Meyboom, Astrid: Untersuchungen zur Wechselwirkung von Surfactant Protein A mit Liposomen

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Kapitel 5. Diskussion

SP-A interagiert in der alveolären Hypophase mit verschiedenen Liganden, zu denen Lipide, Calcium, zelluläre Rezeptoren oder Kohlenhydrate als Bestandteile von Glykolipiden oder -proteinen zählen. Da SP-A in der alveolären Hypophase stets mit Phospholipiden assoziiert ist , sind die Wechselwirkungen von SP-A mit Lipiden Ausgangspunkt zur Untersuchung des Surfactant Systems mit biophysikalischen Methoden. Diese ermöglichen eine Unterscheidung zwischen der calciumabhängigen Bindung von Phospholipid-Liposomen und der Rolle von SP-A bei der Aggregation von Liposomen. Beide Prozesse sind in situ eng miteinander verknüpft und Bestandteile eines calciumabhängigen Gesamtprozesses. Zu diesem zählen die Bildung von tubulärem Myelin, die SP-A, SP-B und Calcium erfordert, die Inhibition der Sekretion von Phospholipiden und die Verstärkung der Aufnahme von Phospholipiden via Rezeptoren in Typ-II-Zellen.

5.1. Methodenapplikation

Ausgehend vom klassischen Aggregationstest wurden die Meßbedingungen für die Methoden Resonant Mirror Spektroskopie und Lichtstreuung untersucht. Dabei konnten mit beiden Techniken reversible Meßsignale bei mikromolaren Calciumkonzentrationen beobachtet werden. Die Verwendung mikromolarer Calciumkonzentrationen ist notwendig, um bei der Resonant Mirror Spektroskopie eine unspezifische Bindung der Liposomen auf der Küvettenoberfläche zu vermeiden. In diesem Konzentrationsbereich wird außerdem eine Selbstaggregation von SP-A verhindert. Diese konnte in der Lichtstreuung unter den gegebenen Versuchsbedingungen nicht beobachtet werden (Abbildung 4.9). Bei Zugabe von SP-A zu einer Pufferlösung ohne Lipid ist eine geringe Zunahme der Streuung zu beobachten, die sich bei Zugabe von Calcium nicht erhöht, so daß keine Indizien für eine Selbstaggregation vorlagen.

Ergebnisse von Ruano et al. bestätigen diesen Befund. Die halbmaximale Selbstaggregation erfolgt bei Calciumkonzentrationen von 2,4 mM für Schweine-SP-A und 0,7 mM für Hunde-SP-A. Damit erfordert die Selbstaggregation wesentlich höhere Calciumkonzentrationen, die z.T. nicht einmal in der alveolären Hypophase erreicht werden. Hier wurden Calciumkonzentration von etwa 1,5 mM gemessen . Daher ist davon auszugehen, daß die Selbstaggregation von SP-A von der Lipidbindung unabhängig ist und die Aggregation der Liposomen durch Selbstaggregation von SP-A


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weniger plausibel ist, als die der Vernetzung von Liposomen durch multivalente Bindung an SP-A.

Die Resonant Mirror Spektroskopie vermeidet durch die Fixierung der SP-A Moleküle auf dem Träger das Problem der Selbstaggregation. Der Versuch, die gekoppelten Proteinmoleküle am Träger durch Kraftfeldmikroskopie zu detektieren, scheiterte an der rauhen Oberfläche der Küvette. Eine Aussage über die Menge an nativem SP-A am Träger ist schwierig zu treffen und zudem von der Qualität der Proteinpräparation abhängig. Die gute Übereinstimmung der Meßergebnisse aus Lichtstreu- und Resonant Mirror-Versuchen spricht jedoch für die Funktionalität eines beachtlichen Proteinanteils nach der Immobilisierung. Ein Vorteil bei der Durchführung der Kopplung ist die Vermeidung eines direkten Kontaktes zwischen Protein und freiem Kopplungsreagenz. Die Oberfläche wird zunächst mit BS³ aktiviert, anschließend wird der nicht gebundene Anteil der Crosslinker durch Waschen mit Puffer entfernt und erst danach reagiert das Protein mit dem am Träger gebundenen Crosslinker. Daher ist die Reaktionswahrscheinlichkeit peripherer Aminogruppen des SP-A (Lysin-Reste) deutlich höher als die im Inneren des Proteins liegender und möglicherweise strukturbildender Aminogruppen.

5.2. Calciumabhängigkeit der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen

Die Bindung von Liposomen an immobilisiertes SP-A erfordert mikromolare Calciumkonzentrationen. Bei gleichen Calciumkonzentrationen führt SP-A auch zu einer Aggregation der Liposomen, die in der Lichtstreuung gemessen wurde.

Anhand der Ergebnisse wird ein Modell mit zwei verschiedenen molekularen Zuständen des Proteins postuliert:

Bei niedriger Calciumkonzentration (< 1 µM) liegt ein inaktiver Zustand vor, in dem die Lipidbindung herabgesetzt ist. Durch Calcium im mikromolaren Bereich wird das SP-A in einen aktiven Zustand überführt, in dem eine Wechselwirkung mit Liposomen erfolgt. Die Aktivierung setzt im SP-A Molekül vermutlich hydrophobe Phospholipid-Bindungsstellen frei, die ohne mikromolare Calciumkonzentrationen nicht zugänglich sind. Eine derartige calciumabhängige Konformationsänderung könnte sowohl Bindung als auch Aggregation von Liposomen im gleichen Bereich der Calciumkonzentration in einer geordneten Sequenz auslösen. Das Calciumion wirkt dabei als Schalter der SP-A/Liposomen-Interaktion in einem breiten Konzentrationsbereich von SP-A- und Lipidkonzentrationen und bei SP-A verschiedener Spezies (Rind, Ratte, Schaf). Die calciumabhängige Interaktion paßt gut zu einer Klasse von Calciumbindungsstellen in der Größenordnung von 10 µM . Die zwei verschiedenen Konformationen des


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SP-A-Moleküls in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration wurden anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Possmayer et al. beobachtet. Die Aufnahmen lassen eine aufgeweitete SP-A-Konformation im calciumfreien und eine schmale Konformation nach Calciumzugabe erkennen (Possmayer, pers. Mitteilung).

Es gibt in der Literatur aber auch Hinweise auf eine calciumunabhängige Lipidbindung des SP-A , .

Da die Versuche von King et al. in Gegenwart von 10 mM EDTA durchgeführt wurden, ist hier von einem durch die Komplexierung von Calciumverunreinigungen calciumfreien System auszugehen. Damit ist die Existenz von lipidassoziiertem SP-A im Gleichgewicht ohne Calcium wahrscheinlich.

Im Gegensatz dazu könnten die Ergebnisse von Casals Kontaminationen von Calcium in mikromolaren Konzentrationen enthalten, da ein Puffer mit 5 mM Tris und 150 mM NaCl ohne EDTA oder EGTA verwendet wurde. Hier ist ein Effekt möglich, wie er auch in dieser Arbeit beobachtet und in Abbildung 4.9 dargestellt ist (beginnende Aggregationsreaktion durch Calciumverunreinigungen in einem Puffer mit 5 mM Tris, 100 mM NaCl, ohne Calciumchelatoren). In der Veröffentlichung von Casals et al. 1993 wird angeführt, daß die physiologische NaCl-Konzentration von 100 mM bis 150 mM zur Interaktion zwischen Lipiden und Proteinen notwendig ist. Gleichzeitig berichten die Autoren über ein verändertes Fluoreszenzspektrum von SP-A in reinem Wasser gegenüber dem bei 100 mM bis 150 mM NaCl. Auch hier liegt die Vermutung nahe, daß Calciumkontaminationen im mikromolaren Bereich (<10 µM Ca2+) im Puffer in Gegenwart von Salz beide Phänomene (Lipidbindung und Fluoreszenzänderung) verursacht haben.

Eine Beeinflussung des Fluoreszenzspektrums von SP-A in Abwesenheit von Lipiden durch mikromolare Calciumkonzentrationen wurde von Sohma et al. gemessen .

Bezogen auf die Struktur der Untereinheiten bleibt es eine interessante Frage, wie die durch Calcium ausgelöste Strukturveränderung aussieht, die den beobachteten Effekt ergibt. Es ist charakteristisch für eine Reaktionsfolge aus Bindung und Aggregation, daß die Assoziation von Liposomen an SP-A sehr viel schneller erfolgt als die nachfolgende Aggregationsreaktion. Aus den Bindungsdaten kann ein Hill-Koeffizient mit hoher Kooperativität für Calcium berechnet werden. Die maximale Anzahl von n entspricht der Zahl wirksamer Untereinheiten. Die genaue Zahl der Bindungsstellen und deren Affinität für Calcium am SP-A Molekül ist unbekannt (nach Daten von Haagsman et al. sind dies zwei, deren Affinität bei 10 µM-1 und 0,7 mM-1 Calcium liegt ; nach Molekülmodellen in Analogie zum MBP ergibt sich eine Bindungsstelle pro Untereinheit). Der Hill-Koeffizient spricht in Übereinstimmung mit der komplexen multimeren SP-A Struktur für eine hohe Symmetrie der Untereinheiten.


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Mögliche Bindungsregionen für Lipide sind die Nacken und CRD-Region des Oktadekamers , , die eine blumenstraußartige Molekülstruktur bilden .

Durch die Zugabe von EGTA oder EDTA können Bindungs- und Aggregationsprozeß umgekehrt werden. Dabei wurde beobachtet, daß der Zerfall der Aggregate sehr viel langsamer erfolgt, als die Dissoziation der Liposomen von immobilisiertem SP-A (18 s vs. 0,3 s). Dies ist mit einem zweistufigen Modell konsistent, in dem die Aufhebung der SP-A/Liposomenbindung die Disaggregation auslöst. Da nur wenige SP-A Moleküle pro Liposom zu einer Aggregationsreaktion ausreichen, ist es wahrscheinlich, daß SP-A zwischen den Liposomen über einen Vesikel/SP-A/Vesikel-Mechanismus bi- oder multivalente Verknüpfungen herstellt. Dafür spricht, daß die Selbstaggregation von SP-A, die für eine Verknüpfung der Liposomen über SP-A Moleküle notwendig wäre, erst bei höheren Calciumkonzentrationen (>0,5 mM) einsetzt.

Die schnelle und vollständige Reversibilität der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen zeigt, daß durch SP-A keine Fusion der Lipidvesikel erfolgt. Dies stimmt mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen überein , , , die die Reversibilität der Aggregationsreaktion im photometrischen Aggregationstest bei millimolaren Calciumkonzentrationen beschrieben haben.

Neben Calcium sind auch andere zweiwertige Kationen, wie Strontium und Barium, in der Lage, die Liposomenbindung an SP-A zu induzieren. Magnesium führt weder zu einer Bindung noch zur nachfolgenden Aggregation der Liposomen (siehe Abbildung 4.7). Dies ist eine Bestätigung der Ergebnisse von Efrati et al., nach denen Calcium, Strontium oder Barium zu einer Aggregation erforderlich sind . Die Ionenspezifität unterstützt nach Einschätzung der Autoren die Hypothese einer direkten Protein-Kationen-Interaktion, da das Verhältnis von Masse zu Ladung bei Barium und Strontium ähnlich ist wie bei Calcium und die notwendige Flexibilität für eine Koordination durch Calciumbindungsstellen im Protein besteht. Diese Hypothese wird durch die in der Arbeit dargestellten Bindungsversuche bestätigt, bei denen SP-A nicht nur durch Calcium, sondern auch durch Strontium oder Barium in eine aktive, lipidbindende Konformation überführt werden konnte.

Der Einfluß der Reduktion von Disulfidbrücken des SP-A auf die Liposomenbindung war gering. Nach Sohma et al. zeigt sich anhand einer Verschiebung des Fluoreszenzmaximums eine Aufweitung der Konformation des SP-A . Da aber in den durch Sohma et al. durchgeführten Versuchen die Calciumbindung nicht beeinflußt wurde, ist


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zu vermuten, daß möglicherweise auch die Lipidbindung, welche hier als Monitor verwendet wurde, unbeeinflußt bleibt.

5.3. Geschwindigkeit der Reaktion zwischen Calcium und Liposomen

Die Wechselwirkung zwischen SP-A und Liposomen vollzieht sich überraschend schnell. Der Reaktionsstart durch Photolyse von caged Calcium erfordert einige Millisekunden, um Calcium aus dem Chelatorkomplex freizusetzen. Eine Interaktion zwischen SP-A und Liposomen erfolgt nach weniger als 1 s. Die kinetische Auswertung der Lichtstreusignale führt zu einer apparenten Geschwindigkeitskonstante von kon = 3 s-1 bei nanomolaren Konzentrationen der Reaktionspartner für die schnelle Komponente des Lichtstreusignals. Über die Geschwindigkeit der Reaktion zwischen SP-A und Liposomen liegen bisher in der Literatur keine vergleichbaren Messungen vor.

Eine mögliche Erklärung für die schnelle Reaktion zwischen SP-A und Liposomen liegt in der Annahme eines präformierten Komplexes. SP-A könnte zumindest teilweise über unspezifische Wechselwirkungen in Lösung mit Lipid assoziiert sein. Ein solcher präformierter Komplex zwischen SP-A und Liposomen, bei dem SP-A im Kontakt mit Lipiden vorliegt und sich zur beobachteten Bindung mit nachfolgender Aggregation nur noch ”umdrehen“ muß, könnte eine Ursache für die schnelle Interaktion mit fließendem Übergang zwischen Bindung und Aggregation bei der Wechselwirkung zwischen SP-A und Liposomen sein. Bei der Resonant Mirror Spektroskopie könnte dieser assoziierte Zustand durch den in die Küvette integrierten Rührer verhindert werden, der Fehler durch den Transport von Molekülen an die Oberfläche vermeiden soll. Dadurch werden Strömungen verursacht, die bei ungerührten Systemen fehlen. Durch eine calciuminduzierte Konformationsänderung im Protein wird eine feste Bindung zwischen Liposomen und SP-A ausgelöst, die auch im gerührten System stabil ist und nachfolgend zu einer Agggregation führt.

Ein solcher assoziierter Komplex könnte sich im Verlauf von Zentrifugationsexperimenten (24 - 36 h) stabilisieren und zur gemeinsamen Sedimentation von SP-A und Liposomen führen. Dies ist eine mögliche Erklärung dafür, daß von King et al. in Gegenwart von 10 mM EDTA Lipidbindung an SP-A beobachtet wurde . In diesen Versuchen ist von einer freien Calciumkonzentration im submikromolaren Bereich auszugehen.

Eine sequentielle Folge der Ereignisse bei der Interaktion zwischen SP-A und Liposomen wäre auch mit dem Besetzen von Calciumbindungsstellen unterschiedlicher Affinität erklärbar, die verschiedene Interaktionen zwischen Protein und Lipid hervor-


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rufen. Eine Bestätigung dieser Hypothese ist aber insofern schwierig, als daß es gelingen müßte, Calcium- und lipidfreies SP-A zu präparieren. Präzisere Aussagen werden auch durch die unbekannte Zahl von Bindungsstellen und deren Affinität für Calcium am SP-A Molekül erschwert.

5.4. Variation der SP-A-Konzentration

Die Erhöhung der SP-A-Konzentration führt in der kinetischen Lichtstreuung von Beginn an zu einer höheren Signalintensität. Die apparenten Geschwindigkeitskonstanten für die erste Phase der Reaktion nach der Photolyse von caged Calcium liegen bei 3 s-1 bei nanomolaren Konzentrationen der Reaktionspartner. Dies gilt sowohl für die Variation der SP-A- als auch der Liposomenkonzentration. Dabei konnte in der Initialphase der Reaktion keine Abhängigkeit von der Konzentration des variierten Reaktionspartners ermittelt werden. Die Reaktion zwischen SP-A und Liposomen erfolgt damit auffallend schnell. Als mögliche Ursache wurde bereits oben die Ausbildung eines präformiertes Komplexes zwischen SP-A und Lipiden erörtert.

Betrachtet man die zweite Phase der SP-A/Liposomen-Interaktion, die als Beginn der Aggregationsreaktion interpretiert wird, so steigen hier apparente Geschwindigkeitskonstanten und Amplituden mit zunehmender SP-A-Konzentration. Dies ist ein Indiz für die Bildung von mehr bzw. größeren Aggregaten und zeigt, daß das Protein den Aggregationsprozeß kontrolliert. Die Unterschiede der apparenten Geschwindigkeitskonstanten zwischen den Kurzzeitmessungen nach Photolyse (5 s) und den Langzeitmessungen (600 s) erklären sich aus dem beobachteten Zeitraum, in dem verschiedene Prozesse ablaufen. Während die Kurzzeitmessung nur den Beginn der Aggregationsreaktion erfaßt, geht dieser Zeitbereich bei der Langzeitmessung in dem durch die Calciumzugabe verursachten Rühren unter. Es ist zu beobachten, daß sich der komplizierte Aggregationsprozeß, der mehrere Reaktionen umfaßt (z.B. Bindung eines Liposoms an einen SP-A/Liposomen-Komplex, Bindung von zwei SP-A/Lipid-Komplexen aneinander, Bindung eines Liposoms an einen Komplex aus mehreren SP-A-Molekülen und Liposomen) mit einer einzigen Exponentialfunktion mathematisch anpassen läßt. Eine Erklärung dieser Beobachtung könnte darin bestehen, daß man i.w. nur einen Schritt des Aggregationsprozesses, die Verknüpfung zweier Liposomen über ein SP-A-Molekül beobachtet, der über einen Mechanismus pseudo erster Ordnung abläuft und geschwindigkeitsbestimmend ist.


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5.5. Einfluß der Lipidkonzentration

Bei konstanter SP-A- und Calciumkonzentration ist die Interaktion zwischen SP-A und Liposomen in einem weiten Konzentrationsbereich von der Konzentration an Liposomen abhängig. Die Kurz- und Langzeitmessungen in der Lichtstreuung zeigen einen ähnlichen Verlauf, wie die Signale bei Variation der SP-A-Konzentration.

Bei der Messung der Bindung verschiedener Lipidkonzentrationen an immobilisiertes SP-A mit der Resonant Mirror Spektroskopie beobachtet man einen zweiphasigen Reaktionsverlauf, der als initiale Besetzung der freien Bindungsstellen am SP-A und nachfolgenden Umlagerungsreaktionen interpretiert werden kann. Die Einstellung eines Gleichgewichts zwischen gebundenen und freien Liposomen dauert -in Abhängigkeit von der Konzentration- bis zu mehreren Stunden. Aus den Gleichgewichtsamplituden von Messungen mit verschiedenen Lipidkonzentrationen ist es möglich, die Dissoziationskonstante zwischen SP-A und Lipiden zu bestimmen. Bezieht man sich auf den gemessenen Gehalt der Liposomen an Phosphatidylcholin, so erhält man Dissoziationskonstanten für überwiegend DPPC-haltige Liposomen zwischen 3 µM und 5 µM (bei 15 °C). Dies liegt in der gleichen Größenordnung wie die durch King et al. aus Zentrifugationsexperimenten mit radioaktiv markiertem SP-A bestimmten Dissoziationskonstanten, die bei 37 °C mit 1 µM angegeben wurden. Schätzt man aus der Lipidkonzentration und der Liposomengröße die Liposomenkonzentration, so erhält man für den Komplex zwischen calciumaktiviertem SP-A- und DPPC-haltigen Liposomen eine nanomolare Affinität (Kd ca. 0,2 nM). Dieses Vorgehen erfordert die Voraussetzung von Liposomen als reagierende Einheiten, eine Annahme, die durch die vollständige Reversibilität und Reproduzierbarkeit der Reaktion zwischen SP-A und Liposomen gerechtfertigt ist.

5.6. Reaktion von SP-A mit verschiedenen Phospholipiden

Die Untersuchung verschiedenster Phospholipide mit unterschiedlichen Kopfgruppen und Fettsäureacylresten bestätigt die generelle Hypothese der calciumabhängigen Aktivierung von SP-A in eine zusätzlich lipidbindende Form SP-Â, die zu einer Liposomenaggregation führt.

Diese charakteristische Reaktionsfolge läßt sich bei allen untersuchten Phospholipiden durch mikromolare Calciumkonzentrationen auslösen und ist vollständig reversibel. Diese Ergebnisse sind ein weiterer Indikator für eine direkte Wechselwirkung zwischen speziellen Calciumbindungsstellen am SP-A und Calciumionen.


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Vergleicht man die Phospholipide DPPC und POPC, die sich nur durch eine Doppelbindung unterscheiden, so führt die ungesättigte Fettsäure von Beginn an zu einer Halbierung der Signalintensität und schließlich zu einer im gleichen Verhältnis verringerten Amplitude. Auch die Aggregationsreaktion zeigt vom Zeitpunkt der Aktivierung des SP-A durch Calcium analoges Verhalten (Abbildung 4.23). Daher können die Unterschiede nicht mit einer Beeinträchtigung des SP-A durch die Immobilisierung erklärt werden.

Untersucht man die Bindung weiterer Phosphatidylcholine an immobilisiertes SP-A, so unterscheiden sich die Reaktionsgeschwindigkeiten der ersten Phase bei einem zweiphasigen Fit über 200 s nur geringfügig. Abweichungen sind nur beim gesättigen Lipid DSPC festzustellen (-60%). Die Amplituden der ersten Reaktionsphase nehmen in charakteristischer Reihenfolge von DSPC, DPPC, EiPC, DLPC, DOPC, POPC, OPC ab.

Die unterschiedliche Bindung der verschiedenen Phosphatidylcholine durch SP-A spricht dafür, daß neben der Kopfgruppe (die für alle Lipide identisch ist) auch die Ordnung der Acylketten, d.h. deren Packungsdichte in den Liposomen bei der Bindung eine Rolle spielen.

Die unterschiedliche Affinität der verschiedenen Phosphatidylcholine zum SP-A ist auch in der Lichtstreuung festzustellen. Dabei zeigen nur DSPC und DPPC eine über längere Zeit ausgeprägte Aggregationsreaktion. Bei allen anderen Lipiden befindet sich die Reaktion nach ca. 200 s im Gleichgewicht. Diese Beobachtung zeigt die kausale Verknüpfung von Bindung und Aggregation, da die schwächere Bindung von Phosphatidylcholinen mit ungesättigten oder kurzkettigen Fettsäuren auch eine Verringerung (bzw. einen Stillstand) der Aggregation bewirkt, was eine verringerte Stabilität der Aggregate indiziert.

Vergleicht man unterschiedliche Lipidkopfgruppen miteinander, so zeigen PC, PI und SM ein ähnliches Bindungsverhalten. Apparente Geschwindigkeitskonstanten und Amplituden für vergleichbare Liposomen aus PE und PG sind deutlich geringer. Dies zeigt die Präferenz des Proteins für Phosphatidylcholin- (und ähnliche) Kopfgruppen.

Daß darüber hinaus, wie bereits beim Vergleich unterschiedlicher Phosphatidylcholine dargestellt wurde, eine Abhängigkeit der Lipidbindung des SP-A von der Natur der Fettsäuren besteht, zeigt sich im Vergleich von DPPG und PG Liposomen. Analog zu DPPC und PC erhöhen die beiden C16-Seitenketten die Affinität um etwa 50%. Eine derartige Vergrößerung der Amplitude beim Vergleich von DPPC und PC ist auch für den photometrischen Aggregationstest bei deutlich höheren Calciumkonzentrationen


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von Casals et al. gemessen worden . Dies zeigt, daß die hier verwendete geringe Calciumkonzentration keinen prinzipiellen Einfluß auf den Reaktionsprozeß hat und genauso als Auslöser der Interaktion dienen kann, wie eine Calciumkonzentration im millimolaren Bereich.

Insgesamt erlauben die Ergebnisse keine Aussage über eine spezifische Erkennung von Kopfgruppen oder Fettsäuren, sondern legen vielmehr nahe, daß beide Lipidcharakteristika für die Interaktion zwischen SP-A und Liposomen entscheidend sind und insbesondere die Packungsdichte bestimmter Kopfgruppen die Bindung beeinflußt. Die nur als relativ zu betrachtende Lipidspezifität wird auch durch die Ergebnisse von Casals et al. bestätigt, die aus ihren Untersuchungen schließen: "Die Interaktion von SP-A mit DPPC war ausgeprägter als die mit anderen Phospholipiden (mit derselben Acylkette und Tm aber verschiedenen Kopfgruppen) oder EiPC (mit derselben polaren Kopfgruppe aber verschiedenen Acylketten und Tm)". In dem von den Autoren publizierten Aggregationstest (Calciumkonzentration 5 mM) liegen die Meßwerte für DPPG-Liposomen geringfügig über denen für DPPC. DPPG-Liposomen zeigen allerdings nach Zugabe von Calcium eine höhere Aggregation in Abwesenheit von SP-A .

Für die Lipidbindung an SP-A wurde von Kuroki und Akino eine Spezifität für DPPC postuliert. Die Autoren beschreiben eine deutlich schwächere Bindung von radioaktiv markiertem SP-A an EiPC, immobilisiert auf Dünnschichtplatten, im Vergleich zu DPPC .

Trotz des vollständig anderen verwendeten Systems (Phospholipide adsorbiert an Silicagel auf Dünnschichtplatten im Gegensatz zu Liposomen in Lösung) und der deutlich höheren Calciumkonzentration (2 mM) ist die qualitative Aussage zu den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit ähnlich. Übereinstimmungen ergeben sich auch bei der starken Bindung von DSPC und der schwachen Bindung von DLPC.

Unterschiede in den Ergebnissen der Untersuchungen sind hingegen beim Vergleich der Kopfgruppen festzustellen: PG, PI, PE und PS binden kein SP-A, während SP-A -in Übereinstimmung mit den in dieser Arbeit dargestellten Ergebnissen- ähnlich gut an SM bindet, wie an DPPC. Mit großer Wahrscheinlichkeit sind die Unterschiede auf das von Kuroki und Akino verwendete Overlaysystem zurückzuführen, in dem die Bindung von iodmarkiertem SP-A an immobilisierte Lipide auf Kieselgel untersucht wird. PE, PG und DPPS binden auch als Liposomen schwächer an SP-A und konnten möglicherweise auf der Autoradiographie nicht mehr vom Hintergrund unterschieden werden. Zudem ist der Zustand der Lipide auf Silicagel mit Sicherheit anders (d.h. weniger geordnet) als in Liposomen. Dies könnte auch bei PI dazu geführt haben, daß keine Bin-


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dung von SP-A erfolgt, zudem die Ordnung der Kopfgruppen und/oder Acylseitenketten für die Bindung entscheidend zu sein scheinen (s.o.).

Die Schlußfolgerung der Autoren Kuroki und Akino, die bereits im Titel programmatisch umgesetzt wird: ”Pulmonary Surfactant Protein A Specifically Binds Phosphatidylcholine“ ist daher mit den Ergebnissen der Autoren nicht vollständig konsistent, denn SP-A bindet nach den dargestellten Versuchen genauso gut an DSPC wie an DPPC. Auch die Schlußfolgerung, daß SP-A an die unpolare Gruppe der Phospholipide bindet, ist kritisch zu betrachten, denn unter Umständen sind die unpolaren Fettsäureketten die einzige Lipidstruktur, die auf der Kieselgelplatte für das Protein zugänglich ist, da die polaren Kopfgruppen mit dem Kieselgel wechselwirken.

King et al. untersuchten die Bindung von SP-A an Liposomen in unterschiedlichen Lipidmischungen in Gegenwart von 3 mM Calcium . Die stärkste Interaktion wurde dabei zwischen SP-A und Liposomen aus 85% DPPC und 15% DPPG festgestellt. Die deutlichen Unterschiede zwischen Liposomen aus einem Gemisch verschiedener Phospholipide und Liposomen mit 90% DPPC könnten bei millimolaren Calciumkonzentrationen auf die verstärkte spontane Aggregation von DPPG-haltigen Liposomen zurückzuführen sein. Bei reinen DPPC-Liposomen ist eine solche Liposomenaggregation ohne SP-A nicht zu beobachten. Für die Ergebnisse in 10 mM EDTA-haltigen Puffer könnten unspezifische Wechselwirkungen zwischen SP-A und Lipid verantwortlich sein. Eine mögliche Erklärung ist eine unterschiedliche Präparationsmethode für SP-A, die bei King et al. zu stärker lipidhaltigem Protein führte, im Vergleich zu den hier verwendeten Präparaten, eine Erklärung, die auch Hawgood anführt . Außerdem könnte die lange Dauer der Zentrifugationsexperimente (24 bis 36 Stunden) zu einer Lipidassoziation bei partieller Inaktivierung des Proteins führen. Wie von King et al. gezeigt wurde, findet eine Aggregation unter diesen Versuchsbedingungen nicht statt. Gleichfalls konnte keine Lipidspezifität für SP-A festgestellt werden.

5.7. Temperaturabhängigkeit der Reaktion

Die Temperaturabhängigkeit wurde nur exemplarisch anhand der Bindung von DPPC-Mix-Liposomen und Liposomen aus 90% DPPC bzw. POPC und 10% Cholesterin untersucht, da höhere Temperaturen (37 °C) die Lebensdauer und Aktivität des immobilisierten SP-A erheblich beeinträchtigen und damit die Kosten für die Versuche sehr hoch sind. Bei den verwendeten Liposomen ist in allen Fällen eine langsamere Bindungsreaktion bei 37 °C im Vergleich zu 15 °C festzustellen. Daher ist die Ursache für die Verlangsamung nicht im Zustand der Lipide zu sehen. Während DPPC eine


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Übergangstemperatur von 41 °C hat und hier der Phasenübergang durch die Verwendung von Liposomen herabgesetzt sein könnte, ist dies für POPC Liposomen bei -2 °C ausgeschlossen. Da aber auch bei POPC Liposomen die Verlangsamung der Bindung einsetzt, ist der Phasenübergang für diesen Prozeß nicht entscheidend. Hingegen kommt dafür als Ursache in Betracht, daß immobilisiertes SP-A im Gegensatz zu SP-A in Lösung empfindlicher auf die Erhöhung der Temperatur reagiert. Dafür spricht auch der Aktivitätsverlust beim Erwärmen auf 37 °C und die Tatsache, daß in der Lichtstreuung keine Unterschiede in der Anfangskinetik zu beobachten sind.

Für humanes oder Hunde-SP-A wurde eine Übergangstemperatur von der tripelhelikalen zur Zufallsknäulstruktur von 52 °C ermittelt , bei dieser Temperatur ist mit einer Denaturierung des Moleküls zu rechnen.

Nach Angaben von Casals et al. hat eine Erwärmung des SP-A auf 50 °C für 10 Minuten in Abwesenheit von Lipiden in Lösung und anschließendes Abkühlen auf 37 °C nur einen geringen Einfluß auf die Aggregation (ähnliche Geschwindigkeit und Ausmaß der SP-A induzierten Liposomenaggregation) während die Temperaturstabilität des immobilisierten SP-A, vielleicht auch aufgrund seiner geringen Konzentration am Träger, nicht so groß ist. Die im Vergleich dazu geringen Unterschiede in der Aggregation stimmen mit den Ergebnissen von Casals et al. überein, die für SP-A induzierte Aggregation von DPPC Liposomen in Gegenwart von 1 mM Calcium keine großen Unterschiede zwischen 20 °C und 37 °C feststellten und erst bei Temperaturen um 45 °C eine Abnahme der Aggregation um 40% beobachteten . Die Messung der Liposomenbindung an immobilisiertes SP-A bei physiologischen Temperaturen ist somit problematischer als die der Aggregationsreaktion in Lösung. Anscheinend wird das immobilisierte Protein durch die höhere Temperatur in einen Zustand versetzt, aus dem heraus es schlechter reagiert. Nur durch ein vorgelagertes inhibitorisches Gleichgewicht ist eine Verlangsamung der Reaktion zu verstehen.

Ansonsten ergaben sich keine prinzipiellen Unterschiede zwischen den Messungen bei 37 °C und 15 °C. Bei beiden Temperaturen wird die Bindung durch mikromolare Calciumkonzentrationen ausgelöst und ist reversibel. Auch die Abhängigkeit der Liposomenbindung von der Calcium- und Lipidkonzentration bleibt erhalten. Gleiches gilt für die Unterschiede in der Bindung von DPPC und POPC (Signale sind um ca. 50% verringert).

5.8. Lokalisation der Lipidbindung am SP-A-Molekül

Die Untersuchung von Bindungs- und Aggregationsreaktion läßt zwar keinen direkten Schluß über die Lipidbindungsregion am SP-A zu, dennoch kann man anhand der Er-


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gebnisse einige hypothetische Betrachtungen über mögliche Lipidbindungsorte am Molekül und deren Plausibilität anstellen. In der Literatur sind letztendlich alle Regionen des Moleküls als Lipidbindungsstellen genannt worden. Geht man aber davon aus, daß SP-A durch Calcium in eine lipidbindende Konformation überführt wird, so ist diese rasche Konformationsänderung im Bereich der flexiblen CRD- und Nackenregion wahrscheinlicher als in der durch Disulfidbrücken und Helixstruktur stabilisierten collagenartigen Domäne. Diese Vermutung wird auch durch elektronenmikroskopische Aufnahmen von Possmayer et al. gestützt. In Gegenwart von EDTA ist eine aufgeweitete Konformation der CRD-Region zu erkennen, während Calcium zu einem ”Zusammenklappen“ des SP-A Moleküls führt (Possmayer, pers. Mitteilung). Wahrscheinlich gibt es neben der calciuminduzierten noch eine unspezifische Lipidbindung an SP-A, die deutlich schwächer ist und keine Aggregation zur Folge hat. Die Bildung eines präformierten Komplexes und die calciumabhängige Lipidbindung könnten auch strukturell an zwei verschiedenen Orten des Moleküls lokalisiert sein und in den elektronenmikroskopisch sichtbaren, unterschiedlichen Konformationen des Moleküls erfolgen. Dafür spricht, daß für die Lipidbindung in der Literatur stets zwei Orte genannt werden:

  1. Die aminoterminale Region, da die Aufhebung der Disulfidbrücke am Cys 6 und die Abspaltung der collagenartigen Domäne die Lipidbindung herabsetzen.
  2. Die CRD-Region, wobei die Aminosäuren um die Disulfidbindung zwischen Cys204 und Cys 218 eine wichtige Rolle spielen und der Sequenzbereich Thr 174 bis Ser 194, der im Ratten-SP-A als essentiell für die Phospholipidbindung angesehen wird (Kuroki et al, 5th Marburg Surfactant Symphosium).

Postuliert man einen präformierten Komplex, in dem keine Aggregation erfolgt, so binden Lipide wahrscheinlich am aminoterminalen Ende der SP-A-Untereinheiten, also am ”Stiel“ des blumenstraußartigen Oktadekamers.

Hingegen ist die calciumabhängige Lipidbindung als Voraussetzung für eine Aggregationsreaktion wahrscheinlich an der CRD-Region lokalisiert. In dieser Region wurde anhand der Struktur des MBPs eine Calciumbindungsstelle postuliert. Mutationen an der putativen Calciumbindungsstelle des SP-A unterstützen die Bedeutung der Calciumbindung als Voraussetzung der Lipidbindung . Für die CRD-Region ist gesichert, daß sie für die SP-A induzierte Liposomenaggregation erforderlich ist, während die collagenartige Domäne für die Aggregation nicht benötigt wird. Darüber hinaus ist die multivalente Struktur der CRD-Region für eine Aggregation der Liposomen prädestiniert.


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Die Hypothese, die anhand der Ergebnisse dieser Arbeit und der Literatur gezogen wurden, ist in Abbildung 5.1 schematisch dargestellt und läßt sich wie folgt zusammenfassen:

  1. Es gibt wahrscheinlich einen assoziierten Zustand zwischen SP-A und Lipiden, der nicht zu einer Aggregation führt und in dem die Lipidbindung am aminoterminalen Ende lokalisiert ist. Dieser könnte auch in Gegenwart von 10 mM EDTA die calciumunabhängige Co-Sedimentation von SP-A und Proteinen hervorrufen .
  2. Die von mikromolaren Calciumkonzentrationen abhängige SP-A-Aktivierung und Bindung von Liposomen führt zu einer nachfolgenden Aggregationsreaktion und erfolgt wahrscheinlich im Bereich der CRD/Nacken Region.

Abbildung 5.1: Hypothetische Reaktionsfolge (Schemazeichnungen)
Comicartige Darstellung des präassoziierten Komplexes (1), der Konformationsänderung und Umlagerung nach Calciumzugabe (2), der Bindung (3) und der Aggregationsreaktion (4).


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5.9. Physiologische Folgerungen

SP-A ist an zahlreichen Prozessen in Immunabwehr und Surfactanthomöostase beteiligt. Da diese physiologischen Funktionen des Proteins in der Regel calciumabhängig sind, hat die reversible Bindung von Calcium, die hier über die besser zu untersuchende Lipidbindung nachgewiesen wurde, wahrscheinlich die Funktion, zwei Proteinzustände mit unterschiedlichen Aktivitäten, einen calciumbindenden aktiven und einen calciumfreien inaktiven, zu definieren.

Die Calciumkonzentrationen in der alveolären Hypophase um 1,5 mM sollten SP-A aktivieren und in einen lipidbeladenem Zustand überführen. Dabei ist von einer dichten Lipidpackung um das SP-A auszugehen, die am ehesten mit Aggregaten in konzentrierten Liposomensuspensionen zu vergleichen ist.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß SP-A bei mikromolaren Calciumkonzentrationen unterschiedlichste Phospholipid-Liposomen bindet, obwohl spezifische quantitative Unterschiede zu messen sind. Daher verhält sich SP-A wie ein calciumabhängiges, peripheres Membranprotein, das vor allem die Kopfgruppen der Lipide, ihre Anordnung und/oder Eigenschaften der Fettsäureseitenketten erkennt. SP-A in seiner calciumaktivierten Form könnte als vergleichsweise unspezifisches aber schnelles extrazelluläres Transportmolekül wirken. Der ”beladene Transporter“, ein Komplex aus SP-A und Liposomen, wird gemeinsam in Typ-II-Pneumozyten aufgenommen. Dies stimmt mit den Beobachtungen überein, daß SP-A die Aufnahme von Lipiden in die Typ-II-Pneumozyten erhöht . Die Endozytose wird durch spezifische, auf der apikalen Seite der Typ-II-Pneumozyten lokalisierten Rezeptoren vermittelt, zu denen das Rezeptorprotein bp55 zählt . In der Zelle werden SP-A und Lipide nicht abgebaut, sondern einem Resekretionsprozeß zugeführt (Recycling). Untersuchungen der Arbeitsgruppe von PD Dr. P. Stevens haben gezeigt, daß SP-A bereits binnen Minuten wieder aus der Zelle ausgeschleust wird und gleichzeitig aufgenommene Lipide in Lamellarkörper eingebaut und kurze Zeit später sezerniert werden (Wissel, pers. Mitteilung). Dies erfordert einen intrazellulären Sortiermechanismus, der SP-A und Lipide rasch voneinander trennt und auf unterschiedlichen Wegen dem Recycling zuführt. Dabei könnte die Aufhebung der Lipidbindung an SP-A durch den Entzug von Calcium eine entscheidende Rolle spielen. Unter intrazellulären Bedingungen bei (sub)mikromolaren Calciumkonzentrationen könnte die Aufhebung der Lipidbindung und die Freisetzung von Liposomen durch Überführung von SP-A in den calciumfreien Zustand erfolgen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Calcium die Lipidbindung an SP-A an- und ausschalten kann. Die Reaktion erfolgt rasch, reversibel und führt nicht


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zu einer Fusion der Liposomen. Diese Voraussetzungen muß man für den intrazellulären Freisetzungsprozeß fordern.

Bisher ist noch nichts über die Signaltransduktion in den Typ-II-Pneumozyten bei der Aufnahme und intrazellulären Sortierung von SP-A/Lipid-Komplexen bekannt. Unter zellulären Bedingungen ist es durchaus möglich, daß weitere Proteine (z.B. der SP-A Rezeptor) an der Freisetzung und Sortierung beteiligt sind.

Extrazellulär ist SP-A stets im lipidbindenden Zustand und beispielsweise an der Bildung tubulärer Myelinstrukturen beteiligt, deren funktionelle Rolle allerdings nicht geklärt ist. Tubuläres Myelin bildet sich in vitro in Gegenwart von SP-A und SP-B und millimolarem Calcium . Lipidgebundenes SP-A ist an der strukurellen Organisation spezieller, dichter tubulärer Myelinstrukturen beteiligt, die durch Konversion in den Alveolen in leichtere vesikuläre Formen umgewandelt werden . Strukturbildende Funktionen werden sicherlich nicht allein durch SP-A wahrgenommen, da die Experimente zeigen, daß eine Modifikation von Bilayern durch Wechselwirkung mit dem Protein nicht erfolgt. Für strukturbildende Wechselwirkungen sind die hydrophoben Surfactantproteine erforderlich. Eine wichtige funktionelle Rolle übernimmt dabei das SP-B, das wahrscheinlich in Interaktion mit SP-A und SP-C die Oberflächenaktivität durch Ausbreitung eines Lipidmonolayers reguliert. Inwiefern dabei eine direkte Wechselwirkung zwischen den Proteinen stattfindet, bleibt Gegenstand weiterer Forschung.


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5.10. Hypothese

Die Interpretation der Ergebnisse läßt sich anhand eines Reaktionsschemas darstellen:

Abbildung 5.2: Reaktionsschema


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5.11. Ausblick

Um die im unteren Teil der Hypothese dargestellten Reaktionen experimentell zu prüfen, ist eine Erweiterung des Methodenspektrums unter Einbeziehung von Oberflächenmethoden erforderlich. Neben dem klassischen Langmuir-Trog bietet sich dazu eine methodische Neuentwicklung von Herrn PD Dr. Wolfgang Meier am Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Charité an. Der sogenannte ”schwingende Tropfen“ hängt an einer Glaskapillare und wird elektromechanisch zu Resonanzschwingungen angeregt. Bei Einhaltung bestimmter Randbedingungen ist der Tropfen ein mechanisches System, dessen Eigenfrequenz bzw. Schwingungsdauer von der Oberflächenspannung und der Masse bestimmt wird. Die Masse des Tropfens bestimmt man bei dieser Methode durch Videobildverarbeitung. Aus der Schwingungsdauer kann die Oberflächenspannung berechnet werden. Zusätzlich kann aus der Abklingkonstanten nach kurzzeitigem Anhalten des Erregers auch die Viskosität der Tropfenflüssigkeit berechnet werden. Der Vorteil des schwingenden Tropfens gegenüber herkömmlichen Oberflächenmethoden besteht in der Verwendung äußerst geringer Volumina und der gleichzeitigen Bestimmung von Oberflächenspannung und Viskosität.

Erste Vorversuche zeigen, daß in einer Liposomensuspension SP-A keine Wirkung auf die Oberflächenspannung hat, während die hydrophoben Surfactantproteine zu einer deutlichen Verringerung der Oberflächenspannung führen.

Daneben soll in Zukunft die Wechselwirkung zwischen SP-A und SP-B auch mit den Methoden der Kinetischen Lichtstreuung und der Resonant Mirror Spektroskopie charakterisiert werden. Dabei könnte das Verhalten von SP-B-haltigen Liposomen bei Bindung und Aggregation mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit verglichen werden.

Zur genaueren Untersuchung der Aggregation erscheint der Einsatz der Multiwinkellichtstreuung sinnvoll. Möglicherweise ist dem Verlauf der Streukurven eine Gestaltänderung bei der Bildung der Aggregate zu entnehmen, so daß Details des Aggregationsprozesses deutlich werden.


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Die mit der Calciumbindung einhergehenden intramolekularen Strukturänderungen lassen sich möglicherweise mit Fouriertransform-Infrarot-(FTIR)-Differenz-Spektroskopie erfassen.

Außerdem ist eine Charakterisierung der Interaktion zwischen SP-A und anderen Liganden, z.B. Glykoproteinen oder dem Rezeptor bp55 von besonderem Interesse, sobald von diesem hinreichende Proteinmengen zur Verfügung stehen.

Um die molekularen Ursachen der Wechselwirkung zwischen SP-A und Liposomen genauer zu untersuchen, sollten rekombinantes SP-A und Mutanten mit modifizierten Calcium- und -nach Möglichkeit und Erkenntnisfortschritt- auch Lipidbindungsstellen untersucht werden.

Wie sich an der Vielzahl geplanter Projekte ablesen läßt, wird die Forschung am Surfactant System und an seinem Hauptprotein SP-A auch in Zukunft interessant und spannend bleiben.


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