Neu, Björn: Alpha-Dispersion sowie Adsorption und Depletion neutraler und geladener Makromoleküle - Untersuchungen an Blutzellen

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Kapitel 1. Einführung

In elektromagnetischen Feldern erfahren Partikel in Abhängigkeit von ihren elektrischen und magnetischen Eigenschaften Kräfte und Drehmomente. Auch die Wechselwirkungen von Partikeln untereinander und mit Molekülen und Polymeren werden von Parametern wie der Oberflächenladung und der Polarisation mitbestimmt. Bei der Zell-Zell-Wechselwirkung spielen aber auch gelöste Polymere und die Wechselwirkung dieser mit den Zellen eine entscheidende Rolle. Insofern ist sowohl in der Medizin, Biotechnologie als auch Kolloidchemie ein detailliertes Wissen über die elektrischen Parameter von biologischen Zellen und Kolloiden als auch über deren Zusammenspiel mit Polymeren unerläßlich.

1.1. Elektrorotation und Alpha-Dispersion

Zur Untersuchung von biologischen Zellen und Kolloiden nutzen verschiedene Messmethoden die Wechselwirkung von elektrischen und dielektrischen Partikeleigenschaften mit elektromagnetischen Feldern aus. Bei der Elektrorotation werden die zu messenden Partikel in ein rotierendes elektrisches Feld gebracht. In Abhängigkeit von der Feldfrequenz rotieren die Partikel entgegen oder mit der Feldrichtung. Normalerweise ist die Ursache für die Partikelrotation eine durch Relaxationsprozesse hervorgerufene Phasendifferenz zwischen der durch das angelegte Feld induzierten Polarisation und dem externen rotierenden Feld [ 2 , 51 ]. Diese Differenz führt zu einem Drehmoment, welches auf das Partikel wirkt. Die Rotationsgeschwindigkeit hängt dabei von der Größe des induzierten Dipolmomentes sowie der hydrodynamischen Reibung ab.

In gleicher Weise ergeben sich die dielektrischen Dispersionsrelationen von Partikelsuspensionen bei Impedanzmessungen aus dem frequenzabhängigen Dipolmoment der Partikel [ 36 ]. Es läßt sich unmittelbar folgern, daß Elektrorotationsspektren und Impedanzmessungen in einer engen Wechselbeziehung zueinander stehen [ 4 , 106 ]. In der Vergangenheit konnte dieser Zusammenhang in zahlreichen Arbeiten bestätigt werden, zumindest für Untersuchungen mit


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höherfrequenten Wechselfeldern (oberhalb weniger kHz) [ 3 , 5 , 34 , 38 , 49 , 56 , 82 , 102 ]. Prinzipiell folgt aus der engen Verbindung zwischen Elektrorotation und Impedanzmessung, daß die gleichen Zellparameter erfaßt bzw. bestimmt werden. Ein Vorteil bei der Elektrorotation ist die Möglichkeit, die dielektrischen Parameter von einzelnen Zellen zu erfassen. Bei Impedanzmessungen wird hingegen über viele Zellen gemittelt.

Je nach Aufbau und Komplexität der dielektrischen Struktur eines Partikels lassen sich in einem Elektrorotationsspektrum verschiedene Minima und Maxima in Abhängigkeit von der Frequenz beobachten. Jeder einzelne Extremwert kann einem bestimmten Dispersionsprozeß zugeordnet werden. Insbesondere beim Studium dielektrischer Eigenschaften von biologischen Zellmembranen und der inneren Zellstruktur hat sich die Elektrorotation als aufschlußreiche Meßmethode erwiesen [ 2 , 37 , 56 , 62 , 90 , 102 , 105 ]. Der Frequenzbereich, in dem ein Großteil dieser Untersuchungen stattfinden, in dem also die dielektrischen Eigenschaften der Zellkompartimente untersucht werden, liegt im Bereich von einigen Kiloherz bis hin zu mehreren Megaherz dem sogenannten beta-Dispersionsgebiet. Im wesentlichen spiegeln die Dispersionsrelationen die Polarisation durch die Unterschiede sowohl der Leitfähigkeit als auch der Dielektrizitätskonstanten zwischen dem Partikel und dem umgebenden Medium wieder. Zum Beispiel zeigen im kHz-Bereich biologische Zellen in Lösungen mit niedriger Ionenstärke ein deutliches Maximum der Elektrorotationsgeschwindigkeit entgegen der Feldrichtung. Dieses Verhalten wird häufig als Pauly-Schwan Dispersion bezeichnet und zeigt den Beginn einer kapazitiven Überbrückung der isolierenden Zellmembran an [ 88 ]. Bei Feldfrequenzen im MHz-Bereich erhält man dagegen ein Rotationsmaximum parallel zur Feldrichtung, welches die sogenannte Maxwell-Wagner Dispersion zeigt. Diese wird durch Leitfähigkeitsunterschiede zwischen dem Zellinneren und der umgebenden Lösung hervorgerufen [ 106 ]. In der Vergangenheit haben sich zahlreiche Arbeiten mit den zu Grunde liegenden Mechanismen beschäftigt [ 47 , 51 , 63 , 88 ].

Jüngere Elektrorotationsmessungen haben gezeigt, daß im niederfrequenten bzw. im alpha- Dispersionsgebiet Dispersionsrelationen auftreten, die der Äquivalenz zwischen der Elektrorotation und der Impedanz, wie man es für die Pauly-Schwan und Maxwell-Wagner Dispersion kennt, nicht mehr gehorchen [ 4 , 16 , 79 , 110 ]. Messungen der


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Impedanz im Bereich niederfrequenter dielektrischer Dispersion zeigen eine abnehmende dielektrische Permititivität mit zunehmender Frequenz [ 68 , 67 , 66 ]. Innerhalb des bisherigen Konzepts sollte dieses Verhalten eine zum äußeren rotierenden Feld antiparallele Rotation des Partikels zur Folge haben. Statt dessen wird häufig eine parallele Rotation beobachtet.

Theoretische Konzepte zur Beschreibung der Elektrorotation von geladenen Partikeln im alpha-Dispersionsgebiet nehmen als Ursache eine Konzentrationspolarisation der elektrischen Doppelschicht an [ 95 ]. Wenn ein geladenes Partikel in ein elektrisches Feld gebracht wird, werden um den Partikel herum Abweichungen der Elektrolytkonzentration vom Gleichgewichtszustand induziert. Diese Abweichungen führen zu einem asymmetrischen Aufbau der elektrischen Doppelschicht. Auf dieser Grundlage aufbauend wurden die dielektrischen Dispersionsrelationen unter der Voraussetzung einer dünnen Doppelschicht berechnet [ 44 , 94 , 95 ]. Eine zusätzlich Verallgemeinerung für eine dicke Doppelschicht, die sich nicht im lokalen Gleichgewicht befindet, wurde von DeLacey und White definiert [ 24 ]. Die Relaxationszeiten der Konzentrationspolarisation sollten vergleichbar sein mit der Diffusionszeit über eine Distanz, die im Bereich des Partikelradius liegt. Es zeigt sich, daß die so abgeschätzten inversen Relaxationszeiten in der gleichen Größenordnung liegen wie der Frequenzbereich, in dem die alpha-Dispersion beobachtet wird.

Da die Konzentrationspolarisation die Verteilung der Polarisationsladungen beeinflußt, beeinflußt sie das gesamte induzierte Dipolmoment des Partikels und der Doppelschicht. Theoretische Bemühungen, welche die Elektrorotation im alpha-Dispersionsgebiet auf diesen Grundlagen unter Berücksichtigung des gesamten induzierten Dipolmomentes erklären wollten, führten immer zu einer Rotation entgegen der Drehrichtung des Feldes. Experimentelle Daten, die eine deutliche Rotation mit dem Feld im alpha-Dispersionsgebiet zeigen, konnten nicht erklärt werden. Erst kürzlich gelang Grosse und Shilov [ 58 ] zum Verständnis der Elektrorotation im niederfrequenten Bereich ein signifikanter Fortschritt. Sie zeigen in ihrem Modell, daß die Rotation bei niedrigen Feldfrequenzen nicht nur durch das Drehmoment hervorgerufen wird, welches durch die Wechselwirkung zwischen dem externen Feld und dem induzierten Dipolmoment entsteht, sondern auch durch Elektroosmose. Diese zusätzliche


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Komponente äußert sich in einer relativen Bewegung der äußeren Doppelschicht zur Partikeloberfläche. Diese relative Bewegung wird durch Wirkung der Tangentialkomponente des externen rotierenden Feldes auf die phasenverschobenen Polarisationsladungen in der Doppelschicht verursacht. Die Folge sind räumliche Kräfte auf die Ladungsverteilungen innerhalb der Doppelschicht, welche zu einer Bewegung der Ionenwolken tangential zur Oberfläche führen. Dieses Phänomen läßt sich am besten als elektroosmotischer Schlupf des äußeren Teils der Doppelschicht relativ zur Oberfläche des Partikels umschreiben. Unter bestimmten experimentellen Bedingungen ist der Einfluß dieses Effektes auf die Partikelrotation größer als der Beitrag, den die Wechselwirkung zwischen dem induzierten Dipolmoment und dem elektrischen Feld liefert. Durch diesen Zusammenhang läßt sich dann eine Rotation in Feldrichtung erklären. Näheres zu dieser Theorie wird im Kapitel 3.1.3 erläutert.

In der Vergangenheit wurde der Elektrorotation im alpha-Dispersionsgebiet nicht all zu viel Aufmerksamkeit geschenkt, obwohl die Existenz sowohl für lebende Zellen als auch Kolloide hinreichend bekannt ist [ 4 , 6 , 57 , 61 , 87 , 107 , 109 , 108 ]. Das Kapitel 4 beschäftigt sich im wesentlichen mit der Elektrorotation im alpha-Dispersionsbereich von fixierten Erythrozyten [ 52 , 84 ]. Die experimentellen Daten werden mit dem theoretischen Modell nach Grosse und Shilov [ 58 ] verglichen.

1.2. Adsorption und Depletion von Polymeren an Partikeloberflächen

Ein detailliertes Verständnis vom Verhalten von Polymeren an Grenzflächen hat sowohl in technologischen Bereichen als auch in der Grundlagenforschung eine große Bedeutung [ 46 , 83 ]. Sowohl die Adsorption als auch die Depletion von Polymeren an Grenzflächen spielen eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von Dispersionen. Vor allem bei kleineren Polymerkonzentrationen kann die Adsorption eines Makromoleküls gleichzeitig an der Oberfläche verschiedener Partikel erfolgen, sofern das Molekulargewicht des Polymers genügend groß ist. Es kommt zur sogenannten Überbrückungsflockung. Wenn hingegen die Polymerkonzentration genügend groß ist, kann dies zur Ausbildung von Polymerschichten auf den Oberflächen von Zellen oder Kolloiden führen. Diese Schichten führen zu einem bestimmten Mindestabstand


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(sterische Barriere) zwischen solchen beschichteten Partikeln und verhindern so Aggregation und Koagulation [ 42 ].

Die Ausbildung von Depletionschichten durch Polymere an Grenzflächen zwischen festen und flüssigen Phasen findet statt, wenn die Abnahme der Konfigurationsentropie der Polymere nahe der Grenzfläche nicht durch eine positive Wechselwirkungsenergie ausgeglichen wird [ 46 ]. Eine direkt abstoßende Wechselwirkung zwischen Oberfläche und Polymer ist nicht nötig. Die Ausbildung einer Depletionschicht führt zu einer Abnahme der Segmentdichte des Polymers mit abnehmender Distanz zur Oberfläche. Eine Konsequenz ist die ortsabhängige Abnahme des osmotischen Druckes. Für zwei sich nähernde Partikel kann dies zu einer attraktiven Depletionwechselwirkung führen, die in einer reversiblen Koagulation resultiert [ 45 , 104 ]. Voraussetzung für diese Ausflockung ist, daß die Energie der osmotischen Anziehung durch die Depletionschicht größer ist als der Verlust durch die Abnahme der Konfigurationsenthalpie. Auch bei Erythrozyten spielt die Existenz von Depletionschichten an der Zelloberfläche eine wichtige Rolle. So wird z.B. bei der Aggregation und Disaggregation von Erythrozyten in Dextranlösungen neben dem Modell der Brückenbindung die attraktive Zellwechselwirkung auf der Grundlage einer attraktiven Depletionwechselwirkung diskutiert [ 7 , 11 ]. In der Vergangenheit haben sich zahlreiche Arbeiten mit der Ausdehnung und Struktur von Depletionschichten beschäftigt [ 21 , 33 , 72 , 103 ].

1.2.1. Polymerdepletion

In Lösungen mit löslichen und nicht adsorbierenden Polymeren können Partikel unerwartet hohe elektrophoretische Mobilitäten aufweisen [ 14 , 15 , 96 ]. Dieser Effekt kann durch eine geringere Viskosität an der Grenzfläche des Partikels zur Lösung interpretiert werden, was durch einen Depletioneffekt hervorgerufen wird [ 7 ]. Die Ursache für die Sensitivität dieser elektrokinetischen Untersuchungsmethode auf die Viskosität im Nanometerbereich der Zelloberfläche liegt daran, daß der elektroosmotische Fluß außerhalb der elektrischen Doppelschicht exponentiell abnimmt. Dies führt dazu, daß die Mobilität im wesentlichen nur von der Viskosität innerhalb der Doppelschicht abhängt. Durch Variation der Ionenstärke läßt sich die


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Ausdehnung der Doppelschicht variieren, ohne die Größe der Depletionschicht zu verändern. Auf diese Weise kann durch Variation der Ionenstärke das Ausmaß einer Depletionschicht bestimmt werden. So lange die Doppelschicht deutlich kleiner ist als die Depletionschicht wird auch die Mobilität deutlich über der nach Smoluchowski’s Formel vorhergesagten liegen. Wenn die Debye-Länge größer wird als die Ausdehnung der Depletionschicht, nähert sich die gemessene Mobilität bzw. das zeta-Potential den nach der Viskosität der Lösung zu erwartenden Werten.

Für den Fall einer glatten Oberfläche läßt sich der Depletioneffekt theoretisch in einer linearen Näherung beschreiben. Auf dieser Grundlage konnte die Dicke der Depletionschicht sowie die Viskosität an der Zelloberfläche durch die elektrophoretischen Mobilitäten von Erythrozyten in Dextranlösungen bestimmt werden [ 7 , 31 , 89 ]. Viele Oberflächen weisen jedoch keine glatte Struktur auf. Wie auch beim Erythrozyten werden sie von einer Schicht umgeben, innerhalb derer ein hydrodynamischer Fluß möglich ist. Die elektrischen Oberflächenladungen verteilen sich in dieser Schicht. Solche Oberflächen bezeichnet man als “haarige“ oder “weiche“ [ 85 ] Oberflächen. Theoretische Modelle, welche die Hydrodynamik in der geladenen Schicht berücksichtigen, ermöglichen unter anderem nähere Angaben zur Ladungsverteilung innerhalb dieser Schicht [ 10 , 27 ].

Ein vergleichbarer Zusammenhang wie zwischen der Mobilität und Polymerdepletionschichten ist auch bei der niederfrequenten Elektrorotation zu erwarten. Nach der am Anfang diese Kapitels erwähnten Theorie von Grosse und Shilov [ 58 ] liegt die Ursache der Elektrorotation im alpha-Dispersionsbereich an einer Polarisation der elektrischen Doppelschicht. Diese führt in Wechselwirkung mit dem externen Feld zu einem elektroosmotischen Fluß, welcher bei genügend niedrigen Frequenzen die Partikelrotation induziert. Bei hohen Frequenzen läßt sich hingegen dieses Phänomen nicht mehr beobachten. Sofern diese Theorie die alpha-Dispersion richtig beschreibt, ist also zu erwarten, daß im niederfrequenten Bereich Polymerdepletionschichten einen vergleichbaren Einfluß auf die Rotationsgeschwindigkeit haben wie bei der Elektrophorese auf die Mobilität. Im Gebiet der beta-Dispersion sollte dagegen ein Einfluß von Polymerdepletion auf die Rotation nicht zu beobachten sein.


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Die Untersuchung von Depletionschichten durch Elektrorotation stellt also auch eine Möglichkeit zur Charakterisierung des zu Grunde liegenden Mechanismus der alpha-Dispersion dar. Im Kapitel 5 wird zu diesem Zweck die Elektrorotation von fixierten Erythrozyten in Dextranlösungen untersucht [ 9 ]. Neben dem alpha-Dispersionsgebiet wird dabei auch auf den Übergang zum beta-Dispersionsgebiet eingegangen.

Auch die Wechselwirkung von Polyelektrolyten mit Zelloberflächen spielen in der Biologie und der Medizin eine wichtige Rolle. So wird zum Beispiel die Aggregation von Erythrozyten auch durch das negativ geladene Fibrinogen im Blutplasma verursacht [ 41 ]. Unklar ist jedoch, ob dies von einer Adsorption des Makromoleküls begleitet wird.

Bei der Adsorption und der Depletion von Polyelektrolyten sind die elektrostatischen Kräfte von entscheidender Bedeutung. Zumal diese Kräfte mit der Ladungsdichte von Polymer und Partikeloberfläche und der Salzkonzentration stark variieren, hängt die absolute Adsorption und auch die Depletion von diesen beiden Größen ab. Oft wird bei niedrigen Salzkonzentrationen nur eine geringe Adsorption bis hin zu gar keiner beobachtet [ 46 ]. Bei Zugabe von Salz steigt der adsorbierte Betrag dagegen häufig an. Dieses Verhalten liegt in der elektrostatischen Abschirmung begründet, die mit der Salzkonzentration zunimmt. Es wird aber auch genau das Gegenteil beobachtet, wenn z.B. eine reine Elektrosorption vorliegt, d.h. die Ladungen vom Polymer und der Oberfläche entgegensetzte Vorzeichen haben.

Im Kapitel 6.1 werden elektrophoretische Untersuchungen an nativen Erythrozyten in Lösungen mit negativ geladenem Polystyrensulfonat vorgestellt. Die Versuche werden hinsichtlich möglicher Rückschlüsse auf die Adsorption und die Depletion dieses Polymers diskutiert.

1.2.2. Mehrschichtadsorption von Polymeren

Die Herstellung und Untersuchung dünner organischer Filme erweckt insbesondere wegen der zahlreichen möglichen Anwendungen sowohl in technologischen als auch biotechnologischen Bereichen großes Interesse [ 43 , 75 ]. Eine Möglichkeit zum Aufbau dünner Filme auf geladenen Festkörperoberflächen und Kolloiden ist die Verwendung entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte [ 23 , 29 ]. Bei dieser Methode werden die Oberflächen abwechselnd mit Lösungen aus entgegengesetzt geladenen Polymeren


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behandelt. Auf diese Weise lassen sich kontrolliert Schichten im Bereich von einigen Nanometern Dicke konstruieren. Durch Verwendung unterschiedlicher Polyelektrolyte kann der Aufbau im Prinzip beliebig komplex gestaltet werden. Durch den Einbau anderer Materialien wie Proteine, Farbstoffe oder Nanopartikel können sie mit einer Vielzahl von speziellen Eigenschaften konstruiert werden [ 20 , 71 , 74 , 78 , 91 , 100 ]. So ermöglicht zum Beispiel der Einbau von Proteinen in Polyelektrolytschichten diese als Biosensoren zu verwenden [ 22 ]. Mit unterschiedlichen Messmethoden wie Ellipsometrie, Neutronenstreuung, Infrarot- und UV-VIS-Spektroskopie, Röntgenreflexion und Quarzkristallmikrodifferenz-Gravimetry wurden solche Schichten bereits untersucht [ 19 , 65 , 69 , 76 , 92 , 101 ]

Erst kürzlich wurde die konsekutive Adsorption von Polyelektrolyten an geladenen Polystyren Latex Partikeln untersucht [ 18 , 29 , 64 , 98 , 99 ]. Durch die Verwendung von löslichen Partikeln gelang durch Auflösen des Kernes nach der Adsorption von mehreren Schichten die Konstruktion von hohlen Polyelektrolytkapseln mit einem Durchmesser zwischen 100 nm und 10 µm [ 30 ]. Dazu wurden zunächst mehrere Polymerschichten auf die Partikel gebracht und diese anschließend durch Senkung des pH aufgelöst. Nach dieser Behandlung bleiben nur die Polyelektrolytschichten in Form von Hüllen übrig. Kapseln in dieser Größenordnung sind sowohl von wissenschaftlichem als auch technologischem Interesse. So werden zum Beispiel Liposomen zum einen zur Modellierung biologischer Membranen verwendet und haben außerdem in der Pharmazie als auch in der Kosmetik eine große Bedeutung als Transportmittel für Arzneimittel erlangt [ 73 ].

Ein besonderes Merkmal der Polyelektrolytkapseln ist, daß sie sich sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer Schichtdicke kontrolliert herstellen lassen. Weiterhin haben diese Hüllen im Gegensatz zu Liposomen [ 73 ] die Eigenschaft durchlässig für kleinere polare Moleküle zu sein [ 18 , 69 , 70 ] und sind extrem stabil gegen chemische und physikalische Einflüße.

In Rahmen dieser Arbeit wurde die Möglichkeit untersucht, Polyelektrolythüllen auf der Grundlage von biologischen Zellen herzustellen. Dies ist insofern wünschenswert, als daß man monodisperse Kapseln in einer großen Vielgestaltigkeit über einen weiten Größenbereich fertigen könnte. Dazu wurde zunächst ein Verfahren zur


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Mehrfachbeschichtung von Glutaraldehyd fixierten Erythrozyten entwickelt. Anschließend folgte das Auflösen der Erythrozyten mit einer proteinspaltenden Lösung. Auf diese Weise gelang es Polyelektrolytkapseln in der Form und Größe von Erythrozyten zu konstruieren. Die Resultate und die sich aus diesem Verfahren ergebenden Möglichkeiten werden im Kapitel 6.2 vorgestellt.
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