Pörs, Yvonne: Anpassung von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L.) an Licht- und Chlorophyllmangel

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial und Anzucht

Zur Untersuchung in vorliegender Arbeit dienten Wildtyppflanzen (WT) und Transformanten (TF) von Tabak (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun N. N.). Die WT-Pflanzen trugen die nach dem Sortennamen gewählte Bezeichnung SNN.

In die Tabakpflanzen wurde in der Arbeitsgruppe Chlorophyllbiosynthese (unter Leitung von Dr. B. Grimm) des Instituts für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben eine invers orientierte GSA-AT cDNA-Sequenz mittels eines CaMV 35S-Promotors eingeführt. Diese Prozedur sowie die nachfolgende Regeneration der transgenen Pflanzen wurde detailliert bei Höfgen et al. (1994) beschrieben. Für vorliegende Untersuchung wurden 3 Transformationslinien gewählt: HÖ32-57, HÖ32-25 und HÖ32-42 (kurz: #57, #25 und #42).

Für die Anzucht kamen entweder Primär-TF oder Sämlinge zur Anwendung. Die Primär-TF wurden in der o. g. Arbeitsgruppe vermehrt und bis zur Ausbildung von tragfähigen Wurzeln ca. 10 - 14 d in sterilen Anzuchtgläsern auf Hygromycin-Medium (s. Höfgen et al., 1994) unter 30 - 40 µmol Quanten m-2 s-1 PPFD angezogen. Für den Erhalt von Sämlingen wurde von Primär-TF gewonnener Samen in eine abgedeckte Schale (gegen Wasserverlust) mit Erde ausgesät und bei ca. 170 µmol Quanten m-2 s-1 PPFD ca. 3 - 4 Wochen angezogen. Die Kultur der Pflanzen erfolgte in Einheitserde (Topfkultursubstrat, Fa. Vehnenmoor, pH 5.0 - 6.0). Die Primär-TF bzw. Sämlinge wurden einzeln in kleine Töpfe (0.25 l) pikiert und ohne Abdeckung in die vorgesehene Anzucht-Lichtintensität gestellt. Dieser Zeitpunkt galt als Tag 0 für die Bestimmung des Pflanzenalters. Nach ca. 14 - 21 d erfolgte ein Umtopfen der Pflanzen in 2 l-Töpfe mit frischer Erde. Gegossen wurde einmal täglich mit Leitungswasser, ab der 3. Woche nach Umsetzen in 2 l-Töpfe wurde im Abstand von 7 d mit Knop´scher Nährlösung (s. Ostareck, 1990b) gedüngt.

Die Pflanzen wuchsen in einem Anzuchtraum in einem 12 h Licht-/12 h Dunkel-Zyklus bei 25 °C/20 °C und ca. 65 % Luftfeuchte unter Starklicht (high light, HL; 300 ± 21 µmol Quanten m-2 s-1 PPFD) bzw. Schwachlicht (low light, LL; 30 ± 3 µmol Quanten m-2 s-1 PPFD). Die Lichtintensität wurde in Höhe der untersuchten Blätter mit Hilfe des Lichtmessgerätes LI-189 mit Quantumsensor (Fa. LI-COR) ermittelt. Die Beleuchtung erfolgte mit Hochdruck-Natriumdampf-Lampen (SON-T AGRO 400, Fa. Philips) mit dem in Abb. 1 dargestellten Emissionsspektrum. Dieses wurde mittels eines tragbaren Spektralradiometers (LI-1800 mit integrierender Kugel LI-1800-12; Fa. LI-COR, Lincoln) aufgenommen.


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Durch entsprechend große Abstände zwischen den Töpfen konnte eine gegenseitige Beschattung der Pflanzen weitgehend vermieden werden.

Abb. 1 Menge an emittierten Quanten (µmol Quanten m-2 s-1 nm-1) pro Wellenlänge (lambda, nm) in dem Bereich von 400 bis 700 nm durch die Hochdruck-Natriumdampf-Lampen der HL- ( ) und der LL-Anzuchtfläche ( )

2.2. Methoden

2.2.1. Messungen und Probenahmen

Die Messungen und Probenahmen für die einzelnen Untersuchungen erfolgten wie in Tab. 1 beschrieben. Die Wahl des jeweiligen Blatt- bzw. Pflanzenalters basierte auf morphometrischen Messungen (Kap. 3.2.2) sowie CO2-Gaswechsel-Untersuchungen (Kap. 3.4.1).


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Tab. 1 Angaben zu Messungen und Probenahmen für die einzelnen Methoden. Aufgeführt sind jeweils das relative ontogenetische Blatt- (mit der jeweiligen Blatt-Nr. von oben gezählt = Bl. v.o.) und das Pflanzenalter (mit der Gesamtblattzahl) zum Zeitpunkt der Messung bzw. Probenahme, die Tageszeit der Messung bzw. Probenahme in Relation zum Lichtregime, die Art und Lagerung der Proben sowie die Dauer der Messung bzw. Probenahme bis zur Fixierung.

Methode
(Kap.)

Blatt-Nr.
(ontogenet. Alter)

Pflanzenalter
(Blattanzahl,
gesamt)

Messung o. Probenahme nach:

Probenart/
Lagerung

Dauer der Messung o. Probenahme

Morphologie
(2.2.2)

alle Blätter
(ab 2 mm Länge bis voll ausge-wachsenes Bl.)

0 - ca. 15 Wochen
(mind. 3 -
max. 60)

2 - 8 h Licht

gesamte Pflanze
(im Topf; im Anzuchtraum)/
Sofortmessung

max. 30 min
je Pflanze

TM, FM
(2.2.3)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

5 - 7 h Licht

Blattscheiben/
Sofortaufarbeitung

< 5 min

CO2-/H2O-Gaswechsel
(2.2.4)

8. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

2 - 12 h Licht

gesamtes Blatt
(an Pflanze belassen)/
Sofortmessung

ca. 2 - 3 h

Stomata- und Epidermis-zelldichte
(2.2.5)

8. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Abdruck von Blattfläche/
Abdruck auf Objektträger

< 5 min

AdN
(2.2.6)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Blattscheiben/
in flüss. N2

10 - 12 sec

PN
(2.2.7)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Blattscheiben/
in flüss. N2

15 - 20 sec

NADP+-MDH
(2.2.8)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Blattscheiben/
in flüss. N2

15 - 20 sec

Chlorophyll
(2.2.9)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Blattscheiben/
in flüss. N2 bzw. Sofortaufarbeitung

15 - 20 sec

Proteine
(2.2.10)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Blattscheiben/
in flüss. N2

15 - 20 sec

C und N
(2.2.11)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 h Licht

Blattscheiben/
als Trockensubstanz

20 - 30 sec

Stärke und
Zucker
(2.2.12)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

je 0.5 h vor Ende der Licht- bzw. Dunkelphase

Blattscheiben/
in flüss. N2

20 - 30 sec

Absorption
(2.2.13)

9. - 12. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

4 - 8 h Licht

gesamtes Blatt (frisch von Pflanze abgetrennt)/Sofortmessung

5 - 10 min

Elektronen-
mikroskopie
(2.2.14)

9. Bl. v.o.
(gerade aus-wachsendes Bl.)

6 - 9 Wochen
(22 - 26)

12 h Dunkel

Frischprobe/
Sofortaufarbeitung

< 5 min


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2.2.2. Morphologische Untersuchungen

Für die Ermittlung von Wachstumsraten und Entwicklungszustand der Blätter und Pflanzen wurden ab dem Zeitpunkt des Pikierens der Pflanzen in kleine Töpfe aller 3 bis 4 d Sprosslänge, Blattanzahl sowie Länge (l) und Breite (b) der einzelnen Blätter ermittelt. Die Blattfläche errechnete sich aus:

[1] [cm2].

Der Faktor 0.739 in Gleichung [1] wurde für die Tabakpflanzen der SNN und der TF mit einer Standardabweichung (s) von 3 % für je 20 Blätter verschiedener Pflanzen und unterschiedlichen Alters aus 2 unabhängigen Versuchsreihen bestimmt. Dafür wurden die ermittelten Längen und Breiten mit den nach der in Kap. 2.2.4.2 beschriebenen Methode bestimmten Blattflächen in Beziehung gesetzt.

Die Ergebnisse zur Sprosslänge (H), zur Fläche einzelner Blätter (Ar), zur gesamten Fläche aller an einer Pflanze gebildeten Blätter (SigmaAr) sowie zur Blattanzahl (n) in Abhängigkeit vom Pflanzen- bzw. Blattalter (t, in d) wurden mit Hilfe folgender in Anlehnung an Landsberg (1977) modifizierten Gleichung (Wachstumskurven) mit den spezifischen Parametern a, b und c beschrieben:

[2] .

y steht für die jeweiligen Biomasse-Parameter (H, Ar, SigmaAr, n) zum Zeitpunkt t. Der Parameter a bezeichnet den maximalen Wert der Sprosslänge, der Fläche eines oder aller Blätter bzw. der Blattanzahl nach Abschluss des Wachstums, der Parameter c den Zeitpunkt der Ontogenese (in d), an welchem die Wachstumsrate (s. [3]) maximal ist ((dy/dt)max). Die Wachstumsraten können mathematisch mittels der 1. Ableitung der Wachstumsfunktion [2] dargestellt werden (Landsberg, 1977; Mohr und Schopfer, 1992), d. h.:

[3] .

Die maximale Wachstumsrate ((dy/dt)max) ergibt sich daher aus der Berechnung von [3] für
t = c:

[4] .


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2.2.3. Frisch- und Trockenmassenbestimmung

Nach Bestimmung der Frischmasse mit einer Feinwaage MC 210P (Fa. Sartorius) wurde das Pflanzenmaterial in Bechergläsern im Trockenschrank (MLW WS30) bei 105 °C getrocknet. Die Ermittlung der Trockenmasse erfolgte nach Erreichen der Gewichtskonstanz nach 3 - 4 d.

2.2.4. Messungen von Parametern des CO2- und H2O-Gaswechsels

Für die Messung von CO2- und H2O-Gaswechsel-Parametern wurden Blätter, wie in Tab. 1 aufgeführt, ausgewählt, welche an der gut bewässerte Pflanze belassen und von der Blattspitze her in die Messküvette eingespannt wurden.

Die Messung der CO2- und H2O-Austauschraten erfolgte in einem offenen System (Kompakt-Miniküvetten-System, Fa. Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland) per Differenzmessung mittels eines Infrarot-Gasanalysators (BINOS 100, Fa. Rosemount GmbH & Co., Hanau, Deutschland). Die Temperatur in der Blattküvette mit angeflanschtem Klimaaggregat (GK 022) war auf 22 °C eingestellt, die Taupunkt-Temperatur des Luftstroms in der Blattkammer lag bei 17 °C. Die Blatt-Temperatur betrug 23.2 ± 0.3 °C, die relative Luftfeuchte
85 ± 6 %. Die Bestrahlung erfolgte über eine Fiberoptik von einer Kaltlichtquelle (FL-400, Fa. Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland). Die Flussrate des Luftstromes durch die Blatt-Küvette betrug 1000 ml min-1 (Bestimmung der lichtabhängigen CO2-Austauschrate) bzw. 1400 ml min-1 (Bestimmung der Photorespirationsrate und der RSL). Das entsprach, bezogen auf die gewählten Blattflächen, einer Luft-Durchflussrate von ca. 20 ± 0.5 l cm-2 h-1.

Die lichtabhängigen CO2-Aufnahmeraten (Lichtsättigungs-, Lichtabhängigkeitskurven) wurden bei 6 PPFD´s (30 - 1800 µmol Quanten m-2 s-1, ansteigend) aufgenommen. Die Zeit bis zum Erreichen des stationären Zustandes von Transpirations- und CO2-Aufnahmeraten betrug ca. 30 (LL) bis 60 (HL) min. Vor jeder Lichtabhängigkeitskurve wurde die Dunkelrespirationsrate (RD) nach vorheriger Dunkeladaptation von ca. 30 min bestimmt. Dabei betrug die äußere CO2-Konzentration (ca) 350 ± 5 ppm (Messung mit natürlicher Umgebungsluft).

Die Bestimmung der Photorespirationsraten (RPh) bzw. des durch die Photorespiration reduzierten Anteiles der Netto-CO2-Austauschrate (% RPh) erfolgte jeweils bei Anzucht- und sättigenden Lichtintensitäten. Letztere wurden bei der Aufnahme der Lichtsättigungskurven ermittelt (Tab. 2; s. auch Kap. 3.4.2.2). Die äußere CO2-Konzentration (ca) wurde mittels einer Gasmischanlage (GMA, Fa. Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Deutschland) auf 340 ppm reguliert.


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Durch Zumischen von N2 wurde die O2-Konzentration der Außenluft von 21 % auf 2 % gesenkt. Auch hier wurde RD vor jeder Messung von jedem Blatt nach vorheriger 30minütiger Dunkelinkubation ermittelt. Der steady state-Zustand war auch nach ca. 30 - 60 min erreicht.

Für die Ermittlung der relativen stomatären Limitierung (RSL) wurde bei sättigender PPFD (Tab. 2) zuerst die CO2-Aufnahmerate bei einer ca von 340 ppm CO2 bestimmt. Danach wurde die CO2-Aufnahmerate bei angenommener fehlender Limitierung durch die Stomata ermittelt, d. h. in diesem Falle wäre die CO2-Konzentration in den Mesophyll-Interzellularen ci gleich derer der Umgebungsluft ca. Dementsprechend wurde ca mittels Gasmischanlage soweit erhöht, bis ci den Wert von 340 ppm CO2 annahm.

Tab. 2 Bei der Bestimmung des Anteiles der Photorespiration sowie der RSL verwendete PPFD´s (in µmol Quanten m-2 s-1) im lichtgesättigten Bereich der Photosynthese in Anlehnung an die ermittelten Lichtsättigungspunkte (Tab. 7, Kap. 3.4.2.2) für Blätter von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42.

SNN

#57

#25

#42

HL

1050

820

450

450

LL

370

290

230

90

2.2.4.1. Berechnungen

Die Berechnung der CO2-Gaswechselparameter JCO2, JH2O, gH2O und ci erfolgte mittels Diagas-Programm (Version 2.16, Fa. Heinz Walz GmbH) nach von Caemmerer und Farquhar (1981).

Die Lichtsättigungskurven der CO2-Aufnahmeraten sind mathematisch nach Schulte (1993) durch eine Exponentialfunktion beschrieben. Die Gleichung hat die Form

[5] [µmol CO2 m-2 s-1]

mit den spezifischen Konstanten A, B und C.

Daraus lassen sich folgende Parameter mittels der aufgeführten Gleichungen [6] bis [9] ableiten:


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Die maximale CO2-Aufnahmerate (max. JCO2) entspricht

[6] [µmol CO2 m-2 s-1].

Der Lichtsättigungspunkt (LSP), der in Anlehnung an Schulze (1970) als die PPFD definiert ist, bei der 90 % der maximalen CO2-Aufnahmerate erreicht werden, errechnet sich aus

[7] [µmol Quanten m-2 s-1].

Der Lichtkompensationspunkt (LKP) ist mit dem Abzissenschnittpunkt der Lichtsättigungskurve [5] identisch, d. h. er entspricht der PPFD, an der JCO2 = 0 ist:

[8] [µmol Quanten m-2 s-1].

Die maximale apparente Quantenausbeute (phisapp) entspricht dem Quotienten aufgenommener CO2-Moleküle pro Anzahl auf das Blatt auftreffender Quanten im linearen Bereich der Lichtsättigungskurve. Sie wird aus der Anfangssteigung der Lichtsättigungskurve im LKP berechnet und entspricht der 1. Ableitung der Exponentialfunktion [5] für PPFD = LKP:

[9] [mol CO2 (mol Quanten)-1].

Die maximale reelle Quantenausbeute (phisreell; in mol aufgenommenes CO2 (mol absorbierte Quanten)-1) ergibt sich nach Korrektur mittels der tatsächlich absorbierten Quanten (Bestimmung s. Kap. 2.2.13).

Die Photorespirationsrate (RPh) sowie der Anteil, um den die Netto-CO2-Aufnahmerate durch die Photorespiration verringert wurde (% RPh), berechnen sich aus:

[10] [µmol CO2 m-2 s-1]

[11] [%],

wobei die CO2-Aufnahmerate bei 21 % O2 in der Außenluft ist und die CO2-Aufnahmerate, die bei einem auf 2 % reduzierten O2-Gehalt gemessen wurde.

Die relative stomatäre Limitierung der CO2-Assimilation (RSL) wurde nach Farquhar und Sharkey (1982) folgendermaßen berechnet:


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[12] [%],

wobei die Netto-CO2-Aufnahmerate für ca = 340 ppm darstellt. ist die potentielle Netto-CO2-Aufnahmerate bei angenommener fehlender Limitierung durch die Stomata ( > ) und ergibt sich daher für ci = 340 ppm.

Der molare Wassernutzungs-Koeffizient (water use efficiency, WUE) bzw. der Kehrwert des water use efficiency (1/WUE) wurden folgendermaßen berechnet:

[13] [µmol CO2 (mmol H2O)-1]

[14] [mmol H2O (µmol CO2)-1].

2.2.4.2. Ermittlung der Blattflächen als Bezugsgröße

Nach abgeschlossener Gaswechselmessung wurde der Umriss des in der Blattküvette eingespannten Blattstückes auf schwarzes Papier übertragen und ausgeschnitten. Mittels Scanner (Epson GT-6000) wurde diese Fläche (schwarz auf weiß) eingescannt und über das Programm PCX die für die Gaswechselmessung relevante Fläche in cm2 ermittelt.

2.2.5. Bestimmung von Epidermiszell- und Stomatadichte sowie Stomataindex

Nach erfolgter Gaswechselmessung und Blattflächenbestimmung wurde von den Blättern ein Stomataabdruck mittels Mikrorelief-Methode (Pazourek, 1963 und 1970) genommen. Dazu wurden jeweils relativ blattaderfreie Stücke der Ober- und Unterseite im mittleren Bereich der Blattspreite mit farblosem Nagellack eingestrichen. Nach dem Trocknen wurde dieser Abdruck mittels kristallklarem Tesafilm auf einen Objektträger übertragen. Die Auszählung der Stomata und der Epidermiszellen erfolgte mit Hilfe einer geeichten Okularmessplatte an einem Stereomikroskop (Axiolab® der Fa. Zeiss; 400fache Vergrößerung). Jeder Abdruck wurde an 10 verschiedenen Stellen ausgezählt.


21

Daraus errechneten sich die Dichten der Stomata (SD) sowie der Epidermiszellen (ED) (Anzahl pro Fläche). Der Stomataindex (SI; Stomataanzahl pro Gesamtanzahl der Epidermiszellen) wurde nach Meidner und Mansfield (1968) folgendermaßen berechnet:

[15] .

2.2.6. Bestimmung der Adenylatgehalte (ATP, ADP, AMP)

Die Bestimmung der AdN-Gehalte erfolgte mittels luminometrischem Test nach Wulff und Döppen (1985) (ATP) bzw. der modifizierten Methode nach Hampp (1985) (ADP, AMP). Die dabei genutzte Lichtemission der Luciferin-Luciferase-Reaktion bei 562 nm (3 und 4 des Messprinzips, Abb. 2) ist hoch ATP-spezifisch und über weite Bereiche proportional der ATP-Konzentration im Messansatz. In Abhängigkeit von Gerät und Methode können Endkonzentrationen im Messansatz zwischen 10-6 und 10-13 mol l-1 erfasst werden (Wulff und Döppen, 1985).

Die Extraktion der AdN erfolgte nach Homogenisierung mit Hilfe von flüssigem N2 in 0.83 N HClO4 (Verhältnis ArProbe : VExtraktionslösung = 1.4 cm2 : 1 ml). Das erhaltene Extrakt wurde
20 min bei 4000 U min-1 und 4 °C zentrifugiert. Nach nochmaligem Auswaschen des Pellets in 0.83 N HClO4 und erneuter Zentrifugation wurde dem vereinigten Überstand 1 M Bicine (im Verhältnis Extrakt : Bicine = 4 : 1) zugegeben und dieses mit 4 N KOH auf einen pH-Wert von 7.2 - 7.4 eingestellt. Nach 15minütiger Inkubation bei 4 °C wurden die neutralisierten Proben


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5 min bei 1000 U min-1 und 4 °C zentrifugiert. Der auf 10 ml mit HEPES (25 mM)/KOH + EDTA (0.48 mM) (pH 7.75) aufgefüllte Überstand wurde bis zur luminometrischen Messung bei - 20 °C gelagert.

Die Bestimmung von ATP erfolgte entsprechend dem Messprinzip (3 und 4, Abb. 2) direkt aus den neutralisierten Proben, während ADP und AMP zunächst enzymatisch (nach 2 bzw. 1 und 2 des Messprinzips, Abb. 2) in ATP umgewandelt werden mussten. Dazu wurden Aliquots der Extrakte bei Raumtemperatur in folgenden Ansätzen inkubiert (Endvolumen 120 µl):

ADP (Inkubationszeit 10 min):

Probe

20

µl

Hepes/koh (pH 7.75)

5.2

mM

PEP

0.3

mM

Mg-Acetat

2.08

mM

PK

1

U

AMP (Inkubationszeit 60 min):

Probe

20

µl

Hepes/koh (pH 7.75)

5.2

mM

PEP

0.3

mM

Mg-Acetat

2.08

mM

PK

1

U

AK

5

U

Um die Blindwerte während der luminometrischen Messung gering zu halten, war es erforderlich, die PK und AK einmal mit dem 5fachen Volumen einer 3.2 M (NH4)2SO4-Lösung zu waschen. Die Erfassung der Lumineszenz erfolgte 10 sec nach Start der Reaktion für 5 sec am Biolumat LB 9501 (Fa. Berthold) in einem Messansatz mit folgender Zusammensetzung (Endvolumen 320 µl):

ATP

ADP/AMP

Probe bzw. Inkubationsansatz

20

µl

120 µl

Hepes/koh (pH 7.75)

23.44

mM

15.63 mM

Mg-Acetat

5

mM

Na-EDTA

0.15

mM

DTT

12.6

µM

HSA

0.075

% (w/v)

Luciferin

0.28

mM

Luciferase

5

µU

Alle Reagenzien (außer hepes/koh) wurden während des Messtages auf Eis gelagert und erst unmittelbar vor der Messung bzw. Inkubation auf Raumtemperatur erwärmt.


23

Ein ATP-Standard, dessen Konzentration in der Stammlösung an Hand der Extinktion bei 260 nm (eATP = 15.0 cm2 µmol-1; Keesey, 1987) ermittelt wurde, diente im Rahmen einer Verdünnungsreihe zur Quantifizierung. Die Gewährleistung der vollständigen enzymatischen Umwandlung von ADP und AMP wurde ebenfalls mit Standardsubstanzen getestet.

Die Wiederfindungsraten bei aufgeführter Aufarbeitung, Lagerung und Messung betrugen
95 % für ATP, 91 % für ADP und 72 % für AMP. Die relativ niedrigen Wiederfindungsraten für AMP lassen sich durch die sehr schwierige Erfassung von AMP durch die luminometrische Methode erklären, deswegen war bei den AMP-Gehalten auch eine weitaus höhere Standardabweichung zu verzeichnen.

Der energy charge (EC) wurde nach Atkinson (1968) aus den Gehalten der einzelnen Adenylate folgendermaßen berechnet:

[16] .

2.2.7. Bestimmung der Pyridinnucleotgehalte (NAD+, NADP+, NADH+H+, NADPH+H+)

Die Bestimmung der PN erfolgte mittels enzymatic cycling spektralphotometrisch nach einer modifizierten Methode nach Lowry et al. (1961b) und Slater und Sawyer (1962). Dabei wird die enzymatische Umsetzung der PN an die nicht-enzymatische Reduktion und der daraus resultierenden Entfärbung des blauen Farbstoffes dcpip gekoppelt, wobei PMS als Elektronenüberträger fungiert (Messprinzip, Abb. 3). Um bei der Untersuchung am Gesamtextrakt zwischen NADP(H+H+) und NAD(H+H+) unterscheiden zu können, nutzt man dank der proportionalen Abhängigkeit zwischen dem Co-Enzymangebot und der Enzymaktivität die Spezifität einzelner Enzyme bezüglich verschiedener Co-Substrate. Aus dem dafür zur Verfügung stehenden Spektrum kamen die NADP+-abhängige G6PDH (1; Abb. 3) und die NAD+-abhängige ADH zum Einsatz (2; Abb. 3). Diese Methode erlaubt eine Bestimmung der PN in Konzentrationen von bis zu 10-11 mol (Messansatz)-1, d. h. ca. 10-9 mol (g FM)-1 (Lowry et al., 1961a; Slater und Sawyer, 1962). Die Unterscheidung zwischen reduzierten und oxidierten PN basierte auf selektiver Extraktion, wobei die Instabilität von NAD(P)+ im alkalischen und NAD(P)H+H+ im sauren Milieu genutzt wurde.

Die Extraktion der PN erfolgte nach Homogenisierung mit Hilfe von flüssigem N2 in 0.5 N HCl (oxidierte PN) bzw. 0.33 N KOH (reduzierte PN) (Verhältnis ArProbe : VExtraktionslösung =


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3 cm2 : 1 ml). Das erhaltene Extrakt wurde 15 min bei 3200 U min-1 und 4 °C zentrifugiert. Da NAD+ und NADP+ selbst im alkalischen Milieu eine gewisse Stabilität zeigen (Klingenberg, 1985), war für die Extrakte von NADH+H+ und NADPH+H+ eine 30minütige Inkubation bei Raumtemperatur erforderlich. Nach erfolgter Neutralisation der Überstände mit 1 M Tris/HCl und 2 N NaOH (oxidierte PN, pH 7.2 - 7.4) bzw. 1 M TEA.HCl und 2 N HCl (reduzierte PN, pH 7.6 - 7.8) wurden die neutralisierten Proben 10 min bei 2800 U min-1 und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde bis zur spektralphotometrischen Messung bei - 20 °C gelagert.

Die Bestimmung der PN erfolgte entsprechend dem Messprinzip (Abb. 3) in einem Messansatz mit folgender Zusammensetzung (Endvolumen 1.22 ml):

NADP(H+H+):

Probe

100 o. 200

µl

Tris/HCl (pH 7.6)

24.6

mM

Na-EDTA

1.6

mM

DCPIP

0.11

mM

PMS

0.61

mM

G6P

2.46

mM

G6PDH

10

U

NAD(H+H+):

Probe

100 o. 200

µl

Tris/HCl (pH 7.6)

24.6

mM

DCPIP

0.11

mM

PMS

0.61

mM

Ethanol

4.1

% (v/v)

ADH

59

U

Alle Reagenzien wurden während des Messtages auf Eis gelagert und erst unmittelbar vor der Messung auf Raumtemperatur erwärmt.

Um die Blindwerte für die spektralphotometrische Messung gering zu halten, war es je nach Chargenqualität der Enzyme erforderlich, die G6PDH 1- bis 4mal mit dem 5fachen Volumen einer 3.2 M (NH4)2SO4-Lösung zu waschen bzw. die ADH mittels Gel-Filtration über eine Sephadex® G25M-Säule (PD-10, Fa. Pharmacia) zu reinigen.

Die Kinetik der DCPIP-Reduktion wurde bei 625 nm und einer Temperatur von 25 °C am Zweistrahlphotometer (Uvikon 931, Fa. Kontron) nach einem ca. 2minütigen Vorlauf zur Erfassung des Blindwertes und Start der Reaktion durch G6PDH bzw. ADH mindestens 5 min aufgenommen. Vor jeder Messserie erfolgte ein Reinheitstest der Enzyme, indem beim Vorlauf der Messansatz alle Reagenzien incl. Enzym ohne Standard beinhaltete und die Reaktion durch Zugabe des Standards gestartet wurde.

Standardsubstanzen (aufgrund der höheren Stabilität nur die jeweils oxidierten PN), deren Konzentration in der 10- bis 100fach konzentrierten Stammlösung an Hand der Extinktion bei


25

260 nm (eNADP+ = 18.0 cm2 µmol-1; eNAD+ = 17.6 cm2 µmol-1; Keesey, 1987) ermittelt wurde, dienten durch Variation des Volumens zur Quantifizierung.

Abb. 3 Prinzip der spektralphotometrischen Messung der phosphorylierten PN (NADP(H+H+), 1) und nicht-phosphorylierten PN (NAD(H+H+), 2) mittels enzymatic cycling nach Lowry et al. (1961b) und Slater und Sawyer (1962).

Die Wiederfindungsraten bei der beschriebenen Aufarbeitungsmethode (Extraktion, Lagerung, Messung) betrugen für NAD+ 99 % und für NADP+ 96 % (jeweils in 5 unabhängigen Versuchen getestet) sowie für NADH+H+ 86 % und für NADPH+H+ 100 % (jeweils nur in 1 Versuch getestet).


26

Der anabolic reduction charge (ARC) und catabolic reduction charge (CRC) werden nach Andersen und von Meyenburg (1977) aus den Gehalten der einzelnen Pyridinnucleotide entsprechend den Gleichungen [17] und [18] berechnet.

[17]

[18]

Der redox charge (RC) ist nach Quebedeaux (1981) folgendermaßen definiert:

[19] .

2.2.8. Bestimmung der Aktivität der NADP+-abhängigen MDH

Die Bestimmung der NADP+-MDH-Aktivität erfolgte spektralphotometrisch nach Verbrauch des Co-Enzyms NADPH+H+ in Anlehnung an die Methoden von Scheibe et al. (1986) und Scheibe und Stitt (1988).

Da Veränderungen des Aktivitätszustandes der MDH mit der Reduktion von Disulfidbrücken verbunden sind (Scheibe, 1987), musste O2 während der Aufarbeitung und Messung zur Vermeidung von oxidativ verursachten Artefakten weitgehend ausgeschlossen werden. Dazu wurden alle Lösungen mit N2 begast und die Extraktion erfolgte in einer O2-freien Box. Der Messansatz wurde während des Pipettierens mit N2 überschichtet und danach die Küvetten mit Parafilm® verschlossen.

Die Extraktion der NADP+-MDH erfolgte nach Homogenisierung mit Hilfe von flüssigem N2 in einem Extraktionsmedium mit folgender Zusammensetzung:

Na-Acetat (pH 6.0)

50

mM

Pefabloc® SC

100

µM

HSA

0.1

% (w/v)

Triton® X-100

0.1

% (v/v)

DTT

4

mM

Das Verhältnis von ArProbe : VExtraktionslösung betrug 10 cm2 : 1 ml.

Das erhaltene Extrakt wurde nach Abnahme eines Aliquots (200 µl) zur Chl-Bestimmung (s. Kap. 2.2.9) 1 min bei ca. 14000 U min-1 und 4 °C (Biofuge 15, Fa. Heraeus) zentrifugiert.


27

Zur Bestimmung des Anteils an aktivem Enzym in den Proben wurde durch Inkubation eines Aliquots mit reduziertem DTT bei Raumtemperatur eine maximale Aktivierung der NADP+-MDH induziert (Scheibe und Stitt, 1988). Der Aktivierungsansatz enthielt (Endvolumen 200 µl):

Probe

80

µl

HSA

0.1

% (w/v)

Tris/HCl (pH 8.0)

0.4

M

DTTred (in 1 M Tris/HCl, pH 9.0 vorgelöst)

0.1

M

Da Vorversuche gezeigt hatten, dass nach 30minütiger Aktivierung der Enzymaktivität ein Plateau erreicht war, wurde nach dieser Zeit die NADP+-MDH-Aktivität ermittelt.

Abb. 4 Prinzip der spektralphotometrischen Messung der Aktivität der NADP+-MDH nach Scheibe et al. (1986) und Scheibe und Stitt (1988).

Die Bestimmung der in vivo- bzw. der Vollaktivität der NADP+-MDH erfolgte entsprechend dem Messprinzip (Abb. 4) in einem Ansatz mit folgender Zusammensetzung (Endvolumen 1.0 ml):

Probe

20

µl

bzw.Aktivierungsansatz

40

µl

Tris/HCl (pH 8.0)

0.1

M

HSA

0.01

% (w/v)

NADPH+H+

0.2

mM

OAA

1

mM

OAA wurde während des Messtages auf Eis gelagert und erst unmittelbar vor Reaktionsstart auf Raumtemperatur erwärmt.

Die Kinetik der NADPH+H+-Umwandlung wurde nach einem ca. 3minütigen Vorlauf zur Erfassung des Blindwertes und Start der Reaktion mit OAA bei 340 nm und 25 °C am Zweistrahl-Spektralphotometer (Uvikon 931, Fa. Kontron) 10 min lang verfolgt.

Die Berechnung der in vivo- bzw. Vollaktivität der NADP+-MDH erfolgte mittels Extinktionskoeffizienten (eNADPH+H+ = 6.2 cm2 µmol-1) in umgesetztes NADPH+H+ pro Zeit.


28

2.2.9. Bestimmung des Chlorophyllgehaltes

Eine Bestimmung des Chlorophyllgehaltes wurde von allen in den Versuchen genutzten Blättern vorgenommen und entweder spektralphotometrisch oder mit HPLC durchgeführt.

Die spektralphotometrische Bestimmung nach Lichtenthaler und Wellburn (1983) erlaubt die Ermittlung der Gehalte an Chl a und b. Dazu wurde das Pflanzenmaterial mit Hilfe von Quarzsand in 100 %igem Aceton unter Zugabe einer Spatelspitze MgCO3 im Dämmerlicht homogenisiert und durch eine Schott´sche Fritte (G4, max. Porenweite 10 - 16 µm) mittels Vakuum gefiltert. Anschließend wurde das Extrakt mit 100 %igem Aceton auf 25 ml aufgefüllt. Je nach Chl-Gehalt erwies sich ein Verhältnis ArProbe : VExtraktionslösung von 0.16 - 0.21 cm2 : 1 ml als geeignet. Die Proben wurden entweder sofort nach Extraktion oder nach 1- bis 2tägiger Lagerung bei - 20 °C im Dunkeln gemessen.

Für die Bestimmung des Chl-Gehaltes in den NADP+-MDH-Extrakten wurde das entnommene Aliquot (200 µl) mit 800 µl 100 %igem Aceton gut gemischt und bis zur Messung 1 - 2 d bei
- 20 °C dunkel aufbewahrt. Vor der Messung wurden die Proben noch einmal gut geschüttelt, 2 min bei 14000 U min-1 (Biofuge 15, Fa. Haraeus) zentrifugiert und der Überstand auf 5 ml mit 100 %igem Aceton aufgefüllt.

Die Messung der Chl-Gehalte erfolgte am Zweistrahl-Spektralphotometer (Uvikon 931, Fa. Kontron) bei 720 nm (Trübung, Küvettenfehler), 662.5 nm (Chl a) und 645.5 nm (Chl b) gegen Blindwert.

Die Gehalte an Chl a und Chl b wurden nach Korrektur der Extinktionen bei 662.5 nm und 645.5 nm um die Abweichung bei 720 nm folgendermaßen berechnet:

[20] [µg ml-1]

[21] [µg ml-1].

Die Pigmentanalyse mittels HPLC erfolgte nach dem Prinzip der reversed phase chromatography entsprechend einer modifizierten Methode nach Thayer und Björkman (1990) sowie Woitke et al. (1994). Sie erlaubt die Trennung und Quantifizierung von Chl a und Chl b sowie von b-Carotin, Lutein, Neo-, Anthera-, Zea- und Violaxanthin.

Dafür wurde das gefrorene Pflanzenmaterial mit Hilfe von Quarzsand unter Zugabe von MgCO3 im Dämmerlicht in 85 %igem (2 Teile) und anschließend in 100 %igem Aceton
(3 Teile) homogenisiert (Verhältnis ArProbe : VExtraktionslösung = 0.8 - 1.1 cm2 : 1 ml) und durch eine


29

Schott´sche Fritte (G4, maximale Porenweite 10 - 16 µm) mittels Vakuum filtriert. Die Proben wurden bis zur Analyse (am selben Tag) dunkel bei - 20 °C gelagert.

Das HPLC-System der Fa. Waters bestand aus einem Autosampler (Waters 717plus) mit einem Heizungs-/Kühlaggregat (heater/cooler) zur Kühlung des Probenraumes, einem Pumpensystem (Waters 600E-system controller und Waters 600-fluid unit) sowie einem Photodiodenarray-Detektor (Waters PDA 996). Zur Pigmentauftrennung diente eine Waters Resolve C18 5 µ Radial-Pak-Säule (8 x 100 nm) in Verbindung mit einem Waters RCM 8 x 10 Modul und einer Vorsäule (Waters Guard-Pak Inserts Resolve C18). Das Injektionsvolumen der durch Filtration über einen 0.2 µm PTFE-Membranfilter vorbereiteten Pigmentproben betrug 50 - 100 µl. Die Trennung der Pigmente erfolgte bei einer Flussrate von 1.5 ml min-1 über folgenden Laufmittelgradienten (Laufmittel A = Acetonitril/Methanol 85 : 15; Laufmittel B = Methanol/ Ethylacetat 68 : 32; mit Helium entgast):

6 min

isokratisch 100 % A

2 min

linearer Gradient von 100 % A zu 100 % B

7 min

isokratisch 100 % B

1 min

linearer Gradient von 100 % B zu 100 % A

9 min

isokratisch 100 % A.

Die Peaks wurden im jeweiligen Absorptionsmaximum detektiert. Standardsubstanzen, deren Konzentrationen an Hand ihrer Extinktionen am Spektralphotometer (Uvikon 931, Fa. Kontron) ermittelt wurden, dienten zur Quantifizierung. Die Berechnung der Pigmentkonzentrationen erfolgte über Integration der Peakflächen mittels HPLC-Software Millennium 2010 (Version 2.00).

Vergleichende Untersuchungen ergaben keine signifikanten Unterschiede der Pigmentgehalte zwischen den beiden Aufarbeitungs- und Messmethoden für das angegebene Pflanzenmaterial unter den gegebenen Bedingungen.

2.2.10. Bestimmung des Gehaltes an löslichen Proteinen

Die löslichen Proteine wurden nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt. Diese Methode beruht darauf, dass der Farbstoff Coomassie® Brillantblau G 250 [Acid Blue 90], der SH-Gruppen enthält, im stark sauren Milieu Protein-Amino- und Iminogruppen bindet. Die sich bildende Verbindung kann nach 5 bis 60 min spektralphotometrisch bei ihrem Absorptionsmaximum von 595 nm nachgewiesen werden.


30

Dazu wurde das gefrorene Pflanzenmaterial mit Hilfe von Quarzsand in 66.7 mM KH2PO4/Na2HPO4 (nach Sörensen, pH 7.4) homogenisiert (Verhältnis ArProbe : VExtraktionslösung = 2.2 - 2.7 cm2 : 1 ml). Danach wurden die Extrakte 15 min bei 1750 U min-1 (Centrikon T-324, Fa. Kontron) zentrifugiert.

Die Bestimmung des Gehaltes an löslichen Proteinen erfolgte spektralphotometrisch (Uvikon 931, Fa. Kontron) gegen Blindwert in einem Messansatz mit folgender Zusammensetzung (Endvolumen 2.55 ml):

Probe

25

µl

KH2PO4/Na2HPO4.H2O (pH 7.4)

0.65

mM

Ethanol

4.66

% (v/v)

H3PO4

1.45

M

Coomassie® Brillantblau G 250

0.12

mM

Zur Quantifizierung diente HSA (Reinheit ³ 96 %) in einer Verdünnungsreihe von 0.1 bis 0.01 % (w/v).

2.2.11. Bestimmung des Kohlenstoff- und Stickstoffgehaltes

Die Bestimmung des C- und N-Gehaltes erfolgte nach Kühl und Kohl (1992). Dazu wurde das Pflanzenmaterial unmittelbar nach Probenahme und Ermittlung der Frischmasse bei 65 °C im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz (mind. 3 d) getrocknet. Die Temperatur von 65 °C wurde gewählt, um Stickstoffverluste zu vermeiden. Nach Bestimmung der Trockenmassen wurden die Proben fein homogenisiert und mit einer elektronischen Mikrowaage (Sartorius 4001) á 5 mg in Alu-Schiffchen portioniert.

Die Bestimmung des N- und C-Gehaltes erfolgte als Doppelbestimmung mit dem Elementaranalysator Mikro U/D (Fa. Heraeus) nach dem Prinzip der trockenen Verbrennung. Der Stickstoff wurde volumetrisch mit dem Doppel-Azetomaten AZ/D (Fa. Heraeus) bestimmt. Kohlenstoff wurde als Kohlendioxid mittels Absorptionsröhrchen aufgefangen und aus der Massendifferenz des Röhrchens vor und nach der Analyse ermittelt.

Zur Kontrolle wurden während der C- und N-Analysen Messungen an Kreatinin, einer Substanz mit bekanntem C- und N-Gehalt, durchgeführt. Die C- und N-Konzentrationen wurden auf die Trockenmasse bezogen angegeben.


31

2.2.12. Bestimmung der Gehalte an Stärke und löslichen Zuckern

Die Bestimmung des Gehaltes an Stärke und an wasser- und alkohollöslichen Zuckern erfolgte nach den Methoden von Heinze und Praznik (1991) und Albrecht et al. (1993) (Extraktion und Bestimmung der Zucker) sowie einer modifizierten Methode nach Boehringer Mannheim (1995) und Fischer (1999) (Extraktion und Bestimmung der Stärke).

Die Extraktion der wasser- und alkohollöslichen Zucker erfolgte durch Kochen der Blattscheiben mit 20 %igem Ethanol für 20 min in einem Wasserbad (Verhältnis FMProbe : VEthanol = 100 mg : 1 ml) und 2maligem nachfolgendem Kochen mit dest. H2O (Verhältnis FMProbe : VH2O = je 200 mg : 1 ml). Die vereinigten Überstände wurden über einen Papierfilter grob gereinigt und weiter für die Zuckerbestimmung aufgearbeitet, während die ausgekochten Blattscheiben bei 105 °C mindestens 3 d bis zur Gewichtskonstanz im Trockenschrank (WS 30, Fa. MLW) getrocknet wurden und zur Stärkebestimmung dienten (s. u.). Die vorgereinigten Überstände wurden bei 40 °C mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (Rotavapor RE 111, Fa. Büchi, Schweiz) mit Wasserbad (Büchi 461) vakuumgetrocknet und der trockene Überstand in 1 ml dest. H2O gelöst. Das Extrakt wurde durch Nachspülen mit dest. H2O über je einen Anionen- und einen Kationenaustauscher (Amberlite® IRA-68 bzw. IRC-50) zur Eliminierung von ionischen Verbindungen geschickt und über eine reversed phase-Kartusche (Sep-Pak® Plus C18, Fa. Millipore) gereinigt. Das erhaltene Extrakt wurde nochmals bei 40 °C vakuumgetrocknet, in 1 ml dest. H2O aufgenommen und bis zur Bestimmung der löslichen Zucker bei -20 °C in Eppendorfgefäßen gelagert. Unmittelbar vor der Messung wurden die Proben 15 min bei 6000 g zentrifugiert und der Überstand in HPLC-Vials überführt.

Die Analyse von Saccharose, Glucose und Fructose mittels HPLC wurde dankenswerterweise von Dr. G. Albrecht (AG Botanik und Biologiedidaktik, Institut für Biologie, HU Berlin) übernommen. Das HPLC-System der Fa. Waters bestand aus einem Autosampler (Waters 717plus), einem Pumpensystem (Waters 625LC System) sowie einem Detektor (Waters 410 Differential Refractometer). Zur Separation der löslichen Zucker diente eine Carbohydrate Pb2+-Säule (300 x 8 mm, CS Langerwehe) in Verbindung mit einer Vorsäule (Waters Sugar Pac® II). Die Temperatur im Waters-Säulenofen lag bei 80 °C. Das Injektionsvolumen betrug 10 - 20 µl. Die Trennung der Zucker erfolgte isokratisch mit entgastem Eiswasser (Milli Q) als Eluent bei einer Flussrate von 0.7 ml min-1 in einer Gesamtlaufzeit von 22 min je Probe.

Standardsubstanzen von Sac, Glu und Fruc dienten zur Quantifizierung. Die Berechnung der Zuckerkonzentrationen erfolgte über Integration der Peakflächen mittels HPLC-Software.


32

Die für die Stärkemessung bestimmten getrockneten Proben wurden fein homogenisiert und in eine lösliche Form überführt. Dazu wurde ein Aliquot von ca. 10 bis 45 mg TM mit DMSO und 8 M HCl (im Verhältnis DMSO : HCl = 4 : 1) versetzt und, mit Parafilm® abgedeckt, bei 60 °C im Schüttelwasserbad für 30 min inkubiert. Die auf 25 °C abgekühlten Proben wurden mit Citratpuffer (bestehend aus 0.112 M Citronensäure und 0.112 M Natriumcitrat) abgepuffert und mittels 8 M NaOH auf pH 4.6 eingestellt.

Der Aufschluss der als Amylose und Amylopektin mit unterschiedlichen Kettenlängen vorliegenden Ethanol-unlöslichen Stärke in D-Glucose (Abb. 5, 1) erfolgte nach Zugabe von AGS in Citratpuffer (4 U AGS/Probe) über 20 h bei 37 °C im Schüttelwasserbad. Die über Papierfilter gereinigten Extrakte wurden mit dest. H2O auf 6 ml aufgefüllt und bis zur enzymatischen Messung bei - 20 °C gelagert.

Abb. 5 Aufschluss der Stärke (1) und Messprinzip der spektralphotometrischen Bestimmung (2) nach Boehringer Mannheim (1995) und Fischer (1999).

Die Bestimmung des Gehaltes an durch Hydrolyse der Stärke gebildeter D-Glu erfolgte entsprechend dem Messprinzip (Abb. 5, 2) spektralphotometrisch gegen Leerwert in einem Messansatz mit folgender Zusammensetzung (Endvolumen 1.026 ml):

Probe

50 µl

TEA.HCl (pH 7.6)

0.25 M

MgCl2.6H2O

3.3 mM

ATP.3H2O

2.66 mM

NaHCO3

19.1 mM

NADP+

0.41 mM

G6PDH

1.5 U

HK

5 U


33

Da die während der Reaktion gebildete NADPH+H+-Menge der D-Glu-Menge proportional ist, war NADPH+H+ Messgröße und wurde aufgrund seiner Absorption bei 340 nm am Zweistrahlphotometer (Uvikon 931, Fa. Kontron) bestimmt. Die Extinktion (E) wurde nach einem ca. 2minütigen Vorlauf zur Erfassung des Blindwertes (E1) und Start der Reaktion durch HK bis zum Stillstand der Reaktion nach ca. 10 bis 20 min (E2) erfasst.

Die Berechnung des Gehaltes an Stärke erfolgte nach folgender Formel:

[22] [µg ml-1],

wobei

V

Endvolumen in Küvette [ml]

Mr

Molekulargewicht von Stärke [= MrGlu - MrH2O = 162.1 g mol-1]

e

Extinktionskoeffizient von NADPH+H+ bei 340 nm [eNADPH+H+ = 6.3 cm2 µmol-1]

d

Schichtdicke der Küvette [cm]

v

Probevolumen [ml].

Als Kontrolle des Messverlaufes diente ein D-Glucose-Standard in Konzentrationen von
100 bis 800 µg ml-1.

Die relative über Nacht abgebaute, d. h. die für Atmungsprozesse und Export verbrauchte Menge an Stärke bzw. löslichen Zuckern (DS/Z) ergab sich durch die Berechnung

[23] [%],

wobei L die Gehalte an Stärke, Saccharose, Glucose oder Fructose in den Lichtproben
(0.5 h vor Beendigung der Lichtphase) und D die entsprechenden Werte in den Dunkelproben (0.5 h vor Beendigung der Dunkelphase) darstellen (s. Tab. 1).

2.2.13. Lichtabsorption der Blätter

Zur Messung der Transmissions- und Reflexionsspektren der Blätter diente ein Zweistrahl-Spektralphotometer (Specord M500, Fa. Carl-Zeiss Jena) mit einer integrierenden Kugel (Ulbricht-Kugel). Die Innenwand der Ulbricht-Kugel ist mit einem speziellen Pulver (KODAK white reflectance coating) beschichtet, dessen Hauptkomponente BaSO4 ist. Dadurch werden alle in die Kugel eintreffenden, durch die Blattprobe stark gestreuten Lichtstrahlen so lange reflektiert, bis sie auf den Detektor am hinteren Teil der Kugel treffen. Parallelmessungen mit einem tragbaren Spektralradiometer LI-1800 mit integrierender Kugel LI-1800-12 (Fa.


34

LI-COR, Lincoln, NA) dienten der Überprüfung der Genauigkeit des Zweistrahlphotometers (Specord M500) und ergaben keine Unterschiede der aufgenommenen Spektren.

Die Transmissions- und Reflexionsspektren wurden an frisch abgeschnittenen Blättern über den Spektralbereich von 400 bis 750 nm in 1 nm-Schritten aufgenommen und auf Spektren einer Messung ohne Blatt normiert.

Das Transmissionsspektrum (t?) wurde aufgezeichnet, indem das Blatt vor die Öffnung der Ulbricht-Kugel, durch die das Licht eintrat, gespannt wurde. Somit wurde nur der Teil der senkrecht auf das Blatt auftreffenden monochromatischen Strahlung registriert, der durch das Blatt in die Ulbricht-Kugel eintrat.

Das Reflexionsspektrum (r?) wurde aufgenommen, indem auf das an einer Öffnung an der hinteren Wand der Kugel befindliche Blatt ein senkrechter Lichtstrahl traf und somit nur der reflektierte Anteil in der Kugel verblieb und gemessen werden konnte.

Da das eingestrahlte Licht (= 100 %) vom Blatt entweder transmittiert, reflektiert oder absorbiert wird, errechnet sich das Absorptionsspektrum (a?) des Blattes nach Gleichung [24] für jede Wellenlänge (l) im Bereich von 400 bis 750 nm.

[24] [%]

Das mittlere Absorptionsvermögen (in %) des Blattes ergab sich nach Mittelung der Absorption über den Spektralbereich von 400 bis 700 nm.

Die Menge an reell absorbierten Quanten des Anzuchtlichtes im Spektralbereich von 400 bis 700 nm wurde errechnet, indem für jede Wellenlänge (l) die nach [24] ermittelte relative Absorption (a?/100) mit der Emission der für die Pflanzenanzucht verwendeten Lampen
(Abb. 1) multipliziert und die erhaltenen Werte für l = 400 - 700 nm aufsummiert wurden.

2.2.14. Licht- und elektronenmikroskopische Aufnahmen

Zur Charakterisierung der Blattmorphologie und der Chloroplastenfeinstruktur dienten Aufnahmen mittels Licht- bzw. Transmissions-Elektronenmikroskopie, welche von Dr. W. Bleiß und Frau A. Marko (AG Molekulare Parasitologie, Institut für Biologie, HU Berlin) angefertigt wurden. Dazu wurden Gewebestücke aus mittleren Interkostalfeldern der Blätter von ca. 1 x 1 mm Größe für 3 h (die ersten 30 min unter Vakuum) in 2.5 %igem Glutaraldehyd in 50 mM Natrium-Cacodylatpuffer (pH 7.2) bei Raumtemperatur und anschließend 2 Tage bei 4 °C fixiert. Nach 3maligem Waschen á 15 min bei 4 °C mit Cacodylatpuffer wurden die Proben


35

in 2 %igem OsO4 in gleichem Puffer für 4 h bei 25 °C und weitere 3 h bei 4 °C nachfixiert. Danach erfolgte ein Waschgang in 50 mM Na-Maleatpuffer (pH 5.2). Weiterhin wurden die Proben in 1 %igem Uranylacetat in Maleatpuffer über Nacht bei 4 °C fixiert. Nach anschließendem 3maligem Waschen in Maleatpuffer (á 15 min bei 4 °C) wurden die Proben in einem Ethanolgradienten bei 25 °C (100 %iges Ethanol) bzw. 4 °C dehydriert. Danach wurden die Proben in Spurr´s Epoxidharz (Spurr, 1969) eingebettet, die Polymerisation erfolgte für 24 h bei 70 °C.

Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen der Blatt- und Zellstrukturen wurden die Epoxidharzblöcke mit einem Ultramikrotom mit integriertem Glasmesser (Ultracut S; Fa. Reichert-Jung) geschnitten und mit Methylblau (Polychrom, Fa. Unna) bei 70 °C angefärbt.

Für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen der Chloroplastenfeinstruktur wurden die Blöcke mittels Ultramikrotom geschnitten und mit 4 %igem Uranylacetat in wässriger Lösung und abschließend mit Bleicitrat angefärbt (Reynolds, 1963). Zur Untersuchung der Ultradünnschnitte diente ein Transmissions-Elektronenmikroskop (EM 900; Fa. Zeiss).

2.2.15. Reagenzien und Chemikalien

Die verwendeten Bioreagenzien (Enzyme, AdN- und PN-Standards) wurden von der Fa. Boehringer Mannheim bezogen. Alle anderen Chemikalien stammten von den Firmen Fluka, Merck bzw. Serva.

2.2.16. Statistische Berechnungen

Die gesamte in dieser Arbeit durchgeführte statistische Bearbeitung der Messdaten erfolgte nach den in Grimm und Recknagel (1985) beschriebenen Methoden. Angegeben sind jeweils das arithmetische Mittel

mit der Standardabweichung s der jeweiligen Stichprobe mit dem gewählten Umfang n. Der t-Test wurde jeweils als zweiseitiger Test für zwei Stichproben (Kontrolle und Behandlung) nach Varianzvergleich (F-Test) angewendet. Die Angaben zum t-Test bedeuten:

-

p

> 0.05

, d. h. nicht signifikant,

+

0.05 ³

p

> 0.01

, d. h. signifikant mind. auf dem 5 %-Niveau,

++

0.01 ³

p

> 0.001

, d. h. signifikant mind. auf dem 1 %-Niveau,

+++

0.001 ³

p

, d. h. signifikant mind. auf dem 0.1 %-Niveau.


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