Neu, Björn: Alpha-Dispersion sowie Adsorption und Depletion neutraler und geladener Makromoleküle - Untersuchungen an Blutzellen



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Kapitel 4. Elektrorotation im Niederfrequenzbereich

In diesem Kapitel werden experimentelle Ergebnisse zur Elektrorotation im alpha- Dispersionsgebiet vorgestellt und mit dem theoretischen Modell von Grosse und Shilov [ 58 ] verglichen. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Elektrorotation von Glutaraldehyd fixierten Erythrozyten im niederfrequenten Bereich (Kapitel 4.1 ). Im darauffolgenden Teil (Kapitel 4.2 ) werden Elektrorotationspektren von Formaldehyd fixierten Thrombozyten unter Berücksichtigung des alpha- und beta-Dispersionsgebietes diskutiert. Im abschließenden Kapitel 4.3 werden dann die gewonnenen Resultate noch einmal zusammengefaßt.

4.1. Fixierte Erythrozyten

Bei den Untersuchungen zur alpha-Dispersion wurden Erythrozyten verwendet, die zuvor mit Glutaraldehyd fixiert wurden (GA-fixiert). Durch die Fixierung mit Glutaraldehyd werden zum größten Teil die positiven Aminogruppen von der Oberfläche entfernt, was zu einem hohen negativen zeta-Potential auch bei niedrigen Ionenstärken führt [ 27 ]. Weiterhin zerstört das Glutaraldehyd die Lipidmembran und vernetzt die Proteine [ 60 ]. Die Folge ist ein stabiles Partikel, welches im Gegensatz zu nativen Erythrozyten nicht mehr hämolysieren kann und dessen Struktur und Aufbau weitestgehend bekannt ist. Durch die Behandlung der Erythrozyten mit Neuraminidase vor der GA-Fixierung läßt sich außerdem die Oberflächenladung reduzieren, ohne andere Zellparameter zu beeinflussen [ 77 , 81 ]. Eine Gegebenheit, welche die GA-fixierten Erythrozyten als Modellpartikel mit sich bringen, ist die Verteilung der Oberflächenladungen in einer Schicht, die einige Nanometer dick ist. Im Standardmodell einer elektrischen Doppelschicht, welches auch Ausgangspunkt für die Theorie zur Elektrorotation im alpha-Dispersionsgebiet ist (Kapitel 3.1.3 ), wird von einer zweidimensionalen Ladungsverteilung ausgegangen.

Im Bild 4.1 ist ein Vergleich zwischen Elektrorotationsspektren von GA-fixierten und nativen Erythrozyten bei ähnlichen externen Leitfähigkeiten zu sehen. Das Spektrum der GA-fixierten Erythrozyten wurde bei einer Leitfähigkeit von 2,0 mS/m und das der


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nativen bei 2,6 mS/m aufgenommen. Da für die Messung der nativen Erythrozyten die geringe Ionenstärke durch Zugabe von Saccharose ausgeglichen wurde, ist die Viskosität um einen Faktor 1,22 höher. Die Feldstärke die bei den GA-fixierten Zellen angelegt wurde, war doppelt so hoch. Dies ist insofern von Bedeutung, da das Drehmoment, welches auf das induzierte Dipolmoment wirkt, proportional zum Quadrat der Feldstärke ist.

Bild 4.1: Vergleich des Elektrorotationsspektrum von nativen Erythrozyten mit dem von GA-fixierten Erythrozyten zwischen 260 Hz und 16 MHz. Das Spektrum der nativen Erythrozyten wurde in isotoner gepufferter NaCl-Lösung mit Sacharose bei einer Leitfähigkeit von 2,6 mS/m und einer Feldstärke von 7,5·103 V/m aufgenommen. Das Spektrum der GA-fixierten Erythrozyten wurde in gepufferter NaCl-Lösung bei einer Leitfähigkeit von 2,0 mS/m und einer Feldstärke von 15·103 V/m aufgenommen. Die durchgezogene Linie ist ein theoretisches Spektrum (unabhängig von der Feldstärke und Viskosität) für die nativen Zellen unter Verwendung des Einschalen Modells (s.a.: Kp. 3.1.1 ) mit folgenden Parametern: epsiloni =50, epsilonm=6, epsilone=80, Gi=60 mS/m, Gm=0.01 µS/m, h =8 nm und R=3.3 µm.

Die nativen Zellen zeigen oberhalb von 1 kHz ein Rotationsverhalten, wie es bei niedrigen Ionenstärken auch für andere biologische Zellen beobachtet wird [ 39 , 82 ]. Bei 1 kHz beginnend steigt zunächst die Rotationsgeschwindigkeit entgegen der Feldrichtung an, bis sie ein Maximum noch unterhalb von 1 MHz erreicht. Anschließend kehrt sich die Rotation um und läuft oberhalb von 1 MHz abermals in ein Maximum. Unterhalb von 1 kHz zeigen die nativen Erythrozyten eine geringe Rotation parallel zur Feldrotation.


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Mit dem Einschalen Modell wurde ein theoretisches Spektrum für den Verlauf oberhalb von 1 kHz berechnet (durchgezogene Linie im Bild 4.1 ). Für dieses theoretische Spektrum mußte eine innere Leitfähigkeit der Erythrozyten von 60 mS/m angenommen werden. Elektrorotationsmessungen von Erythrozyten bei physiologischen Ionenstärken ergeben hingegen eine Leitfähigkeit des Cytoplasmas von 0,4 S/m [ 56 ]. Diesbezüglich erscheint der Wert zunächst recht gering. Auf Grund der geringen Leitfähigkeit in der das Spektrum aufgenommen wurde, war diese Abnahme zu erwarten. Bei nativen Erythrozyten kann es zu einem Flux von Ionen aus der Zelle heraus kommen, wenn sie in Lösungen mit geringen Ionenstärken gebracht werden [ 35 ].

Die Rotation parallel zur Feldrichtung unterhalb von 1kHz läßt sich mit dem Einschalen Modell bzw. mit dem Konzept der beta-Dispersion nicht erklären. Im Bild 4.2 sind zwei Elektrorotationsspektren von nativen Erythrozyten im Frequenzbereich zwischen 64Hz und 3kHz zu sehen. Die beiden Spektren wurden bei einer externen Leitfähigkeit von jeweils 3,2mS/m und 22,6mS/m aufgenommen. Mit abnehmender Feldfrequenz kehrt sich die Rotationsrichtung bei 1kHz um. Im weiteren Verlauf steigt die Rotationsgeschwindigkeit monoton bis zum letzten Meßwert bei 64Hz an, wobei dieser Anstieg bei niedriger Leitfähigkeit deutlich steiler ist. Die charakteristische Frequenz f01, bei der sich die Rotationsrichtung umkehrt, weist keine Abhängigkeit von der Leitfähigkeit auf. Bei anderen Messungen von nativen Erythrozyten zwischen 2mS/m und 22,6mS/m wurde f01 immer im Bereich von 600Hz bis 1,2kHz bestimmt. Diese Variation von f01 konnte nicht den experimentellen Bedingungen zugeordnet werden. Ihr Ursprung wird wohl eher in der biologischen Vielfalt der Zellen liegen. So könnte zum Beispiel die Ursache dieser Bandbreite an leicht unterschiedliche Zellradien und -formen oder auch an Unterschieden der Oberflächenladungen und -strukturen liegen.


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Bild 4.2: Elektrorotationsspektren im Bereich des ersten Nulldurchganges von nativen Erythrozyten der gleichen Population bei zwei verschiedenen externen Leitfähigkeiten. Bei den Spektren handelt es sich um Mittelwerte aus 2-4 Einzelwerten. Für Fedlfrequenzen oberhalb von 100 Hz ist die absolute Varianz der Messpunkte <0,025 rad/sec. Die Spektren wurden bei einer Feldstärke von 13,8·103 V/m aufgenommen.

Das Spektrum der GA-fixierten Erythrozyten zeigt bei vergleichbarer externer Leitfähigkeit keine Gegenfeldrotation. Im Gegensatz zu den nativen Erythrozyten ist eine wesentlich ausgeprägtere Rotation mit dem Feld im Bereich niedriger Frequenzen zu erkennen. Das Rotationsmaximum zwischen 100 kHz und 1 MHz deutet darauf hin, daß auch hier eine Maxwell-Wagner Dispersion vorliegt. Diese ist jedoch geringer als bei den nativen Erythrozyten. Bevor weiter unten der beta-Dispersionsbereich der GA-fixierten Erythrozyten näher beschrieben wird, soll zunächst auf die Elektrorotation im niederfrequenten Bereich eingegangen werden.

Im Bild 4.3 sind mehrere Elektrorotationsspektren im alpha-Dispersionsgebiet von GA-fixierten Erythrozyten bei unterschiedlichen Leitfähigkeiten des Elektrolyten zu sehen. Die Leitfähigkeit wurde zwischen 1,0 mS/m und 18,5 mS/m variiert. Bei allen Leitfähigkeiten fällt auf, daß die Partikel eine maximale Rotationsgeschwindigkeit bei 50 Hz haben. Die Position des Maximums scheint nur sehr gering von der Leitfähigkeit abzuhängen. Die Rotationsrichtung ist parallel zur Feldrotation. Weiterhin erkennt man, daß die Rotationsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der äußeren Leitfähigkeit ein Maximum bei 3.5 mS/m hat.


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Bild 4.3: Vergleich theoretischer und experimenteller Elektrorotationsspektren von GA-fixierten Erythrozyten bei unterschiedlichen externen Leitfähigkeiten. Die Feldstärke betrug bei allen Messungen 5·103 V/m. Die einzelnen Messpunkte repräsentieren jeweils einen Mittelwert der Rotationsgeschwindigkeit von 3 bis 8 einzelnen Zellen. Für die theoretischen Spektren, die durchgezogenen Linien, wurde eine Oberflächenladungsdichte von 0,038 C/m2 und ein Zellradius von 3,92 µm angenommen. Die entsprechenden Leitfähigkeiten Ge sind: a=1,0 mS/m, b=3,5 mS/m, c=8,0 mS/m, d=12,0 mS/m und e=18.5 mS/m. Die mittleren Standardabweichungen betrugen 14-18%.

Die theoretischen Kurven im Bild 4.3 wurden mit dem Modell der Elektrorotation bei niedrigen Frequenzen (Kapitel 3.1.3 ) berechnet. Dabei wurde eine Oberflächenladung von 0,038 C/m2 und ein Erythrozytenradius von 3,92 µm [ 53 ] angenommen. Die Konzentrationen des Elektrolyten, welche ebenfalls für die Berechnung der theoretischen Spektren benötigt werden, wurden aus den gemessenen Leitfähigkeiten und den Mobilitäten von Chlor- und Kaliumionen [ 25 ] abgeleitet. Die grundsätzliche Übereinstimmung zwischen den theoretischen und experimentellen Daten läßt sich gut erkennen. Sowohl die Geschwindigkeit und die Richtung der Zellrotation als auch die Abfolge der Maxima der Rotationsgeschwindigkeit zeigen eine gute Übereinstimmung. Dennoch liegen die Positionen der theoretischen Rotationsmaxima nicht genau bei der Feldfrequenz, bei der das experimentelle Maximum liegt (s.a. Tabelle 4.1 ). Bei allen gemessenen Leitfähigkeiten läßt sich eine systematische Verschiebung der theoretischen Daten hin zu höheren Frequenzen erkennen. Ein Vergleich der Rotationsgeschwindigkeiten in Bild 4.3 oberhalb einer Feldfrequenz von 100 Hz zeigt, daß sich das Spektrum der Rotationsgeschwindigkeit bei einer Leitfähigkeit von


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1,0 mS/m, also der niedrigsten gemessenen Ionenstärke, zu größeren Frequenzen hin verbreitert. Bei den theoretischen Spektren scheint sich dieses Verhalten indirekt wiederzuspiegeln. Die theoretische Position des Maximums ist bei einer Leitfähigkeit von 1,0 mS/m bei einer Frequenz von 150 Hz zu finden, dagegen bewegt sich dieses bei höherer Ionenstärke zwischen 109 Hz und 88 Hz.

Tabelle 4.1: Experimentelle (ex) und theoretische (th) Werte zum Bild 4.3. RcL und fcL stehen jeweils für die maximale Rotationsgeschwindigkeit und die dazugehörige Feldfrequenz.

Ge [mS/m]
1,0
3,5
8,0
12,0
18,5
fcL-ex [Hz]

43

49

48

52

71

RcL-ex [rad s-1]
0,37
0,72
0,54
0,33
0,21
fcL-th [Hz]

150

109

95

90

88

RcL-th [rad s-1]

0,33

0,67

0,47

0,35

0,25

Ein möglicher Grund für die beobachteten Abweichungen der experimentellen Daten von den theoretischen können die Vereinfachungen sein, die in dem theoretischen Modell angenommen werden. Insbesondere sollte in diesem Zusammenhang nochmals darauf hingewiesen werden, daß in dem theoretischen Modell von einem sphärischen Partikel mit einer glatten Oberfläche ausgegangen wird [ 58 ]. Der Erythrozyt hat jedoch eher eine diskoide Form und eine haarige Oberfläche. Innerhalb der haarigen Oberfläche kann es zu einer Verringerung der effektiven Diffusionskonstanten kommen [ 26 , 27 ], was die Relaxationszeit der Konzentrationspolarisation entsprechend verlängert. Diese Verlängerung könnte die geringere Frequenz maximaler Rotation erklären.

Die Oberflächenladung, welche für die theoretischen Spektren angenommen werden mußte, war etwas höher als erwartet. Nach der Fixierung mit Glutaraldehyd sollten die roten Blutkörperchen eine Oberflächenladung von 0.029 C/m2 haben [ 27 ]. Statt dessen wurde bei den Anpassungen in Bild 4.3 von 0.038 C/m2 ausgegangen. Möglicherweise liegt hierfür die Ursache in der räumlichen Anordnung der Oberflächenladungen. Das theoretische Modell geht von einer flachen bzw. zweidimensionalen Ladungsverteilung aus. Im Falle einer räumlichen Ladungsverteilung ist die Oberflächenleitfähigkeit größer, als wenn die gleiche Ladung in einer Fläche verteilt wäre. Dies liegt an dem


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größeren konvektiven Beitrag des endlichen elektrolytischen Flusses in der geladenen Oberfläche zu der Oberflächenleitfähigkeit.

Bild 4.4: Die Geschwindigkeit der Zellrotation in Abhängigkeit von der externen Leitfähigkeit bei einer Feldfrequenz von 32 Hz (bzgl. der experimentellen und theoretischen Parameter siehe Bild 4.3 ).

Das Bild 4.4 zeigt die Rotationsgeschwindigkeit bei einer festen Feldfrequenz von 32 Hz in Abhängigkeit von der äußeren Leitfähigkeit. Es wurden die gleichen Parameter zur Anpassung der theoretischen an die experimentellen Werte wie im Bild 4.3 verwendet. Deutlich wird in diesem Bild nochmals die Übereinstimmung der Abhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeit von der Leifähigkeit der Messlösung. Beginnend bei 1 mS/m steigt diese zunächst an und fällt nach dem Erreichen eines Maximums kontinuierlich ab. Das Maximum der theoretischen Kurve liegt bei 3 mS/m. Im theoretischen Verlauf ist noch zu erkennen, daß es unterhalb von 1 mS/m bei ungefähr 0,65 mS/m zu einer Richtungsumkehr der Zellrotation kommen sollte. Dieser Wechsel konnte bei den GA-fixierten Erythrozyten nicht gefunden werden.

Um den Einfluß der Oberflächenladungsdichte auf die Elektrorotationsspektren im niederfrequenten Bereich zu untersuchen, wurden die Oberflächenladungen des Erythrozyten teilweise durch Neuraminidase abgebaut. Dazu wurden zunächst native Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Neuraminidase behandelt (s.a. Kapitel 2.2.2 ). Anschließend folgte die Fixierung der Erythrozyten mit Glutaraldehyd.


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Die Folgen der Behandlung wurden durch Messung der elektrophoretischen Mobilität überwacht. Es ergab sich eine Reduktion um 70-80 % verglichen mit den unbehandelten Kontrollzellen ( Bild 4.6 ). Im Bild 4.5 werden die experimentellen und theoretischen Elektrorotationsspektren der GA-fixierten Erythrozyten mit unterschiedlichen Oberflächenladungen dargestellt. An den experimentellen Daten erkennt man, daß bei der verwendeten Leitfähigkeit um 2,3 mS/m die Rotationsgeschwindigkeit der Zellen mit abnehmender Oberflächenladung ebenfalls abnahm. Im Bild 4.6 wird diese Abhängigkeit noch einmal verdeutlicht. Neben den relativen Mobilitäten sind hier die Mittelwerte aus den Verhältnissen der Rotationsgeschwindigkeit relativ zu den Kontrollzellen aufgetragen. Die Position des Maximums im Bild 4.5 weist keine Abhängigkeit von der Oberflächenladung auf.

Für das theoretische Spektrum der Kontrollzellen wurde wieder von einer Oberflächenladung von 0,038 C/m2 ausgegangen. Zwei weitere theoretische Kurven, welche die experimentellen Daten der mit Neuraminidase behandelten Zellen mehr oder weniger einhüllen, gehen von 0,01 und 0,008 C/m2 aus. Weiterhin mußte noch ein Reibungsfaktor von 2,05 angenommen werden. Geringe Variationen in Form, Größe und Oberflächenladung der Erythrozyten dürften ein wesentlicher Grund sein für die unterschiedlichen Reibungsfaktoren (die normalerweise zwischen eins und zwei lagen). Hinsichtlich der Oberflächenladung sollte in diesem Zusammenhang noch erwähnt werden, daß es keinen direkten Zusammenhang zwischen der elektrophoretischen Mobilität und der Oberflächenladung gibt. Dies liegt vor allem an der räumlichen Verteilung der Oberflächenladung, dem dynamischen Verhalten der Ladungsanordnung in sich ändernden elektrischen Potentialen und an dem Einfluß der Oberflächenleitfähigkeit auf die elektrophoretische Mobilität im Bereich niedriger Ionenstärken. Die theoretischen Oberflächenladungen lassen sich aber nach dem Standardmodell für einen sphärischen glatten Partikel unter Berücksichtigung der niedrigen Ionenstärke in die entsprechenden zeta-Potentiale umrechnen. Bezogen auf die Kontrolle ergibt sich dann jeweils eine Abnahme auf 72 % und 60 %. Diese Werte sind nur geringfügig kleiner als es nach den elektrophoretischen Daten zu erwarten wäre. Da die Spektren an sedimentierten Zellen aufgenommen wurden, ist aber auch ein Einfluß von der Oberflächenladung auf den Reibungsfaktor zu erwarten. Die experimentellen


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und theoretischen Werte der Höhe und Position der Maxima in den Spektren werden nochmals in Tabelle 4.2 zusammengefaßt.

Bild 4.5: Experimentelle und theoretische Rotationsspektren im alpha-Dispersionsbereich von GA-fixierten Erythrozyten mit unterschiedlichen Oberflächenladungen. Die Feldstärke betrug bei allen Messungen 8·103 V/m und die Leitfähigkeit 2,3 ± 0,1 mS/m. Die mittlere Standardabweichung betrug 19 % bei 20 µl ND sonst lag sie bei 11-15 %. In der Legende werden die verwendeten Neuraminidase (ND)- Konzentrationen angegeben (s.a. Bild 4.6 ). Die durchgezogenen Linien stellen theoretische Spektren für verschiedene Oberflächenladungsdichten in C/m2 dar. Es mußte ein Reibungsfaktor von 2,05 bei einem Zellradius von 3, 92 µm angenommen werden.


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Bild 4.6: Mobilitäten der mit Neuraminidase behandelten und anschließend GA-fixierten Erythrozyten relativ zu den unbehandelten GA-fixierten Erythrozyten (mittlere Mobilität der Kontrollzellen wurde gleich eins gesetzt) sowie die mittlere relative Rotation bezüglich der Kontrollzellen.

Tabelle 4.2: Experimentelle (ex) und theoretische (th) Werte zum Bild 4.5. RcL und fcL stehen jeweils für die maximale Rotationsgeschwindigkeit und die dazugehörige Feldfrequenz. ND kennzeichnet die verwendete Neuraminidasekonzentration bei der Präparation (siehe Kp. 2.2.2 ) und sigmao die Oberflächenladung in den theoretischen Spektren.

ND
0 µl
2 µl
5 µl
20 µl
100 µl
fcL-ex [Hz]

118

127

143

114

93

RcL-ex [rad s-1]
0,87
0,60
0,52
0,52
0,56
sigmao [C m-2]

0,038


0,013


0,008

fcL-th [Hz]

90


75


72

RcL-th [rad s-1]

0,80


0,59


0,41

Eine weitere Beobachtung, die Aufschluß über die Kräfte gibt, welche im alpha-Dispersionsgebiet wirken, ist im Bild 4.7 illustriert. Zu sehen ist der öfters beobachtete Fall eines Paares von Zellen. Beide Erythrozyten ziehen sich gegenseitig durch Polarisationskräfte an, liegen also dicht beieinander. Dennoch rotieren sie unabhängig voneinander in der gleichen Richtung wie das rotierende Feld. Die Geschwindigkeit der Zellen unterscheidet sich dabei nicht von der einer einzelnen Zelle. Zusätzlich kann das Paar gemeinsam langsam in die entgegengesetzte Feldrichtung rotieren. Offensichtlich gibt es, trotz des geringen Zellabstandes, zwischen den GA-fixierten Erythrozyten keine deutliche hydrodynamische Wechselwirkung. Diese Beobachtung kann man durch die Existenz eines an die Rotation gekoppelten Flusses verstehen, welcher eine geringere


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Reichweite hat als die Spalte zwischen den Zellen. Solch ein Fluß ist charakteristisch für den elektroosmotischen Beitrag zur Elektrorotation. Dies resultiert aus der Tatsache, daß die Rotation von einem elektroosmotischen Fluß außerhalb der elektrischen Doppelschicht null ist. Solch ein Fluß läßt keine hydrodynamische Wechselwirkung zwischen Teilchen zu, wenn diese deutlich weiter auseinander liegen als die Debye-Länge [ 7 , 28 ]. Somit kann das im Bild 4.7 beschriebene Verhalten als weiterer deutlicher Hinweis für die elektroosmotische Natur der Elektrorotation im alpha-Dispersionsgebiet der GA-fixierten Erythrozyten verstanden werden. Im Kapitel 5 wird dieser Sachverhalt an Hand des Depletioneffektes von Dextran bei GA-fixierten Erythrozyten nochmals untermauert.

Bild 4.7: Schematische Darstellung des Rotationsverhaltens von zwei eng benachbarten GA-fixierten Erythrozyten im alpha- Dispersionsbereich.

Nach dem theoretischen Konzept zur Elektrorotation im niederfrequenten Bereich ist die Rotationsgeschwindigkeit proportional zum Quadrat der Feldstärke. Eine Voraussetzung für dieses Modell ist, daß die Änderung der Ionenkonzentration im Feld überall wesentlich kleiner ist als die Gleichgewichtskonzentration. Für Partikel in der Größenordnung von Erythrozyten setzt dies für die angelegten Felder eine Feldstärke voraus, die wesentlich kleiner ist als 104 V/m [ 58 ]. Die meisten Versuche wurden in einem Feldstärkebereich zwischen 5·103 V/m und 8·103 V/m durchgeführt. Bis zu einer Feldstärke von 1,2·104 V/m konnte keine Abweichung von der linearen Abhängigkeit beobachtet werden. Im Bild 4.8 wird die experimentelle Feldstärkeabhängigkeit zwischen 3·103 V/m und 12·103 V/m bei einer Feldfrequenz von 32 Hz dargestellt.


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Bild 4.8: Feldstärkeabhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeit GA-fixierter Erythrozyten bei einer Feldfrequenz von 32 Hz. Der Elektrodenabstand betrug 1mm und die externe Leitfähigkeit 1,5 mS/m.

Abschließend soll auf die Elektrorotation von GA-fixierten Erythrozyten im Gebiet der beta-Dispersion eingegangen werden. Im Bild 4.9 sind drei Spektren in einem Frequenzbereich zwischen 2 kHz und 16 MHz bei drei verschiedenen Leitfähigkeiten zu sehen. Die Spektren zeigen eine maximale Rotation zwischen 300 kHz und 1,5 MHz. Bei niedrigen Ionenkonzentrationen ist die Rotation parallel zur Feldrichtung und wird bei Erhöhung der externen Leitfähigkeit antiparallel. Die Position der Rotationsmaxima wandert mit steigender Leitfähigkeit zu höheren Frequenzen.

Um die experimentellen Daten zu interpretieren wurde auf das Einschalen Modell zurückgegriffen (Kapitel 3.1.1 ). Der Vergleich der theoretischen mit den experimentellen Daten zeigt, daß sich GA-fixierte Erythrozyten wie leicht leitende Partikel verhalten. Es stimmt mit dem theoretischen Modell einer schwach leitenden Kugel umgeben von einer leitenden Schale überein. Für den Fall der Rotation in Feldrichtung muß die Leitfähigkeit der Kugel größer sein als die der umgebenden Lösung. Die Rotation entgegen der Feldrichtung ist mit einer inneren Leitfähigkeit konsistent, die etwas geringer ist als die äußere Leitfähigkeit.

Die Dielektrizitätskonstante wurde in den theoretischen Spektren sowohl für die Schale als auch für die Kugel gleich 78 gesetzt. Bei externen Leitfähigkeiten von 3,0 mS/m und


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4,5 mS/m ergaben sich nach diesem Modell etwas höhere Leitfähigkeiten der Schale von jeweils 4,7 mS/m und 5,6 mS/m. Die inneren Leitfähigkeiten waren ebenfalls zur äußeren Leitfähigkeit mit jeweils 3,4 mS/m und 4,63mS/m leicht erhöht. Bei einer höheren äußeren Leitfähigkeit von 15,0 mS/m zeigt dann das theoretische Spektrum eine etwas geringere innere Leitfähigkeit von 14,7 mS/m. Die Leitfähigkeit der Schale beträgt hier 16,0 mS/m

Bild 4.9: Vergleich von theoretischen und experimentellen Elektrorotationsspektren im hochfrequenten Bereich bei unterschiedlichen Leitfähigkeiten. Die Feldstärke betrug 15·10 3V/m. Für die theoretischen Spektren (durchgezogene Linien) wurde das Modell für einschalige Objekte verwendet. Es wurden leitende Sphären mit einer Leitfähigkeit von (a) 3,4 mS/m, (b) 4,63 mS/m und (c) 14,7 mS/m und leitende Schalen mit (a) 4,7 mS/m (b) 5,6 mS/m und (c) 16,0 mS/m. Die Dielekrizitätskonstante für den Partikel und das externe Medium betrug 78.

Durch Elektrorotationsdaten von nativen Erythrozyten ist bekannt, daß die innere Dielektrizitätskonstante bei 50 liegen sollte (s.a. Bild 4.1 ). Um die Elektrorotationsdaten der GA-fixierten Erythrozyten im höherfrequenten Bereich zu interpretieren war es notwendig eine Dielektrizitätskonstante von 78 anzunehmen. Dies kann ein Resultat des durch das Glutaraldehyd induzierten Vernetzen der Proteine sein sowie der drastische Erhöhung der Membranleitfähigkeit. Eine Folge könnte dann die Zunahme der inneren Dielektrizitätskonstante sein [ 12 ]. In diesem Zusammenhang ist auch noch interessant, daß die Elektrorotationsspektren im Bild 4.9 keinerlei Hinweis auf die Existenz einer Membran liefern.


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Obwohl sich die Daten prinzipiell mit dem Modell eines kugelförmigen Partikels interpretieren lassen, sind exakte theoretische Beschreibungen der Maxima nicht möglich. Ein Grund neben der Vereinfachung der Erythrozytenform könnte auch an einem Einfluß liegen den die alpha-Dispersion auch in diesem hohen Frequenzbereich noch hat.

4.2. Fixierte Thrombozyten

Im Zusammenhang mit den Untersuchungen zur alpha-Dispersion der GA-fixierten Erythrozyten haben sich fixierte Thrombozyten ebenfalls als Untersuchungsobjekt angeboten. Thrombozyten stellen insofern ein weiteres interessantes Modellpartikel dar, als ihr Durchmesser nur knapp ein Drittel bis Viertel von dem der Erythrozyten beträgt. Im alpha-Dispersionsbereich hängt die Frequenz des Rotationsmaximums insbesondere vom Radius des Partikels ab (s.a. Kapitel 3.1.3 ).

Im Bild 4.10 werden die Elektrorotationsspektren von nativen und mit Formaldehyd fixierten Thrombozyten (FA-fixiert) bei einer externen Leitfähigkeit um 3 mS/m verglichen. Die nativen Zellen zeigen qualitativ ein ähnliches Spektrum wie die nativen Erythrozyten. Oberhalb von 1 kHz steigt die Rotationsgeschwindigkeit entgegen der Feldrichtung zunächst an, bis bei 70 kHz ein Maximum erreicht wird. Knapp unterhalb von einem MHz kehrt sich die Drehrichtung um. Die darauf folgende Maxwell-Wagner Dispersion konnte innerhalb des Meßbereiches nicht mehr vollständig erfaßt werden. Unterhalb von 1 kHz zeigen die Thrombozyten eine geringe Rotation parallel zur Feldrichtung. Im Verhältnis zu den Rotationsgeschwindigkeiten, die im beta-Dispersionsgebiet erreicht werden, ist die alpha-Dispersion ähnlich gering ausgeprägt wie bei den nativen Erythrozyten. Die durchgezogene Linie im Bild 4.10 zeigt ein theoretisches Spektrum nach dem Einschalen Modell (Kapitel 3.1.1 ). Die entsprechenden Parameter sind in der Legende zu finden. Das Spektrum der mit FA-fixierten Thromboyten zeigt bei vergleichbarer externer Leitfähigkeit eine relativ zur beta-Dispersion wesentlich ausgeprägtere alpha-Dispersion. Außerdem ist das zweite Maximum deutlich zu niedrigeren Feldfrequenzen gewandert. Die absolute Rotationsgeschwindigkeit hat abgesehen von der alpha-Dispersion durch die Fixierung der Zellen signifikant abgenommen.


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Bild 4.10: Vergleich der Elektrorotationsspektren von nativen und FA-fixierten Thrombozyten. Das Spektrum der nativen Zellen wurde in isotoner gepufferter NaCl-Lösung mit Sacharose bei einer Feldstärke von 12·103 V/m aufgenommen. Das Spektrum der FA-fixierten Zellen wurde in KCl-Lösung bei einer Feldstärke von 12,1·103 V/m aufgenommen. Die durchgezogene Linie ist ein theoretisches Spektrum (unabhängig von der Feldstärke und Viskosität) für die nativen Zellen unter Verwendung des Einschalen Modells (s.a.: Kp. 3.1.1 ) mit folgenden Parametern: epsiloni =50, epsilonm=10, epsilone=78, Gi=0,25 S/m, Gm=4 µS/m, h =5 nm und R=1 µm.


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Bild 4.11: Elektrorotationsspektren von FA-fixierten Thrombozyten bei verschiedenen Leitfähigkeiten. Die Feldstärke betrug E=10 V/m für f le 2 kHz und E=12,1 V/m für f > 2 kHz. Für die theoretischen Spektren wurden die des kubisch strukturierte Modells (CSM) und des Niederfrequenz Modells (LFDD) addiert.


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Bild 4.12: Effektive Dielektrizitätskonstante epsilonef (s. Kp. 3.1.3 ) und effektive innere Leitfähigkeit Gef in Abhängigkeit von der Feldfrequenz. Die Parameter werden in Tabelle 4.3 wiedergegeben und die entsprechenden Elektrorotationsspektren in Bild 4.11 .

Im Bild 4.11 sind Elektrorotationsspektren FA-fixierter Thrombozyten bei vier verschiedenen äußeren Leitfähigkeiten zwischen 0,7 mS/m und 16,0 mS/m im Frequenzbereich von 32 Hz bis 8 MHz zu sehen. Bei allen Leitfähigkeiten erkennt man oberhalb von 1 kHz zunächst ein Maximum der Rotation entgegen der Feldrichtung und bei steigender Feldfrequenz ein weiteres Rotationsmaximum parallel zur Feldrichtung. Die Position dieser Maxima wandert mit steigender Leitfähigkeit zu höheren Frequenzen. Gleichzeitig nimmt die Rotationsgeschwindigkeit des zweiten Maximums ab. Die Geschwindigkeit der Gegenfeldrotation weist hingegen keine signifikante Abhängigkeit von der Leitfähigkeit auf. Im niederfrequenten Bereich erkennt man ab einer Leitfähigkeit von 3,1 mS/m eine Rotation parallel zum Feld. Insbesondere die Leitfähigkeitsabhängigkeit der Rotation parallel zur Feldrichtung im oberen kHz- bis


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MHz-Bereiches zeigt, daß durch die Fixierung der Thrombozyten die Durchlässigkeit der Membran stark zugenommen hat.

Um die Elektrorotationsspektren zu interpretieren, wurde eine modifizierte Form des kubisch strukturierten Modells (Kapitel 3.1.2 ) [ 32 , 37 ] mit der Theorie zur alpha-Dispersion (Kapitel 3.1.3 ) superponiert. Die innere Struktur von Thrombozyten ist dadurch gekennzeichnet, daß sie verschiedene Vesikel enthalten, wie zum Beispiel Exocytosevesikel. Diese Inhomogenität des Innenraumes kann im kubisch strukturierten Modell näherungsweise durch Quader, die von einer Membran umgeben sind, berücksichtigt werden. Diese Quader haben einem festen Durchmesser und festen Abstand zueinander.

Die theoretischen Spektren im Bild 4.11 zeigen im Bereich der beta-Dispersion eine recht gute Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Die theoretischen Parameter werden in Tabelle 4.3 wiedergegeben. Die Leitfähigkeit der äußeren Membran wurde gleich der externen Leitfähigkeit gesetzt. Die Leitfähigkeit der Vesikelzwischenräume lag immer geringfügig über der äußeren Leitfähigkeit. Die Innenleitfähigkeit der Innenvesikel Ginv lag immer deutlich über der Leitfähigkeit der Lösung. Ginv weist eine deutliche Abhängigkeit von der äußeren Leitfähigkeit Ge auf. Mit abnehmender externer Leitfähigkeit nimmt auch die Innenleitfähigkeit der Vesikel ab. Die Membranleitfähigkeit Gmv der Innenvesikel mußte dagegen bei allen Leitfähigkeiten wesentlich geringer gewählt werden, nimmt aber auch mit der äußeren Leitfähigkeit ab. Für die Dielektrizitätskonstanten wurde sowohl bei der Membran der Innenvesikel epsilonmv als auch beim Innenraum der Innenvesikel epsiloninv ein Wert von 50 angenommen. Die Dielektrizitätskonstante für den übrigen Zellzwischenraum epsilong und die Zellmembran epsilonm wurde gleich 78 gesetzt. Für die geometrischen Parameter der Innenvesikel folgte bei einem Durchmesser (bzw. Seitenlänge der Quader) von Lv=0,3 µm ein mehr als doppelt so großer Abstand von d=0,65 µm.


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Tabelle 4.3: Parameter die für die theoretischen Elektrorotationsspektren aus Bild 4.11 variiert wurden (Ge: externe Leitfähigkeit; Gmv: Leitfähigkeit der Vesikelmembran; Ginv: Leitfähigkeit des Vesikelinneren; sigma: Oberflächenladungsdichte der Zelle). Folgende Parameter wurden konstant gehalten. Vesikelparameter: Membrandicke hv =5nm, Dielektrizitätskonstante der Membran epsilonmv = 50 und des Inneren epsiloninv = 50 sowie der Durchmesser Lv = 0,3 µm; Zellparameter: Membranleitfähigkeit Gm= Ge, Spaltdurchmesser d= 0,65 µm, Dielektrizitätskonstante der Membran epsilonm = 78 und des Spaltes epsilong = 78.

Ge [mS/m]

0,7

3,1

8,7

16,0

Ginv [mS/m]

11

15

25

45

Gg [mS/m]

0,815

3,33

9,0

16,7

Gmv [µS/m]

0,5

14

65

150

sigma [C/m2]

0,5·10 -3

1,5·10 -3

3,4·10 -3

3,6·10 -3

Tabelle 4.4: Charakteristische Frequenzen der experimentellen (ex) und theoretischen (th) Spektren der FA-fixierten Thrombozyten. cL, c1 und c2 stehen jeweils für das Maximum im alpha-Dispersionsbereich sowie das erste und zweite Maximum im beta-Dispersionsbereich.

Ge [mS/m]

0,7

3,1

8,7

16,0
fcL-ex_[Hz]


122

120

fcL-th_[Hz]

379

864

1120

1130
fc1-ex [kHz]

1,43

26,1

58

108
fc1-th [kHz]

4,52

22,6

69

127
fc2-ex [MHz]

0,273

1,22

3,8

fc2-th [MHz]

0,178

1,01

3,91

6,48

An Hand dieses Modells läßt sich vermuten, daß die Fixierung mit Formaldehyd vergleichbare Auswirkungen auf die dielektrischen Zellparameter von Thrombozyten hat wie die Fixierung der Erythrozyten mit Glutaraldehyd. Zunächst deuten die Spektren eine erhöhte Durchlässigkeit der äußeren Lipidmembran an. Dies führt zu einer drastischen Abnahme der Volumenleitfähigkeit Gg, welche im wesentlichen die Höhe des zweiten Maximums parallel zur Feldrichtung festlegt. Dieses Maximum wird noch durch die deutlich höhere Innenleitfähigkeit von einigen Innenvesikeln Ginv verbreitert. Diese weisen auch eine deutlich geringere Membranleitfähigkeit Gmv auf, welche zu einer Rotation entgegen der Feldrichtung bei etwas niedrigeren Feldfrequenzen führt. Aus der Inhomogenität des Innenraumes der Thrombozyten kann man die effektive und frequenzabhängige Innenleitfähigkeit Gef sowie die Dielektrizitätskonstante epsilonef berechnen (S. 25 Gleichung (3.19 ) und (3.20 )). Die


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entsprechenden Funktionen zu den theoretischen Spektren aus Bild 4.11 werden im Bild 4.12 dargestellt.

Im Bereich der alpha-Dispersion zeigen die theoretischen Spektren im Bild 4.11 eine deutliche Verschiebung des Maximums zu höheren Feldfrequenzen. Um hier die theoretischen Verläufe an die experimentellen Daten anzugleichen, wurde, abgesehen von dem Einfluß der beta-Dispersion, nur die Oberflächenladung der Thrombozyten variiert. Ab einer Leitfähigkeit von 3,1 mS/m geschah dies durch angleichen der maximalen experimentellen Rotationsgeschwindigkeiten an die theoretischen. Wie in Tabelle 4.3 zu sehen nimmt die Oberflächenladungsdichte kontinuierlich von 1,5 mC/m2 bei 3,1 mS/m bis auf 3,6 mC/m2 bei 16 mS/m zu. Bei einer Leitfähigkeit von 0,7 mS/m wird unter der Annahme einer weiteren kontinuierlichen Abnahme der Oberflächenladungsdichte mit abnehmender Ionenstärke von 0,5 mC/m2 ausgegangen, um im theoretischen Spektrum die alpha-Dispersion nicht zu vernachlässigen. Elektrophoretische Messungen an nativen Thrombozyten zeigten bereits, daß die Oberflächenladung mit der Ionenstärke abnimmt [ 10 ]. Die Ursache für dieses Verhalten liegt darin, daß Oberflächenstruktur und -ladung auf Veränderungen der Ionenstärke reagiert. Bei abnehmender Ionenstärke wird das negative Oberflächenpotential durch die geringere elektrostatische Abschirmung zunächst zunehmen. Dieser Prozeß führt aber gleichzeitig zu einem anwachsen des pH an der Zelloberfläche. Wenn nun der pK dieser Polyelektrolytstruktur im Bereich des pH der Lösung liegt, folgt eine geringere Dissoziation. Insgesamt nimmt die gemessene effektive Oberflächenladung ab. Auch bei FA-fixierten Thrombozyten konnte mit Elektrophorese ein ähnlicher Zusammenhang festgestellt werden. Wenn vereinfachend ein glatter sphärischer Partikel angenommen wird, fällt bei FA-fixierten Thrombozyten die Oberflächenladung zwischen 46 mS/m und 0,3 mS/m von 6,2 mC/m2 auf 0,8 mC/m2. Diese Werte liegen in dem Bereich, wie die in den theoretischen Spektren verwendeten Werte (siehe Tabelle 4.3 ).

Die Überlagerung der alpha-Dispersion und der beta-Dispersion durch Addition der Spektren zeigt eine recht gute Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Es fällt auf, daß die Innenvesikel im theoretischen Ansatz einen recht großen Abstand zueinander haben. Nach elektronenmikroskopischen Aufnahmen (z.B. in [ 37 ]) ist ein wesentlich


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geringerer Vesikelabstand und demzufolge eine höhere Vesikelkonzentration zu erwarten. Da im kubisch strukturierten Modell nur von einem Vesikeltyp ausgegangen wird, ist zu vermuten, daß die FA-Fixierung die unterschiedlichen Vesikel nicht einheitlich hinsichtlich ihrer Struktur verändert. Die berechneten Werte können somit nur über alle Eigenschaften gemittelte effektive Parameter der Vesikel sein.

Im niederfrequenten Dispersionsgebiet fällt die systematische Verschiebung der Position des theoretischen Maximums zu höheren Frequenzen auf. Die Position der experimentellen Maxima bei 3,1 mS/m und 8,7 mS/m im Bild 4.11 entsprechen ungefähr der, wie sie für ein knapp viermal so großes Partikel zu erwarten wäre. Ein möglicher Grund könnte in der Struktur und der Größe der Trombozyten liegen. In dem Modell zur alpha-Dispersion wird zum einen von einem glatten Partikel ausgegangen und zum anderen von einem Partikelradius der wesentlich größer ist als die Debye-Länge. Eventuell macht sich hier die Verletzung dieser beiden Voraussetzungen bemerkbar. Eine haarige Oberfläche, wie sie Thrombozyten haben, wird sicherlich zu einer Verringerung der Ionendiffusionszeiten führen. Ein weiteres Problem, welches genauso für die beta-Dispersion gilt, ist, daß die Superposition eine zu grobe Vereinfachung darstellen kann. Bei der Addition der theoretischen Spektren wird nicht die Möglichkeit eines gegenseitigen Einflusses berücksichtigt.

4.3. Zusammenfassung und Schlußfolgerung

Im ersten Abschnitt dieses Kapitels konnte gezeigt werden, daß mit Glutaraldehyd fixierte Erythrozyten in dem Frequenzbereich zwischen 10 Hz und 1 kHz eine deutliche Elektrorotation parallel zur Feldrichtung aufweisen. Die experimentellen Spektren sind mit dem theoretischen Modell (Kapitel 3.1.3 ) zur Elektrorotation im niederfrequenten Bereich konsistent. Im Bereich der beta-Dispersion wird die Elektrorotation durch die Leitfähigkeiten und die Dielektrizitätskonstanten von Membran und den übrigen Zellkompartimenten bestimmt. Im Gegensatz dazu wird im Gebiet der alpha-Dispersion die Elektrorotation durch die Oberflächenleitfähigkeit und die Oberflächenladung bestimmt. Die im Bereich der beta-Dispersion bekannte Äquivalenz von Elektrorotation und Impedanzmessung geht als Folge des elektroosmotischen Anteils der niederfrequenten Elektrorotation verloren.


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Im zweiten Teil wurden experimentelle Elektrorotationsspektren FA-fixierter Thrombozyten im alpha- und beta-Dispersionsbereich untersucht. Die experimentellen Daten wurden mit einer Kombination aus dem kubisch strukturieren Modell und dem Modell zur alpha-Dispersion verglichen. Beim kubisch strukturierten Modell wurde eine etwas modifizierter Ansatz des ursprünglichen Modells verwendet [ 32 ]. Die Erweiterung bestand in der Ausdehnung auf beliebige Vesikelkonzentrationen und -abstände. Das herkömmliche Modell ist auf kleine Vesikelabstände im Verhältnis zum Vesikeldurchmesser beschränkt.

Die experimentellen Spektren der FA-fixierten Thrombozyten (S. 50 Bild 4.11 ) zeigten gerade im Bereich der beta-Dispersion eine sehr gute Übereinstimmung mit den theoretisch berechneten Verläufen. Um die Zuverlässigkeit dieses Modells abschließend beurteilen zu können, bedarf es in Zukunft weiterer Untersuchungen an z.B. Aggregaten oder Partikeln, die durch entsprechende Innenstrukturen auffallen. Im niederfrequenten Bereich stellten sich größere Abweichungen zwischen Experiment und Theorie ein. Hier lag die theoretische Frequenz maximaler Rotation immer bei deutlich höheren Frequenzen als im Experiment.

Die Theorie zur niederfrequenten Elektrorotation beschreibt nur das Standardmodell einer elektrischen Doppelschicht um ein kugelförmiges Partikel. Weitere theoretische Ansätze werden nötig sein, um diese Theorie auf beliebige Partikel anwenden zu können. So muß zum einen der Einfluß von haarigen Oberflächenstrukturen geklärt werden, zumal zahlreiche biologische und nicht biologische Partikel über solch eine Struktur verfügen (z.B. Erythrozyten). Außerdem muß die Theorie für den Fall beliebig großer Debye-Längen im Verhältnis zum Partikelradius erweitert werden. Da sich die alpha-Dispersion nur bei geringen äußeren Leitfähigkeiten beobachten läßt, muß man zwangsläufig mit relativ großen Debye-Längen arbeiten. Dies könnte auch die Ursache für die Abweichungen zwischen Theorie und Experiment bei den Untersuchungen der FA-fixierten Thrombozyten im alpha-Dispersionsbereich sein.


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Tue May 18 19:05:39 1999