Neu, Björn: Alpha-Dispersion sowie Adsorption und Depletion neutraler und geladener Makromoleküle - Untersuchungen an Blutzellen

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Kapitel 2. Experimentelle Methoden

Dieses Kapitel dient zum einen der Erläuterung der verwendeten Meßmethoden, und zum anderen sollen die einzelnen Schritte bei der Herstellung von Proben und Meßlösungen beschrieben werden.

2.1. Meßmethoden

2.1.1. Elektrorotation

Zur Aufnahme der Elektrorotationsspektren standen zwei Frequenzgeneratoren (FOKUS, Giesenhorst) mit den Frequenzbereichen 10Hz-2,5kHz und 260Hz-33MHz (Spannungsbereich von 2,5-13 V) zur Verfügung, die Rechtecksignale liefern. Gemessen wurde zum einen in einer Mikrokammer mit einem Elektrodenabstand von 200 µm und 250 µm (siehe Bild 2.1 ). Weiterhin wurde eine Kammer mit einem Elektrodenabstand von einen Millimeter eingesetzt. Das Volumen dieser Kammer betrug etwa 850 µm3, was die Leitfähigkeitsmessung nach der Aufnahme der Spektren erlaubte. Wenn die Leitfähigkeit leicht angestiegen war, wurde dieser Wert angegeben und für theoretischen Berechnungen verwendet.

Sofern es bei den experimentellen Daten nicht anders angegeben wird, wurden für jeden Messpunkt die Rotationsgeschwindigkeiten von 3-8 Zellen gemessen. Bei Versuchen mit Erythrozyten wurde die Rotation von absedimentierten Zellen um ihre kurze Achse gemessen. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur ausgeführt (22°C).

Zur Bestimmung der charakteristischen Feldfrequenzen mit einem Maximum der Rotationsgeschwindigkeit wurden die experimentellen Daten in eine Glockenkurve gelegt [ 39 ]:

(2.1)


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R, Rmax, f und fmax stehen jeweils für die Rotationsgeschwindigkeit, die maximale Rotationsgeschwindigkeit, die Feldfrequenz und die Feldfrequenz mit maximaler Rotation. Je nach Form des Spektrums wurden zur Abschätzung der Frequenz drei und mehr Messpunkte berücksichtigt. Um den oder die Nulldurchgänge f0 zu berechnen, wurde von der folgenden linearen Abschätzung ausgegangen [ 39 ]:

(2.2)

Hier stehen f1 und f2 für zwei Feldfrequenzen unterhalb und oberhalb des Nulldurchganges mit den Rotationsgeschwindigkeiten R1 und R2.

Bild 2.1: Mikroskopische Aufnahme einer Mikrokammer mit einem Elektrodenabstand von 200 µm, welche mit einer Erythrozytensuspension gefüllt ist.

2.1.2. Elektrophorese

Zur Messung der elektrophoretischen Mobilität wurde das kommerzielle Elektrophoresegerät ELECTROPHOR der Firma HaSoTec verwendet [ 59 ]. Im wesentlichen handelt sich dabei um eine Apparatur die auf einem Echtzeitbildverarbeitungssystem sowie einer speziellen Tracking Prozedur beruht. Es ermöglicht gleichzeitig die Messung der elektrophoretischen Mobilität, der Größe und der Sedimentation von einzelnen Zellen.

Die Erfassung von Partikeln in der Elektrophoresekammer erfolgt über ein Mikroskop und eine Videokamera. Ein Computer mit einem Bilddigitalizierer erfaßt die Bewegung und die Parameter der Partikel. Die Elektrophoresekammer ist durch semipermeable Membranen von den Elektroden getrennt. Zwei separate Elektrolytkreisläufe an den beiden Platinelektroden schützen die Partikel vor Elektrolyseprodukten. Die


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Probenzufuhr erfolgt automatisch zwischen den einzelnen Messzyklen. Dies garantiert die Erfassung unterschiedlicher Zellen in jedem Zyklus.

Zur Bestimmung einzelner Messpunkte wird in der Regel über mehrere hundert einzelne Messwerte gemittelt. Bei der Angabe von Fehlern ist im Zusammenhang mit der Elektrophorese immer die empirische Standardabweichung zu verstehen.

2.1.3. Durchflußzytometer

Die Durchflußzytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage der Streulicht- und Floureszenzeigenschaften. Sie ermöglicht die simultane Messung von der relativen Zellgröße, der Granularität sowie zwei bis drei verschiedener Floureszenzfarben an einzelnen Zellen. Zur Analyse wird eine Zellsuspension über ein Schlauchsytem mittels Überdruck in den Messbereich geführt. Die Zellkonzentration liegt dabei um 106 Partikel/ml. Beim Durchtritt durch eine Düse kommt es zur Beschleunigung des Zellflusses, zur Auftrennung von kleineren Zellaggregaten und zur Hintereinanderreihung der Zellen (hydrodynamische Fokussierung). Durch Variation der Düsengröße lassen sich Partikel mit einem Durchmesser von 0,5-100µm messen. Am Analysepunkt trifft ein monochromatischer Laserstrahl auf die einzelnen vorbeiströmenden Zellen. Die Streulicht und Floureszenzsignale werden durch Photomultiplier erfaßt. Das verwendete Durchflußzytometer FACScan (Becton Dickinson) arbeitet mit einem Argon-Ionen-Laser bei einer Wellenlänge von 488nm.

2.1.4. Mikroskopische Verfahren

2.1.4.1. Kraftmikroskop (AFM)

Das Kraftmikroskop liefert die Möglichkeit Oberflächen bis hin zu atomarer Auflösung abzubilden. Das Grundprinzip ist dabei, daß eine Spitze an einem Cantilever so dicht über einer Probe positioniert wird das es zu einer Wechselwirkung zwischen Probe und Sonde kommt. Die Kraft zwischen Probe und Sonde spiegelt sich dann in der Auslenkung des Cantilevers wieder. Der Abstand der Spitze zur Probe sowie die Position in der Probenebene werden über Piezokristalle gesteuert. Um nun ein Abbild der Probe zu erhalten unterscheidet man unterschiedliche Verfahren. Im Kontakt-Modus


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wird die Spitze quasi in Kontakt mit der Probe über diese gerastert. Entweder wird die Auslenkung des Cantilevers gemessen oder die Auslenkung des Cantilevers (also die Kraft bzw. der Sonden-Proben Abstand) wird konstant gehalten. Im zweiten Fall wird die Topographie durch die Spannungsdifferenzen des Piezokristalles, der den Abstand reguliert, wiedergegeben. Im sogenannten tapping- Modus oszilliert der Cantilever (100 Hz - 1 MHz), so daß die Spitze nur flüchtig in Kontakt mit der Probe kommt. Die Änderungen der Spitzen-Oszillationen werden in ein Bild umgewandelt.

Für die Aufnahmen mit dem AFM wurden die Proben getrocknet und anschließend am Nanoscope III vermessen. Die Messungen wurden von Ch. Dürr vom Max Planck Institut für Kolloid und Grenzflächenforschung in Berlin durchgeführt.

2.1.4.2. Konfokales Laser Raster Mikroskop (CSLM)

Das konfokale Laser Mikroskop ist ein neueres mikroskopisches Verfahren, um hoch aufgelöste dreidimensionale Aufnahmen von unterschiedlichen biologischen und nichtbiologischen Objekten zu erhalten. Beim CSLM wird ein Laser durch ein Linsenaufbau auf einen kleinen floureszenten Ausschnitt des zu untersuchenden Objektes fokussiert. Das Streulicht und das Floureszenzlicht wird durch die gleiche Optik auf einen Photodetektor fokussiert, wobei das Streulicht durch einen dichroitischen Filter vom Floureszenzlicht getrennt wird. Ein Blende vor dem Photomultiplier filtert das Floureszenzlicht von Bereichen, welche nicht im Fokus lagen heraus. Mit dem Fokus des Lasers kann nun die Probe Punkt für Punkt gerastert werden, wodurch man die Floureszenzintensitäten in Abhängigkeit von den Raumkoordinaten erhält. Das Resultat ist eine dreidimensionale Intensitätsverteilung.

Die Messungen mittels konfokaler Mikroskopie wurden von P. Klein und C. Reichle aus der Abteilung für Membranphysiologie der Humboldt Universität zu Berlin durchgeführt.

2.1.4.3. Rasterelektronenmikroskp (SEM)

Für die Aufnahmen mit einem Rasterelektronenmikroskop wurden die Proben zunächst getrocknet und anschließend mit Gold bedampft. Die Proben wurden anschließend mit einem Zeiss DSM 40 bei einer Beschleunigungsspannung von 15 keV aufgenommen.


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Die SEM Messungen wurden von J. Hartmann und R. Pitschke vom Max Planck Institut für Kolloid und Grenzflächenforschung in Berlin durchgeführt.

2.1.4.4. Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

Für die Aufnahmen mit einem Transmissionselektronenmikroskop wurden die Zellen nach einer Standardprozedur für biologische Objekte zubereitet. Die Schnitte wurden in einem EM 906 der Firma Zeiss bei 80 kV betrachtet.

Die TEM Messungen wurden von G. Holland vom Institut für Anatomie der Charité durchgeführt.

2.2. Proben und Messlösungen

2.2.1. Messlösungen

Zur Zubereitung der Messlösungen wurde zweifach destilliertes Wasser verwendet. Die erforderlichen Ionenstärken wurden mit Natriumchlorid und zum Teil auch mit Kaliumchlorid eingestellt (sofern im experimentellen Teil nichts anderes angegeben wird). Sofern erforderlich wurde Phosphatpuffer zu den Lösungen hinzu gegeben, um einen pH von 7,4 einzustellen. Bei nativen Blutzellen wurde bei geringen Ionenstärken die Osmolarität durch Zugabe von Saccharose hergestellt. Die Viskositäten wurden mit einem Kapillarviskosimeter bestimmt [ 8 ].

2.2.1.1. Polymere

Für die Dextranlösungen (Kapitel 5 ) wurde 71 kDa, 464 kDa und 2400 kDa Dextran der Firma Pharmacia aus Schweden verwendet.

Für die Untersuchungen in Lösungen mit Polystyrenesulfonatnatriumsalz (PSS) (Kapitel 6.1 ) wurde PSS mit einem mittleren Molekulargwicht MW =70 kDa und MW =1000 kDa von SIGMA Aldrich sowie PSS mit MW =48,6 kDa, MW =350 kDa, MW =990 kDa und MW =2,61 kDa von Polymer Standards Service (Mainz) verwendet.

Bei den Experimenten zur Adsorption von Polymeren auf der Oberfläche fixierter Erythrozyten (Kapitel 6.2 ) wurde zum einen negativ geladenes PSS (MW =70 kDa) von SIGMA und zum anderen positiv geladenes Polyallylaminehydrochlorid (PAH, MW =50-60 kDa) von Aldrich verwendet.


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2.2.2. Erythrozyten

EDTA-Vollblut von freiwilligen Spendern (mit schriftlicher Zustimmung) wurde innerhalb von einer Stunde nach Abnahme mit Hilfe einer Zentrifuge (1400 g, 10 min) separiert. Das Plasma sowie der Buffy-coat wurden abgenommen. Anschließend folgte zweimaliges Waschen in einer isotonen mit Phosphatpuffer gepufferten Kochsalzlösung (PBS) (Phosphatpuffer 5,8 mM mit pH 7,4, Kaliumchlorid 5,6 mM, Natriumchlorid 150 mM) im Verhältnis 1:10.

Neuraminidase (vibrio cholerae) von SIGMA wurde zum Abbau der N-Acetylneuraminsäure von der Erythrozytenoberfläche verwendet [ 40 ]. Dazu wurden 100 µl Erythrozytenkonzentrat in 900 µl Inkubationslösung (110 mM NaCl, 20 mM CaCl2) gegeben, die jeweils 0, 2, 5, 20 und 100 µl einer Einheit Neuraminidase enthielten. Diese Proben wurden bei 37°C leicht agitiert. Nach einer Stunde wurde die Behandlung durch Zugabe von jeweils 9 ml PBS (4°C) unterbrochen. Es folgte dreimaliges Waschen in PBS (110 g, 5 min). Anschließend folgte die Fixierung (s.u.) der behandelten und unbehandelten Zellen mit Glutaraldehyd.

2.2.2.1. Fixierung

Die Fixierung der Erythrozyten erfolgte mit Glutaraldehyd (GA). Dazu wurden zu 2ml einer Erythrozytensuspension (Hämatokrit ca. 0,4) tröpfchenweise mit einer isotonen GA-Lösung (1 Teil GA: Grade I: 25% Aqueus von Sigma und 9 Teile PBS) aufgefüllt bis eine Endkonzentration von 2 % GA erreicht wurde. Nach einer Einwirkzeit von 60 Minuten bei 20°C wurde die Lösung abzentrifugiert (110 g, 5 min) und die Erythrozyten viermal in zweifach destilliertem Wasser gewaschen (110 g, 5 min).

Um Echinozyten herzustellen, wurden Erythrozyten mit Acetylsalicylsäure behandelt. Dazu wurde zunächst von frischem EDTA-Vollblut das Plasma sowie der Buffy-Coat abzentrifugiert, gefolgt von zweimaligem Waschen in PBS (s.o.). Anschließend wurden 0,5 ml des Sediments mit 0,5 ml PBS aufgefüllt. Diese Suspension wurde mit 1 ml Aspisol (0,9 g DL-Lysinmono(acetylsalicyclat), entsprechend 0,5 g Acetylsalicylsäure, und 0,1 g Aminoessigsäure in 5 ml H2O) aufgefüllt. Nach einer Einwirkzeit von 10min bei 20°C erfolgte die Fixierung mit Glutaraldehyd (s.o.).


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2.2.3. Thrombozyten

1 ml Thrombozytenkonzentrat von freiwilligen Spendern, welches durch Thrombopherese gewonnen wurde, wurde in 5 ml Zitronensäurepuffer (pH=6,5, Zitonensäure 7,56 g/l, Glucose 0,9 g/l, HCl 0,37 g/l, NaCl 5,26 g/l, EDTA-Na 3,72 g/l) gewaschen (450 g, 10 min). Nach der Entfernung des Überstandes erfolgte erneutes Waschen in isotoner Saccharoselösung (450 g, 10 min).

2.2.3.1. Fixierung

Zur Fixierung von Thrombozyten wurde 1ml einer gepufferten Formaldehydlösung (10 %) zu 5 ml Thrombozytenkonzentrat gegeben, um eine endgültige Formaldehydkonzentration von knapp 1,7 Prozent zu erhalten. Nach einer Einwirkzeit von 20 Minuten wurden die fixierten Thrombozyten abzentrifugiert und anschließend dreimal in destilliertem Wasser gewaschen (jeweils 450 g, 10 min).

2.2.4. Polymeradsorption & Hüllenpräparation

Die Beschichtung von fixierten Erythrozyten erfolgte mit positiv geladenem Polyallylaminhydrochlorid (PAH) und negativ geladenem Na-Polystyrensulfonat (PSS). Zur Adsorption des jeweiligen Polymers wurden 2-4 ml 0,5 M NaCl-Lösung mit 0,5 g/dl PAH bzw. 0,5 M PSS verwendet. Die Volumenkonzentration der Erythrozyten betrug ca. 2,5 %. Nach einer Einwirkzeit von 10 Minuten bei 20°C wurden die Erythrozyten zunächst abzentrifugiert und anschließend dreimal in einer 154 mM Kochsalzlösung gewaschen (110 g, 5 min).

Zur Präparation von Erythrozytenhüllen wurden als erstes fixierte Zellen mehrmals mit PAH und PSS beschichtet. Nach dem Aufbringen von insgesamt zehn Schichten folgte die Behandlung mit einer Lösung zum Abbau der Proteine. Dazu wurden die beschichteten fixierten Erythrozyten in eine Lösung mit 1,2 % NaOCl gegeben. Die Einwirkzeit betrug ca. 20 Minuten bei 20°C. Anschließend wurden die Erythrozytenhüllen dreimal in einer 145 mM Natriumchloridlösung gewaschen.


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Tue May 18 19:05:39 1999