Plath, Kathrin: Zum Mechanismus der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum der Hefe


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Anhang B. 7. ANLAGEN

B.1. Anlage 1

Hanein, D., Matlack, K.E., Jungnickel, B., Plath, K., Kalies, K.U., Miller, K.R., Rapoport,T.A.,
Akey, C.W. (1996). Oligomeric rings of the Sec61p complex induced by ligands required
for protein translocation. Cell 87:721-732

B.2. Anlage 2

Finke, K.*, Plath, K.*, Panzner, S., Prehn, S., Rapoport, T.A., Hartmann, E., Sommer, T.
(1996). A second trimeric complex containing homologs of the Sec61p complex functions
in protein transport across the ER membrane of S. cerevisiae. EMBO J. 15:1482-1494.
(*both authors contributed equally to this work)

B.3. Anlage 3

Plath, K., Mothes, W., Wilkinson, B.M., Stirling, C.J., Rapoport, T.A. (1998). Signal
sequence recognition in posttranslational protein transport across the yeast ER
membrane. Cell 94:795-807.

B.4. Anlage 4: Das Sec61p-Oligomer bindet an den Austrittsort der naszierenden Kette am Ribosom

Abbildung 1 und 2

Abbildung 1: Ribosomen binden spezifisch an den Sec61p-Komplex in Membranen

Um die dreidimensionale Struktur des Ribosom-Sec61p-Komplexes ermitteln zu können, mußte gesichert werden, daß die Sec61p-Bindungsstellen aller Ribosomen in der für die Elektronen-mikroskopie bereitgestellten Probe gesättigt sind und gleichzeitig kaum ungebundener Sec61p-Komplex in dieser Probe enthalten ist. In die Bildverarbeitung eingehende Bilder freier Ribosomen führen zu einem dreidimensionalen Bild des Ribosom-Sec61p-Komplexes, in dem die Intensität des Sec61p-Komplexes deutlich schwächer ist als die des Ribosoms. Freie Ribosomen können jedoch im Elektronenmikroskop nicht von Ribosom-Sec61p-Komplexen unterschieden werden (siehe Abbildung 2). Der gleichmäßig an den elektronenmikroskopischen Träger bindende freie Sec61p-Komplex stört die Auswertung ebenfalls, da die Ribosomen nicht klar vom Hintergrund abgrenzbar sind. Um die beiden Bedingungen zu erfüllen, wurden gereinigte Ribosomen der Hefe (Bahn 1 des Coomassie-gefärbten SDS-Polyacrylamidgels) unter physiologischen Salzkonzentrationen mit Proteoliposomen inkubiert, die den Sec61p-Komplex enthalten (in Bahn 2 mit Vierecken markiert), und nicht einfacherweise mit dem Sec61p-Komplex in Detergenzlösung. Die im SDS-Gel sichtbaren Verunreinigungen der Sec61p-Komplex-Präparation werden nicht in Proteoliposomen integriert. Durch die Flotation der Membranen in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten konnten die an die Vesikel gebundenen Ribosomen isoliert werden (Bahn 3). In diesem Schritt sedimentieren ungebundene Ribosomen (Bahnen 5 und 7). Die Bindung der Ribosomen an die Proteoliposomen erfolgt spezifisch über eine Interaktion mit dem Sec61p-Komplex, da die Ribosomen nicht mit Liposomen flotierbar sind (vergleiche Bahnen 4, 6 und 8 mit Bahnen 3, 5 und 7). Die Lipidmoleküle der flotierten Vesikel in den Bahnen 3 und 4 sind durch Sterne gekennzeichnet. Nachdem die flotierten Vesikel mit Digitonin solubilisiert wurden, konnten die Ribosom-Sec61p-Komplexe durch Sedimentation von den freien Sec61p-Komplexen abgetrennt und in einem Digitonin-haltigen Puffer elektronenmikroskopisch analysiert werden (siehe Abbildungen 2 und 3).

Abbildung 2: Kryo-elektronenmikroskopische Aufnahme der Ribosom-Sec61p-Komplexe in Detergenzlösung

Die auf ein mit einer Kohlenstoffschicht überzogenes Trägernetz aufgebrachte Probe wurde sehr schnell durch Eintauchen in flüssiges Ethan bei einer Temperatur von -196°C eingefroren.Die elektronenmikroskopische Aufnahme der tiefgefrorenen Probe zeigt die Ribosomen-Sec61p-Komplexe in vielen verschiedenen Orientierungen. Einige Beispiele sind durch die Pfeile hervorgehoben.

Abbildung 3 und 4

Abbildung 3: Die dreidimensionale Rekonstruktion des Ribosom-Sec61p-Komplexes

Bilder von 6000 Ribosom-Sec61p-Komplexen wurden digitalisiert und durch verschiedene Bildverarbeitungsverfahren so zusammengestellt, daß ein dreidimensionales Bild des Komplexes mit einer Auflösung von ungefähr 30Å entsteht. Die Seitenansicht (A) zeigt, daß sich der oligomere Sec61p-Komplex in einem Abstand von 15-20Å zur großen Untereinheit des Ribosoms befindet. Das Sec61p-Oligomer ist nur über eine einzige Ausstülpung (Pfeil) mit dem Ribosom verbunden. Das Sec61p-Oligomer könnte von vier heterotrimeren, möglicherweise unterschiedlich ausgerichteten Sec61p-Komplexen gebildet werden, da die vom Ribosom weggewandte Oberfläche des Sec61p-Zylinders (in B) deutlich vier Massenschwerpunkte aufweist, deren Positionen in dem Einsatz durch Punkte gekennzeichnet sind. In einer Serie von 5Å dicken Schnitten durch den Ribosom-Sec61p-Komplex (C) wird ein ribosomaler Tunnel sichtbar, der genau in den Mittelpunkt des oligomeren Sec61p-Komplexes mündet und wahrscheinlich dem Kanal entspricht, durch den naszierende Polypeptidketten das Ribosom verlassen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß die naszierende Kette direkt vom Peptidyl-transferase-Zentrum im Ribosom durch die oligomere Struktur des Sec61p-Komplexes in das Lumen des ER geleitet werden kann. Der angenommene Weg der naszierenden Kette ist durch eine gestrichelte Linie in Schnitt 4 gekennzeichnet. Eine kürzlich erhaltene verbesserte dreidimensionale Struktur des Ribosom-Sec61p-Komplexes mit einer Auflösung von ungefähr 25Å, in die die Information von 10000 einzelnen Partikel einging, zeigt das Sec61p-Oligomer mit einer zentralen Pore, die sich durch das gesamte Partikel erstreckt (nicht gezeigte Daten).

Abbildung 4: Kryo-elektronenmikroskopische Aufnahmen von einzelnen Ribosomen, die an den Sec61p-Komplex in Membranen gebunden sind

Um herauszufinden, ob die deutliche Trennung zwischen dem Ribosom und dem oligomeren Sec61p-Komplex durch die Solubilisierung des Komplexes in Digitonin hervorgerufen wurde, untersuchten wir den Ribosom-Sec61p-Komplex auch direkt in Membranen. Dazu wurden Ribosomen (Klammer) mit Proteoliposomen (Pfeil) inkubiert, die den gereinigten Sec61p-Komplex enthalten, die Vesikel flotiert und anschließend durch die Kryo-Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Eine dreidimensionale Rekonstruktion zeigt, daß das Ribosom mindestens 15Å von der Membranoberfläche entfernt sein muß (nicht gezeigte Ergebnisse).

B.5. Anlage 5: Die cytosolischen Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors werden bei seiner Bindung an den Sec-Komplex freigesetzt

Abbildung 1: Interaktionen des Prepro-Alphafaktors im Cytosol

Um die Umgebung des Prepro-Alphafaktors im Cytosol zu untersuchen, wurde das photoreaktive Lysyl-Derivat anstelle von Lysinen in die Polypeptidkette eingebaut. Neben dem Wildtyp-Prepro-Alphafaktor (wt), der neun Lysine in seiner C-terminalen Hälfte trägt, verwendeten wir 37 Prepro-Alphafaktor-Mutanten mit jeweils einem einzigen Lysin an der angegebenen Position (Pos.). Die Translation der entsprechenden mRNAs wurde in der Gegenwart von 35S-Methionin und der modifizierten Lsysl-tRNA im Retikulozytenlysat durchgeführt, die Synthese mit Cycloheximid gestoppt und alle Ribosomen durch Zentrifugation entfernt. Ein Teil der Probe wurde mit UV-Licht bestrahlt und anschließend ebenso wie der unbehandelte Teil durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die Bereiche des Gels, in denen die Quervernetzungs-produkte des Prepro-Alphafaktors zu cytosolischen Proteinen beobachtet werden können, sind durch Klammern gekennzeichnet. Deutlich wird, daß jede untersuchte Position des vollständig im Retikulozytenlysat synthetisierten Prepro-Alphafaktors zu einer Vielzahl von cytosolischen Proteinen vernetzt werden kann. An den Positionen 5-28 tritt ein Quervernetzungsprodukt auf, das eine größere Mobilität im SDS-Gel als der Prepro-Alphafaktor selbst besitzt (Pfeil). Diese Beobachtung läßt sich am besten damit erklären, daß die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors im Cytosol eine Schleifenstruktur bildet, deren Abschnitte miteinander vernetzt werden können.

Abbildung 2: Der Prepro-Alphafaktor ist Bestandteil verschiedener translokations-kompetenter Komplexe

(A) Im Retikulozytenlysat synthetisierte Prepro-Alphafaktor-Mutanten, die das photoreaktive Lysyl-Derivat entweder an der Position 5 (K5 ppaF, linkes Bild) oder an mehreren Positionen im C-Terminus (wt ppaF, rechtes Bild) tragen, wurden mit UV-Licht bestrahlt und ihre cytosolischen Vernetzungsprodukte anschließend entweder direkt durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert (Bahn 2) oder erst unter nativen Bedingungen mit Antikörpern gegen Hsp70 (Bahn 4) oder Tcp1a (Bahn 5) immunopräzipitiert. Durch Immunopräzipitationen unter denaturierenden Bedingungen mit den beiden spezifischen Antikörpern konnte gezeigt werden, daß jeweils die markierte Bande dem Hsp70- bzw. Tcp1a-Quervernetzungsprodukt des Prepro-Alphafaktors entspricht (nicht gezeigt). Tcp1a, eine Untereinheit des TRiC-Komplexes, und Hsp70 sind demnach Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors im Retikulozytenlysat. Sie sindsowohl in der Nähe der Position 5 der Signalsequenz als auch in der Nähe der C-terminalen Hälfte des Prepro-Alphafaktors nachweisbar. Da unter nativen Bedingungen mit den Antikörpern gegen Hsp70 bzw. Tcp1a neben den Hsp70- bzw. Tcp1a-Quervernetzungsprodukten auch andere Vernetzungsprodukte des Prepro-Alphafaktors immunopräzipitiert werden konnten, ist der Prepro-Alphafaktor offensichtlich ein Bestandteil verschiedener cytosolischer Komplexe, die entweder das Tcp1a- oder das Hsp70-Quervernetzungsprodukt enthalten.

Diese Komplexe des Prepro-Alphafaktors konnten im Saccarosegradienten voneinander getrennt werden (B). Dazu wurde der im Retikulozytenlysat quervernetzte K5 ppaF bzw. wt ppaF auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (300-1000mM) aufgetragen und in einem Beckman SW55-Rotor bei 48000rpm für 6 Stunden zentrifugiert. Die Analyse der Fraktionen erfolgte durch SDS-PAGE und Autoradiographie. Die Bereiche des Gels, in denen die Quervernetzungsprodukte des Prepro-Alphafaktors auftreten, sind durch Klammern gekennzeichnet. Das Tcp1a-Quervernetzungsprodukt (Viereck) ist im Gegensatz zu dem Hsp-70-Quervernetzungsprodukt (Dreieck) in einem Komplex mit einem Molekulargewicht von ungefähr 700kD enthalten. Der Prepro-Alphafaktor ist daher wahrscheinlich nicht nur mit einer Untereinheit des TRiC-Komplex assoziiert, sondern mit dem gesamten hetero-oligomeren Chaperon-Komplex. Nur ein einziges der zum K5 Prepro-Alphafaktor vernetzbaren cytosolischen Proteine ist ein Bestandteil aller cytosolischen Komplexe des Prepro-Alphafaktors (Stern).

Um zu untersuchen, ob der in den verschiedenen Komplexen vorliegende Prepro-Alphafaktor translokationskompetent ist (C), wurde der im Retikulozytenlysat synthetisierte Wildtyp-Prepro-Alphafaktor, der nur unmodifizierte Lysine trägt, im Saccharosegradienten aufgetrennt. Gleiche Mengen des radioaktiv markierten Prepro-Alphafaktors der einzelnen Fraktionen und des Ausgangsmaterials (load) wurden mit Proteoliposomen, die den Sec-Komplex, Kar2p und ATP enthalten, inkubiert und das nicht translozierte Material anschließend durch die Proteinase K abgebaut. Nach Abbruch der Reaktion mit TCA wurden alle Proben mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die mit einem Phosphoimager bestimmte Menge des proteasegeschützten Prepro-Alphafaktors ist das Maß für die Effizienz der Reaktion (%Transport). Der Prepro-Alphafaktor der verschiedenen Fraktionen wird genauso effizient in die Vesikel transportiert wie der im vollständigen Retikulozytenlysat vorliegende Prepro-Alphafaktor (load).

Abbildung 3: Die cytosolischen Interaktionspartner werden bei der Bindung an den Sec-Komplex vom Prepro-Alphafaktor abgelöst

Das photoreaktive Lysyl-Derivat wurde wie in (A) beschrieben an verschiedenen Positionen in die Polypeptidkette des Prepro-Alphafaktors eingebaut (Pos.). Die Proben wurden geteilt und eine Hälfte mit Proteoliposomen, die den Sec-Komplex (Sec) enthalten, inkubiert, so daß der Prepro-Alphafaktor effektiv an den Sec-Komplex binden kann. Anschließend wurden alle Proben mit UV-Licht bestrahlt und mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Wie bereits in Abbildung 1 gezeigt, treten in Abwesenheit des Sec-Komplexes an allen Positionen des Prepro-Alphafaktors eine Vielzahl cytosolischer Quervernetzungsprodukte auf. Diese sind zum Beispiel für die Positionen 5-14 des Prepro-Alphafaktors durch Klammern hervorgehoben. Durch den Zusatz des Sec-Komplexes nimmt einerseits die Intensität der cytosischen Quervernetzungsprodukte deutlich ab, andererseits tauchen die Quervernetzungsprodukte des Prepro-Alphafaktors zu den Komponenten des Translokationsapparates auf. Die Quervernetzungsprodukte des Prepro-Alphafaktors zu Sec61p sind für die Positionen 5-14 durch Vierecke gekennzeichnet. Auch die interne Schleifenstruktur der Signalsequenz des cytosolischen Prepro-Alphafaktors (Pfeil) wird anscheinend durch die Bindung an den Sec-Komplex aufgelöst. Nur ein einziges cytosolisches Vernetzungsprodukt bleibt offensichtlich unverändert (Stern). Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die cytosolischen Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors während der Bindung an den Sec-Komplex freigesetzt werden. In Übereinstimmung damit konnte gezeigt werden, daß der an den Sec-Komplex gebundene Prepro-Alphafaktor nur zu den Komponenten des Translokations-apparates, aber nicht zu cytosolischen Proteinen vernetzt werden kann (Anlage 3; Abbildung 3).


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