Neu, Björn: Alpha-Dispersion sowie Adsorption und Depletion neutraler und geladener Makromoleküle - Untersuchungen an Blutzellen

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Kapitel 5. Erfassung von Polymer-Depletionschichten im Alpha-Dispersionsbereich

Ziel dieses Kapitels ist den Einfluß von Depletionschichten auf die Elektrorotation im alpha-Dispersionsgebiet darzustellen. Ausgehend von der Schlußfolgerung des letzten Kapitels, daß die Elektrorotation im alpha-Dispersionsbereich durch Elektroosmose wesentlich beeinflußt wird, sollten sich makromolekulare Depletionschichten mit Hilfe von Elektrorotation detektieren lassen. Dazu werden zunächst im Kapitel 5.1 elektrophoretische Untersuchungen in Dextranlösungen vorgestellt. Dies dient in erster Linie der Quantifizierung des Depletioneffektes bei den verwendeten Konzentrationen und Molekulargewichten von Dextran. Auf dieser Grundlage folgen im zweiten Teil die Untersuchung und Interpretation der Elektrorotation von fixierten Erythrozyten im niederfrequenten Bereich in Anwesenheit von Dextrandepletionschichten.

5.1. Depletion in Dextranlösungen

Im Bild 5.1 werden die Verhältnisse der elektrophoretischen Mobilität von fixierten Erythrozyten in Natriumchloridlösung µs zu den in Dextranlösung µp für unterschiedliche Debye-Längen dargestellt. Die Debye-Länge wurde bei den Versuchen durch die Variation der Konzentration von Natriumchlorid erreicht. Für die Messungen wurde Dextran mit den Molekulargewichten 71 kDa, 464 kDa und 2400 kDa verwendet. Die Konzentration betrug immer 2 g/dl. Das Viskositätsverhältnis der Dextranlösungen zu den Kochsalzlösungen etap/etas betrug jeweils 1,73 für 71 kDa Dextran, 2,46 für 464 kDa Dextran und 3,61 für 2400 kDa Dextran.

Das Verhältnis µs/µp zeigte für die Lösungen mit Dextran von einem Molekulargewicht von 464 kDa und von 2400 kDa über den gesamten Messbereich eine lineare Abhängigkeit von der Debye-Länge. Außerdem war es immer kleiner als das entsprechende Viskositätsverhältnis etap/etas. Bei Verwendung von Dextran mit einem Molekulargewicht von 71kD war diese Abhängigkeit nur bis zu einer Debye-Länge von ungefähr 5 nm linear. Bis zu diesem Wert war die Mobilität auch noch größer als nach der Viskosität zu erwarten. Oberhalb dieser Länge erreichte dann das


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Mobilitätsverhältnis das Viskositätsverhältnis. In keinem Fall überstieg das Mobilitätsverhältnis signifikant das Viskositätsverhältnis. Auffällig war noch das etwas größere Mobilitätsverhältnis der fixierten Erythrozyten in der Lösung mit 464 kDa Dextran gegenüber der mit 2400 kDa Dextran im gesamten Messbereich. Nur bei einer Debye-Länge um 7,5 nm überstieg das Mobilitätsverhältnis der 2400 kDa Lösung geringfügig den Wert, der in der 454 kDa Lösung erreicht wurde. Die Viskosität der 2400 kDa Lösung war dagegen deutlich größer.

Bild 5.1: Verhältnis der elektrophoretischen Mobilität µsDx von fixierten Erythrozyten in gepufferten Lösungen (pH = 7.4) mit unterschiedlichen Natriumchloridkonzentrationen ohne zusätzliches Dextran µs und mit 2 g/dl Dextran µDx unterschiedlicher Molekularmassen. Die durchgezogenen Linien sind theoretische Abhängigkeiten nach Gleichung (3.48) auf Seite 35. Die verwendeten theoretischen Parameter und das Verhältnis der Viskositäten werden in Tabelle 5.1 zusammengefaßt.

Neben den experimentellen Daten wird im Bild 5.1 auch die lineare theoretische Abhängigkeit dargestellt, wie sie näherungsweise für Depletionschichten gilt, die deutlich größer sind als Dicke der Doppelschicht (S. 35 Gl. (3.48) ). Die beiden freien Parameter, lambda sowie die Viskosität eta0 an der Oberfläche der haarigen Schicht des Erythrozyten wurden durch Angleichen der linearisierten Gleichung an die experimentell bestimmten Mobilitätsverhältnisse festgelegt. Beide Parameter


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bestimmen unterschiedliche Eigenschaften des Mobilitätsverhältnisses µs/µDx. Das Maß für die Schichtdicke lambda legt die Steigung in Abhängigkeit von der Debye-Länge fest, während die Viskosität den absoluten Wert von µs/µDx bestimmt. In Tabelle 5.1 werden die ermittelten Werte zusammengefaßt.

Der Längenparameter lambda lag in der gleichen Größenordnungen wie der Gyrationsradius der Dextran-Moleküle [ 96 ]. Auffällig ist die etwas höhere Viskosität eta0 an der Zelloberfläche verglichen mit der des Lösungsmittels. Diese Viskositätszunahme ist auf an der Erythrozytenoberfläche immobilisierte Dextranmoleküle zurückzuführen. Inwieweit die Dextranmoleküle adsorbiert sind oder auch nur eine hydrodynamische Wechselwirkung mit der Zelloberfläche eingehen, läßt sich durch Elektrophorese nicht entscheiden [ 10 ].

Tabelle 5.1: Zusammenstellung der theoretische Viskositätsverhältnisse eta0/etaseta0: an der Zelloberfläche, siehe Kapitel 3.2 ), Viskositätsverhältnis der Dextranlösung zu den Salzlösungen etaDx/etas und die Dicke der Depletionschicht lambdafür fixierte Erythrozyten in unterschiedlichen Dextran Lösungen.

Dextran [kD] Dextran [g/dl] etaDx/etas eta0/etas lambda[nm]

71

2

1,73

1,11

4,4

71<1> 4 2,64 1,23 2,9

464

2

2,46

1,11

13,0

464

3

3,72

1,22

11,9

2.400 2 3,61 1,11 18,2

Im Bild 5.2 werden die Verläufe der Viskositäten in Abhängigkeit vom Abstand zur Zelloberfläche für verschiedene Dextranlösungen dargestellt. Die Berechnung der Profile erfolgte unter der Annahme des exponentiellen Viskositätsverlaufes, wie er in der Gleichung (3.47 ) auf Seite 35 beschrieben wird. In diese Gleichung wurden die theoretischen und experimentellen Werte aus Tabelle 5.1 eingesetzt. Zu sehen sind die Profile von Dextranlösungen mit 2 und 4 g/dl 71 kDa Dextran, 2 und 3 g/dl 464 kDa Dextran und 2 g/dl 2400 kDa Dextran. Nur bei den Lösungen mit 71 kDa Dextran wurde annähernd der Viskositätswert der Lösungen in einem Abstand erreicht, der geringer war als die Debye-Länge bei der niedrigsten verwendeten Ionenstärke.


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Bei einem Vergleich der unterschiedlichen Lösungen mit gleicher Konzentration aber unterschiedlichen Molekulargewichten fällt im Bild 5.2 für niedrige Oberflächenabstände auf, daß beim geringsten Molekulargewicht von 71kD die Viskosität am größten war. Der Vergleich zwischen dem 464kD und dem 2400kD lieferte einen etwas größeren Viskositätswert des 464kD Dextran bis zu einer Distanz von ca. 13nm. Bei größeren Abständen zur Oberfläche kehrte sich diese Reihenfolge um. Dann wurde die größere Viskosität der höhermolekularen Dextranlösungen entscheidend. Bei geringen Oberflächenabständen machte sich dagegen der steilere Viskositätszuwachs der Dextranlösungen mit niedrigerem Molekulargewicht bemerkbar.

Bild 5.2: Viskositätsprofile als Funktion des Abstandes von der Partikeloberfläche für unterschiedliche Dextrankonzentrationen und Molekulargewichte nach Gleichung (3.47 ) auf Seite 35. Die verwendeten Parameter sind in Tabelle 5.1 zu finden.

Die experimentell ermittelten Mobilitätsverhältnisse in Bild 5.1 spiegeln die in Bild 5.2 berechneten Viskositätsprofile wieder. Nach den Viskositätsprofilen sollten die fixierten Erythrozyten bis zu einer Debye-Länge von 11 nm in der 71 kDa Dextranlösung (2 g/dl) eine geringere Mobilität haben als in den Lösungen mit 464 kDa und 2400 kDa Dextran. Bei größerer Debye-Länge müßten dagegen die Mobilitätsverhältnisse, die in der 71 kDa Lösung gemessen wurden, kleiner werden als die in den 464 kDa und 2400 kDa Lösungen. Der Unterschied zwischen den


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Viskositätsprofilen des 464 kDa und 2400 kDa Dextran ist bis zu einem Oberflächenabstand von 25 nm nicht allzu gravierend. Bis zu einer Debye-Länge um 15 nm ist eine etwas größere Mobilität in der 464 kDa Lösung zu erwarten. Oberhalb dieses Wertes sollte die Mobilität etwas unterhalb der Mobilität in der 2400 kDa Lösung zu finden sein.

Die elektrophoretischen Mobilitätsverhältnisse im Bild 5.1 stimmen mit den obigen Deutungen der Viskositätsprofile gut überein. Bei einer Debye-Länge um 14 nm schneiden die Mobilitätsverhältnisse der fixierten Erythrozyten in der 71 kDa Lösung die in den 464 kDa und 2400 kDa Lösungen. Bei niedrigen Ionenstärken liegt die Mobilität im 71 kDa Dextran dann deutlich über den Verhältnissen wie sie bei 464 kDa und 2400 kDa zu finden sind. Bei der niedrigsten Ionenstärken ist das Mobilitätsverhältnis in der 464 kDa Lösung etwas größer als in der 2400 kDa Lösung, obwohl nach den Viskositätsprofilen das Gegenteil eintreten sollte. Die nach den Viskositätsprofilen zu erwartenden Unterschiede sind auch nur gering.

5.2. Elektrorotation in Dextranlösungen

Als erstes soll der Einfluß des Molekulargewichtes des verwendeten Dextran auf die Elektrorotation im alpha-Dispersionsbereich untersucht werden. Dazu werden im Bild 5.3 Elektrorotationsspektren von fixierten Erythrozyten bei einer Leitfähigkeit von 2,1 mS/m im Frequenzbereich zwischen 32 Hz und 2 kHz dargestellt. Wie bereits im Kapitel 4 beschrieben, läßt sich in diesem Frequenzbereich bei fixierten Erythrozyten nur eine Rotation parallel zur Feldrotation beobachten. Die Spektren wurden jeweils in Lösungen mit 71 kDa Dextran bei einer Konzentration von 4 g/dl, 464 kDa Dextran bei einer Konzentration von 3 g/dl, 2400 kDa Dextran bei einer Konzentration von 2 g/dl sowie in einer Kontrollösung ohne Dextran aufgenommen. Die unterschiedlichen Konzentrationen wurden gewählt, um alle Spektren bei vergleichbarer Viskosität aufzunehmen.

Die Viskosität betrug jeweils 2,3 mPas für 71 kDa Dextran, 3,4 mPas für 464 kDa Dextran und 3,5 mPas für 2400 kDa Dextran. Bei kleinen Rotationsgeschwindigkeiten soll diese normalerweise proportional zum Kehrwert der Viskosität sein. Dennoch war die Rotationsgeschwindigkeit in der Lösung mit 2400 kDa größer als in den übrigen


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Dextranlösungen. Auch der Vergleich zwischen den Spektren im 464 kDa Dextran und im 71 kDa Dextran widersprach der zu erwartenden Proportionalität. Um die Spektren in den Dextranlösungen quantitativ mit dem Kontrollspektrum zu vergleichen, sind im Bild 5.4 die Verhältnisse der Rotationsgeschwindigkeiten in der Kontrollösung zu denen in den Dextranlösung in Abhängigkeit von der Feldfrequenz aufgetragen. Zum Vergleich wurden in der Abbildung auch die Viskositätsverhältnisse dargestellt. Das Verhältnis in der 2400 kDa Lösung lagen über den gesamten Frequenzbereich deutlich unter dem Verhältnis der Viskositäten. Beim 464 kDa Dextran war dieses ebenfalls immer unterhalb zu finden, allerdings ist der Unterschied bei Frequenzen kleiner als 100 Hz nicht mehr so signifikant. Beim 71 kDa Dextran war die Rotationsgeschwindigkeit unterhalb von 100 Hz sogar langsamer als eigentlich zu erwarten wäre und oberhalb wie bei den anderen Lösungen schneller, wenn auch bei weitem nicht so deutlich wie beim höhermolekularen Dextran. Dieses Rotationsverhalten läßt sich auf der Grundlage der Viskositätsprofile ( Bild 5.2 ), die sich durch einen Depletioneffekt ausbilden, sowie dem elektroosmotischen Konzept der alpha-Dispersion interpretieren.

Die Viskositäten der Lösung mit 464 kDa Dextran sowie die mit 2400 kDa Dextran weichen nur geringfügig voneinander ab. Innerhalb der Depletionschicht unterscheiden sich die Viskositätsprofile jedoch erheblich ( Bild 5.2 ). Durch die schmalere Depletionschicht bei der 464 kDa Dextran-Lösung wird die Volumenviskosität bereits bei kleineren Oberflächenabständen erreicht. Bei einer Konzentration von 2 g/dl betrug der experimentell ermittelte Parameter lambda, der die effektive Dicke der Depletionschicht beschreibt, bei einem Molekulargewicht von 2400 kDa 18,2 nm und bei 464 kDa nur 13,0 nm (siehe Tabelle 5.1 ). Unter den gewählten experimentellen Bedingungen lag die Debyelänge bei 23 nm. Wegen der Unterschiede in der Dicke der Depletionschicht erfährt der elektroosmotische Fluß in den Lösungen mit höhermolekularen Dextran einen geringeren Widerstand. So ist zum Beispiel der Reibungswiderstand in der Lösung mit dem 2400 kDa Dextran geringer als in der 464 kDa Lösung, weil die Depletionschicht in der höhermolekularen Lösung weiter in die elektrische Doppelschicht vordringt. Analog läßt sich die Rotationsgeschwindigkeit beim 71 kDa Dextran im Bild 5.3 verstehen. Die Lösung des 71 kDa Dextran hatte bei einer


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Konzentration von 4 g/dl einen Depletionparameter lambda von 2,9 nm, was nur knapp einem Achtel der Debyelänge entspricht. Dies erklärt die geringe aber noch sichtbare Auswirkung des Depletioneffektes auf die Rotation zwischen 200 Hz und 2 kHz.

Bild 5.3: Vergleich von Elektorotationsspektren fixierter Erythrozyten in Natriumchlorid- und Dextranlösungen. Molekulargewichte und Konzentrationen werden in der Legende angegeben. Alle Rotationsspektren wurden bei einer Feldstärke von 8·103 V/m und einer Leitfähigkeit von 2,1 mS/m aufgenommen. Die Standardabweichung lag zwischen 8 und 16 Prozent.

Auffällig ist im Bild 5.4 , daß die Rotationsverhältnisse unterhalb von 100 Hz in den Lösungen mit 71 kDa und 464 kDa Dextran deutlich größer waren. Beim 71 kDa Dextran wurde sogar das Viskositätsverhältnis überschritten, d.h. die Rotation war langsamer als mit der erhöhten Viskosität klassisch zu erwarten wäre. Trotz dieses Widerspruches erkennt man deutlich den Einfluß des Depletioneffektes auf die Rotationsverhältnisse im Bereich der alpha-Dispersion. Auch die in den elektrophoretischen Daten ermittelte Abhängigkeit von den Molekulargewichten läßt sich in der gleichen Reihenfolge im Bild 5.4 wiedererkennen.


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Bild 5.4: Verhältnisse der Rotationsgeschwindigkeiten aus Bild 5.3 in Dextranlösung zur Kontrolle. Die gestrichelten Linien geben die entsprechenden Viskositätsverhältnisse an.

Bild 5.5: Vergleich von Elektorotationsspektren fixierter Erythrozyten in Natriumchloridlösung und Dextranlösung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 2400 kDa Dextran. Die Rotationsspektren wurden bei einer Feldstärke von 8·103 V/m und bei einer Leitfähigkeit von 3,9 mS/m aufgenommen.


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In Bild 5.5 sind Elektrorotationsspektren im niederfrequenten Bereich zu sehen, bei denen die Konzentration von 2400 kDa Dextran variiert wurde. Die Spektren wurden bei einer Leitfähigkeit um 4.0 mS/m aufgenommen. Trotz einer fast vierfachen Viskosität der Lösung mit 2 g/dl Dextran gegenüber der Kontrollösung und einer mehr als siebenfachen mit 4 g/dl Dextran sind die Rotationsgeschwindigkeiten im Durchschnitt über den gemessenen Frequenzbereich nur um einen Faktor von 1,8 (2 g/dl) und 3,2 (4 g/dl) reduziert. Im Bild 5.6 werden zur Verdeutlichung noch die relativen Rotationsspektren im Vergleich zu den Viskositäten der Lösungen dargestellt. Bei der verwendeten Ionenstärke beträgt die Debyelänge ungefähr 16nm.

Bild 5.6: Verhältnisse der Elektrorotationsspektren aus Bild 5.5 in 2400 kDa Dextranlösung zur Kontrolle. Die gestrichelten Linien geben die entsprechenden Viskositätsverhältnisse an.

Im Bild 5.6 fällt außerdem der monotone Anstieg des Rotationsverhältnisses bei einer Konzentration von 4 g/dl mit zunehmender Feldfrequenz auf. Der Einfluß einer Depletionschicht beim Übergang vom alpha- zum beta-Dispersionsbereich wird im Bild 5.7 in einem Frequenzbereich von 64 Hz bis 2 MHz dargestellt. Zu sehen ist das Verhältnis der Rotationsgeschwindigkeiten von fixierten Erythrozyten in einer Natriumchloridlösung zu dem in einer 2400 kDa Dextranlösung mit einer Konzentration von 2 g/dl. Die Spektren wurden bei einer externen Leitfähigkeit von 2,1 mS/m aufgenommen. Deutlich zu erkennen ist die Zunahme des Rotationsverhältnisses mit steigender Feldfrequenz bis in den Bereich von 10-100kHz


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hinein. Von hier an rotieren die Erythrozyten innerhalb der Fehlergrenzen mit der nach der Viskosität zu erwartenden Geschwindigkeit. Diese Beobachtungen untermauern zum einen die Unabhängigkeit der beta-Dispersion vom Depletioneffekt und zum anderen den deutlichen Zusammenhang zwischen der Depletionschicht und der Elektrorotation im alpha-Dispersionbereich.

Bild 5.7: Verhältnis der Rotationsgeschwindigkeiten von fixierten Erythrozyten in Natriumchloridlösung zu denen in 2 g/dl Dextran 2400 kDa Lösung in Abhängigkeit von der externen Feldfrequenz. Die gestrichelte dicke Linie entspricht dem Viskositätsverhältnis. Die Daten wurden bei einer Leitfähigkeit von 2,1 mS/m und einer Feldstärke von 8·103 V/m aufgenommen.

Um die Aussagekraft dieser Ergebnisse zu verdeutlichen, soll zum Abschluß noch qualitativ die Energiedissipation von hydrodynamischen und elektroosmotischen Strömungen verglichen werden. Elektrokinetische Wechselwirkungen treten im Nanometerbereich auf. Im Gegensatz dazu reichen die hydrodynamischen Kräfte, die zum Beispiel durch die Wechselwirkung eines externen elektrischen Feldes auf den induzierten Dipol eines in einer Lösung befindlichen Partikels wirken, wesentlich weiter. Im Bild 5.8 wird dieser Sachverhalt an Hand zweier Geschwindigkeitsprofile dargestellt. Dazu wird von einer Oberfläche ausgegangen, an der die Geschwindigkeit null ist und von dort beginnend mit dem senkrechtem Abstand zunimmt. Beim elektroosmotischen Profil wird der Grenzwert der Geschwindigkeit bei einem Abstand erreicht, der in der Größenordnung der Debye-Länge liegt. Das hydrodynamische Profil


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nähert sich dagegen unabhängig von der Debye-Länge allmählich dem endgültigen Wert, welcher erst bei wesentlich größeren Abständen erreicht wird.

Im Bild 5.8 wird auch noch der Einfluß des verwendeten Polymers und der Ionenstärke der Lösung illustriert. Zu diesem Zweck sind qualitativ die Größen von zwei Depletionschichten und eine Debye-Länge eingezeichnet. Man erkennt für die illustrierten Fälle zum einen den Einfluß der Größe der Depletionschicht und zum anderen den Einfluß einer größer werdenden Debye-Länge. Im Falle der Elektrorotation im alpha - Dispersionsbereich führt so eine Debye-Länge, die größer als die Depletionschicht ist, zu einem größeren Einfluß der Lösungsviskosität auf die Rotationsgeschwindigkeit.

Bild 5.8: Qualitativer Vergleich eines elektroosmotischen und eines hydrodynamischen Geschwindigkeitsprofils in Abhängigkeit vom Abstand zur Oberfläche. lambda2400kD und lambda71kD markieren die Dicke der Depletionschicht für unterschiedliche Molekuargewichte des verwendeten Polymers.

5.3. Zusammenfassung und Schlußfolgerung

Die experimentellen und theoretischen Resultate zeigen deutlich den Einfluß, den die Dextrandepletionschicht auf die Elektrorotation im Niederfrequenzbereich bei fixierten Erythrozyten hat. Im Gegensatz dazu existiert im Bereich höherer Frequenzen bzw. der beta - Dispersion nur ein geringer oder gar kein Einfluß von Dextrandepletionschichten auf


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das Elektrorotationsverhalten. Die experimentellen Ergebnisse dieses Kapitels bestätigen also die Vermutung, daß ein wesentlicher Anteil der Kräfte im alpha-Dispersionsbereich elektroosmotischer Natur sein muß [ 58 ]. Besonders deutlich wird dies auch beim Übergang zu höheren Frequenzen.

Ein weiterer Einfluß, der vorerst hier nicht berücksichtigt wurde, ist die Adsorption von Polymeren. Sicher wird auch dies Einfluß auf die Diffusionszeiten der Ionen und somit auf den Verlauf der Spektren haben. Damit die Elektrorotation aber zu einem geeigneten Instrument beim Untersuchen von Polymerdepletion und -adsorption werden kann, müssen noch theoretische Hindernisse genommen werden. Zum einen wird eine Verallgemeinerung auf haarige Oberflächen benötigt, die auch den Einfluß ortsabhängiger Viskositätsprofile berücksichtigt. Mit einem derartigen Modell wäre eine quantitative Interpretation der dargestellten Erythrozytenspektren in Dextranlösungen möglich. Außerdem muß geklärt werden, inwieweit sich die alpha- und beta-Dispersion beeinflussen und in einer Theorie vereinigt werden können.

Die Elektrorotation könnte gegenüber der Elektrophorese erhebliche experimentelle Vorteile für die Bestimmung von Depletioneffekten aufweisen. Bei der Elektrophorese muß die Debye-Länge variiert werden, um die Ausmaße der Depletionschicht zu bestimmen. Bei der Rotation könnte hingegen die Variation der Feldfrequenz ausreichen, um z.B. beim Übergang vom alpha- zum beta-Gebiet die Ausmaße und das Viskositätsprofil einer Depletionschicht zu bestimmen.


Fußnoten:
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