPC: 54, DLPC: 53, POPC: 32, OPC: 10.

Abbildung 4.19: Bindung verschiedener Phosphatidylcholin-Liposomen an immobilisiertes SP-A
Zur Messung mit Resonant Mirror Spektroskopie wurde Schaf-SP-A auf dem Sensorchip mit ca. 20 nM Liposomen (Durchmesser etwa 50 nm) aus verschiedenen Phosphatidylcholinen in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 inkubiert (Zusammensetzung der Liposomen: 80% Phospholipid -siehe Abbildung-, 10% Cholesterin, 10% a-Tocopherol). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 90 µM Calcium gestartet.


63

Bei der Untersuchung der Aggregationsreaktion mit der kinetischen Lichtstreuung erkennt man eine Analogie zur Bindungsreaktion. In Abbildung 4.20 fällt auf, daß die Reaktion mit DSPC und DPPC auch nach ca. 200 s weiterläuft, während bei den übrigen Liposomen nur noch eine geringe Veränderung der Signalamplitude zu erkennen ist.

Abbildung 4.20: SP-A vermitteltes Aggregationsverhalten verschiedener Phosphatidylcholin-Liposomen
Reaktion von 1280 µM Lipid (41 nM unterschiedliche Liposomen 80% Phosphatidylcholin, 10% Cholesterin, 10% a-Tocopherol, Durchmesser 50 nm) mit 7 nM Schaf-SP-A in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA nach Zugabe von 470 µM Calcium.


64

4.5.3. Bedeutung der Kopfgruppe der Phospholipide

Untersucht man Liposomen, die aus Surfactantlipiden mit unterschiedlicher Kopfgruppe zusammengesetzt sind, so zeigt sich bei jeder Messung die charakteristische Calciumabhängigkeit der Interaktion. Für alle Reaktionen ist Calcium erforderlich und bei Zugabe des Calciumchelators EDTA ist die Interaktion reversibel (Abbildung 4.21).

Es gibt keine eindeutige Präferenz für die Bindung der Phosphatidylcholinkopfgruppe an SP-A. Eine im Hinblick auf Geschwindigkeit und Affinität ähnliche Bindung zeigen Phosphatidylinositol (PI) und Sphingomyelin (SM). Liposomen, die allein Phosphatidylglycerol (PG) enthalten, binden deutlich schlechter als Liposomen mit anderen Phospholipid-Kopfgruppen. In Gemischen mit DPPC beeinträchtigt PG die Liposomenbindung jedoch nicht, wie der Vergleich zwischen DPPC-Mix-Liposomen mit DPPC-Liposomen (90% DPPC, 10% Cholesterin) zeigt. Im Vergleich zwischen Dipalmitoylphosphatidylserin (DPPS), Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) und DPPC ist die Wechselwirkung zwischen SP-A und DPPS am schwächsten, erkennbar am langsamen Anstieg der ersten Phase, während von den übrigen Phospholipiden mit gemischten Seitenketten Phosphatidylethanolamin (PE) die geringsten Bindungseigenschaften zeigt. Daß die Lipidbindung, neben der Kopfgruppe, auch von den Seitenketten und/oder der Ordnung der Kopfgruppen abhängig ist, zeigt sich beim Unterschied zwischen DPPG- und PG-Liposomen. Wie bei DPPC und PC erhöhen die beiden C16-Seitenketten die Affinität um ca. 50%.


65

Abbildung 4.21: Resonant Mirror Signale mit verschiedenen Phospholipid-Liposomen
Immobilisiertes Schaf-SP-A wurde mit verschiedenen Liposomen in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 inkubiert und durch Zugabe von 87 µM Calcium aktiviert. Es wurden ca. 590 µM Lipid (19 nM Liposomen, Durchmesser ca. 50 nm, 89% DPPS, DPPG, PE, PC, PG, PI, SM, DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol, DPPC-Mix-Liposomen) zur Reaktion gebracht. Die Rückreaktion erfolgte nach Zugabe von 400 µM EDTA.


66

4.6. Interaktion zwischen SP-A und Liposomen bei 37 °C

Um die Übertragbarkeit des Systems auf physiologische Temperaturen zu untersuchen, wurden Messungen mit gekoppeltem SP-A in der Resonant Mirror Technik der Liposomen-Interaktion bei 37 °C durchgeführt.

Dabei ergaben sich Probleme bei der Temperaturstabilität des immobilisierten Proteins auf der Küvettenoberfläche. Bei höheren Temperaturen nahm die Stabilität von SP-A ab, so daß mit der Küvette weniger Messungen durchgeführt werden konnten, als bei 15 °C. Um den Einfluß der Temperatur auf die Bindung vom Aktivitätsverlust unterscheiden zu können, wurde in allen dargestellten Resonant Mirror Experimenten eine Sequenz aus drei Versuchsreihen bei 15 °C, 37 °C und 15 °C durchgeführt.

Abbildung 4.22: Temperaturabhängigkeit der Liposomenbindung
320 µM DPPC-Mix-Liposomen (50 nm) suspendiert in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA, pH 7,4 binden bei 15 °C und 37 °C an immobilisiertes Schaf-SP-A nach Zugabe von 90 µM Calcium.

Dabei erfolgt sowohl bei 15 °C als auch bei 37 °C die durch mikromolare Calciumkonzentrationen induzierte Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A. Allerdings ist die Geschwindigkeit der Bindung bei 37 °C deutlich langsamer als bei 15 °C. Die steile Anstiegsphase nach der Zugabe von Calcium verringert sich von ca. 300 arc s bei 15 °C in den Messungen 1 und 3 auf etwa 100 arc s bei 37 °C (Abbildung 4.22).


67

Die Bindung ist reversibel und zeigt bei 15 °C wie bei 37 °C analoge Unterschiede zwischen DPPC- und POPC-Liposomen sowie eine entsprechende Abhängigkeit von der Calciumkonzentration (Abbildung 4.23).

Abbildung 4.23: Einfluß der Temperatur auf die Bindung von DPPC- und POPC-Liposomen an immobilisiertes SP-A
Ca. 1230 µM DPPC in 50 nm Liposomen (Zusammensetzung: 89% DPPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol) bzw. POPC in 50 nm Liposomen (Zusammensetzung: 89% POPC, 10% Cholesterin, 1% a-Tocopherol) in 100 µM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA reagieren nach Zugabe von 150 µM, 75 µM, 38 µM oder 16 µM Calcium (von rechts nach links) mit immobilisiertem Schaf-SP-A. Untereinander dargestellt sind jeweils drei nacheinander durchgeführte Meßreihen in einer Küvette mit Resonant Mirror Spektroskopie bei 15 °C, 37 °C und 15 °C (Messung 1, 2, 3). Die Reaktion ist durch äquimolare EDTA-Zugabe reversibel; zwischen den Einzelmessungen werden Waschschritte durchgeführt.


68

Sowohl bei POPC- als auch bei DPPC-Liposomen ist eine Verringerung der steilen Anstiegsphase bei 37 °C zu erkennen. Für DPPC-Bilayer liegt die Übergangstemperatur vom "festen" Gelzustand zur "fluiden" flüssigkristallinen Phase bei 41 °C. Durch die Zugabe von 10% Cholesterin ändert sich die Übergangstemperatur kaum. Bei der Betrachtung der Übergangstemperatur ist allerdings zu berücksichtigen, daß bei kleinen Liposomen (SUV) aus DPPC im Gegensatz zu lamellaren Strukturen kein Übergangszustand (Pre-Transition) zu messen ist, der Phasenübergang breiter wird und bei etwa 37 °C erfolgt, d.h. die Übergangstemperatur um etwa 4 °C sinkt . Bei POPC-Liposomen (Übergangstemperatur - 2 °C) liegt bei Temperaturen von 15 °C und 37 °C der flüssigkristalline Zustand vor.

Die Aggregation zeigt hingegen in der Anfangssteigung keine Unterschiede zwischen 37 °C und 15 °C, die Amplitude ist jedoch bei 37 °C geringer (Abbildung 4.24), was allerdings auch mit einer verminderten Aktivität des SP-A bei der höheren Temperatur erklärt werden kann.

Abbildung 4.24: Einfluß der Temperatur auf die Aggregationsreaktion
Aggregation von 50 nm Liposomen, Zusammensetzung 89% DPPC, 10% Cholesterin, 0,1% a-Tocopherol (ca. 640 µM Lipid) und 23 nM Schaf-SP-A in 100 mM NaCl, 5 mM Tris, 50 µM EGTA nach Zugabe von 73 µM Calcium.


[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [Bibliographie] [Anhang] [Danksagung] [Lebenslauf] [Selbständigkeitserklärung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri May 21 11:47:05 1999