Plath, Kathrin: Zum Mechanismus der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum der Hefe

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Kapitel 2. ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE

2.1. Der Sec61p-Komplex bildet oligomere Ringstrukturen, die vermutlich protein-leitenden Kanälen der ER-Membran entsprechen

Zahlreiche Experimente deuteten darauf hin, daß Proteine co- und posttranslational durch einen hydrophilen Kanal in der Membran in das ER gelangen, der von dem heterotrimeren Sec61p-Komplex gebildet wird. Es gibt allerdings keinen direkten Beweis, da in den Experimenten zum Nachweis der Kanäle nicht mit rekonstituierten Proteoliposomen aus gereinigten Komponenten gearbeitet wurde. Wir benutzten die Elektronenmikroskopie, um Informationen über die Struktur des Sec61p-Komplexes zu erhalten, und um herauszufinden, wie der Sec61p-Komplex einen proteinleitenden Kanal bilden könnte (Anlage 1).

Experimentelle Herangehensweise

Der Sec61p-Komplex und der Sec-Komplex können aus Membranen des rauhen ER der Hefe gereinigt werden (Panzner et al., 1995). Um die Lipidschicht aufzulösen bzw. hydrophobe Interaktionen zu brechen und damit die integralen Membranproteine freizusetzen, werden die Mikrosomen mit dem Detergenz Digitonin extrahiert. Die gelösten Bestandteile befinden sich nach einem Zentrifugationsschritt im Überstand (Digitoninextrakt). Einige Membranproteine bleiben unter den gewählten Bedingungen mit den sedimentierten Ribosomen assoziiert und können in einem zweiten Schritt durch eine Behandlung mit Puromycin und Hochsalz von den Ribosomen abgelöst und mit Digitonin in Lösung gebracht werden (genannt r ibosome- a ssociated m embrane p roteins = RAMPs). Durch den Einbau eines Puromycinmoleküls in die naszierende Polypeptid-kette wird die Proteinsynthese terminiert und die Kette vom Ribosom entlassen.

Der heterotrimere Sec61p-Komplex ist zum Teil mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert und daher in der RAMP-Fraktion zu finden. Der größere Teil des Sec61p-Komplexes existiert jedoch in freier Form im Digitoninextrakt. Er kann aus beiden Fraktionen nach demselben Protokoll mit Ionenaustauschern gereinigt werden. Dabei wird der Durchlauf einer Q-Sepharose-Säule an SP-Sepharose gebunden. Der Sec61p-Komplex eluiert von diesem Kation-Austauscher bei ungefähr 450mM Kaliumacetat (Panzner et al., 1995).

Der ausschließlich im Digitoninextrakt vorkommende heptamere Sec-Komplex wird nach einem Protokoll isoliert, das Fraktionierungen an einer das Glykoprotein Sec71p bindenden Concanavalin


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A-Säule sowie an einer anti-Sec62p-Matrix einschließt (Panzner et al., 1995). Der gereinigte Sec-Komplex läßt sich mit dem Detergenz Triton X-100 in den heterotrimeren Sec61p-Komplex und den tetrameren Sec62/63p-Komplex dissozieren. Beide Teilkomplexe können anschließend separat gereinigt werden (Panzner et al., 1995). Der Sec-Komplex stellt somit einen weiteren Ausgangspunkt für die Isolation des heterotrimeren Sec61p-Komplexes dar. In exponentiell wachsenden Hefezellen sind ungefähr 10-20% des Sec61p-Komplexes mit Ribosomen assoziiert, ~40% liegen in freier Form und der Rest in Verbindung mit dem Sec62/63p-Komplex vor.

Die gereinigten Proteinkomplexe in Detergenzlösung können durch Negativkontrastierung oder Kryo-Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Bei dem elektronenmikroskopischen Verfahren der Negativkontrastierung wird die auf einem Kohlenstoffträger aufgebrachte Probe mit einer Mischung von Form- und Glutaraldehyd fixiert und anschließend mit dem Schwermetall-salz Uranylacetat inkubiert. Sobald die Probe getrocknet ist, überzieht ein dünner Schwermetall-film den Träger überall dort, wo keine Moleküle absorbiert sind und grenzt so deren Oberfläche ab. Da Elektronen organische Moleküle leichter durchdringen als die umgebende Metallschicht, erhält man im Elektronenmikroskop ein sehr kontrastreiches negatives Bild der Oberflächen-struktur der gebundenen Moleküle. Die erreichbare Auflösung ist durch die Größe der Metallpartikel im Färbemittel begrenzt.

Das Verfahren der Kryo-Elektronenmikroskopie hat gegenüber der Negativkontrastrierung den Vorteil, daß die native Konformation der Moleküle bewahrt wird und die Darstellung der Innenstruktur dreidimensionaler Objekte möglich ist. Dazu wird die Probe auf einen Kohlenstoff-träger aufgebracht und sehr schnell durch Eintauchen in flüssiges Ethan bei einer Temperatur von -196°C eingefroren, wodurch das in ihr enthaltene Wasser glasartig erstarrt ohne zu kristallisieren. Die Probe kann so ohne Fixierung, Färbung und Trocknung in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Probenhalter im Elektronenmikroskop betrachtet werden. Die Intensität der Bestrahlung wird so niedrig gewählt, daß die auf dem Kohlenstoffträger in unterschiedlichen Orientierungen gebundenen Moleküle gerade sichtbar gemacht, jedoch nicht beschädigt werden. Um Details der molekularen Struktur aufzuklären, müssen unabhängig von dem angewandten Verfahren die Informationen vieler einzelner Partikel durch Bildverarbeitungsverfahren zusammengefaßt werden.

Man verwendetet das Verfahren der Gefrierbruch- und Gefrierätz-Elektronenmikroskopie, um Informationen über die Struktur von Proteinkomplexen in Membranen zu erhalten. Zur Rekonstitution in Proteoliposomen werden die Proteinkomplexe in Detergenzlösung mit gereinigten


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Lipiden gemischt. Das Detergenz wird durch Adsorption an eine hydrophobe Oberfläche (SM2-Beads bestehend aus Polystyren) aus dem Gemisch entfernt. Die Proteine integrieren dabei spontan in die Lipidschicht der sich bildenden Vesikel (Görlich et al., 1993; Panzner et al., 1995). Die Membranprobe wird äußerst schnell eingefroren und anschließend gebrochen, wodurch die beiden Lipidschichten voneinander getrennt und Membran-durchspannende Proteine exponiert werden. Um die Oberflächenstrukturen der Proteine besser sichtbar zu machen, verringert man die Eisschicht durch Vakuumsublimation von Wasser. Die entstandenen Bruchflächen werden jetzt mit einem dünnen Film aus Platin bedampft. Der Metallabdruck kann nach Ablösung der Probe mit einer starken Säure im Elektronenmikroskop untersucht werden. Da das Metall aus einem bestimmten Winkel aufgebracht wurde, ist der Überzug an einigen Stellen dicker als an anderen, wodurch ein dreidimensionales Bild entsteht.

Der Sec61p-Komplex liegt in Form oligomerer Ringstrukturen vor

In den ersten Experimenten wurde der aus dem Digitoninextrakt gereinigte Sec61p-Komplex der Hefe in Detergenzlösung elektronenmikroskopisch untersucht. Fast alle Moleküle binden in einer bevorzugten Orientierung an das elektronenmikroskopische Trägernetz und liegen in Form von Ringstrukturen mit einer quasipentagonalen Geometrie vor (Anlage 1; Abbildung 1). Die durch Negativkontrastierung sichtbar gemachten ringförmigen Partikel besitzen einen äußeren Durchmesser von ~82Å und eine zentrale Pore von ~21Å. In der selten beobachteten Seitenansicht ist der Sec61p-Komplex ein zylinderförmiges Partikel mit einer Höhe von ~50-60Å. Aus dem berechneten Volumen der Partikel und ihrer experimentell ermittelten Masse konnte bestimmt werden, daß jede Ringstruktur drei oder vier heterotrimere Sec61p-Komplexe enthält. Auffällig ist die Variabilität des äußeren Durchmessers der Partikel (~+/-2Å) und vor allem die des Durchmessers der zentralen Pore (~+/-3Å). Diese Heterogenität deutet an, daß die Sec61p-Oligomere eine gewisse strukturelle Flexibilität besitzen, die eine variable Zusammensetzung oder unterschiedliche Konformationen der oligomeren Strukturen widerspiegeln könnte.

Wenn der aus dem Digitoninextrakt gereinigte Sec61p-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert wurde, war die Zahl der Ringstrukturen überraschenderweise deutlich reduziert (Anlage 1; Einsatz in Abbildung 3C). Die Integration des Komplexes in die Lipidschicht führt anscheinend zur Dissoziation der in Detergenzlösung beobachteten Oligomere. Da der Sec61p-Komplex im cotranslationalen Transport fest an Ribosomen bindet (Görlich et al., 1992; Jungnickel und Rapoport, 1995) und im posttranslationalen Transport mit dem Sec62/63p-Komplex assoziiert ist (Panzner et al., 1995), ergab sich die Hypothese, daß diese beiden Liganden des Sec61p-Komplexes die Bildung der oligomeren Ringe in Membranen auslösen könnten.


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Tatsächlich wird die Zahl der Ringstrukturen in Proteoliposomen, die den aus dem Digitoninextrakt gereinigten Sec61p-Komplex enthalten, durch den Zusatz von Hefe-Ribosomen deutlich erhöht (Anlage 1; Abbildung 3C). Dagegen konnten keine Ringe nachgewiesen werden, wenn Liposomen mit Ribosomen inkubiert wurden. Die in rekonstituierten Proteoliposomen durch Ribosomen induzierten Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes sind in Größe und Struktur den in Detergenzlösung beobachteten sehr ähnlich. Sie besitzen wie diese eine zentrale Pore, weisen eine quasipentagonale Geometrie auf und haben einen äußeren Durchmesser von ~90Å.

Die Induktion der Ringstrukturen durch Ribosomen ist unabhängig vom Ursprung des Sec61p-Komplexes, da sie in rekonstituierten Membranen nicht nur mit dem aus dem Digitoninextrakt gereinigten sondern auch mit dem aus dem Sec-Komplex isolierten heterotrimeren Sec61p-Komplex beobachtbar ist (Anlage 1; Abbildung 3D). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß ein und derselbe Sec61p-Komplex sowohl den post- als auch den cotranslationalen Transport vermitteln kann.

Oligomere Ringstrukturen konnten ebenfalls in großer Zahl nachgewiesen werden, wenn zusätzlich zum Sec61p-Komplex der Sec62/63p-Komplex in die Membran integriert wurde (Anlage 1; Abbildung 4). Dabei wurden Proteoliposomen analysiert, die entweder den undissoziierten Sec-Komplex oder die beiden aus dem Sec-Komplex isolierten Teilkomplexe zusammen enthalten. Der Sec62/63p-Teilkomplex allein bildet keine Ringstrukturen in Membranen. Auffällig ist, daß der äußere Durchmesser der vom Sec-Komplex gebildeten Ringe mit ~83Å in rekonstituierten Membranen dem der Sec61p-Ringe sehr ähnlich ist, obwohl zusätzlich die Membranproteine des Sec62/63p-Komplexes im Sec-Komplex enthalten sind. Aufgrund der vorgeschlagenen Topologien (Abbildung 3 der Einleitung) ist es vorstellbar, daß sich die Hauptmasse der Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes auf der cytosolischen Seite der Membran befindet und daher nach Gefrierbruch nicht in der Membranebene sichtbar ist.

Die in Detergenzlösung und in rekonstituierten Membranen beobachteten oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes entsprechen wahrscheinlich den proteinleitenden Kanälen der ER-Membran, die zuvor mit elektrophysiologischen und spektroskopischen Methoden im Säugersystem nachgewiesen wurden (Simon und Blobel; 1991; Crowley et al., 1993; 1994). Ein entscheidender Hinweis dafür ist, daß ihre Bildung in Membranen durch die Bindung von Ribosomen bzw. durch eine Interaktion mit dem Sec62/63p-Komplex induziert wird. Die Kanäle wären damit sowohl im co- als auch im posttranslationalen Transport verfügbar. Darüber hinaus liegt die zentrale Pore der Ringstrukturen vermutlich senkrecht zur Membranebene. Die zylinderförmigen Sec61p-Oligomere können in dieser Orientierung mit einer Höhe von ~50-60Å


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die Lipiddoppelschicht (~45Å) vollständig durchspannen. Es ist allerdings nicht klar, ob sich die beobachtete zentrale Pore durch das gesamte Partikel erstreckt, oder ob sie nur eine tiefe Einstülpung an einem Ende darstellt. Ringstrukturen, die denen des gereinigten Sec61p-Komplexes gleichen, konnten auch in nativen Membranen des rauhen ER nachgewiesen werden (Anlage 1; Abbildung 6).

Das Sec61p-Oligomer bindet an den Austrittsort der naszierenden Kette am Ribosom

Eine dreidimensionale Struktur des an das Ribosom gebundenen Sec61p-Oligomers unterstützt die Annahme, daß die oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes proteinleitende Kanäle der ER-Membran darstellen (Anlage 4; auch Beckmann et al., 1997). Um diese dreidimensionale Struktur des Ribosom-Sec61p-Komplexes mit “single-particle“-Kryo-Elektronenmikroskopie und anschließender dreidimensionaler Bildrekonstruktion ermitteln zu können, mußte eine Methode etabliert werden, die die spezifische und effiziente Bindung des Sec61p-Komplexes an Ribosomen und die Entfernung ungebundener Sec61p-Komplexe und freier Ribosomen erlaubt (Anlage 4; Abbildung 1). Dazu wurden gereinigte Ribosomen an den Sec61p-Komplex in der Membran von Proteoliposomen gebunden und die Vesikel anschließend flotiert, um ungebundene Ribosomen abzutrennen. Nach der Solubilisierung der Membranen mit Digitonin konnten die Ribosom-Sec61p-Komplexe durch Sedimentation von den freien Sec61p-Komplexen abgetrennt und anschließend in Digitoninlösung mittels Kryo-Elektronenmikroskopie analysiert werden (Anlage 4; Abbildung 2).

Die dreidimensionale Rekonstruktion des Ribosom-Sec61p-Komplexes (Anlage 4; Abbildung 3) mit einer Auflösung von ungefähr 30Å zeigt den Sec61p-Komplex in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Ergebnissen als eine zylinderförmige Struktur mit einem Durchmesser von ~90Å und einer Höhe von ~40Å. Anstelle der zuvor beobachteten zentralen Pore ist eine leichte Vertiefung sichtbar. Eine kürzlich erhaltene verbesserte dreidimensionale Struktur mit einer Auflösung von 25Å zeigt allerdings eine zentrale Pore, die sich durch das gesamte Sec61p-Partikel erstreckt (nicht gezeigte Ergebnisse). Das Sec61p-Oligomer befindet sich in einer Entfernung von 15-20Å zur großen Untereinheit des Ribosoms. Es ist nur an einer einzigen Stelle über eine Ausstülpung direkt mit dem Ribosom verbunden. Eine nähere Analyse des Ribosom-Sec61p-Komplexes in der Membran von Proteoliposomen zeigte, daß auch der Abstand zwischen Ribosom und Membranoberfläche mindestens 15Å beträgt (Anlage 4; Abbildung 4). Die deutliche Trennung des Sec61p-Oligomers vom Ribosom ist daher kein Artefakt der Solubilisierung.


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Der Mittelpunkt des Sec61p-Zylinders (bzw. die zentrale Pore) liegt in der Verlängerung eines durch die große ribosomale Untereinheit führenden Tunnels. Dieser Tunnel verbindet das aktive Zentrum im Inneren des Ribosoms mit dem Ort auf der Oberfläche des Ribosoms, an dem die naszierende Kette heraustritt (Bernabeu et al., 1983), und leitet vermutlich die naszierende Kette durch die große ribosomale Untereinheit. Die genaue Anordnung des Sec61p-Zylinders unter dem Austrittsort der naszierenden Kette impliziert, daß die Polypeptidkette direkt aus dem ribosomalen Tunnel durch die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers in das ER geleitet werden kann.

2.2. Der dem Sec61p-Komplex verwandte heterotrimere Ssh1p-Komplex spielt eine Rolle beim cotranslationalen Proteintransport in das ER der Hefe

Enno Hartmann entdeckte in der Hefe-Datenbank ein dem Sec61p verwandtes Molekül, das als Ssh1p ( S ec- s ixty one- h omolog 1) bezeichnet wird, und ein homologes Protein des Sbh1p, das wir Sbh2p ( S ec61p b eta h omolog 2) nennen (Anlage 2; Abbildung 1). Das Ssh1p ist dem Sec61p strukturell ähnlich. Wie dieses besitzt es vermutlich zehn Membran-durchspannende Segmente, hat eine Molmasse von ~53 kD und ist ein sehr basisches Protein. Vergleicht man die zu ~30% identischen Aminosäuresequenzen von Ssh1p und Sec61p findet man die größten Ähnlichkeiten in ihren cytoplasmatischen Loop-Bereichen, was für einen gemeinsamen cytoplasmatischen Interaktionspartner spricht. Mit Immunofluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, daß Ssh1p im ER lokalisiert ist (Anlage 2; Abbildung 3). Die Aminosäuresequenzen der beiden Sbh-Proteine sind zu ungefähr 50% identisch. Sbh2p durchspannt mit einem hydrophoben Segment nahe dem C-Terminus wie Sbh1p die ER-Membran vermutlich einmal; der N-Terminus liegt im Cytoplasma (auch Toikkanen et al., 1996).

Wir untersuchten mit genetischen und biochemischen Methoden, ob die beiden neu-entdeckten Proteine Ssh1p und Sbh2p an der Translokation von Proteinen in das ER der Hefe beteiligt sind. Dabei wurde außerdem die Funktion der Sbh1p-Untereinheit des heterotrimeren Sec61p-Komplexes in vivo analysiert.

Ssh1p, Sbh1p und Sbh2p sind für den Proteintransport von Bedeutung

Das SSH1 Gen kann im Gegensatz zu SEC61 ohne Verlust der Überlebensfähigkeit deletiert werden (Anlage 2; Abbildung 4). Eine solche Hefemutante ist jedoch in ihrem Wachstum gegenüber dem Wildtyp leicht gehemmt. Dieser Wachstumsdefekt wird dramatisch verstärkt, wenn die Deletion des SSH1-Gens in einem Stamm vorgenommen wird, dessen SEC61-Genbereits mutiert ist (synthetischer Phänotyp mit dem


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temperatursensitiven sec61-2 Allel; Anlage 2; Abbildung 5). Bei der gewählten Temperatur weist die sec61-2 Mutante allein nur einen geringen Wachstumsphänotyp auf. Die beobachtete genetische Interaktion zwischen Sec61p und Ssh1p deutet darauf hin, daß beide Proteine zumindest teilweise überlappende Funktionen in der ER-Membran besitzen. Da gezeigt werden konnte, daß der Phänotyp der sec61-2 Mutante durch den Abbau des mutierten Sec61p hervorgerufen wird (Biederer et al., 1996), könnte man annehmen, daß Ssh1p bei einer verringerten Sec61p-Konzentration für die Translokationsaktivität der Hefezelle essentiell wird. Bisher konnte allerdings kein Translokationsdefekt in Zellen nachgewiesen werden, die das Ssh1p nicht besitzen (nicht gezeigt und persönliche Mitteilung von B. Wilkinson).

Sbh1p und Sbh2p sind ebenfalls nicht essentiell; das Fehlen von Sbh1p oder Sbh2p hat keinen Effekt auf das Wachstum der Zellen bei allen getesteten Temperaturen. Die Deletion beider SBH Gene resultiert jedoch in einer starken Wachstumshemmung bei hohen Temperaturen und deutlichen Translokationsdefekten (Anlage 2; Abbildung 2). Einerseits akkumulieren in vivo unprozessierte Preproteine der beiden normalerweise ins ER transportierten Proteine Kar2p und Prepro-Alphafaktor im Cytosol dieser Mutante, andererseits ist in vitro die posttranslationale Transportaktivität isolierter Mikrosomen deutlich reduziert.

Im Falle der Deltasbh1- und Deltasbh2-Einzeldeletionsmutanten konnte in vivo keine Akkumulation der unprozessierten Form des co- und posttranslational transportierbaren Kar2p nachgewiesen werden. Der ausschließlich posttranslational transportierte Prepro-Alphafaktor wird jedoch in Zellen, denen nur Sbh1p, aber nicht in solchen, denen allein Sbh2p fehlt, leicht angereichert (Anlage 2, Abbildung 2). Die Tatsache, daß die gleichzeitige Deletion von SBH1 und SBH2 zu deutlichen Translokations-defekten führt, zeigt, daß sowohl Sbh1p als auch Sbh2p zur Translokationskapazität der Zelle beitragen. Die fehlenden oder nur minimalen Translokations- oder Wachstumsdefekte der Deltassh1-, Deltasbh2- und Deltasbh1-Einzeldeletionsmutanten erklären wahrscheinlich, warum diese Proteine zuvor nicht in genetischen Screens nach Hefemutanten, die in der Sekretion von Proteinen gestört sind, identifiziert wurden.

Hefen, denen Ssh1p fehlt, enthalten im Vergleich zu Wildtypzellen deutlich weniger Sbh2p, was vermuten läßt, daß Sbh2p durch eine Interaktion mit Ssh1p stabilisiert wird (Anlage 2; Abbildung 4). Daraus ergab sich die Hypothese, daß Ssh1p und Sbh2p ebenso wie ihre Homologen Sec61p und Sbh1p Bestandteile eines Komplexes in der ER-Membran der Hefe sind.


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Ssh1p und Sbh2p sind Bestandteile eines heterotrimeren Komplexes

Ein beträchtlicher Anteil des Ssh1p und Sbh2p der ER-Membran läßt sich mit Digitonin in Lösung bringen (ungefähr 80%; Anlage 2; Abbildung 8). Coimmunopräzipitationen im Digitoninextrakt deuteten darauf hin, daß Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen eigenständigen Komplex bilden, der nicht mit den Untereinheiten des tetrameren Sec62/63p-Komplexes interagiert (Anlage 2; Abbildung 6A). Durch die biochemische Aufreinigung des Komplexes aus dem Digitoninextrakt konnte diese Annahme bestätigt und darüber hinaus gezeigt werden, daß neben Ssh1p, Sbh2p und Sss1p keine weiteren Proteine in dem sogenannten Ssh1p-Komplex enthalten sind (Anlage 2; Abbildungen 6B und C). Der heterotrimere Ssh1p-Komplex befindet sich wie der Sec61p-Komplex im Durchlauf einer Q-Sepharosesäule und kann mit ungefähr 500mM Kaliumacetat von SP-Sepharose eluiert werden.

Das kleine Protein Sss1p ist eine identische Untereinheit der beiden homologen heterotrimeren Komplexe der Hefe. Ssh1p oder Sbh2p bilden in Wildtyphefen und auch in den verschiedenen Deletionsmutanten keine heterologen Komplexe mit Sec61p oder Sbh1p. Die einzige Ausnahme besteht im Fall der Deltassh1/Deltasbh1-Doppeldeletionsmutante, in der Sbh2p und Sec61p miteinander assoziiert sind (Anlage 2; Abbildungen 6 und 7).

Der Ssh1p-Komplex existiert nicht ausschließlich im Digitoninextrakt. Eine signifikante Menge ist aufgrund der Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen auch in der RAMP-Fraktion zu finden und kann somit erst nach Entlassen der naszierenden Polypeptidketten von den Ribosomen in Lösung gebracht werden (ungefähr 20%; Anlage 2; Abbildung 8). Der Ssh1p-Komplex verhält sich demnach genauso wie der Sec61p-Komplex der Hefe und des Säugers. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß der in Proteoliposomen integrierte Ssh1p-Komplex wie der Sec61p-Komplex spezifisch an gereinigte Ribosomen bindet (nicht gezeigte Ergebnisse). Da für den Säuger-Sec61p-Komplex im rekonstituierten System eine Funktion im cotranslationen Transportmodus demonstriert worden ist (Görlich und Rapoport, 1993), nehmen wir an, daß auch der Ssh1p-Komplex eine Rolle im cotranslationalen Transport von Proteinen spielt. Diese Sicht wird dadurch unterstützt, daß der Ssh1p-Komplex in Detergenzlösung oligomere Ringstrukturen bildet, die denen des Sec61p-Komplexes der Hefe gleichen (nicht gezeigte Ergebnisse).

Im Gegensatz zum Sec61p-Komplex interagiert der Ssh1p-Komplex nicht mit dem tetrameren Sec62/63p-Komplex, um einen stabilen heptameren Sec-Komplex zu formen (Anlage 2; Abbildungen 6). Da nur der heptamere Sec-Komplex, aber nicht einer seiner beiden Teilkomplexe den posttranslationalen Transport


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von Proteinen vermitteln kann (Panzner et al., 1995), postulieren wir, daß der Ssh1p-Komplex keine Funktion im posttranslationalen Proteintransport besitzt. In Übereinstimmung damit akkumuliert der ausschließlich posttranslational transportierbare Prepro-Alphafaktor in Hefezellen, denen Sbh1p fehlt, jedoch nicht in solchen, die kein Sbh2p besitzen (siehe oben). Außerdem ist der allein oder auch zusammen mit dem Sec62/63p-Komplex in Proteoliposomen integrierte Ssh1p-Komplex in Gegenwart von Kar2p und ATP nicht in der Lage, den posttranslationalen Transport verschiedener Testsubstrate zu katalysieren (nicht gezeigte Ergebnisse).

2.3. Die Erkennung der Signalsequenz im posttranslationalen Transportmodus

Der posttranslationale Transport von Proteinen durch die Membran des ER der Hefe gliedert sich in zwei Phasen. Das Translokationssubstrat bindet zunächst in einer Kar2p- und ATP- unabhängigen Reaktion an die cytosolische Seite des Sec-Komplexes in der Membran. Anschließend sind Kar2p und ATP erforderlich, um den Precursor durch einen Kanal in das Lumen des ER zu transportieren (Lyman und Schekman, 1997; Matlack et al. 1997). Während des Bindungsschrittes wird die Signalsequenz des Translokationssubstrats durch den Sec-Komplex erkannt. Der Mechanismus der Signalsequenzerkennung ist nur wenig untersucht und weitgehend unverstanden. Vor allem ist unklar, welche Komponenten des Sec-Komplexes daran beteiligt sind. Das etablierte rekonstituierte System aus gereinigten Komponenten bietet optimale Voraussetzungen um dieser Frage nachzugehen. Fehlt Kar2p in den Proteoliposomen, stellt das an den Sec-Komplex gebundene Substrat ein stabiles Translokationsintermediat dar. Wir wählten einen Photoquervernetzungsansatz, um zu untersuchen, in welcher Umgebung sich die Signalsequenz nach der Bindung an den Sec-Komplex befindet (Anlage 3). Außerdem wurden die Interaktionen des reifen Teils des gebundenen Prepro-Alphafaktors analysiert.

Experimentelle Herangehensweise

Als ein posttranslational transloziertes Preprotein verwendeten wir in diesen Experimenten den Prepro-Alphafaktor (Panzner et al., 1995). Die Translation der mRNA des Prepro-Alphafaktors wird in vitro in Gegenwart von 35S-Methionin im Retikulozytenlysat durchgeführt. Um einen cotranslationalen Transport auszuschließen, wird die Synthese mit Cycloheximid gestoppt und alle Ribosomen werden durch Sedimentation entfernt. Anschließend wird der radioaktiv markierte Prepro-Alphafaktor mit Proteoliposomen, die den Sec-Komplex enthalten, inkubiert. Dabei bindet der Precursor effektiv an den Sec-Komplex, wird aber nicht in das Innere der Vesikel transportiert, da den Proteoliposomen Kar2p fehlt. Zur Untersuchung


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des Bindungsschrittes können anstelle rekonstituierter Proteoliposomen auch Mikrosomen des ER der Hefe verwendet werden. Da diese Kar2p enthalten, muß jedoch ATP im Bindungsansatz depletiert werden, um eine Translokation zu verhindern.

Um herauszufinden, in welcher Umgebung sich der Prepro-Alphafaktor nach der Bindung an den Sec-Komplex befindet, wurde ein Photoquervernetzungsansatz gewählt. Dieser Ansatz beruht darauf, daß während der Synthese am Ribosom chemische Gruppen mittels modifizierter Aminoacyl-tRNAs in die Polypeptidkette eingebaut werden können (Johnson et al., 1976). Da modifizierte Aminoacyl-tRNAs zwar von Ribosomen, modifizierte Aminosäuren aber nicht von den hochspezifischen Aminoacyl-tRNA-Synthetasen akzeptiert werden, dürfen die Aminosäuren erst nach ihrer Übertragung auf die tRNA chemisch verändert werden. So können modifizierte Lysine, die in ihrer Seitenkette eine photoaktivierbare Quervernetzungsgruppe tragen, an Stelle von nativen Lysinen in den Prepro-Alphafaktor eingebaut werden, wenn dessen Synthese in vitro in Gegenwart einer modifizierten Lysyl-tRNA und in Abwesenheit von Lysin durchgeführt wird (Krieg et al., 1996; Kurzchalia et al., 1986). Als photoreaktive Gruppe verwendeten wir die Trifluoromethyl-diazirino-Benzoesäure (Brunner et al., 1980; Wiedmann et al., 1987). Das Reagenz kann mittels eines N-Hydroxy-Succinimidoesters auf die (-Aminogruppe des Lysins der Lysyl-tRNA übertragen werden. Wird die Probe, d.h. der Prepro-Alphafaktor nach seiner Bindung an den Sec-Komplex in Membranen, mit langwelligem UV-Licht bestrahlt, entsteht aus dem Diazirino-Baustein ein sehr reaktives Carben, das kovalente Bindungen zu allen Molekülen in unmittelbarer Nähe ausbildet, egal, ob es sich dabei um Proteine, Lipide oder Wassermoleküle handelt. Mit dieser Methode ist es möglich, die Umgebung der nativen Lysine des zu untersuchenden Proteins zu charakterisieren. Eine Ortsspezifität der Quervernetzung kann erreicht werden, indem alle nativen Lysine des Proteins durch zielgerichtete in vitro Mutagenese der DNA entfernt und einzelne Lysine an den gewünschten Positionen der Polypeptidkette einbaut werden.

Die entstandenen Quervernetzungsprodukte zeichnen sich aufgrund ihres größeren Molekulargewichts durch eine veränderte Beweglichkeit in SDS-Polyacrylamidgelen aus. Die quervernetzten Interaktionspartner des an den Sec-Komplex gebunden Precursors können durch Immunopräzipitationen mit Antikörpern gegen die verschiedenen Sec-Proteine unter denaturierenden Bedingungen identifiziert werden. Quervernetzungsprodukte mit Lipidmolekülen sind durch ihre Spaltbarkeit mit Phospholipase A2 nachweisbar (Martoglio et al., 1995). Alle Quervernetzungsprodukte des gebundenen Prepro-Alphafaktors können auch einfacherweise auf einmal mit dem intakten Sec-Komplex in Digitonin coimmunopräzipitiert werden. Die Membranen werden dazu im Anschluß an die Bindungsreaktion und Bestrahlung mit UV-Licht


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mit Digitonin solubilisiert und der in diesem Detergenz stabile Sec-Komplex mit Antikörpern gegen Sec62p immunopräzipitiert. Unter den gewählten Bedingungen bleibt der gebundene Prepro-Alphafaktor, unabhängig davon, ob er quervernetzt ist oder nicht, fest mit dem Sec-Komplex assoziiert (Matlack et al., 1997). Zur quantitativen Auswertung wurde die Intensität der Quervernetzungsprodukte auf die an den Sec-Komplex gebundene Menge der entsprechenden Lsysl-Mutante des Prepro-Alphafaktors bezogen.

Der reaktive Diazirino-Baustein der Trifluoromethyl-diazirino-Benzoesäure kann auch direkt in den aromatischen Ring eines Phenylalanins eingebaut werden und das modifizierte Phenylalanin (Trifluoromethyl-Diazirino-Phenylalanin) ortsspezifisch mittels der Suppressor-tRNA-Methode in die Polypeptidkette integriert werden (High et al., 1993). Dazu werden einzelne Stopcodons in die DNA eingeführt und diese während der Translation in vitro durch Suppressor-tRNAs, die das modifizierte Phenylalanin tragen, suppremiert. Der Diazirino-Baustein ist in dem in die Polypeptidkette eingebauten Phenylalanyl-Derivat 6Å von der Peptidbindung entfernt, dem gegenüber beträgt dieser Abstand beim Lysyl-Derivat 13Å. Die Einführung der modifizierten Aminosäuren hat keinen Einfluß auf die Translation, Bindung oder Translokation des Prepro-Alphafaktors.

Signalsequenz-abhängige Interaktionen des Prepro-Alphafaktors mit dem Sec-Komplex

Erste Untersuchungen mit dem photoreaktiven Lysyl-Derivat zeigten, daß sich die Position 5 der Signalsequenz des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors in Nachbarschaft zu Sec61p befindet, wohingegen die C-terminale Hälfte des Precursors Sec62p, Sec71p und Sec72p kontaktiert (Anlage 3; Abbildung 1). Um zu überprüfen, ob diese Quervernetzungen die Umgebung von Translokationsintermediaten widerspiegeln, wurde das Verhalten entsprechender Prepro-Alphafaktor-Mutanten mit defekten Signalsequenzen, deren Bindungs- und Transporteffizienz stark reduziert ist, untersucht (Anlage 3; Abbildung 1 und nicht gezeigte Daten). Da die verwendeten Signalsequenzmutanten auch in ihrem Quervernetzungsvermögen zu den Proteinen des Sec-Komplexes deutlich gestört sind, kann man annehmen, daß das beobachtete Quervernetzungsmuster spezifisch für Proteine mit funktionellen Signalsequenzen ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß sich der gebundene Prepro-Alphafaktor in einem translokationskompetenten Zustand befindet. Nach Zugabe von Kar2p und ATP wird er durch den Kanal transportiert und auf der luminalen Seite des Sec-Komplexes freigesetzt (Matlack et al., 1997). Die Intensität der Quervernetzungsprodukte des Prepro-Alphafaktors zu den Sec-Proteinen nimmt dabei dramatisch ab (nicht gezeigte Ergebnisse).


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Die beschriebene Quervernetzung des Prepro-Alphafaktors zu den Sec-Proteinen erfordert außerdem die Assoziation der beiden Teilkomplexe des Sec-Komplexes. Sowohl für den Sec61p- als auch für den Sec62/63p-Komplex allein sind keine Verknüpfungen mit dem Precursor nachweisbar (Anlage 3; Abbildung 2). In Übereinstimmung damit sind beide Teilkomplexe ebenfalls nicht in der Lage, Preproteine zu transportieren oder zu binden (Panzner et al., 1995; Matlack et al., 1997). Die Erkennung der Signalsequenz ist offensichtlich die Voraussetzung für die Bindung des Prepro-Alphafaktors an den Sec-Komplex.

Die Signalsequenz-Bindungsstelle befindet sich an der Grenzfläche des Translokationskanals und der Lipiddoppelschicht

Um die Umgebung der Signalsequenz des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors im Detail zu analysieren, wurde das Lysyl-Reagenz an 15 verschiedenen Positionen der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors eingebaut (Pos. 8-22). Die systematische Studie zeigte, daß die Signalsequenz nicht nur Sec61p sondern auch Sec62p und Sec71p kontaktiert (Anlage 3; Abbildung 3).

Das Ausmaß der Quervernetzung zu Sec61p, Sec71p und Sec62p ist an den einzelnen Positionen der Signalsequenz sehr verschieden. Effiziente Sec62p- und Sec71p-Querver-netzungsprodukte treten an den gleichen, durch 4 oder 5 Aminosäuren voneinander getrennten Positionen auf. Die Sec61p-Quervernetzungsprodukte können interessanterweise in zwei Klassen unterteilt werden, die sich in ihrer Mobilität im SDS-Polyacrylamidgel unterscheiden. Beide verhalten sich innerhalb des hydrophoben Bereichs der Signalsequenz sehr unterschiedlich. Hier sind besonders starke Vernetzungsprodukte der einen Klasse an solchen Positionen beobachtbar, an denen die der anderen Klasse kaum nachweisbar sind. Auffällig ist dabei wiederum eine Periodizität von 4 bis 5 Aminosäuren.

Das mit dem Lysyl-Derivat erhaltene, strikt periodische Vernetzungsmuster innerhalb des hydrophoben Bereichs der Signalsequenz, das nicht nur mit Proteoliposomen sondern auch mit rauhen Mikrosomen beobachtet wurde, spricht für eine spezifische Bindungsstelle der Signalsequenz, die von den Proteinen Sec61p, Sec62p und Sec71p gebildet wird. Das periodische Auftreten der verschiedenen Quervernetzungsprodukte deutet außerdem darauf hin, daß der hydrophobe Teil der gebundenen Signalsequenz eine helikale Struktur einnimmt (Anlage 3; Abbildung 7A). Positionen, die effizient zu Sec62p und Sec71p vernetzt werden können, befinden sich auf einer Seite der Signalsequenzhelix; Positionen, an denen die beiden


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Sec61p-Quervernetzungsprodukte auftreten, liegen auf jeweils gegenüberliegenden Seiten dieser Helix. Erklärt man die unterschiedliche Mobilität der beiden Sec61p-Quervernetzungs-produkte durch eine Vernetzung der Signalsequenz zu zwei verschiedenen Regionen des Sec61p, ergibt sich die Hypothese, daß die Signalsequenz auf gegenüberliegenden Seiten von unterschiedlichen Regionen des Sec61p kontaktiert wird.

Der Prepro-Alphafaktor wurde nicht nur zu Proteinen, sondern auch zu Lipidmolekülen vernetzt. Quervernetzungsprodukte des Prepro-Alphafaktors zu Lipiden traten an allen Positionen der Signalsequenz auf. Sie konnten quantitativ mit dem Sec-Komplex coimmunopräzipitiert werden und sind daher nicht Prepro-Alphafaktor-Molekülen zuzuordnen, die vollständig in die Lipidschicht entlassen worden sind. Da jede Position der Signalsequenz neben Proteinen auch Lipide kontaktiert, muß sich die Bindungsstelle der Signalsequenz an der Grenzfläche zwischen Proteinen und der Lipiddoppelschicht befinden.

Die Signalsequenz wird hauptsächlich von Sec61p erkannt

Da das photoreaktive Reagenz des Lysyl-Derivats aufgrund der langen Seitenkette sehr beweglich ist, untersuchten wir die Umgebung der Signalsequenz des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors (Pos. 8-19) auch mit dem kürzeren und weniger flexiblen Phenylalanyl-Derivat (Anlage 3; Abbildung 4).

Die Analyse mit dem Phenylalanyl-Derivat zeigte, daß der hydrophobe Teil der gebundenen Signalsequenz hauptsächlich von Sec61p erkannt wird. Während sich erneut alle Positionen der Signalsequenz in der Nähe von Sec61p und auch in der Nähe von Lipiden befanden, konnten Sec62p und Sec71p nur am C-terminalen Ende der Signalsequenz nachgewiesen werden. Die beiden Proteine des Sec62/63p-Teilkomplexes sind vermutlich weiter vom hydrophoben Teil der Signalsequenz entfernt als Sec61p, und können daher nicht von dem kurzen Photoreagenz erreicht werden. Wie mit dem Lysyl-Derivat konnten auch mit dem Phenylalanyl-Derivat zwei charakteristische Sec61p-Quervernetzungsprodukte unterschiedlicher Mobilität im SDS-Polyacrylamidgel beobachtet werden. Das periodische Auftreten der beiden Sec61p-Quervernetzungsklassen scheint hier noch betonter. Die Positionen, an denen die stärksten Sec61p-Quervernetzungsprodukte beider Klassen nachweisbar sind, sind gegenüber dem Lysyl-Derivat um genau eine Aminosäure verschoben. Sie befinden sich allerdings wiederum an gegenüberliegenden Seiten der postulierten Signalsequenzhelix.


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Wir verwendeten einen mutanten, aber translokationsaktiven Sec-Komplex, dem Sec71p und Sec72p fehlen, um Hinweise auf die Bedeutung des Sec71p für die Signalsequenzerkennung zu erhalten. Experimente, in denen die Umgebung der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors nach der Bindung an diesen Sec-Komplex mit dem Lysyl-Derivat untersucht wurde, zeigten, daß das Sec61p-Quervernetzungsmuster verglichen zum Wildtyp-Sec-Komplex unverändert ist. Sec71p spielt demnach keine entscheidende Rolle bei der Bindung der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors.

Mit beiden in dieser Arbeit verwendeten photoreaktiven Derivaten konnte keine Nachbarschaft der Signalsequenz zu Sec72p, Sec63p, Sss1p oder Sbh1p nachgewiesen werden. Diese Proteine sind daher wahrscheinlich nicht an der Erkennung von Signalsequenzen beteiligt.

Die Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p flankieren die Signalsequenz auf gegenüberliegenden Seiten

Um herauszufinden, welche Regionen des Sec61p mit der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors interagieren, verwendeten wir in den Quervernetzungsexperimenten verschiedene Sec61p-Mutanten, die jeweils in einem ihrer cytoplasmatischen oder luminalen Loop-Abschnitte eine Schnittstelle für die Protease Faktor Xa enthalten (Wilkinson et al., 1996). Damit ist es möglich, die Sec61p-Quervernetzungsprodukte des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors spezifisch mit der Protease Xa zu spalten, und den Ort der Vernetzung einem der beiden entstandenen Fragmente des Sec61p zuzuordnen. Die beiden Fragmente des Sec61p können entweder durch Immunopräzipitationen mit Antikörpern gegen den N- oder C-Terminus des Sec61p oder aufgrund ihrer Größe unterschieden werden. Durch den Einsatz verschiedener Sec61p-Xa-Mutanten kann eine zwischen zwei Faktor Xa-Schnittstellen aufeinanderfolgender Loop-Abschnitte liegende Region des Sec61p identifiziert werden, die zu einer bestimmten Position des Prepro-Alphafaktors vernetzt wurde.

Die mit dem Phenylalanyl-Derivat durchgeführte Analyse zeigte, daß alle Positionen des hydrophoben Teils der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors hauptsächlich entweder zur Transmembrandomäne 2 oder zur Transmembrandomäne 7 des Sec61p bzw. zu den an diese Transmembrandomänen angrenzenden Loop-Abschnitten des Sec61p vernetzt werden können (Anlage 3; Abbildung 5). Die Vernetzbarkeit zu diesen beiden Regionen des Sec61p korreliert gut mit dem Auftreten der beiden Sec61p-Quervernetzungsprodukte im SDS-Gel, deren unterschiedliche Mobilität also tatsächlich auf einer Vernetzung der Signalsequenz zu verschiedenen Regionen des Sec61p beruht. In Übereinstimmung damit liegen Positionen, an


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denen starke Vernetzungsprodukte zu Transmembrandomäne 2 bzw. den angrenzenden Loop-Abschnitten auftreten, auf einer Seite der Signalsequenzhelix, solche an denen effiziente Vernetzungen zu Transmembrandomäne 7 oder den angrenzenden Loop-Abschnitten beobachtbar sind, auf der gegenüberliegenden Seite dieser Helix (Anlage 3; Abbildung 7B). Innerhalb des hydrophoben Teils der Signalsequenz konnten an einigen Positionen, die sich in der Nähe der Transmembrandomäne 2 befinden, zusätzlich signifikante Quervernetzungen zu der die Transmembrandomäne 1 einschließenden Region des Sec61p nachgewiesen werden. Im SDS-Gel verhalten sich die Quervernetzungsprodukt dieser beiden Regionen identisch (Anlage 3; Abbildung 5).

Obwohl experimentell nicht zwischen einer Vernetzung zu den Transmembran- oder Loop-Bereichen des Sec61p unterschieden werden konnte, nehmen wir an, daß die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors von den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p und nicht von den angrenzenden Loop-Abschnitten erkannt wird. Die Signalsequenz durchspannt vermutlich die Membran, da zwei bis drei Windungen der an der Grenzfläche zur Lipidschicht gebundenen Signalsequenzhelix mit den gleichen Regionen des Sec61p interagieren.

Wie mit dem Phenylalanyl-Derivat konnten mit dem Lysyl-Derivat vor allem die Transmembran-domänen 2 und 7 in der Umgebung des hydrophoben Teils der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors nachgewiesen werden (Anlage 3; Abbildung 6). Die Positionen der Signalsequenz, die diese beiden Regionen des Sec61p besonders stark kontaktieren befinden sich wiederum jeweils auf gegenüberliegenden Seiten der Signalsequenzhelix, sind aber, wie bereits durch die Mobilität der Sec61p-Quervernetzungsprodukte angedeutet wurde (siehe oben), um eine Aminosäure im Vergleich zum Phenylalanyl-Derivat verschoben (Anlage 3; Abbildung 7A).

Die Einführung verschiedener Derivate führt offensichtlich dazu, daß die Signalsequenz innerhalb der gleichen Bindungsstelle etwas anders orientiert ist. Diese Beobachtung deutet darauf hin, daß Signalsequenzen zwar in einer spezifischen Art und Weise von zwei definierten Regionen des Sec61p (Transmembrandomänen 2 und 7) gebunden werden, ihre exakte Orientierung relativ zu diesen Regionen des Sec61p jedoch durch ihre Aminosäurezusammen-setzung bestimmt wird. Das könnte widerspiegeln, wie Sec61p in der Lage ist, viele verschiedene, in ihrer Länge und Zusammensetzung variable Signalsequenzen zu binden.


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Der unmittelbar der Signalsequenz folgende Bereich der Polypeptidkette kontaktiert hauptsächlich die Transmembrandomäne 8 von Sec61p

Um herauszufinden, in welcher Umgebung sich der unmittelbar der Signalsequenz folgende Abschnitt des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors befindet, bauten wir einzelne photoreaktive Lysyl-Derivate an den Positionen 23 bis 29 der Polypeptidkette ein. Während Quervernetzungsprodukte zu Sec62p und Sec71p nur an Position 24 beobachtet werden konnten, treten effiziente Sec61p-Quervernetzungsprodukte unterschiedlicher Mobilität im SDS-Gel an allen sieben Positionen auf (Anlage 3; Abbildung 3). Die Intensität der Sec61p-Quervernetzungsprodukte unterscheidet sich zwischen den einzelnen Positionen kaum. Der unmittelbar der Signalsequenz folgende Abschnitt des Prepro-Alphafaktors ist offensichtlich im Gegensatz zur Signalsequenz nicht in einer definierten Orientierung an den Sec-Komplex gebunden und relativ frei beweglich. Eine Analyse mit den Sec61p-Xa-Mutanten zeigte, daß die Positionen 25 bis 29 des Prepro-Alphafaktors hauptsächlich die Transmembrandomäne 8 des Sec61p kontaktieren (Anlage 3; Abbildung 6 und nicht gezeigte Daten). Quervernetzungs-produkte zu Lipiden konnten außerhalb der Signalsequenz nicht nachgewiesen werden (Anlage 3; Abbildung 3). Der unmittelbar der Signalsequenz folgende Abschnitt der Polypeptidkette befindet sich offensichtlich in einer ganz anderen Umgebung als die Signalsequenz.

2.4. Die cytosolischen Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors werden bei seiner Bindung an den Sec-Komplex freigesetzt

Der Photoquervernetzungansatz kann auch zur Untersuchung der Interaktionen des Prepro-Alphafaktors im Cytosol eingesetzt werden, indem der Prepro-Alphafaktor direkt nach seiner Synthese und der Entfernung der Ribosomen mit UV-Licht bestrahlt wird.

Der Prepro-Alphafaktor wird nach seiner vollständigen Synthese im Retikulozytenlysat mit dem photoreaktiven Lysyl-Derivat zu einer Vielzahl von cytosolischen Proteinen vernetzt (Anlage 5; Abbildung 1). Hsp 70 und Tcp1alpha, eine Untereinheit des TRiC-Komplexes (für t -complex polypeptide 1 (Tcp1) ri ng c omplex), wurden bisher als cytosolische Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors identifiziert (Anlage 5; Abbildungen 2A). Sie konnten sowohl in der Nähe der Signalsequenz als auch in der Nähe der C-terminalen Hälfte des Prepro-Alphafaktors nachgewiesen werden. Aus dem Quervernetzungsmuster der einzelnen Positionen des Prepro-Alphafaktors läßt sich nicht ableiten, ob es cytosolische Proteine gibt, die sich ausschließlich in der Nachbarschaft der Signalsequenz befinden.


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Der Prepro-Alphafaktor liegt im Retikulozytenlysat in verschiedenen Komplexen vor, die im Saccharosegradienten voneinander getrennt werden können (Anlage 5; Abbildung 2B). Jedem dieser Komplexe können bestimmte Quervernetzungspartner zugeordnet werden. Das Tcp1alpha-Quervernetzungsprodukt ist im Gegensatz zum Hsp70-Quervernetzungsprodukt in einem Komplex mit einem Molekulargewicht von ungefähr 700kD enthalten. Da dieses Molekulargewicht annähernd dem des TRiC-Komplexes entspricht, ist der Prepro-Alphafaktor vermutlich ein Substrat dieses hetero-oligomeren Chaperonkomplexes. Trotz der unterschiedlichen Zusammensetzung der Komplexe sind alle Populationen des Prepro-Alphafaktors translokationskompetent (Anlage 4; Abbildung 2C).

Der Prepro-Alpafaktor wird offensichtlich im Verlauf der Bindung an den Sec-Komplex von seinen cytosolischen Interaktionspartnern freigesetzt. Einerseits befindet sich der an den Sec-Komplex gebundene Prepro-Alphafaktor nicht mehr in der Nachbarschaft cytosolischer Proteine (Anlage 3; Abbildung 3), andererseits nimmt die Intensität der cytosolischen Quervernetzungs-produkte des Prepro-Alphafaktors deutlich ab, wenn dieser vor der Bestrahlung mit UV-Licht mit Proteoliposomen inkubiert wird, die den Sec-Komplex enthalten (Anlage 5; Abbildung 3). Die Beobachtung, daß neben anderen sowohl die Hsp70- als auch die Tcp1alpha- Quervernetzungs-produkte des Prepro-Alphafaktors im Bindungsschritt verschwinden, ist in Übereinstimmung damit, daß der in verschiedenen cytosolischen Komplexen enthaltene Prepro-Alphafaktor gebunden bzw. transportiert werden kann.

Eine stabile Interaktion der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors mit cytosolischen Proteinen verhindert offensichtlich die posttranslationale Bindung des Prepro-Alphafaktors an den Sec-Komplex. Experimente, in denen der Prepro-Alphafaktor vor seiner Bindung an den Sec-Komplex zu cytosolischen Proteinen vernetzt wurde, zeigten, daß die cytosolischen Quervernetzungs-produkte der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors nicht an den Sec-Komplex binden (nicht gezeigte Ergebnisse). Anscheinend müssen die mit der Signalsequenz interagierenden cytosolischen Proteine freigesetzt werden, bevor die Signalsequenz vom Sec-Komplex in der Membran erkannt und der Prepro-Alphafaktor gebunden werden kann. Durch eine Quervernetzung wird dies verhindert.


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