Plath, Kathrin: Zum Mechanismus der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum der Hefe

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Kapitel 3. DISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit wurde der Transport von sekretorischen Proteinen in das ER der Hefe untersucht und dabei insbesondere die Frage beantwortet, wie die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors im ersten Schritt des posttranslationalen Transportprozesses erkannt wird.

3.1. Der posttranslationale Transport in das ER der Hefe

Die Interaktionen des Translokationssubstrats Prepro-Alphafaktor im Cytosol, vor seiner posttranslationalen Translokation in das ER

Der Prepro-Alphafaktor interagiert während seiner Synthese im Retikulozytenlysat, d.h. solange er ribosomenassoziiert ist, mit dem cotranslationalen Signalsequenzrezeptor SRP54 und dem ribosomenassoziierten Protein NAC (für “ n ascent polypeptide a ssociated c omplex“; nicht gezeigte Daten). Diese Proteine sind nach der Termination der Translation durch eine Vielzahl anderer cytosolischer Proteine ersetzt. Zwei der cytosolischen Interaktionspartner des vollständig synthetisierten Prepre-Alphafaktors konnten als der TRiC-Komplex und Hsp70 identifiziert werden. Diese beiden Chaperone sind Bestandteil größerer cytosolischer Komplexe des Prepro-Alphafaktors, kommen aber nicht in den gleichen Komplexen vor. Die cytosolischen Komplexe verschiedener Zusammensetzung, in denen der Prepro-Alphafaktor vorliegt, weisen keine Unterschiede in der Translokationskompetenz auf. Diese Tatsache, und das Ergebnis, daß der TRiC-Komplex und Hsp70 sowohl zur Signalsequenz als auch zum reifen Teil des Prepro-Alphafaktors quervernetzt werden können, deuten darauf hin, daß beide Chaperone keine translokationsspezifische Funktion beim posttranslationalen Targeting übernehmen, sondern den Prepro-Alphafaktor lediglich in einer entfalteten und somit translokationskompetenten Konformation halten. In Übereinstimmung damit wurde gezeigt, daß Hsp70 den posttrans-lationalen Transport von Proteinen in das ER und die Mitochondrien der Hefe, d.h. in zwei verschiedene Organellen, stimuliert (Deshaies et al., 1988). Es ist offen, ob es cytosolische Proteine gibt, die spezifisch die Signalsequenz eines posttranslationalen Substrats erkennen oder ausschließlich an dem posttranslationalen Targeting zur Membran des Endoplasmatischen Retikulum beteiligt sind. Offensichtlich tritt keines der erhaltenen cytosolischen Quervernetzungs-produkte nur zur Signalsequenz des vollständig synthetisierten Prepro-Alphafaktors auf.


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Die Bindung des Prepro-Alphafaktors an den Sec-Komplex

Die cytosolischen Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors werden bei seiner Bindung an den Sec-Komplex, dem ersten Schritt des posttranslationalen Transports in das ER der Hefe, vollständig freigesetzt. Obwohl die beiden Chaperone Hsp70 und TRiC-Komplex ATPasen sind und ihre Assoziation mit Proteinen durch den ATPase-Zyklus reguliert wird, ist ATP nicht für ihre Ablösung vom Prepro-Alphafaktor notwendig (nicht gezeigte Ergebnisse). In welcher Weise die Freisetzung der verschiedenen cytosolischen Interaktionspartner geschieht, ist nicht verstanden. Es ist einerseits vorstellbar, daß die Komplexe, in denen der Prepro-Alphafaktor vorliegt, nur transient sind und bereits im Cytosol ständig assoziieren und dissoziieren. Andererseits könnten die cytosolischen Proteine aktiv durch den Sec-Komplex abgelöst werden. In diesem Fall ist die Annahme naheliegend, daß der Sec-Komplex mit cytosolischen Partnern des Prepro-Alphafaktors interagieren kann, woraufhin die cytosolischen Komplexe zerfallen und der Prepro-Alphafaktor auf den Sec-Komplex übertragen wird.

Damit im ersten Schritt des posttranslationalen Transports durch die ER-Membran die Bindung des Prepro-Alphafaktors an den Sec-Komplex in der Membran erfolgt, muß die Polypeptidkette eine funktionelle Signalsequenz besitzen. Für die Erkennung der Signalsequenz sind beide Teilkomplexe des Sec-Komplexes, d.h. der Sec61p- und der Sec62/63p-Komplex, die nur miteinander oligomere Strukturen in Membranen bilden können (siehe Abschnitt 3.3.), notwendig.

Die Erkennung der Signalsequenz innerhalb der Membran - ein proteinvermittelter Prozeß

Die Bindungsstelle der Signalsequenz befindet sich an der Grenzfläche des Translokationskanals und der Lipiddoppelschicht, da alle Positionen der Signalsequenz des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors zu Lipiden und zu Proteinen vernetzt werden können. Wenn man annimmt, daß der hydrophobe Bereich der Signalsequenz eine helikale Struktur bildet, wird die Signalsequenz auf gegenüberliegenden Seiten von den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p umgeben. Sec62p und Sec71p, die gemeinsam eine Seite der Signalsequenzhelix flankieren, könnten, obwohl sie sich in größerer Entfernung zur Signalsequenz als Sec61p befinden, ebenfalls an der Bindung der Signalsequenz beteiligt sein (siehe unten).


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Die Existenz einer Signalsequenzbindungsstelle in der Membran, die in spezifischer Weise von Sec61p und Sec62/71p gebildet wird, deutet darauf hin, daß Signalsequenzen in der Membran hauptsächlich durch Protein-Protein-Wechselwirkungen erkannt werden. Unterstützt wird diese Sicht dadurch, daß synthetische Signalpeptide die Interaktion des Prepro-Alphafaktors mit dem Sec-Komplex in der Membran verhindern (nicht gezeigte Ergebnisse). Die Zahl der Signalsequenzbindungsstellen in der Membran ist demnach begrenzt. Für einen protein-vermittelten Prozeß spricht außerdem, daß der Prepro-Alphafaktor auch nach der Solubilisierung der Membran und intensiven Waschschritten mit Detergenz am Sec-Komplex gebunden bleibt (Anlage 3 und Matlack et al., 1997). Dieses Ergebnis schließt eine essentielle Funktion von Lipiden bei der Aufrechterhaltung der Interaktionen des Prepro-Alphafaktors mit dem Sec-Komplex aus. Lipide, aber nicht die Lipiddoppelschicht, sind jedoch für die vorherige Erkennung der Signalsequenz und die damit einhergehende Bindung des Prepro-Alphafaktors an den Sec-Komplex absolut notwendig, denn dieser Prozeß kann nur dann in Detergenzlösung nachvollzogen werden, wenn zusätzlich zum Sec-Komplex große Lipidmengen anwesend sind (Matlack et al., 1997). Welche Rolle die Lipidmoleküle im Bindungsschritt spielen, ist unklar. Sie könnten einfach eine zusätzliche Verteilungsphase für Signalsequenzen bilden und die helikale Struktur der Signalsequenz begünstigen oder die Konformation des Sec-Komplexes beeinflussen, möglicherweise eine aktive Konformation stabilisieren.

Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen keine Aussage darüber zu, wie Signalsequenzen ihre Bindungsstelle am Translokationskanal erreichen. Es ist möglich, daß sie direkt senkrecht zur Membran in den Kanal inserieren, oder, daß sie erst in die Lipidschicht eindringen und dann seitlich zum Kanal gelangen. Im letzteren Fall könnte die Fähigkeit künstlicher Lipiddoppel-schichten, funktionelle von nicht-funktionellen Signalpeptiden zu unterscheiden (Briggs et al., 1985), von direkter Bedeutung für den Translokationsprozeß sein.

Die Insertion der Polypeptidkette in den Kanal und der anschließende Transport durch die Membran

Die Quervernetzungsexperimente dieser Arbeit zeigen, daß sich auch der unmittelbar der Signalsequenz folgende Bereich des Prepro-Alphafaktors nach der Bindung an den Sec-Komplex in der Nähe des Sec61p befindet. Dieser Abschnitt der Polypeptidkette wird im Gegensatz zur Signalsequenz hauptsächlich von der Transmembrandomäne 8 des Sec61p kontaktiert. Eine Interaktion mit Lipiden konnte nicht nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse lassen sich in Übereinstimmung mit Daten aus dem cotranslationalen Säugersystem (Shaw et al., 1988; Mothes et al., 1994; Martoglio et al., 1995) am besten durch ein Modell erklären, in dem die Polypeptidkette im Prozeß der Bindung als eine Haarnadelstruktur in den Translokationskanal inseriert. Ein Teil der Schleife ist fixiert und wird von der Signalsequenz gebildet. Diese ist so in einer Transmembrankonformation gebunden, daß sich ihr N-Terminus am cytosolischen Ende und


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ihr C-Terminus am luminalen Ende des Kanals befindet. Der andere Teil der Haarnadelschleife besteht aus dem der Signalsequenz folgenden Bereich der Polypeptidkette. Dieser Bereich des Prepro-Alphafaktors ist im Gegensatz zur Signalsequenz nicht in einer definierten Orientierung im Translokationskanal gebunden und vermutlich relativ frei beweglich, da sich das Sec61p-Quervernetzungsmuster der einzelnen Positionen kaum unterscheidet. Dieser Abschnitt befindet sich immer in einer hydrophilen Umgebung und ist Lipiden unzugänglich.

Im zweiten Schritt des posttranslationalen Transportprozesses wird der C-terminale Teil der Polypeptidkette in einer Kar2p- und ATP- abhängigen Weise durch eine Umgebung in der ER-Membran transportiert, die ausschließlich durch Sec61p gebildet wird und vollständig von der Lipidschicht abgeschirmt ist (nicht gezeigte Daten). Dies konnte in Quervernetzungsexperimenten bestimmt werden, da es möglich ist, den vollständigen Transport eines Proteins durch eine große Gruppe an seinem C- Terminus zu blockieren (zum Beispiel eine tRNA), wodurch die Umgebung der C-terminalen Hälfte des Prepro-Alphafaktors in der Membran mit dem Photoquervernetzungs-ansatz untersucht werden kann. Welche Transmembrandomänen des Sec61p den Kanal auskleiden, durch den die hydrophile Kette in das ER gelangt, konnte unter Verwendung der Sec61p-Xa-Mutanten bisher nicht eindeutig geklärt werden. Klar ist jedoch, daß Transmembran-domänen des Sec61p, die nicht an der Erkennung der Signalsequenz beteiligt sind, eine entscheidende Rolle spielen, und daß die Kette im Kanal nicht definiert gebunden ist (nicht gezeigte Ergebnisse).

Während des Kar2p-abhängigen Translokationsprozeß entsteht das reife Protein, indem die Signalsequenz auf der luminalen Seite der ER-Membran abgespalten wird (von Heijne, 1998). Über den Verbleib der abgespaltenen Signalsequenz beim posttranslationalen Transport gibt es keine Informationen. In einem synchronisierten cotranslationen Transportsystem konnte allerdings gezeigt werden, daß sich Signalpeptide kurz nach ihrer Abspaltung in der Umgebung von Lipiden und der Signalpeptidase befinden, und anschließend weiter prozessiert werden, wodurch ihre Akkumulation in der Membran verhindert wird (Lyko et al., 1995; Martoglio et al., 1997).

3.2. Die Signalsequenzerkennung durch Sec61p ist evolutionär konserviert

Die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors interagiert beim cotranslationalen Transport durch die ER-


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Membran der Säuger in ähnlicher Weise mit dem Säugerhomologen des Sec61p, Sec61alpha, wie mit dem Sec61p beim posttranslationalen Transport durch die ER-Membran der Hefe, da in beiden Fällen innerhalb des hydrophoben Bereichs der Signalsequenz das gleiche positions-abhängige Quervernetzungsmuster auftritt (Anlage 3; Abbildung 4D). Eine systematische Quervernetzungsstudie zeigte weiterhin, daß sich die Signalsequenz des cotranslational in die ER-Membran der Säuger inserierten Prepro-Alphafaktors bei einer Kettenlänge von 86 Aminosäuren ebenso wie im Hefesystem in der Nachbarschaft zu Lipiden befindet. Darüber hinaus flankiert das Säugerprotein TRAM die Signalsequenz in ähnlicher Weise wie die beiden Hefeproteine Sec62p und Sec71p (Anlage 3; Abbildung 3F). Die Bindungsstelle der Signalsequenz eines anderen Preproteins (Preprolaktin) wird ebenfalls in spezifischer Weise von Sec61alpha und TRAM an der Grenzfläche zur Lipidschicht gebildet (Martoglio et al., 1995; Mothes et al., 1998). Im Fall des Preprolaktin ist der Sec61p-Komplex in rekonstituierten Membranen allerdings hinreichend und notwendig für die Erkennung der Signalsequenz und den anschließenden cotranslationalen Transport durch die Membran (Jungnickel und Rapoport, 1995).

Diese Ergebnisse weisen auf eine generelle Rolle des Sec61p in der Signalsequenzerkennung hin. Dafür sprechen auch Erkenntnisse über den Transport von Proteinen durch die Plasmamembran von E.coli. Mutationen, die die Sekretion von Proteinen mit defekten oder sogar fehlenden Signalsequenzen durch die Plasmamembran von E.coli erlauben (prl Mutationen), wurden hauptsächlich in dem secY Gen, das das Homologe des Sec61p in E.coli kodiert, gefunden, und zu einem geringen Ausmaß auch in den secE, secG und secA Genen. Interessanterweise sind die prl Mutationen des secY (als prlA bezeichnet) fast alle in den Transmembrandomänen 7 und 10 sowie in dem periplasmatischen Loop-Abschnitt zwischen den Transmembrandomänen 1 und 2 des SecY lokalisiert (Osborne und Silhavy, 1993). Diese Bereiche des SecY üben vermutlich unterschiedliche Funktionen im Prozeß der Signalsequenz-erkennung aus (siehe unten). Die Transmembrandomäne 7 des SecY ist direkt an der Erkennung von Signalsequenzen beteiligt (Sako, 1991). Da die meisten prlA Mutationen der Transmembran-domäne 7 auf einer Seite einer theoretischen alpha-Helix liegen, nimmt man an, daß diese Transmembrandomäne normalerweise mit funktionellen, aber nicht mit defekten Signalsequenzen interagiert (Osborne und Silhavy, 1993). Es wurde vorgeschlagen, daß prlA Mutationen in der Transmembrandomäne 7 ein Zurückstoßen defekter Signalsequenzen (proof-reading) verhindern (Osborne und Silhavy, 1993). Allerdings gibt es bisher in keinem der untersuchten Translokationssysteme direkte Hinweise darauf, daß der Prozeß der Signalsequenzerkennung mit einem Zurückstoßen defekter Signalsequenzen, das vermutlich Energie verbrauchen würde, gekoppelt ist.


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Eine generelle Rolle der Transmembrandomänen 2 und 7 bei der Interaktion mit Signalsequenzen könnte auch die Erklärung dafür sein, daß zwei der drei am besten zwischen SecY und Sec61p konservierten Sequenzabschnitte in diesen Transmembrandomänen enthalten sind (Görlich et al., 1992). Man könnte spekulieren, daß die beiden im Säugersystem beobachteten Sec61alpha-Quervernetzungsprodukte unterschiedlicher Mobilität in Analogie zum Hefesystem Vernetzungsprodukten zu den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61alpha entsprechen.

Die beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Signalsequenzbindungsstelle innerhalb der Membran sowohl zwischen Pro- und Eukaryonten als auch zwischen co- und posttranslationalen Transportsystemen konserviert ist. Trotz der verschiedenen Targetingprozesse und Möglichkeiten, wie die Direktionalität des Transports erreicht wird, gleichen sich anscheinend alle Signalsequenz-vermittelten Transportwege im Mechanismus der Signalsequenzerkennung innerhalb der Membran. Signalsequenzen interkalieren offensichtlich generell in eine hydrophobe Umgebung, die von definierten Transmembrandomänen gebildet wird und Lipidmolekülen zugänglich ist.

Hydrophobe Interaktionen sind vermutlich auch bei der Erkennung von Signalsequenzen durch die cytosolische Targetingkomponente SRP54 beim cotranslationalen Transport von entscheidender Bedeutung (siehe Einleitung). Trotzdem werden wahrscheinlich im Cytosol durch SRP und in der Membran durch die große Untereinheit des Sec61p-Komplexes nicht exakt dieselben strukturellen Merkmale der Signalsequenz geprüft. Im cotranslationalen Säugersystem wurde gezeigt, daß einige Signalsequenzmutanten des Modellproteins Preprolaktin, die kaum in ihrer Interaktion mit SRP gestört sind, deutliche Translokationsdefekte aufweisen, da ihre Signalsequenzen nicht von dem Sec61p-Komplex in der Membran erkannt werden (Jungnickel und Rapoport, 1995). Auch im Fall des Plasminogenaktivator-Inhibitors 2, dessen Sekretion in Abhängigkeit vom Differenzierungsstatus der Zelle reguliert wird, wird nur ein Teil der SRP-gebundenen naszierenden Polypeptidketten durch die Membran transportiert (Belin et al., 1996). Allerdings weist die Tatsache, daß Proteine, egal ob sie cotranslational und SRP-abhängig oder posttranslational und SRP-unabhängig zur ER-Membran der Hefe gelangen, von dem Sec61p-Komplex in der Membran erkannt werden müssen, um in das Lumen des ER transportiert zu werden, darauf hin, daß der Sec61p-Komplex bzw. seine große Untereinheit ein größeres Spektrum an Signalsequenzen erkennt, als der cytosolische Signalsequenzrezeptor SRP54.


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3.3. Die Assemblierung des Translokationskanals und die Erkennung der Signalsequenz sindvermutlich aufeinanderfolgende Schritte beim co- und posttranslationalen Transport in das ER der Eukaryonten

Der heterotrimere Sec61p-Komplex ist die zentrale Komponente des post- und auch des cotranslationalen Translokationsapparates in der ER-Membran. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß der gereinigte Sec61p-Komplex in Detergenzlösung in Form von oligomeren Ringstrukturen mit einem Durchmesser von ~82Å und einer zentralen Pore von ~21Å vorliegt. Diese oligomeren Strukturen des Sec61p entsprechen vermutlich den proteinleitenden Kanälen der ER-Membran, deren Existenz zuvor beim cotranslationalen Transport im Säugersystem mit elektrophysiologischen und spektroskopischen Methoden nachgewiesen wurde (Simon und Blobel, 1991; Crowley et al., 1993; 1994). Dafür spricht, daß ihre Bildung in rekonstituierten Membranen im posttranslationalen Modus durch die Interaktion mit dem tetrameren Sec62/63p-Komplex oder im cotranslationalen Modus durch die Bindung von Ribosomen induziert werden kann. Darüber hinaus ist das Sec61p-Oligomer in Detergenzlösung und in Abwesenheit einer naszierenden Kette so an das Ribosom gebunden, daß der Tunnel in der großen Untereinheit des Ribosoms, durch den die naszierende Kette vermutlich das Ribosom verläßt, genau in den Mittelpunkt des oligomeren Sec61p-Komplexes mündet (auch von Beckmann et al. (1997) beobachtet). Die naszierende Kette könnte so beim cotranslationalen Transport durch einen kontinuierlichen Kanal transportiert werden, der sich vom Peptidyltransferase-Zentrum im Ribosom durch das Sec61p-Oligomer in der Membran bis in das Lumen des ER erstreckt.

Eine Interaktion mit dem Translokationssubstrat ist anscheinend für die Oligomerisierung des Sec61p-Komplexes im co- und posttranslationalen Transportprozeß nicht erforderlich. Im posttranslationalen System sind vermutlich Sec62p und/oder Sec63p für die Oligomerisierung des Sec61p-Komplexes in Membranen verantwortlich, da die anderen beiden Untereinheiten des tetrameren Sec62/63p-Komplexes im Gegensatz zu Sec62p und Sec63p keine essentiellen Proteine der Hefe sind (Kurihara und Silver, 1993; Feldheim et al., 1993; Feldheim und Schekman, 1994).

Die Struktur des Sec61p-Komplexes ist ebenso wie der Mechanismus der Signalsequenz-erkennung evolutionär konserviert. Die homologen Komplexe des Säugers und der Bakterien bilden in Detergenzlösung ringähnliche Strukturen, die denen des Sec61p-Komplexes der Hefe gleichen (Anlage 1 und Meyer et al., 1999). In Analogie zum Hefesystem wird die Bildung der Oligomere des Sec61p-Komplexes der Säuger in rekonstituierten Membranen erst durch den Zusatz von Ribosomen induziert (Anlage 1).


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Da die Bindung des Ribosoms an den Sec61p-Komplex der Säuger beim cotranslationalen Transport der

Signalsequenzerkennung vorausgeht (Jungnickel und Rapoport, 1995) und sich naszierende Ketten innerhalb der Membran in dem Stadium vor der Signalsequenzerkennung bereits in einer hydrophilen, zum Cytosol hin abgeschlossenen Umgebung befinden (Crowley et al., 1993), interagiert die Signalsequenz beim cotranslationalen Transport offensichtlich erst mit dem assemblierten Translokationskanal in spezifischer Weise. Diese Annahme läßt sich auch auf den posttranslationalen Transport der Hefe übertragen, denn nur die beiden Teilkomplexe des Sec-Komplexes zusammen sind in der Lage, in Membranen oligomere Strukturen zu bilden und die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors zu binden. Die Assemblierung des Kanals und die Erkennung der Signalsequenz sind offensichtlich getrennte Schritte des Transportprozesses, das eine anscheinend die Voraussetzung für das andere. Es ist denkbar, daß die Bindungsstelle der Signalsequenz von den Transmembrandomänen 2 und 7 verschiedener Sec61p-Moleküle gebildet wird und daher nur im assemblierten Translokationskanal vorliegt. Quervernetzungsexperimente im posttranslationalen Hefesystem, in denen photoreaktive Lysyl-Derivate an Positionen auf gegenüberliegenden Seiten der Signalsequenzhelix des Prepro-Alphafaktors eingebaut wurden, deuten allerdings darauf hin, daß beide Transmembrandomänen einem einzigen Sec61p-Molekül des Sec-Komplexes zuzuordnen sind (nicht gezeigte Daten). Möglicherweise sind mit der Oligomerisierung einhergehende Konformationsänderungen in einem einzelnen Sec61p-Molekül von Bedeutung für die Bildung der Signalsequenzbindungsstelle.

3.4. Die Öffnung des Translokationskanals im co- und posttranslationalen Transportprozeß

Die Assemblierung des Translokationskanals und seine Öffnung müssen unabhängig voneinander erfolgen, um die Funktion der ER-Membran als Permeabilitätsbarriere für kleine Moleküle in der Abwesenheit der zu transportierenden Polypeptidkette zu gewährleisten. Beim cotranslationalen Transport sind die mit der Öffnung einhergehenden strukturellen Veränderungen im Translokationskanal beträchtlich, da sein innerer Durchmesser nach der Öffnung zum ER-Lumen 40-60Å beträgt (Hamman et al., 1997). Das deutet darauf hin, daß die von uns in Detergenzlösung beobachteten Ringstrukturen mit einer zentralen Pore von ungefähr 21Å vermutlich geschlossenen Kanälen entsprechen. Die Pore könnte durch bewegliche Domänen ausgefüllt sein, die bei der erreichten Auflösung nicht sichtbar sind.


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Beim cotranslationalen Transport bleibt das Ribosom nach der Insertion der Kette und Öffnung des Kanals während der gesamten Synthese eines sekretorischen Proteins fest an der Membran gebunden (Matlack und Walter, 1995, Hedge und Lingappa, 1996; Mothes et al., 1997) und könnte so gewährleisten, daß die Permebilitätsbarriere der Membran aufrechterhalten wird, obwohl der geöffnete Kanal relativ groß ist

(Crowley et al., 1993, 1994; Hamman et al., 1997). Beim posttranslationalen Transport von Proteinen ist leicht vorstellbar, daß der Kanal nur so weit geöffnet wird, daß die Polypeptidkette gerade hindurchpaßt, kleine Moleküle aber ausgeschlossen werden.

Die Signalsequenz öffnet vermutlich den Kanal

Vermutlich führt die Bindung der Signalsequenz in allen Signalsequenz-abhängigen Transportprozessen direkt zur Öffnung des Translokationskanals. Diese Annahme wird durch drei Experimente gestützt: Nach Zugabe synthetischer Signalpeptide konnten mit elektrophysiologischen Methoden in der Plasmamembran von E.coli Kanäle gemessen werden (Simon und Blobel, 1992). In Säugern öffnet sich der Translokationskanal zum Lumen, wenn die membrangebundene naszierende Kette bei ihrem cotranslationalen Transport die für die Signalsequenzerkennung erforderliche Länge erreicht (Crowley et al., 1994; Jungnickel und Rapoport, 1995). Im posttranslationalen Transportsystem der Hefe ermöglichen Antikörper, die an den unmittelbar der Signalsequenz folgenden Abschnitt des Prepro-Alphafaktors binden, und anstelle des Kar2p in Proteoliposomen eingeschlossen werden, die Translokation des Prepro-Alphafaktors in die Vesikel (Matlacket al., 1999). Dieses Experiment zeigt, daß der Teil des Prepro-Alphafaktors, gegen den die Antikörper gerichtet sind, nach seiner Bindung an den Sec-Komplex auf der luminalen Seite der Membran zugänglich ist; der Kanal muß also geöffnet sein. Es ist allerdings nicht ausgeschlossen, daß die Kanäle in rekonstituierten Proteoliposomen ständig geöffnet sind. In diesem Zusammenhang ist es interessant zu prüfen, ob in rekonstituierten Membranen elektrophysiologisch nachweisbare Kanäle existieren, deren Aktivität durch Signalpeptide reguliert wird.

Offensichtlich sind nicht nur die Struktur des Translokationskanals, die Signalsequenzbindungs-stelle und die Signalsequenzen selbst evolutionär konserviert, sondern auch die Signalsequenz-abhängige, auf Protein-Protein Wechselwirkungen beruhende Öffnung des Translokationskanals.


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Ein Modell, das die Öffnung des Kanals durch die Signalsequenz erklärt

Zahlreiche genetische und biochemische Experimente zeigen, daß die beiden Untereinheiten SecY und SecE des SecYEG-Komplexes von E.coli direkt miteinander interagieren (zur Übersicht Ito, 1995). Der synthetisch lethale Phänotyp zwischen bestimmten prl Mutationen in SecY und SecE deutet darauf hin, daß der periplasmatische Loop-Abschnitt zwischen den Transmembrandomänen 1 und 2 des SecY mit dem ebenfalls im Periplasma liegenden C-Terminus des SecE bzw. die Transmembrandomänen 7 und 10 des

SecY mit der Transmembrandomäne 3 des SecE interagieren (Osborne und Silhavy, 1993; Flower et al., 1995). Experimente mit einer dominant-negativen secY Mutante zeigten zusätzlich, daß die Transmembrandomäne 7 und der vorhergehende cytosolische Loop-Abschnitt des SecY eine Rolle in der Wechselwirkung mit SecE spielen (Baba et al., 1994). Dieser cytosolische Loop-Bereich des SecY kontaktiert wahrscheinlich den cytosolischen Loop-Abschnitt zwischen den Transmembrandomänen 2 und 3 des SecE (Pohlschröder et al., 1996). Es ist offensichtlich, daß vor allem die Bereiche des SecY, die prl Mutationen enthalten und daher vermutlich an der Erkennung von Signalsequenzen beteiligt sind (siehe oben), auch die Interaktion des SecY mit dem SecE vermitteln. In der Hefe gibt es eine ähnliche Korrelation: die Region, die die an die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors bindende Transmembrandomäne 7 des Sec61p einschließt (diese Arbeit), ist wahrscheinlich auch für eine Interaktion des Sec61p mit dem Sss1p, dem Hefehomologen des SecE, von Bedeutung. Zum einen konnte Sss1p mit einem bifunktionellen Reagenz zu einem Bereich des Sec61p vernetzt werden, der die Transmembrandomänen 6 bis 8 umfaßt (Wilkinson et al., 1997), zum anderen wird durch die Überexpression von Sss1p die Funktionalität von sec61 Mutanten, in denen der Loop-Abschnitt zwischen den Transmembrandomänen 7 und 8 des Sec61p verändert ist, wiederhergestellt (Wilkinson et al., 1997).

Aufgrund dieser Daten postulierten wir ein Modell, daß die Öffnung des Kanals für die Polypeptidkette durch die Signalsequenz folgendermaßen erklärt (Anlage 3): Signalsequenzen und Sss1p bzw. SecE binden an gleiche oder überlappende Regionen des Sec61p bzw. SecY. Am Beginn des Translokationsprozesses verdrängt die Signalsequenz Sss1p (SecE) von seiner Bindungsstelle im Sec61p (SecY) und induziert damit eine Konformationsänderung, die den Kanal für den hydrophilen Teil der Polypeptidkette öffnet. In dem zuvor geschlossenen Kanal wirkt Sss1p (SecE) als eine Ersatz-Signalsequenz. Diese Hypothese wird dadurch unterstützt, daß Sss1p und SecE in weitestem Sinne Signalsequenzen ähneln. Die essentielle und außerdem evolutionär konservierte Region des dreimal die Membran durchspannenden SecE besteht ebenso wie Sss1p nur aus einer Transmembrandomäne (TM3) und einigen umgebenden Aminosäuren auf beiden Seiten der Membran (Schatz et al., 1991; Hartmann et al., 1994). In Analogie zu Signalsequenzen ist für die Funktion der Transmembrandomäne 3 des SecE die Hydrophobizität entscheidend und nicht ihre exakte Aminosäuresequenz (Murphy und Beckwith, 1994). Sss1p (SecE) muß nach der Insertion der Signalsequenz nicht vollkommen vom Sec61p (SecY) freigesetzt werden, sondern könnte nur seine Position im Komplex ändern. Es ist denkbar, daß die Transmembrandomäne des


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Sss1p (TM3 des SecE) im geschlossenen Kanal mit der Transmembrandomäne 7 und im offenen Kanal mit der Transmembrandomäne 10 des Sec61p (SecY) interagiert. Letztere konnte in den Quervernetzungsexperimenten dieser Arbeit ebenso wie Sss1p nicht in der Nähe der Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors nachgewiesen werden, ist aber in E.coli für die Erkennung von Signalsequenzen von Bedeutung (siehe oben). Die oben erwähnte Wechselwirkung zwischen bestimmten cytoplasmatischen Bereichen des Sss1p (SecE) und Sec61p

(SecY), in denen bisher keine prl Mutationen identifiziert wurden, könnten in jedem Fall zur Stabilisierung des Komplexes beitragen.

Unser Modell sagt voraus, daß prl Mutationen in SecY oder SecE die Interaktion beider Proteine so ändern, daß SecE leichter durch die Signalsequenz, d.h. sogar durch solche, die defekt sind, verdrängt werden kann, wodurch der Kanal geöffnet wird. In Übereinstimmung damit konnte mit Coimmunopräzipitationen gezeigt werden, daß eine bestimmte prlA Mutante, die jeweils eine Mutation in den Transmembrandomänen 7 und 10 des SecY trägt (prlA4), nicht mehr fest mit SecE assoziiert ist (F. Duong, persönliche Mitteilung) und eine prl Mutation in der Transmembran-domäne 3 des SecE (prlG1) dessen Interaktion mit dem SecY schwächt (Pohlschröder et al., 1996).

Zusätzliche Signale könnten bei der Öffnung des Kanals eine Rolle spielen

Die Öffnung des Kanals könnte allerdings zusätzlich zur Signalsequenz weitere Signale erfordern. In E.coli könnte die Interaktion des SecYEG-Komplexes mit SecA eine Rolle spielen. Nur so kann man erklären, warum sekretorische Proteine, denen die Signalsequenz vollständig fehlt, von prlA Mutanten in SecB- und SecA-abhängiger Weise exportiert werden, cytosolische Proteine jedoch in keinem Fall (Derman et al., 1993; Flower et al., 1994; Prinz et al., 1996). Tatsächlich konnte gezeigt werden, daß die Membranen einer bestimmten prlA (secY)-Mutante SecA mit höherer Affinität binden als Wildtyp-Membranen (van der Wolk et al., 1998).

Ausgehend von Arbeiten, in denen die Umgebung der ausschließlich in der C-terminalen Hälfte des Wildtyp-Prepro-Alphafaktors gelegenen Lysine untersucht wurde, wurde spekuliert, daß Kar2p bei der Öffnung des Kanals beim posttranslationalen Transport von Proteinen in das ER der Hefe eine Rolle spielen könnte. In Mikrosomen der temperatursensitiven kar2-159 Mutante ist die durch Quervernetzung zu Sec61p nachgewiesene Insertion des C-terminalen Teils des Prepro-Alphafaktors in den Sec61p-Kanal bei der restriktiven Temperatur verhindert, in Mikrosomen der kar2-203 Mutante wird der C-terminale Teil des Prepro-Alphafaktors zwar noch in eine Sec61p-Umgebung inseriert, aber nicht transloziert (Sanders et al., 1992). Daraus wurde abgeleitet, daß

Kar2p in zwei verschiedenen Phasen des posttranslationalen Transport-prozesses benötigt wird: für die Insertion der Kette in den Sec61p-Kanal und für den eigentlichen Transfer von Polypeptiden durch den Kanal (Sanders et al., 1992); erstere könnte der Öffnung des Kanals entsprechen.


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Diese Sicht wurde durch Quervernetzungsexperimente unterstützt, in denen gezeigt wurde,

daß der Prepro-Alphafaktor in der ATP-unabhängigenTransportphase nur mit Sec62p, Sec71p und Sec72p interagiert und erst durch Kar2p und ATP in eine Sec61p-Umgebung übertragen wird (Müsch et al., 1992; Sanders et al., 1992; Lyman und Schekman, 1997). Wie schon erwähnt, ist allerdings zu beachten, daß in beiden experimentellen Ansätzen nur die Umgebung der Lysine des Wildtyp-Prepro-Alphafaktors analysiert wurde, die sich in der C-terminalen Hälfte der Polypeptidkette befinden, und nicht die Interaktionen der Signalsequenz. Wir konnten zeigen, daß die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors in nativen Membranen in Abwesenheit von ATP, in rekonstituierten Proteoliposomen ohne Kar2p und in Membranen der kar2-159 Mutante in An- oder Abwesenheit von ATP die gleiche Bindungsstelle im Sec61p erreicht (Anlage 3 und nicht gezeigte Daten). Diese Ergebnisse sprechen dafür, daß Kar2p nicht für die Erkennung der Signalsequenz und die Insertion der Kette in den Sec61p-Kanal erforderlich ist und damit vermutlich auch nicht für die Öffnung des Translokationskanals. Nach der Bindung an den Sec-Komplex könnte ein kleiner Teil der als Haarnadelstruktur in den Translokationskanal inserierten Polypeptidkette direkt für Kar2p auf der luminalen Seite der Membran zugänglich sein, wodurch der eigentliche Translokationsprozeß unmittelbar eingeleitet werden könnte. Es gibt in unserem Labor keine Hinweise darauf, daß Kar2p andere Funktionen als die des direkten Transfers der Polypeptidkette besitzt. Die früheren Ergebnisse stehen nur in scheinbarem Widerspruch dazu. Sie lassen sich einfacherweise damit erklären, daß Kar2p und ATP für den Transfer der C-terminalen Hälfte des Wildtyp-Prepro-Alphafaktors in und durch den Sec61p-Kanal im zweiten Schritt des posttranslationalen Transportprozesses notwendig sind.

Beim cotranslationalen Transport von Proteinen in das ER der Eukaryonten ist es vorstellbar, daß die der Erkennung der Signalsequenz vorausgehende Bindung des Ribosoms an den Sec61p-Komplex für die Öffnung des Kanals direkt erforderlich ist. Das Ribosom könnte zum Beispiel notwendig sein, um den geöffneten Kanal mit der 40-60Å großen Pore zu stabilisieren, was sich in dem mit der Signalsequenzerkennung einhergehenden Übergang von einer lockeren zu einer festen, d.h. salzresistenten Bindung des Ribosoms an die Membran ausdrücken könnte (Simon und Blobel; 1991; Jungnickel und Rapoport, 1995; Hamman et al., 1998).

3.5. Die Schließung des Translokationskanals

Am Ende der Translokation der Polypeptidkette muß sich der Kanal schließen. Es ist vorstellbar, daß die Signalsequenz unmittelbar nach ihrer Abspaltung den Translokationskanal verläßt, und somit nur für die Öffnung des Kanals, aber nicht für die Aufrechterhaltung des geöffneten Zustandes benötigt wird.


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DerKanal könnte dann beim posttranslationalen Transport ausschließlich durch den reifen Teil der zu transportierenden Polypeptidkette offen gehalten werden und nach dem vollständigen Transport der Kette automatisch in seine geschlossene Konformation übergehen. Es ist unbekannt, ob der posttranslationale Kanal in nativen Membranen in jeder Translokationsrunde assembliert und deassembliert wird. Eine mit der Beendigung der Translokation einhergehende Deassemblierung des Kanals, die mit der Dissoziation des Sec-Komplexes in seine Teilkomplexe gleichzusetzen sein sollte, wäre vermutlich der einfachste und sicherste Weg, den Kanal in der Membran nach der Beendigung der Translokation zu schließen. In diesem Fall müßte es ein Signal geben, das zur Assemblierung des Kanals am Beginn einer neuen Translokationsrunde führt. Die Tatsache, daß sich der Sec-Komplex als eine stabile Einheit reinigen läßt und in rekonstituierten Membranen als Ringstruktur vorliegt, deutet allerdings darauf hin, daß der Sec62/63p-Komplex und der Sec61p-Komplex in Membranen auch ständig miteinander assoziiert sein könnten.

Beim cotranslationalen Transport in Säugern ist die Freisetzung der Polypeptidkette mit Puromycin allein nicht ausreichend, um den Kanal zu verschließen; zusätzlich ist die Ablösung des Ribosoms von der ER-Membran mit Hochsalz erforderlich (Simon und Blobel, 1991). Durch diese Behandlung ändert sich die Zahl der im Elektronenmikroskop beobachtbaren oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes in der ER-Membran der Säuger allerdings nur unwesentlich (Anlage 1). Die Schließung des Kanals muß demnach beim cotranslationalen Transport nicht mit seiner Deassemblierung einhergehen. Die Ringstrukturen des Sec61p-Komplex bleiben auch bestehen, wenn die mit Puromycin und Hochsalz behandelten ER-Membranen der Säuger solubilisiert und anschließend wieder rekonstituiert werden (Anlage 1). Im Gegensatz dazu dissoziieren die in Detergenzlösung vorliegenden Ringstrukturen des gereinigten Sec61p-Komplexes bei ihrer Integration in die Lipidschicht. Möglicherweise stabilisieren andere Membranproteine die Sec61p-Oligomere in nativen Membranen in der Abwesenheit von Ribosomen. Der den cotranslationalen Transport vermittelnde, aus dem Sec61p-Komplex gebildete Kanal könnte daher in nativen ER-Membranen ständig assembliert sein und durch die Signalsequenz des Translokationssubstrats geöffnet bzw. durch Konformationsänderungen im Ribosom am Ende der Translation und das Entlassen der naszierenden Polypeptidkette geschlossen werden (auch Hamman et al., 1998). Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß die physiologische Termination der Translation im Gegensatz zur Puromycin-Hochsalzbehandlung die Deassemblierung des Kanals bewirkt, indem zum Beipiel der stabilisierende Effekt anderer Membranproteine herabgesetzt wird. In diesem Fall würde das Ribosoms in der Targetingphase des cotranslationalen Transports die Oligomerisierung des Sec61p-Komplexes auslösen. Es wäre interessant zu wissen, ob in rekonstituierten Membranen die durch Ribosomen induzierten Ringstrukturen des gereinigten Sec61p-Komplexes bestehen bleiben, wenn die Ribosomen durch Hochsalz von der Membran abgelöst werden.


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Kürzlich wurde vorgeschlagen, daß der Translokationskanal beim cotranslationalen Transport in das ER der Säuger nicht selbst zwischen einem geschlossenen und offenen Zustand wechselt, sondern an seinem luminalen Ende durch BiP, das Säugerhomologe des Kar2p, in einer Nukleotid-abhängigen Weise verschlossen wird (Hamman et al., 1998). Die Bedeutung dieses Ergebnisses ist bisher unklar, denn keines der Proteine des cotranslationalen Translokationsapparates besitzt eine J-Domäne. Experimente in unserem Labor zeigten, daß BiP durch eine J-Domaine für die Bindung von Polypeptiden (welche zum Beispiel Proteine des Sec61p-Komplexes sein könnten) aktiviert werden muß (Misselwitz et al., 1998). Da der cotranslationale Transport von Proteinen in das ER der Säuger mit rekonstituierten Proteoliposomen, die den Sec61p-Komplex, TRAM und den SRP-Rezeptor enthalten, reproduziert werden kann (Görlich et al., 1993), wäre der Verschluß des Kanals durch BiP nicht essentiell für den eigentlichen cotranslationalen Transfer von Proteinen durch die ER-Membran der Säuger.

3.6. Mögliche Funktion der beiden zur Signalsequenz vernetzbaren Proteine Sec62p und Sec71p im posttranslationalen Transport

Die Quervernetzungsexperimente der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die beiden Proteine Sec62p und Sec71p die Signalsequenz des an den Sec-Komplex gebundenen Prepro-Alphafaktors im posttranslationalen Hefesystem auf nur einer Seite flankieren und sich in größerer Entfernung zur Signalsequenz als Sec61p befinden. Außerdem sind Sec62p und Sec71p neben Sec72p in der Nachbarschaft des reifen Teils des Prepro-Alphafaktors nachweisbar, bevor dieser Kar2p-abhängig durch den Sec61p-Kanal transportiert wird. Welche Funktionen Sec62p und Sec71p beim posttranslationalen Transport in das ER der Hefe besitzen, ist bisher nur wenig untersucht und vollkommen unverstanden. Klar ist jedoch, daß Sec71p von geringerer Bedeutung für den Translokationsprozeß ist als das für die Hefezelle essentielle Sec62p (Deshaies und Schekman, 1989). Allerdings führt die Deletion des SEC71 Gens bei erhöhten Temperaturen zur Akkumulation von unprozessierten Precursoren im Cytosol der Hefezelle (Feldheim et al., 1993).

Die Oligomerisierung des Sec61p-Komplexes der Hefe an sich ist für die Erkennung der Signalsequenz im ersten Schritt des posttranslationalen Transport nicht ausreichend. Es konnte gezeigt werden, daß die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors in Detergenzlösung in Anwesenheit von Lipiden zwar spezifisch mit dem gereinigten heptameren Sec-Komplex interagieren kann, aber nicht mit dem Sec61p-Komplex, der unter diesen Bedingungen


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in oligomerer Form vorliegt (Matlack et al., 1997 und nicht gezeigte Daten). Der Sec62/63p-

Teilkomplex des Sec-Komplexes muß demnach in Membranen zusätzlich zur Oligomerisierung des Sec61p-Komplexes andere Funktionen in der frühen Phase des posttranslationalen Transports besitzen. Die Proteine des Sec62/63p-Komplexes könnten zum Beispiel für die Freisetzung der cytosolischen Interaktionspartner von dem zu transportierenden Protein erforderlich sein, die der Signalsequenzerkennung vorausgehen muß. Allerdings bindet auch die Signalsequenz eines Harnstoff-denaturierten Prepro-Alphafaktors nicht spezifisch an den oligomeren Sec61p-Komplex in Detergenzlösung (nicht gezeigte Daten). Es ist daher naheliegend anzunehmen, daß speziell die beiden zur Signalsequenz vernetzbaren Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes eine Rolle bei der Signalsequenzerkennung im posttranslationalen Transportprozeß der Hefe spielen. Diese Sicht wird durch die Tatsache unterstützt, daß das Säugerprotein TRAM in ähnlicher Weise wie die beiden Hefeproteine Sec62p und Sec71p zur Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors vernetzt wird. Es ist bekannt, daß TRAM während der Phase des cotranslationalen Transportprozesses wirkt, in der die Signalsequenz in der Membran erkannt wird (Voigt et al., 1996). Sec62p und Sec71p könnten eine Funktion bei der Erkennung von Signalsequenzen direkt über die Bindung von Signalsequenzen ausüben, oder indirekt über eine Beeinflußung der Konformation des oligomeren Sec61p-Komplexes.

Der Translokationskanal ermöglicht nicht nur den Transfer von hydrophilen Teilen der Polypeptidkette durch die Membran, sondern auch die Integration von Transmembrandomänen der Membranproteine in die Lipidschicht. Die Bindungsstelle der Signalsequenz an der Grenzfläche des Translokationskanals und der Lipiddoppelschicht könnte auch der Ort sein, an dem Transmembrandomänen erkannt werden, denn die Transmembrandomänen von verschiedenen Modellproteinen befinden sich im cotranslationalen Säugersystem unmittelbar nach ihrer Insertion in den Translokationskanal in der Nähe von Lipiden, Sec61alpha und TRAM (Martoglio et al., 1995), von Lipiden und Sec61alpha (Mothes et al., 1997), oder von Sec61alpha und TRAM (Do et al., 1996; die Nachbarschaft zu Lipiden wurde hier nicht analysiert). Da in den verschiedenen Quervernetzungsexperimenten nur die Umgebung von sehr wenigen Positionen der Transmembrandomänen untersucht wurde, ist bisher nicht bekannt, ob Transmembran-domänen tatsächlich in spezifischer Weise mit dem Sec61alpha und TRAM interagieren, d.h. ob sie ähnlich spezifisch wie Signalsequenzen gebunden werden.

Transmembrandomänen unterscheiden sich von Signalsequenzen vor allem durch die Länge des hydrophoben Bereiches. Im Falle von solchen Membranproteinen, die keine Signalsequenz besitzen, übernimmt die erste Transmembrandomäne die Targetingfunktion der Signalsequenz. Man könnte annehmen, daß für die Erkennung hydrophober Sequenzen durch den Translokationskanal


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die wenigen hydrophoben Aminosäuren von Signalsequenzen ausreichend sind, für die sofortige Freisetzung von dem

gleichen Bindungsort in die Lipidschicht allerdings die 20 hydrophoben Aminosäuren von Transmembrandomänen erforderlich sind.

TRAM bzw. Sec62/71p könnten sich genau dort befinden, wo sich der Sec61p-Kanal seitlich zur Lipidschicht öffnet und Transmembrandomänen in die Lipidschicht entlassen werden. In Übereinstimmung damit wurde gezeigt, daß die Transmembrandomäne eines Modellproteins nachdem sie den Sec61p-Kanal seitlich verlassen hat, bis zum Ende der Translation in der Umgebung des TRAM verbleibt (Do et al., 1996). TRAM bzw. Sec62/71p könnten demnach den Transfer von Transmembrandomänen aus dem Sec61p-Kanal in die Lipidschicht vermitteln. Eine weitere Funktion des Sec62/63p-Komplexes könnte auch die Verhinderung der Ribosomen-bindung beim posttranslationalen Transport sein.

Ob Sec62p und Sec71p tatsächlich funktionale Homologe des TRAM in der Hefe sind, ist nicht bekannt. Außerdem ist zum Beispiel noch nicht untersucht worden, ob der gereinigte Sec-Komplex überhaupt die Integration von Membranproteinen in das ER der Hefe ermöglicht. Es könnte aufschlußreich sein, den Sec62/63p-Komplex zu dissoziieren und die Funktionen der einzelnen Untereinheiten im posttranslationalen Transport zu charakterisieren. Darüber hinaus wäre es interessant zu prüfen, ob ein Protein in der ER-Membran der Hefe existiert, das die Funktion des Säugerproteins TRAM beim cotranslationalen Transport von Proteinen übernimmt.

3.7. Die Interaktion zwischen dem Sec61p-Komplex und dem Ribosom beim cotranslationalen Transport

Während des cotranslationalen Transports von Proteinen in das ER der Eukaryonten interagiert der Sec61p-Komplex direkt mit dem Ribosom. In Detergenzlösung befindet sich das Sec61-Oligomer der Hefe in der Abwesenheit einer naszierenden Kette in einem Abstand von 15-20Å zur großen Untereinheit des Hefe-Ribosoms und ist nur an einer einzigen Stelle erkennbar mit dem Ribosom verbunden (vorliegende Arbeit und auch Beckmann et al., 1997). Der gleiche Abstand konnte auch in rekonstituierten Membranen beobachtet werden. Dieses Ergebnis wirft die Frage auf, wie bei einem so großen Abstand die Permeabilitätsbarriere der Membran während des cotranslationalen Transports von Proteinen aufrechterhalten werden kann. Es ist einerseits vorstellbar, daß andere Komponenten des Cytosols oder der Membran die Lücke zwischen Translokationskanal und Ribosom verschließen und somit den Durchtritt von kleinen Molekülen durch den geöffneten


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Sec61p-Kanal verhindern. Andererseits könnten auch flexible Loop-Abschnitte des Sec61p-Komplexes oder Protein- bzw. RNA-Strukturen des Ribosoms in die Lücke hineinreichen, die bei der mit unserer Methode erreichten Auflösung von 30Å vermutlich nicht sichtbar sind oder durch ihre Flexibilität nicht als definierte Strukturen bei dieser Art von Bildaufbereitung auszumachen sind.

Im Säugersystem gibt es Hinweise darauf, daß sich die Natur der Interaktion zwischen dem Sec61p-Komplex und dem Ribosom beim cotranslationalen Transport in Abhängigkeit von der naszierenden Kette ändert. Ribosomen mit kurzen naszierenden Ketten binden ebenso wie Ribosomen, die keine naszierende Ketten tragen, nur schwach an den Sec61p-Komplex in der Membran. Sie sind durch hohe Salzkonzentrationen von dem Sec61p-Komplex ablösbar (Kalies et al., 1994; Jungnickel und Rapoport, 1995). Die Interaktion zwischen dem Sec61p-Komplex und dem Ribosom wird hochsalzresistent, sobald die naszierende Kette die kritische Länge erreicht, bei der ihre Signalsequenz in der Membran erkannt und der Translokationskanal geöffnet wird (Crowley et al., 1994; Jungnickel und Rapoport, 1995). Es es leicht vorstellbar, daß der Übergang von der schwachen zur festen Bindung, d.h. möglicherweise die Öffnung des Kanals, mit einer Verringerung des Abstandes zwischen dem Sec61p-Kanal und dem Ribosom einhergehen könnte, wodurch die Permeabilitätsbarriere der Membran nach der Öffnung des Kanals aufrechterhalten wäre. Dieser Hypothese steht jedoch die Tatsache gegenüber, daß sowohl kurze als auch lange naszierende Ketten nach der Bindung des Ribosoms an die ER-Membran der Säuger von der cytosolischen Seite der Membran aus für kleine Moleküle unzugänglich sind, d.h. Fluoreszenzsonden in membrangebundenen naszierenden Polypeptidketten sind schon vor der Öffnung des Translokationskanals für Fluoreszenzlöscher wie Jodid- oder NAD+- Ionen nicht vom Cytosol aus erreichbar (Crowley et al., 1993; 1994; Hamman et al., 1997). Der dichte Abschluß des Translokationskanals zum Cytosol geht in nativen Membranen offensichtlich seiner Öffnung zum Lumen voraus und könnte schon durch die Bindung von Ribosomen ohne naszierende Ketten gewährleistet sein. Es wird aufschlußreich sein, die Struktur des Ribosom-Sec61p-Komplexes mit naszierenden Ketten definierter Länge zu ermitteln, und diese in einer erhöhten, idealerweise atomaren Auflösung darzustellen, um herauszufinden, ob die Lücke zwischen Kanal und Ribosom durch bewegliche Domänen ausgefüllt ist, und ob sich der Abstand während des Translokationsprozesses verringert.

Im Säugersystem ist die Ribosom-Membran-Interaktion nicht für alle sekretorischen Proteine stabil. Für einige Proteine ist sie durch Translokations-Haltesignale reguliert. Das nicht genau definierte Haltesignal ist in der Lage, die feste Bindung zwischen dem Ribosom und der Membran aufzubrechen. Dadurch akkumulieren bestimmte Abschnitte der naszierenden Kette vorüber-gehend im Cytosol, und sind dort zum Beispiel für Proteasen zugänglich, bevor sie in das ER transportiert


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werden (Hedge und Lingappa, 1996; Hedge et al., 1998). Eine ähnliche Situation besteht bei der Synthese cytosolischer Domänen von Membranproteinen: sie erscheinen während ihrer Synthese an membrangebundenen Ribosomen im Cytosol (Do et al., 1996; Mothes et al., 1997). In beiden Beispielen ist die Ribosom-Sec61p-Interaktion offensichtlich so geändert, daß unter Erhalt der Ribosomenbindung eine Synthese der Kette in das Cytosol ermöglicht wird. Möglicherweise ist das Ribosom in diesen Fällen hauptsächlich über die in der dreidimensionalen Struktur sichtbare Verbindung (Ausstülpung) asymmetrisch am Translokationskanal verankert und flexibler im Verhältnis zu Sec61p.

Experimente, in denen die Zugänglichkeit von Fluoreszenzsonden in einem Typ1-Membranprotein für Fluoreszenzlöscher untersucht wurde, deuten auf einen Mechanismus, nach dem eine gerade synthetisierte Transmembrandomäne noch während sie sich im Ribosom befindet strukturelle Veränderungen auslöst, die den Translokationskanal zum Lumen hin schließen und wenig später die Ribosom-Membran-Interaktion zum Cytosol aufbrechen (Liao et al., 1997). Die Permeabilitätsbarriere der Membran könnte demnach während der Synthese cytosolischer Domänen dadurch aufrechterhalten werden, daß sich der Kanal zum Lumen hin verschließt, bevor der Verschluß durch das Ribosom an seinem cytosolischen Ende aufgehoben wird.

Die Dynamik der Ribosom-Membran-Interaktion und des Translokationskanals beim cotranslationalen Transport besser zu verstehen, wird eine interessante Aufgabe der Zukunft sein.

3.8. Die co- und posttranslationale Translokation von Proteinen in das ER der Hefe - der neu-entdeckte Ssh1p-Komplex und die Rolle der Sbh1p-Untereinheit des Sec61p-Komplexes

Die vorliegende Arbeit zeigt, daß ein dem Sec61p-Komplex homologer heterotrimerer Komplex in der ER-Membran der Hefe existiert, der aus den Untereinheiten Ssh1p, Sbh2p und Sss1p besteht. Es gibt Hinweise darauf, daß der Ssh1p-Komplex am cotranslationalen Proteintransport beteiligt ist. Er interagiert wie der Sec61p-Komplex mit membrangebundenen Ribosomen und bildet in Detergenzlösung oligomere Ringstrukturen. Im Gegensatz zum Sec61p-Komplex ist der Ssh1p-Komplex nicht in der Lage, sich mit dem Sec62/63p-Komplex zu einem heptameren Sec-Komplex zu verbinden, um den posttranslationalen Transport zu vermitteln - zumindest gibt es für eine stabile Wechselwirkung im Moment keinerlei Anhaltspunkte. Ein Modell, nach dem der Ssh1p-Komplex ausschließlich im cotranslationalen und nicht im posttranslationalen Modus arbeitet, der Sec61p-Komplex dagegen in beiden, könnte erklären, warum der Ssh1p-Komplex für die


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Translokationsaktivität der Hefezelle von geringerer Bedeutung als der Sec61p-

Komplex ist, obwohl beide heterotrimere Komplexe ungefähr in gleichen Mengen vorliegen. Der posttranslationale Transport von Proteinen könnte für die Hefe besonders wichtig sein, denn die Untereinheiten Sec62p und Sec63p des Sec62/63p-Komplexes sind essentielle Proteine der Hefe und nahezu vollständig in dem gereinigten Sec-Komplex enthalten (Panzner et al., 1995). Eine Funktion des Ssh1p- und des Sec61p-Komplexes der Hefe im cotranslationalen Transportprozeß konnte bisher nicht direkt gezeigt werden, da entsprechende in vitro Systeme fehlen.

Die Frage, warum zwei cotranslationale Translokationsapparate in der ER-Membran der Hefe existieren, ist vollkommen ungeklärt. Es ist vorstellbar, daß die beiden heterotrimeren Komplexe unterschiedliche Substratspektren besitzen. In diesem Fall könnten verschiedene cytosolische Targetingmechanismen zum Ssh1p- bzw. Sec61p-Komplex in der Membran führen und der Ssh1p-Komplex nur nicht-essentielle Proteine der Hefezelle transportieren. Alternativ könnte ein zweites cotranslationales Transportsystem eine unabhängige Regulation der co- und posttranslationalen Transportprozesse ermöglichen. Über das dynamische Verhalten der Transportsysteme der ER-Membran der Hefe ist jedoch nur wenig bekannt. Der Ssh1p-Komplex ist zu einem Großteil mit Digitonin aus der Membran exponentiell wachsender Hefen extrahierbar, ungefähr 20% sind mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert. Demgegenüber liegen 40% des Sec61p-Komplexes in freier Form vor, 10-20% in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen und der Rest in Verbindung mit dem Sec62/63p-Komplex. Die freien Sec61p- und Ssh1p-Komplexe könnten einen Pool inaktiver Moleküle bilden, der bei Bedarf schnell in die entsprechende aktive Form überführt werden kann. Ob der Sec-Komplex in Membranen tatsächlich in seine beiden Teilkomplexe zerfällt und im Gleichgewicht mit dem freien Sec61p-Komplex steht, ist unklar. Wir fanden, daß zumindest Ribosomen nicht in der Lage sind, den Sec-Komplex in Membranen zu dissoziieren, denn sie binden nicht an rekonstituierte Proteoliposomen, die den Sec-Komplex enthalten (nicht veröffentlichte Daten). Wie sich Ribosomen mit naszierenden Polypeptidketten in diesem Zusammenhang verhalten, wurde bisher nicht untersucht.

Sbh1p ist die einzige Untereinheit des Sec61p-Komplexes bzw. Sec-Komplexes, die nicht in genetischen Screens entdeckt worden ist. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, daß Sbh1p und sein Homologes Sbh2p zur Translokationskapazität der Hefezelle beitragen. Obwohl die beiden Sbh-Proteine evolutionär konserviert sind, da sie der beta-Untereinheit des Sec61p-Komplexes der Säuger verwandt sind, sind sie für den co- oder posttranslationalen Transport in vivo nicht absolut essentiell. In Übereinstimmung damit ist der posttranslationale Transport in vitro reduziert, aber nicht vollständig verhindert, wenn Sbh1p und Sbh2p fehlen. In welcher Weise die Sbh-Proteine den Translokationsprozeß beeinflussen, ist ungeklärt.


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Untersuchungen im cotranslationalen Säugersystem deuten darauf hin, daß das Säugerhomologe Sec61beta

die produktive Insertion der naszierenden Kette in den Translokationskanal beschleunigt. Die Interaktion zwischen dem Ribosom und dem Sec61p-Komplex ist jedoch in der Abwesenheit der beta-Untereinheit nicht gestört (Kalies et al., 1998). Es wurde außerdem vorgeschlagen, daß Sec61beta bei der Bindung der Signalpeptidase an den Sec61p-Komplex eine Rolle spielt, da es ribosomenabhängig zu einer Untereinheit des Signalpeptidase-Komplexes vernetzt werden kann (Kalies et al., 1998).

Die beta-Untereinheiten der eukaryontischen Sec61p-Komplexe haben keine Sequenzhomologie zu der dritten Untereinheit des SecYEG-Komplexes in E.coli; die Situation des SecG ist jedoch ähnlich. Zum einen ist SecG nicht essentiell, zum anderen ist ein dimerer Komplex aus SecY und SecE für die Translokation von Proteinen in rekonstituierte Proteoliposomen ausreichend, obwohl der Prozeß durch SecG deutlich stimuliert wird (Akimura et al., 1991; Nishiyama et al., 1993; 1994; Hanada et al., 1994; Duong und Wickner, 1997). Die dritte Untereinheit der heterotrimeren Komplexe (Sec61beta, Sbh1p, Sbh2p bzw. SecG) ist offensichtlich von geringer Bedeutung für den Translokationsprozeß. Man könnte annehmen, daß der minimale Translokationsapparat in der Membran aus nur zwei Proteinen besteht: die große, mehrfach die Membran durchspannende alpha-Untereinheit bildet den Kanal, die kleine gamma-Untereinheit wird benötigt, um den Kanal in der Abwesenheit zu transportierender Polypeptidketten in einer geschlossenen Konformation zu halten.

Viele Fragen auf dem Gebiet der Translokation sind ungeklärt. Besonders interessant wäre es herauszufinden, ob der Kanal in vivo in jeder Translokationsrunde assembliert und deassembliert, wie Assemblierung und Deassemblierung reguliert sind, wie die Funktion der Membran als Permebilitätsbarriere beim co- und posttranslationalen Transport tatsächlich aufrechterhalten wird, welche Funktion die einzelnen Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes besitzen, wie die Signalsequenz den Translokationskanal öffnet und wie der Kanal am Ende der Translokation geschlossen wird. Eine Erweiterung des Methodenspektrums wird notwendig sein, um diese wichtigen Fragen zufriedenstellend beantworten zu können.


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