Plath, Kathrin: Zum Mechanismus der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum der Hefe
Zum Mechanismus der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum der Hefe
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
im Promotionsfach Biologie
Spezialisierung Zellbiologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biochemikerin Kathrin Plath ,
geboren am 2. Mai 1971 in Brandenburg/Havel

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. Dr. h.c. Hans Meyer

Dekan der Fakultät: Prof. Dr. Jürgen P. Rabe

Gutachter:
Prof. T. A. Rapoport
Prof. E. Hartmann
Prof. Andreas Herrmann

Tag der Einreichung beim Promotionsausschuss: 14. Mai 1999

Tag der mündlichen Prüfung: 23. Juli 1999

Schlagwörter:
Proteintransport, Endoplasmatisches Retikulum, Saccharomyces cerevisiae, cotranslational, posttranslational, Sec61p-Komplex

Keywords:
protein translocation, endoplasmic reticulum, Saccharomyces cerevisiae, cotranslationa, posttranslational, Sec61p complex

ZUSAMMENFASSUNG

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae können Proteine entweder co- oder posttranslational durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden. Sie besitzen eine Signalsequenz, die sie zu einem hydrophilen Kanal in der Membran bringt, durch den der Transport erfolgt. Die zentrale Komponente des Translokationsapparates in der Membran ist der aus den Untereinheiten Sec61p, Sbh1p und Sss1p bestehende Sec61p-Komplex. Beim Protein-transport wirkt der Sec61p-Komplex zusammen mit anderen Faktoren: Im cotranslationalen Transport geht er eine feste Bindung mit Ribosomen ein; der posttranslationale Transport erfordert die Assoziation mit dem tetrameren Sec62/63p-Komplex unter Bildung des sogenannten Sec-Komplexes.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur des Sec61p-Komplexes durch Elektronen-mikroskopie analysiert. Er liegt in Detergenzlösung in ringförmigen Strukturen mit einem Durchmesser von ~82Å und einer zentralen Pore von ~21Å vor. Jeder Ring besteht aus drei oder vier heterotrimeren Sec61p-Komplexen. Die oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes entsprechen vermutlich proteinleitenden Kanälen der Membran des Endoplasmatischen Retikulum. In Membranen wird ihre Bildung durch die Bindung von Ribosomen oder die Interaktion mit dem Sec62/63p-Komplex induziert. Eine dreidimensionale Struktur, die durch Kryo-Elektronen-mikroskopie erhalten wurde, zeigt, daß das Ribosom so an den Sec61p-Komplex bindet, daß der Tunnel im Ribosom, durch den die naszierende Polypeptidkette das Ribosom verläßt, genau in die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers mündet. Es existiert also ein kontinuierlicher Kanal, der sich vom Peptidyltransferase-Zentrum im Ribosom durch die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers erstreckt, durch den naszierende Polypeptidketten cotranslational direkt in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden könnten.

In dieser Arbeit wurde ein dem Sec61p-Komplex verwandter heterotrimerer Komplex in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum identifiziert, der aus den Untereinheiten Ssh1p, Sbh2p und Sss1p besteht. Sss1p ist beiden trimeren Komplexen gemein; Ssh1p und Sbh2p sind homolog zu Sec61p bzw. Sbh1p. Durch Deletion von Ssh1p und Sbh2p wurde gezeigt, daß der Ssh1p-Komplex wie der Sec61p-Komplex am Transport von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum beteiligt ist. Der Ssh1p-Komplex ist mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert und bildet in Detergenzlösung oligomere Ringstrukturen, aber interagiert nicht mit dem Sec62/63p-Komplex. Wir postulieren daher, daß der Ssh1p-Komplex ausschließlich den cotranslationalen Transport von Proteinen vermittelt.

Beim posttranslationalen Transport interagiert das vollständig synthetisierte Modellsubstrat Prepro-Alphafaktor mit vielen cytosolischen Proteinen. Die cytosolischen Chaperone Hsp70 und TRiC konnten als Interaktionspartner identifiziert werden. Bei der Bindung des Prepro-Alphafaktors an die Membran werden die cytosolischen Proteine freigesetzt. Wir verwendeten einen Photoquervernetzungsansatz, um zu untersuchen, wie die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors im Bindungsschritt durch den Sec-Komplex erkannt wird. Die Signalsequenz-bindungsstelle wird hauptsächlich von Sec61p gebildet und befindet sich an der Grenzfläche zur Lipiddoppelschicht. Die gebundene Signalsequenz ist in einer helikalen Struktur fixiert und wird auf gegenüberliegenden Seiten von den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p umgeben. Sec62p und Sec71p, zwei Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes, flankieren gemeinsam eine Seite der Signalsequenzhelix, befinden sich aber in größerer Entfernung zur Signalsequenz als Sec61p. Es wird ein Modell vorgeschlagen, das beschreibt, wie die Bindung der Signalsequenz den Translokationskanal für den Transport öffnen könnte.


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteZum Mechanismus der Translokation von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum der Hefe
1 EINLEITUNG
2 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE
2.1.Der Sec61p-Komplex bildet oligomere Ringstrukturen, die vermutlich protein-leitenden Kanälen der ER-Membran entsprechen
2.2.Der dem Sec61p-Komplex verwandte heterotrimere Ssh1p-Komplex spielt eine Rolle beim cotranslationalen Proteintransport in das ER der Hefe
2.3.Die Erkennung der Signalsequenz im posttranslationalen Transportmodus
2.4.Die cytosolischen Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors werden bei seiner Bindung an den Sec-Komplex freigesetzt
3 DISKUSSION
3.1.Der posttranslationale Transport in das ER der Hefe
3.2.Die Signalsequenzerkennung durch Sec61p ist evolutionär konserviert
3.3.Die Assemblierung des Translokationskanals und die Erkennung der Signalsequenz sindvermutlich aufeinanderfolgende Schritte beim co- und posttranslationalen Transport in das ER der Eukaryonten
3.4.Die Öffnung des Translokationskanals im co- und posttranslationalen Transportprozeß
3.5.Die Schließung des Translokationskanals
3.6.Mögliche Funktion der beiden zur Signalsequenz vernetzbaren Proteine Sec62p und Sec71p im posttranslationalen Transport
3.7.Die Interaktion zwischen dem Sec61p-Komplex und dem Ribosom beim cotranslationalen Transport
3.8.Die co- und posttranslationale Translokation von Proteinen in das ER der Hefe - der neu-entdeckte Ssh1p-Komplex und die Rolle der Sbh1p-Untereinheit des Sec61p-Komplexes
Bibliographie 4. LITERATURVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis 5. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Anhang A 6. ANHANG
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Danksagung
Anhang B 7. ANLAGEN
B.1.Anlage 1
B.2.Anlage 2
B.3.Anlage 3
B.4.Anlage 4: Das Sec61p-Oligomer bindet an den Austrittsort der naszierenden Kette am Ribosom
B.5.Anlage 5: Die cytosolischen Interaktionspartner des Prepro-Alphafaktors werden bei seiner Bindung an den Sec-Komplex freigesetzt

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Übersicht über die Komponenten des Sec61p/SecYEG-Komplexes in den verschiedenen Organismen
Abbildung 2 Modell des cotranslationalen Proteintransports durch die ER-Membran der Säuger
Abbildung 3 Schematische Darstellung wichtiger Komponenten des Translokationsapparates in der ER-Membran von S.cerevis
Abbildung 4 Modell des posttranslationalen Proteintransports durch die ER-Membran der Hefe S.cerevisiae
Abbildung 1 und 2
Abbildung 3 und 4
Abbildung 1: Interaktionen des Prepro-Alphafaktors im Cytosol
Abbildung 2: Der Prepro-Alphafaktor ist Bestandteil verschiedener translokations-kompetenter Komplexe
Abbildung 3: Die cytosolischen Interaktionspartner werden bei der Bindung an den Sec-Komplex vom Prepro-Alphafaktor abgelöst

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Tue Apr 11 11:56:29 2000