Pörs, Yvonne: Anpassung von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L.) an Licht- und Chlorophyllmangel

36

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1. Chlorophyllgehalt

Durch die Expression einer invers orientierten mRNA für GSA-AT (s. S. 9 und S. 13) kam es in den Tabak-Transformanten zu einer verringerten Gesamt-Aktivität der GSA-AT (Höfgen et al., 1994), was letztendlich zu einer reduzierten Chlorophyllbiosynthese führte.

Der Chl-Gehalt wurde in allen laufenden Versuchen mit einer der unter 2.2.9 beschriebenen Methoden bestimmt. Streng standardisierte Anzucht-, Probenahme- und Messbedingungen in sämtlichen Versuchen erlaubten, alle Ergebnisse in einer Graphik zusammenzufassen. Die Bestimmung des Chl-Gehaltes in jeder Versuchsreihe ermöglichte zudem eine Kontrolle des Materials, die als Grundlage für das Zusammenfassen und den Vergleich von aus zeitlich versetzten Versuchsreihen erhaltenen Ergebnissen diente.

Abb. 6 Gehalt an Chlorophyll a ( ) und b ( ) (in nmol cm-2) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( +/- s, n ³ 42). Die Werte über den Balken geben das Chlorophyll a/b-Verhältnis an ( ; s = 1.1 - 5.8 %).

Der Gehalt an Gesamtchlorophyll (in nmol cm-2) (Abb. 6) war in den TF graduell geringer als in den Wildtyppflanzen. So enthielten unter HL die Blätter der #57 um 18 %, der #25 um 46 %


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und der #42 um 92 % weniger Chlorophyll als die der SNN-Pflanzen. Unter diesen Bedingungen war eine stärkere Reduzierung an Chl b als an Chl a zu erkennen, was sich in einem signifikant (mit mind. p < 0.01) steigenden Chl a/b-Verhältnis mit sinkendem Gesamtchlorophyll-Gehalt äußerte (Abb. 6, Werte über den Balken). Bei Anzucht unter LL enthielten die Blätter der transgenen Pflanzen 93 % (#57), 63 % (#25) bzw. 21 % (#42) vom Chlorophyll der vergleichbaren Kontrolle. Hier waren die Gehalte an Chlorophyll a und b in gleichem Maße verringert, was sich in einem nicht signifikant unterschiedlichen Chl a/b-Verhältnis widerspiegelt (Abb. 6).

Im Vergleich gleichartiger Pflanzen unter verschiedenen Anzucht-PPFD´s zeigte sich, dass der WT, die #57 und die #25 unter LL-Bedingungen ca. die Hälfte (52 %, 60 % und 61 %) der Chl-Menge der HL-Pflanzen enthielten. Die Blätter der #42 dagegen besaßen unter LL 48 % mehr Gesamt-Chl als die entsprechenden Pflanzen der HL-Variante (Abb. 6).

3.2. Morphologie und Anatomie sowie Wachstum und Entwicklung der Blätter und Pflanzen

3.2.1. Charakterisierung der Pflanzen

In diesem Kapitel sollen die makroskopisch sichtbaren Veränderungen der Pflanzen durch Licht- bzw. Chlorophyllmangel beschrieben werden. Diese wurden in mehreren unabhängigen Versuchsreihen bonitiert und dienten, ebenfalls wie der Chl-Gehalt, als Kontrolle für die Vergleichbarkeit von Pflanzen aus zeitlich versetzten Versuchsreihen. Da die Art und Stärke der Symptomausprägung bei Chlorophyll-Defizienz u. a. von den Kulturbedingungen wie z. B. den Licht- und Temperaturverhältnissen sowie dem Substrat und dem Nährstoffangebot abhängen (Höfgen et al., 1994; Falbel und Staehelin, 1996), wurde einerseits auf gleiche Bedingungen in den Messreihen geachtet. Andererseits können die erzielten Ergebnisse auch nur im Rahmen der im Kap. 2.1 beschriebenen Versuchsbedingungen diskutiert werden.


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3.2.1.1. Phänotyp der Pflanzen

In den Abb. 7.1 und 7.2 sind die jeweils unter Stark- und Schwachlicht angezogenen Wildtyp- und transgenen Pflanzen abgebildet. Die Aufnahmen entstanden im Herbst 1996 während einer Versuchsreihe, in der die Pflanzen die typischen morphometrischen Werte und Chlorophyllgehalte aufwiesen. Die Pflanzen wurden einige Tage, bevor sie biochemischen und physiologischen Untersuchungen dienten (s. Tab. 1), photographiert. Sie waren dementsprechend zum Zeitpunkt der Aufnahme 35 bis 55 Tage alt. Dieses unterschiedliche kalendarische Alter ergibt sich aus der in Kap. 3.2.2 beschriebenen Tatsache, dass aufgrund der unterschiedlichen Entwicklungsdauer der Pflanzen das ontogenetische Alter ausschlaggebend für die Auswahl des Pflanzenmaterials sein muss.

Die Pflanzen der #57 und #25 wirkten trotz geringerer Höhe in ihrem Habitus ähnlich kräftig wie der WT, die #42 dagegen war schon rein äußerlich kleiner und schwächer als die SNN. Das traf sowohl für den Vergleich der HL- (Abb. 7.1) als auch der LL-Pflanzen (Abb. 7.2) untereinander zu. Auch die Ausbildung der Wurzelmasse war bei der #42 im Vergleich zum WT offensichtlich geringer (o. Daten). Im Vergleich der unter zwei verschiedenen Lichtintensitäten angezogenen Pflanzen waren alle LL-Pflanzen deutlich schwächer als die Pflanzen der entsprechenden HL-Variante. Die Blätter waren kleiner, dünner und empfindlicher, die Blattstiele schmaler und länger, der Spross dünner und weniger stabil (Abb. 7), die Wurzeln viel schwächer ausgebildet (o. Daten).

Die genetische Transformation und der damit verbundene verringerte Chl-Gehalt führte bei den Tabakpflanzen zur Ausbildung von Chlorosen. Wie aus den Abb. 7.1 und 7.2 deutlich wird, sind die Chlorosen nicht in allen TF gleichmäßig über die Blattspreite verteilt, sondern äußern sich in einem typischen Muster. So zeigten die Blätter der #57 die chlorotischen Stellen nur entlang der Blattadern (Abb. 7.1B, 7.2B). Die Blätter der #25 waren gleichmäßig in kleinen Flecken panaschiert (Abb. 7.1C, 7.2C). Diese Färbung der Blätter der transgenen #57 und #25 trat unter HL deutlicher zu Tage, da unter diesen Bedingungen die grünen Areale dunkler im Vergleich zu den unter LL angezogenen Pflanzen waren und somit die Panaschierung stärker zum Ausdruck kam. Die Pflanzen der #42 bildeten uniforme gelbe (HL) bis hellgrüne (LL) Blätter (Abb. 7.1D, 7.2D). Der in den Blättern von unter LL-Bedingungen angezogenen Pflanzen des Wildtyps, der #57 und #25 geringere sowie der #42 höhere Chlorophyllgehalt im Vergleich zu den HL-Varianten (Abb. 6) war schon rein äußerlich zu erkennen.


39

Abb. 7.1 Unter HL angezogene Tabakpflanzen der SNN (A), #57 (B), #25 (C) und #42 (D).


40

Abb. 7.2 Unter LL angezogene Tabakpflanzen der SNN (A), #57 (B), #25 (C) und #42 (D).


41

3.2.1.2. Wachstum und Entwicklung der Pflanzen

Für die Charakterisierung des Wachstumsverhaltens der Pflanzen wurden Bestimmungen der Sprosslängen sowie der Blattanzahl und -flächen zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 3 bis 4 Tage) im Laufe der Ontogenese der Pflanzen durchgeführt. Die Zunahme der Sprosslänge ist ebenso ein geeignetes Maß für das Wachstum höherer Pflanzen (Mohr und Schopfer, 1992) wie die Anzahl der gebildeten Blätter und deren Flächen-Ausdehnung.

Tabakpflanzen zeigen einen sigmoiden Verlauf des Wachstums (geringes Wachstum ® starkes Wachstum ® Abnahme des Wachstums ® Endwert), welcher sich durch eine symmetrisch logistische Gleichung ([2], S. 16) beschreiben lässt. Die richtige Auswahl dieser Funktion zur Beschreibung des Wachstumsverlaufes von Tabak wird durch die sehr guten Korrelationskoeffizienten zwischen den Messwerten und den durch das mathematische Modell errechneten Werten bestätigt (r2 = 0.9946 - 0.9994). Daraus ergaben sich für die Sprosslänge (H, in cm), für die Fläche aller Blätter (SAr, in cm2) sowie für die Blattanzahl einer Pflanze (n) jeweils der maximale Wert nach Abschluss des Wachstums (max. y) sowie der Wert ((dy/dt)max) und der Zeitpunkt (t von (dy/dt)max) für die maximale Wachstumsrate (Tab. 3).

Die transgenen Pflanzen zeigten entsprechend ihrem “abgestuften“ Chl-Gehalt im Vergleich zum Wildtyp eine verzögerte Entwicklung (Abb. 7.1, 7.2, 8, 9). Ein geringeres Wachstum kann sich in einer Reduzierung des erreichten maximalen Wachstumsparameters am Ende der Ontogenese und/oder der relativen Wachstumsraten äußern. Bei den TF waren sowohl die ermittelten Endwerte der Sprosslängen um 13 - 63 % (Tab. 3, Abb. 8 oben) als auch die maximalen Wachstumsraten der Sprosse um 14 bis 84 % (Tab. 3, Abb. 8 unten) im Vergleich zur SNN reduziert. Auch bei dem Vergleich der unter LL mit den unter HL angezogenen Pflanzen ist das beobachtete verringerte Wachstum der LL-Pflanzen (Abb. 7.2) nicht nur auf die geringeren maximalen Sprosslängen (um 11 bis 49 %; Tab. 3, Abb. 8 oben), sondern insbesondere auch auf die niedrigeren maximalen Wachstumsraten (um 41 - 57 %; Tab. 3, Abb. 8 unten) zurückzuführen. Der Zeitpunkt, zu dem die maximale Wachstumsrate der Sprosslängen erreicht wurde (Tab. 3, Abb. 8 unten), zeigte im Vergleich der Licht- als auch der Chl-Tabak-Varianten eine Verzögerung um je bis zu 16 d.

Die gebildete Gesamtblattfläche pro transformierter Pflanze war v. a. in ihrer Zuwachsrate bis auf 70 % des WT unter HL und 15 % unter LL reduziert, dessen Maximum zudem zu einem späteren Zeitpunkt (um 15 bis 29 d) eintrat (Tab. 3, Abb. 9 unten). Der Wert der gesamten gebildeten Blattfläche aller Blätter scheint bei allen Tabakpflanzen unter HL- und beim WT


42

unter LL-Bedingungen einen Maximalwert von ca. 4200 bis 4400 cm² anzustreben (Tab. 3, Abb. 9 oben). Ob dieses evtl. auch für die Transformanten unter Schwachlicht zutrifft, konnte nicht geklärt werden, da die Bildung von neuen Blättern dieser Pflanzen innerhalb des Versuchszeitraumes noch nicht endgültig abgeschlossen war. Die mathematische Auswertung der erzielten Ergebnisse spricht jedoch für eine 37 bis 78 %ige Reduzierung der maximal erreichten Gesamt-Blattfläche in Abhängigkeit vom Chlorophyllgehalt. Sehr deutlich wird hier, dass mit sinkendem Chl-Gehalt die beeinträchtigende Wirkung von Lichtmangel auf das Blattflächenwachstum zunahm. So zeigten der WT und z. B. die #42 unter LL-Bedingungen eine maximale Gesamt-Blattfläche von 99.0 bzw. 27.3 % und eine maximale Zuwachsrate von 53.8 bzw. sogar nur noch 11.5 % im Vergleich zur entsprechenden HL-Variante (Tab. 3).

Abb. 8 Sprosslängen (H, oben; Messwerte und mathematische
Modellierung) und Wachstumsraten der Sprosslängen (dH/dt, unten; mathematisches Modell) in Abhängigkeit vom Pflanzenalter von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 (Messwerte: +/- s, n ³ 4).


43

Abb. 9 Summe der Blattflächen aller Blätter einer Pflanze (SAr, oben; Messwerte und mathematische Modellierung) und Zuwachsraten der Gesamtblattflächen (dSAr/dt, unten; mathematisches Modell) in Abhängigkeit vom Pflanzenalter von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42
(Messwerte: +/- s, n ³ 4).


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Abb. 10 Blattanzahl (n, oben; Messwerte und mathematische Modellierung) und Blattbildungsraten (dn/dt, unten; mathematisches Modell) in Abhängigkeit vom Pflanzenalter von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 (Messwerte: +/- s, n ³ 4).

Die Summe der Blattflächen aller gebildeten Blätter pro Pflanze hängt sowohl von der Blattausdehnung eines jeden Blattes als auch von der Anzahl der sich entwickelnden Blätter (Abb. 10) ab. Unter HL zeigten die TF eine gleiche (#25) bzw. erhöhte (#57, #42) maximale Blattanzahl (Tab. 3, Abb. 10 oben) mit einer um 10 - 20 % höheren Rate der Blattbildung (Tab. 3, Abb. 10 unten). Dagegen ist unter LL-Anzuchtbedingungen die Tendenz zu einer Reduzierung v. a. der Blattbildungsraten um 12.5 bis 56 %, aber auch der Gesamtzahl der gebildeten Blätter um maximal 22 % zu verzeichnen (Tab. 3, Abb. 10).


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Eine Pflanze hat ihre Gesamt-Blattzahl endgültig erreicht, wenn die Bildung der Blütenknospen eintritt. Dieser Zeitpunkt war bei den HL-Pflanzen nach ca. 11 bis 13 Wochen erreicht. Alle LL-Varianten erreichten die Knospenbildung innerhalb der 103 d Versuchsdauer nicht.

Tab. 3 Endwerte nach Abschluss des Wachstums (max. y), maximale Wachstumsraten ((dy/dt)max) sowie Zeitpunkt der maximalen Wachstumsrate (t von (dy/dt)max) von Sprosslänge (H; in cm), Gesamtblattfläche pro Pflanze (SAr; in cm2) sowie Blatt-anzahl pro Pflanze (n) von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42. Die Werte wurden lt. Gleichungen [2] bis [4] (Kap. 2.2.2) aus den jeweiligen Mittelwerten (s. Abb. 8, 9, 10) errechnet.

Variante

Sprosslänge (H)

Ges.-Blattfläche (SAr)

Blattanzahl (n)

max.

H

(dH/
dt)max

T von (dH/
dt)max

max.

SAr

(dSAr/
dt)max

t von (dSAr/
dt)max

max.

n

(dn/
dt)max

t von (dn/

dt)max

(cm)

(cm d-1)

(d)

(cm2)

(cm2 d-1)

(d)

(d-1)

(d)

HL

SNN

79.4

2.63

52

4418

187.7

37

43

0.71

33

#57

67.2

2.25

52

4288

169.1

42

48

0.84

37

#25

65.6

2.23

54

4195

172.3

40

43

0.85

34

#42

49.5

0.98

68

4327

131.4

52

70

0.78

60

LL

SNN

69.1

1.48

60

4373

101.0

55

72

0.72

64

#57

60.0

1.33

63

2739

47.9

66

73

0.63

76

#25

45.9

0.97

67

2076

32.5

71

61

0.53

66

#42

25.4

0.43

76

1205

15.2

84

56

0.32

90

3.2.2. Charakterisierung der Blätter

Nachdem bisher die Entwicklung der Gesamtpflanze im Mittelpunkt der Untersuchungen stand, werden ab jetzt einzelne vergleichbare Blätter betrachtet. Die Befunde der morphologischen Studien (Kap. 3.2.1) und der CO2-Gaswechsel-Messungen im Laufe der Blatt- und Pflanzenentwicklung (Kap. 3.4.1) erlaubten, die für die geplanten Messreihen relevanten vergleichbaren Blätter von vergleichbaren Pflanzen auszuwählen. Als Grundlage diente dazu nicht das kalendarische Alter der Blätter bzw. Pflanzen, sondern das ontogenetische. Vor allem bei einem Vergleich von physiologischen Parametern in unter verschiedenen Lichtintensitäten angezogenen Pflanzen führt ein Vergleich nach dem kalendarischen Alter aufgrund der unterschiedlichen Entwicklungsdauer (Tab. 3, Abb. 8, 9, 10, 12) zwangsläufig zu Artefakten


46

(s. dazu Wild und Höhler, 1978; Longstreth et al., 1981; Lichtenthaler et al., 1981; Rühle und Wild, 1985; Nikolaeva, 1994; Gall et al., 1996).

Abb. 11 Blattflächen der ausgewachsenen Blätter (cm²) von unter HL (links; A - D) und LL (rechts; E - H) angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A, E), #57 (B, F), #25 (C, G) und #42 (D, H) ( + s, n ³ 4).


47

So kamen für sämtliche im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen Pflanzen zum Einsatz, die sich nach ca. 40 bis 65 Tagen nach Pikieren im 22- bis 26-Blatt-Stadium (Tab. 1) und sich damit ungefähr am Zeitpunkt der maximalen Zuwachsrate (Tab. 3) befanden. Davon wurde dann das 8. bis 12. Blatt - von der Pflanzenspitze aus gezählt - für die Versuche verwendet. Diese Blätter entsprachen dem 10. bis 18. Blatt von unten (Bl. v.u.), zeigten im Vergleich zu den anderen Blättern höhere Wachstumsraten und erreichten die größten Endblattflächen je Pflanze (Abb. 11). Sie hatten zum Zeitpunkt der Probenahme bzw. Messung ihr Flächenwachstum zu ca. 70 bis 95 % abgeschlossen und waren damit, nach den Kriterien von Fischer (1999), sicher als “vollaktive“ (s. Kap. 3.4.1) source-Blätter ohne Seneszenz-Erscheinungen einzuordnen.

3.2.2.1. Wachstum und Entwicklung der Blätter

Die nach o. g. Kriterien ausgewählten Blätter zeigten sowohl bei den TF im Vergleich zum WT als auch bei den Schwachlicht- im Vergleich zu den Starklichtpflanzen ein reduziertes Blattspreitenwachstum. Ausdruck dafür waren einerseits die verminderten maximalen Blattflächen am Ende der Blattentwicklung (Abb. 11, 12 oben, Tab. 4) und andererseits die reduzierten maximalen Blattflächen-Zuwachsraten (Abb. 12 unten, Tab. 4). So waren die Blätter

Tab. 4 End-Blattflächen nach Abschluss des Wachstums (max. Ar, in cm2), maximale Wachstumsraten ((dAr/dt)max) sowie Zeitpunkt der maximalen Blattflächen-Wachstumsrate (t von (dAr/dt)max) der Blätter von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42. Die Werte wurden lt. Gleichungen [2] bis [4] (Kap. 2.2.2) aus den Mittelwerten (s. Abb. 12) errechnet.

Variante

max. Ar

(dAr/dt)max

t von

(dAr/dt)max

(cm2)

(cm2 d-1)

(d)

HL

SNN

214

27.3

10

#57

202

27.1

10

#25

207

27.8

10

#42

156

18.9

10

LL

SNN

136

14.6

12

#57

68

6.5

12

#25

79

7.4

13

#42

37

2.6

11


48

der Chl-ärmsten Pflanzen um 27 % (HL) bzw. 73 % (LL) kleiner und ihre maximale Zuwachsrate war um 31 % (HL) bzw. 82 % (LL) geringer als die der SNN. Jedoch gab es keinen Unterschied in der Entwicklungsdauer der Blätter zwischen den TF und dem WT. Alle untersuchten Blätter erreichten ihre maximale Zuwachsrate durchschnittlich nach 10 (HL) bzw. 12 d (LL) (Tab. 4) und ihre endgültige Spreitenausdehnung nach 33 ( 9 d (HL, n = 238) bzw. 38 ( 10 d (LL, n = 144). Unter Schwachlicht betrug die endgültige Flächenausdehnung der Blätter 1/4 bis 2/3 derer unter Starklicht, die maximale Wachstumsrate der Blattspreiten lag sogar nur bei 14 bis 54 % der HL-Werte (Tab. 4).

Abb. 12 Blattflächen (Ar, oben) und Zuwachsraten (dAr/dt, unten) (mathematisches Modell) der Blätter in Abhängigkeit vom Blattalter von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( aus Modellkurven von nge18 Blättern).


49

Die für diese Arbeit ausgewählten ontogenetisch vergleichbaren Blätter wurden zum Zeitpunkt der Probenahme bzw. Messung hinsichtlich der akkumulierten Biomasse, d. h. auf ihre spezifischen Frisch- und Trockenmassen (mg cm-2) untersucht. Dies geschah unmittelbar nach der Probenahme innerhalb einer begrenzten Zeitspanne der Lichtperiode (ca. 5 - 7 h nach Beginn der Lichtphase). Vor allem für die Bestimmung der Trockenmassen war aufgrund der Akkumulation transienter Stärke in den Blättern während der Lichtphase (s. Kap. 3.6.1; Fischer, 1999) eine enge Zeitbegrenzung der Bestimmung notwendig.

Tab. 5 Spezifische Frisch- (spez. FM) und Trockenmassen (spez. TM) (in mg cm-2) sowie der daraus ermittelte relative Wassergehalt (rel. H2O, in % der FM) in Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 44 - 86). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

spez. FM

(mg cm-2)

t-Test

I II

spez. TM

(mg cm-2)

t-Test

I II

rel. H2O

(%)

t-Test

I II

HL

SNN

25.52 ± 2.32

2.58 ± 0.38

89.6 ± 3.5

#57

23.63 ± 1.72

+++

2.28 ± 0.33

+++

90.2 ± 1.3

-

#25

24.99 ± 1.58

-

2.64 ± 0.57

-

89.0 ± 4.1

-

#42

20.63 ± 1.64

+++

0.96 ± 0.10

+++

95.4 ± 0.6

+++

LL

SNN

18.02 ± 1.98

+++

0.82 ± 0.11

+++

95.3 ± 0.7

+++

#57

17.62 ± 1.59

-

+++

0.82 ± 0.12

-

+++

95.3 ± 0.8

-

+++

#25

16.42 ± 1.00

+++

+++

0.80 ± 0.10

-

+++

95.1 ± 0.8

-

+++

#42

16.39 ± 1.02

+++

+++

0.63 ± 0.09

+++

+++

96.4 ± 0.7

+++

+++

Es ist zu beobachten, dass die Menge an Chlorophyll wenig mit der auf die pro Fläche gebildeten Frischmasse korrelierte (Tab. 5). Lediglich bei stark reduziertem Chl-Gehalt in den Blättern der #42 war eine Verringerung der spezifischen FM sowohl unter HL (um 20 %) als auch unter LL (um 9 %) zu verzeichnen. Unter Schwachlicht akkumulierten alle Varianten ca. 20 - 35 % weniger Frischmasse als die entsprechenden HL-Pflanzen, wobei bei der #42 aufgrund der erkennbaren reduzierten spez. FM unter Starklichtbedingungen der Unterschied zwischen HL- und LL-Anzucht am geringsten war (Tab. 5).


50

Ähnlich wie bei der spez. FM, war eine Verringerung der TM pro Blattfläche erst bei einem stark reduzierten Chl-Gehalt (#42) zu beobachten (Tab. 5). Unter HL-Bedingungen war diese niedrigere spez. TM der #42 gegenüber den SNN-Pflanzen stärker ausgeprägt (37 % vom WT) als unter LL-Bedingungen (76 % vom WT). Daraus resultierte, dass der Unterschied zwischen den Pflanzen gleicher Transformation unter verschiedenen Anzucht-PPFD´s bei der #42 zwar ebenfalls signifikant, doch nicht so stark ausgeprägt war wie bei den Pflanzen der #25, #57 und der SNN (Tab. 5).

Aus den ermittelten spezifischen Trocken- und Frischmassen resultieren die in Tab. 5 dargestellten relativen Wassergehalte der Blätter. Hieraus geht hervor, dass die rel. H2O-Gehalte in den Blättern des Wildtyps, der #57 und der #25 sowohl unter HL- als auch unter LL-Anzuchtbedingungen sich nicht unterschieden und nur die Blätter der #42 signifikant (mit p < 0.001) höhere relative Wassergehalte aufwiesen. In allen Varianten wird deutlich, dass die unter LL gewachsenen Blätter signifikant (mit p < 0.001) mehr Wasser pro FM enthielten als die der entsprechenden HL-Pflanzen (Tab. 5).

3.2.2.2. Stomata- und Epidermiszellanzahl

Die Blätter des Tabaks weisen eine hypoamphistomatische Struktur auf, d. h. es finden sich auf beiden Blattseiten Stomata, jedoch auf der Unterseite 1.8 - 1.9mal (HL) bzw. 1.9 - 2.1mal (LL) mehr als auf der Oberseite (Abb. 13). Die Stomata selbst sind dem anomocystischen (Ranunculaceen-)Typ zuzuordnen (Wagenitz, 1996), d. h. sie sind von Epidermiszellen umgeben, die sich nicht von den benachbarten Zellen unterscheiden. Die Stomataanzahl auf der Blattober- und -unterseite ist sowohl unter HL- als auch unter LL-Anzuchtbedingungen bei den TF mit “nur geringer Chl-Defizienz“ im Vergleich zum WT um das max. 1.3fache erhöht, wogegen die Blätter der stark chlorotischen #42 um bis zu 42 % weniger Stomata pro Fläche aufweisen (Abb. 13). Wenn die Pflanzen unter LL aufgezogen worden waren, bildeten sich im Vergleich zu den unter HL angezogenen Pflanzen 30 bis 65 % weniger Stomata auf beiden Blattseiten aus (Abb. 13). Es waren jedoch keine auffälligen Veränderungen in der Länge der Stomataporen sowie der Größe der Geleitzellen infolge von Licht- bzw. Chl-Mangel zu verzeichnen (o. Abb.). Der Stomataindex, d. h. die Zahl der Spaltöffnungen pro Anzahl Epidermiszellen, war auf der Blattunterseite der Tabakblätter höher als auf der Oberseite (Tab. 6). Zwischen SNN- und transgenen Pflanzen konnte auf beiden Blattseiten weder unter HL noch


51

Abb. 13 Anzahl der Stomata pro mm2 Blattunter- ( ) sowie -oberseite ( ) von Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 21 - 65). Die Werte über den Balken geben das Verhältnis der Stomataanzahl von Blattunter-/-oberseite an ( ; s = 19 - 25 %).

Tab. 6 Stomataindex (Anzahl Stomata pro Anzahl Epidermiszellen) der Blattober- (OS) sowie -unterseite (US) von Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabak-pflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 21 - 65). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I), den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) sowie den Vergleich des Stomataindex von Ober- zu Unterseite (III) durchgeführt.

Variante

Stomataindex

OS

t-Test

I II

Stomataindex

US

t-Test


[I II III]

HL

SNN

0.27 ± 0.06

0.29 ± 0.07

+

#57

0.26 ± 0.05

-

0.31 ± 0.06

-

+++

#25

0.29 ± 0.07

-

0.30 ± 0.06

-

-

#42

0.26 ± 0.09

-

0.28 ± 0.07

-

-

LL

SNN

0.19 ± 0.07

+++

0.25 ± 0.09

++

+++

#57

0.19 ± 0.05

-

+++

0.26 ± 0.04

-

+++

+++

#25

0.18 ± 0.04

-

+++

0.24 ± 0.05

-

+++

+++

#42

0.19 ± 0.08

-

+++

0.25 ± 0.06

-

-

++


52

unter LL ein signifikanter Unterschied im Stomataindex gefunden werden (Tab. 6). Unter HL wurden im Mittel bei allen Tabak-Varianten eine Stomatazelle pro 3.7 (Oberseite) bzw. eine pro 3.4 Epidermiszellen (Unterseite) ausgebildet, wogegen unter LL sich dieses Verhältnis auf 1 : 5.3 (OS) bzw. 1 : 4.0 (US) signifikant veränderte (Tab. 6).

3.2.2.3. Blatt-, Zell- und Chloroplastenstruktur

Für die Strukturanalysen wurden Proben von gerade auswachsenden (ca. 90 % der endgültigen Blattfläche) source-Blättern (9. Blatt von oben) von jeweils unter Stark- und Schwachlicht angezogenen Tabakpflanzen des WT und der extrem chl-defizienten #42 genommen. Leider reichte der Stichprobenumfang in den Untersuchungen zur Blatt-, Zell- und Chloroplastenstruktur mittels Licht- und Elektronenmikroskopie, bedingt durch den hohen Arbeits- und Zeitaufwand, nicht für eine statistische Auswertung aus.

In den Abb. 14 und 15 sind Blattquerschnitte (Abb. 14) und jeweils eine typische Palisadenparenchymzelle (Abb. 15) von Blättern des Wildtyps und #42 dargestellt. Es wird deutlich, dass die unter LL angezogenen Tabakpflanzen (Abb. 14C, 14D, 15C, 15D) eine geringere Blattdicke, eine verminderte Anzahl von Palisaden- und Schwammparenchymzellen und größere Interzellularräume aufwiesen als die HL-Varianten (Abb. 14A, 14B, 15A, 15B). Das Palisadenparenchym der HL-Blätter war einschichtig und dichter gepackt, während die LL-Blätter kleine, locker gepackte Palisadenzellen besaßen, die aufgrund ihrer “deformierten und runden“ Form nicht immer leicht von den Schwammparenchymzellen zu unterscheiden sind (Abb. 14, 15). Im Vergleich der jeweils unter gleichen Lichtbedingungen angezogenen Pflanzen scheint nur unter HL die #42 (Abb. 14B, 15B) im Vergleich zur SNN (Abb. 14A, 15A) weniger, dafür aber größere und unregelmäßigere (v. a. im Palisadengewebe) Zellen sowie größere Interzellularräume zu besitzen, unter LL scheint dagegen kaum ein Unterschied zwischen WT und TF zu bestehen (Abb. 14C, 14D, 15C, 15D).

In den gelben Blättern der #42 finden sich unter beiden Lichtintensitäten kleinere und weniger Chloroplasten pro Zelle als in den grünen Geweben des Wildtyps (Abb. 15, 16). Schwachlicht-Bedingungen während der Anzucht bewirkten eine verminderte Anzahl von z. T. aber größeren (SNN) bzw. gleichgroßen (#42) Chloroplasten pro Zelle im Vergleich mit der entsprechenden HL-Variante (Abb. 15, 16.1, 16.2).


53

Abb. 14 Lichtmikroskopische Aufnahmen von Semidünnschnitten der Blattquerschnitte von unter HL (A, B) und LL (C, D) angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A, C) und #42 (B, D). Der Balken entspricht 100 µm.


54

Abb. 15 Lichtmikroskopische Aufnahmen von Zellen aus dem Palisadenparenchym der Blätter von unter HL (A, B) und LL (C, D) angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A, C) und #42 (B, D). Der Balken entspricht 20 µm.


55

Abb. 16.1 TEM-Aufnahmen von Chloroplasten aus Blättern von unter HL angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A) und #42 (B). Der Balken entspricht 1 µm. (Pfeile siehe Text)


56

Abb. 16.2 TEM-Aufnahmen von Chloroplasten aus Blättern von unter LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A) und #42 (B). Der Balken entspricht 1 µm.


57

Der niedrigere Chlorophyllgehalt in der #42 sowie die Anzucht unter verschiedenen Lichtbedingungen hatten einen deutlichen Einfluss auf die Struktur der Chloroplasten (Abb. 16). Der HL-Wildtyp besaß Chloroplasten mit gut ausgeprägten Stroma- und Granathylakoiden, wobei die Granathylakoide überwiegen und “schöne“ Stapel ausbilden (Abb. 16.1 A). Schwachlicht schien das Verhältnis von Stroma- zu Granathylakoiden zugunsten der stromalen zu verschieben (Abb. 16.2 A). In den Blättern der #42 sind unter HL-Bedingungen lediglich Chloroplasten mit “Thylakoidfragmenten“ (kurze stromale Thylakoide, keine Granabildung) zu finden (Abb. 16.1 B), während unter LL-Bedingungen zwar offensichtlich auch weniger Thylakoide als bei dem vergleichbaren Wildtyp, aber ein besser ausgebildetes Thylakoidsystem als bei der #42-HL zu sehen ist. Hier bestand das chloroplastidäre Membransystem aus wenigen kurzen Stroma- und niedrig gestapelten Granathylakoiden (Abb. 16.2 B). Interessant ist, dass in der Starklicht-Variante der #42 in Größe und Anzahl mehr Plastoglobuli, d. h. Tocopherole, Carotenoide und andere Substanzen enthaltende Lipidtröpfchen (Lichtenthaler, 1968), vorhanden waren als in der #42-LL, SNN-HL und SNN-LL. Diese verweisen auf verstärkte Umbauprozesse der Membransysteme. Auch die teilweise deutlich zu sehende “Schwellung“ der Thylakoide (Pfeile in Abb. 16.1 B) deutet auf veränderte Membraneigenschaften mit einem Wassereinstrom in die Thylakoidinnenräume und daraus resultierender Elektronentransparenz der hellen Bereiche hin (Miyake et al., 1984).

3.3. 3.3 Lichtabsorption der Blätter

Die durch die veränderten Chlorophyllgehalte sowie die verschiedene Belichtungsquantität verursachten Unterschiede der Blatt- und Chloroplastenstruktur der Tabak-Varianten (Kap. 3.2.2) lassen verschiedene Lichtabsorptionseigenschaften der Blätter erwarten. Mittels der in Kap. 2.2.13 beschriebenen Methode wurde die unter Anzuchtbedingungen absorbierte Menge an Quanten im photosynthetisch verwertbaren Wellenlängenbereich von 400 bis 700 nm für die Blätter der Tabakpflanzen ermittelt.

Wie Abb. 17 zeigt, nahmen die Pflanzen von dem Anzuchtlicht unter HL-Bedingungen 83 (SNN), 70 (#57), 57 (#25) bzw. 22 % (#42) der eingestrahlten 300 µmol Quanten m-2 s-1 auf, unter LL-Bedingungen wurden 72, 57, 52 bzw. 26 % der angebotenen 30 µmol Quanten m-2 s-1 absorbiert. In den LL-Pflanzen wird entsprechend dem um 90 % verringerten Lichtangebot 8.1 bis 11.5 % der durch die HL-Varianten absorbierten Photonenmenge aufgenommen (Abb. 17).


58

Die Verringerung des Absorptionsvermögens der transgenen im Vergleich zu den Wildtyp- sowie der LL- im Vergleich zu den HL-Pflanzen ging mit einer Erhöhung sowohl des reflektierten als auch des transmittierten Anteiles des Lichtes einher (o. Abb.).

Abb. 17 Menge der im Wellenlängenbereich 400 - 700 nm eingestrahlten (eL) und absorbier-ten Quanten des Anzuchtlichtes (in µmol Quanten m-2 s-1) durch Blätter von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 6 - 8). Man beachte die unterschiedliche Skalierung der y-Achsen für HL und LL!

3.4. CO2- und H2O-Gaswechsel der Blätter

3.4.1. CO2-Gaswechsel im Verlaufe der Ontogenese eines Blattes

Am Anfang der Untersuchungen zum CO2- und H2O-Gaswechsel stand die Frage, wie sich die Netto-CO2-Assimilationsleistung im Laufe der Blatt-Ontogenese ändert und inwieweit gemessene Unterschiede im Gaswechsel-Verhalten der verschiedenen Tabak-Varianten wirklich auf die Transformation bzw. Lichtquantität zurückzuführen sind und nicht durch altersbedingte Unterschiede der Blätter hervorgerufen wurden. Ziel war es, ontogenetisch vergleichbare Blätter für die nachfolgenden Untersuchungen zu ermitteln. Dafür wurden Gaswechselmessungen


59

an mehreren Blättern von verschiedenen Pflanzen der SNN und der #42 je unter HL und LL bis zum Abschluss ihres Blattflächenwachstums vor Beginn der Seneszenz durchgeführt.

Abb. 18 Dunkelrespirations- (RD, A) und Netto-Assimilationsraten (JCO2) bei 30 (B), 150 (C), 300 (D), 600 (E) und 1800 µmol Quanten m-2 s-1 (F) Mess-PPFD in Abhängigkeit von der relativen Blattfläche (die maximal erreichte Blattfläche nach Beendigung des Flächenwachstums = 100 %) von Blättern von unter HL angezogenen Wildtyp-Tabakpflanzen (n = 4; für jedes Blatt steht 1 Symbol).


60

In Abb. 18 sind am Beispiel der SNN-HL die Netto-CO2-Umsatzraten im Verlauf der Blattontogenese dargestellt. Die Dunkelrespirationsrate fiel während des gesamten Blattflächenwachstums ab (Abb. 18A), während die CO2-Assimilationsraten je nach Mess-Lichtintensität ein mehr oder weniger stark ausgeprägtes Maximum bei 55 - 70 % der endgültigen Blattfläche zeigten (Abb. 18 B - F). Ein ähnliches, doch aufgrund der geringeren absoluten Werte nicht so stark ausgeprägtes Bild war auch bei den Blättern der Varianten SNN-LL, #42-HL und #42-LL zu beobachten (o. Abb.). Aus diesem gleichartigen Verlauf der CO2-Assimilation in Bezug auf die ontogenetische Blattentwicklung folgt, dass zu jedem relativen Zeitpunkt des Flächenwachstums der Tabakblätter die Unterschiede zwischen den Varianten wirklich durch den Licht- bzw. Chlorophyll-Mangel und nicht altersbedingt waren. Aufgrund des sigmoiden Verlaufes des Blattflächenwachstums (Abb. 12) und der unterschiedlichen maximalen Flächen der einzelnen Blätter (Abb. 11) war die Auswahl von Blättern mit einer maximalen Photosyntheseleistung (Abb. 18), d. h. zum Zeitpunkt von 50 % relativer Blattfläche, sehr schwierig. Deshalb wurden die Gaswechsel-Messungen, ebenso wie alle anderen Untersuchungen, an Blättern mit ca. 70 - 95 % ihrer endgültigen Blattfläche durchgeführt, das entsprach den ausgewählten Blättern (ca. 8. bis 12. Blatt von oben) im gewählten ontogenetischen Alter der Pflanzen (22- bis 26-Blatt-Stadium) (s. Kap. 3.2.2).

3.4.2. CO2- und H2O-Gaswechsel in Abhängigkeit von Mess- und Anzucht-
Lichtintensität

3.4.2.1. Lichtabhängigkeit von Parametern des CO2- und H2O-Gaswechsels

In den vorangegangenen Kapiteln wurde gezeigt, welche Auswirkungen sowohl der Chlorophyllgehalt als auch die Lichtquantität während der Anzucht auf das Absorptions- sowie das Wachstumsverhalten der Pflanzen hatten. Damit stellte sich die Frage, inwieweit diese Veränderungen sich in gleichem Maße im Prozess der CO2-Assimilation, der eine unmittelbare Voraussetzung für das Wachstum darstellt, wiederfinden.

Zu diesem Zweck wurden von allen Tabak-Varianten Lichtsättigungskurven der CO2-Austauschraten aufgenommen (Abb. 19). Zur Modellierung dieser Kurven wurde die in Kap. 2.2.4.1 dargestellte Exponentialgleichung [5] verwendet. Die richtige Auswahl dieser Funktion für den lichtabhängigen Verlauf von JCO2 der Tabakblätter bestätigt sich durch die sehr


61

hohe Korrelation (r2 = 0.9950 - 0.9999) zwischen den Messwerten und den Modelldaten bei allen Varianten. Schon bei niedrigen PPFD´s zeichnet sich ab, dass die TF eine geringere CO2-Assimilationsleistung hatten als der entsprechende WT. Nur die Pflanzen der #57 zeigten bis zu einer Lichtintensität von 150 (LL) bzw. 600 (HL) µmol Quanten m-2 s-1 signifikant nicht unterschiedliche JCO2-Werte zum WT. Bei der höchsten Mess-Lichtintensität von 1800 µmol Quanten m-2 s-1 waren die Netto-CO2-Aufnahmeraten der Blätter der transgenen Pflanzen im Vergleich zu denen der SNN bis auf 21 (HL) bzw. 14 % (LL) niedriger. Die unter HL angezogenen Pflanzen der SNN gingen erst bei sehr hohen PPFD´s in den Bereich einer Lichtsättigung der CO2-Aufnahmerate über, die Assimilation der #42-LL war dagegen schon bei
150 µmol Quanten m-2 s-1 gesättigt (Abb. 19; s. auch Kap. 3.4.2.2).

Abb. 19 Netto-CO2-Aufnahmeraten (JCO2; in µmol CO2 m-2 s-1) in Abhängigkeit von der eingestrahlten Mess-Lichtintensität (PPFD) von Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( +/- s, n ³ 5). Oben links ist jeweils ein Ausschnitt der Kurven in ihrer Anfangssteigung dargestellt.


62

Im Vergleich der unter den verschiedenen Lichtintensitäten angezogenen Pflanzen wird deutlich, dass alle LL-Pflanzen bei einer Mess-PPFD von 30 µmol Quanten m-2 s-1
(LL-Bedingungen) eine um 71 (SNN), 43 (#57), 39 (#25) bzw. 81 % (#42) höhere Netto-CO2-Aufnahmerate aufwiesen als die vergleichbaren HL-Varianten. Waren die PPFD´s während der Messung größer als 30 µmol Quanten m-2 s-1, zeigten dagegen wieder die unter HL angezogenen Pflanzen die höheren JCO2-Werte, wobei diese unter 1800 µmol Quanten m-2 s-1 das 1.7 bis 3.5fache der an den Blättern der entsprechenden LL-Pflanzen gemessenen Werte erreichten (Abb. 19).

Abb. 20 Blattleitwert für Wasserdampf (gH2O; in mmol H2O m-2 s-1) in Abhängigkeit von der eingestrahlten Mess-Lichtintensität (PPFD) von Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( +/- s, n ³ 5).

Parallel zu den Lichtsättigungskurven der Netto-CO2-Aufnahmeraten wurden aus den Gaswechselmessungen ebenfalls Lichtabhängigkeitskurven des Blattleitwertes für Wasserdampf (gH2O, Abb. 20), der CO2-Konzentration in den Mesophyll-Interzellularräumen (ci, Abb. 21) sowie des Kehrwertes des water use efficiency, d. h. des Quotienten JH2O/JCO2 (1/WUE, Abb. 22) abgeleitet. Die gH2O-Kurven der Tabakpflanzen zeigten alle einen Anstieg bis zu einer Beleuchtungsstärke von ca. 600 (LL, #25- und #42-HL) bzw. 1200 (SNN- und #57-HL) µmol


63

Quanten m-2 s-1 und danach einen Plateauwert bzw. sogar ein leichtes Absinken der Werte. In den LL-Pflanzen waren diese Werte generell um bis zur Hälfte niedriger als in den HL-Pflanzen. Bei sättigender Strahlung lagen die Blattleitwerte für Wasserdampf in den Blättern der HL-Pflanzen zwischen 100 und 170 und diejenigen der LL-Pflanzen bei 63 - 87 mmol H2O m-2 s-1. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Tabak-Transformanten lassen keine eindeutige Tendenz erkennen. Die gH2O-Werte der #57 schienen im Vergleich zur SNN erhöht, die der #25 und #42 meist geringer zu sein (Abb. 20).

Abb. 21 CO2-Konzentration in den Interzellularen (ci; in ppm) in Abhängigkeit von der eingestrahlten Mess-Lichtintensität (PPFD) von Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( +/- s, n ³ 5).

Die für die Tabakblätter ermittelte CO2-Konzentration der Luft in den Mesophyll-Interzellularen lag in dem für C3-Pflanzen unter nicht-limitierender Temperatur und Lichtstärke typischen Bereich von ca. 240 ppm (von Willert et al., 1995). Sie nahm unter beiden Lichtintensitäten vom WT über die #57 und #25 zur #42 hin bis auf das ca. 1.5fache (d. h. um bis zu 120 ppm) zu. In den LL-Blättern lagen die ci-Werte im gleichen Bereich wie in den ent-


64

sprechenden HL-Varianten, teilweise zeichnete sich die Tendenz zu leicht höheren Werten ab (Abb. 21).

Abb. 22 Kehrwert des water use efficiency (1/WUE; JH2O/JCO2; in mmol
H2O (µmol CO2)-1) in Abhängigkeit von der eingestrahlten Mess-
Lichtintensität (PPFD) von Blättern von unter HL (links) und LL
(rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42.
Die Werte wurden aus den Mittelwerten der CO2- (JCO2; Abb. 19)
und H2O-Austauschraten (JH2O; o. Abb.) berechnet.

Der Quotient JH2O/JCO2 (1/WUE) als ein Maß für die Effizienz des Wasserverbrauchs bei der Netto-CO2-Aufnahme war in den TF der #57 und #25 im Vergleich zur SNN kaum verändert und lag unter nichtlimitierenden Lichtbedingungen bei ca. 0.08 - 0.10 in den HL- bzw.
0.11 - 0.17 in den LL-Pflanzen. Bei den Blättern der #42 war dieser gegenüber dem am WT gemessenen Werten stark erhöht (bis 2.8fach unter HL und 4.5fach unter LL). Die LL-Pflanzen wiesen bei einer Mess-Lichtintensität von 30 und z. T. auch noch 150 µmol Quanten m-2 s-1 niedrigere Mengen an transpirierten H2O- pro assimilierten CO2-Molekülen auf, bei höheren Photonenflussdichten während der Messung lagen diese Werte bis zum 2.7fachen über denen der HL-Pflanzen (Abb. 22).


65

3.4.2.2. Abgeleitete Werte aus den Lichtabhängigkeitskurven der CO2-Aufnahmeraten

Aus den Lichtabhängigkeitskurven der CO2-Aufnahmerate lassen sich nach den in Kapitel 2.2.4.1 beschriebenen Gleichungen [6] bis [9] folgende Parameter ableiten:

  1. die maximale CO2-Aufnahmerate (max. JCO2),
  2. der Lichtsättigungspunkt der CO2-Assimilation (LSP), der nach Schulze (1970) als die PPFD definiert ist, bei der 90 % der maximalen CO2-Aufnahmerate erreicht werden,
  3. der Lichtkompensationspunkt (LKP), d. h. die photosynthetische Photonenflussdichte, bei der CO2-Ein- und Ausstrom ausgeglichen sind,
  4. die apparente Quantenausbeute (Fapp), d. h. die Menge an aufgenommenen CO2-Molekülen pro Anzahl auf das Blatt auftreffender Quanten im linearen Bereich der Lichtsättigungskurve. Unter Berücksichtigung der Lichtabsorption der Tabak-Varianten (Abb. 17) kann die reelle Quantenausbeute (Freell), d. h. die Anzahl aufgenommener CO2-Moleküle pro Anzahl tatsächlich absorbierter Quanten, berechnet werden.

Diese für die Tabak-Varianten ermittelten Werte sind in den Tab. 7 und 8 aufgeführt.

Tab. 7 Maximale CO2-Aufnahmerate (max. JCO2; in µmol CO2 m-2 s-1), Lichtsättigungs-punkt (LSP; in µmol Quanten m-2 s-1) und Lichtkompensationspunkt (LKP; in µmol Quanten m-2 s-1) von Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n ³ 5). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

max. JCO2

(µmol CO2
m-2 s-1)

t-Test

I II

LSP

(µmol Quanten
m-2 s-1)

t-Test

I II

LKP

(µmol Quanten
m-2 s-1)

t-Test

I II

HL

SNN

15.32 ± 2.76

1030 ± 153

17.8 ± 3.6

#57

12.77 ± 2.69

-

821 ± 76

+

9.4 ± 2.9

+++

#25

5.66 ± 0.76

+++

450 ± 56

+++

12.3 ± 2.6

+

#42

3.15 ± 0.92

+++

474 ± 32

+++

21.5 ± 3.3

++

LL

SNN

6.33 ± 1.53

+++

367 ± 56

+++

5.4 ± 1.4

+++

#57

4.90 ± 0.46

-

+++

286 ± 32

++

+++

2.2 ± 0.9

+++

++

#25

3.37 ± 0.41

++

++

228 ± 41

+++

+++

4.0 ± 1.3

+

++

#42

1.00 ± 0.34

+++

+++

87 ± 9

+++

+++

4.6 ± 2.6

-

+++

Die maximale CO2-Aufnahmerate war in den TF gegenüber den SNN-Pflanzen graduell mit dem Chl-Gehalt verringert - unter HL um 17 (#57), 63 (#25) bzw. 79 % (#42) und unter LL um 23 (#57), 47 (#25) bzw. 84 % (#42). Unter LL zeigten die Tabakblätter maximale JCO2-Werte


66

Tab. 8 Apparente (Fapp; in mol aufgenommenes CO2 (mol eingestrahlte Quanten)-1) und reelle Quantenausbeute der CO2-Aufnahme (Freell; in mol aufgenommenes CO2 (mol absorbierte Quanten)-1) von Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n ³ 5). Die Werte der absorbierten Quanten zur Berechnung von Freell wurden aus Abb. 17 entnommen. Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

Fapp

(mol CO2
(mol Quanten)-1)

t-Test

I II

Freell

(mol CO2
(mol Quanten)-1)

t-Test

I II

HL

SNN

0.035 ± 0.006

0.042 ± 0.008

#57

0.036 ± 0.002

-

0.051 ± 0.003

+

#25

0.030 ± 0.004

+

0.052 ± 0.007

+

#42

0.016 ± 0.004

+++

0.072 ± 0.017

+++

LL

SNN

0.040 ± 0.004

+

0.055 ± 0.006

+++

#57

0.040 ± 0.005

-

-

0.070 ± 0.008

+++

++

#25

0.035 ± 0.002

+

-

0.065 ± 0.004

+

+

#42

0.028 ± 0.008

+++

+++

0.105 ± 0.032

+++

+++

von 32 - 60 % der der HL-Pflanzen (Tab. 7). Parallel zu den niedrigeren maximalen JCO2-Werten war sowohl in den TF im Vergleich zum WT als auch in den LL- im Vergleich zu den HL-Pflanzen eine Verschiebung der Lichtsättigung zu geringeren PPFD´s hin zu beobachten. Während der HL-WT die Lichtsättigung bei 1030 µmol Quanten m-2 s-1 erreichte, war das bei den HL-TF schon bei 821 bis 450 µmol Quanten m-2 s-1 der Fall. Unter LL liegt der LSP des WT bei 367 µmol Quanten m-2 s-1 und der der TF zwischen 286 und 87 µmol Quanten m-2 s-1 (Tab. 7). Die für die Tabakblätter ermittelten Lichtsättigungswerte lagen in dem für krautige C3-Pflanzen typischen Bereich von 100 - 200 µmol Quanten m-2 s-1 (Schattenpflanzen) bzw. 1000 - 1500 µmol Quanten m-2 s-1 (Sonnenpflanzen) (Long und Hällgren, 1993; Larcher, 1994). Diese für die einzelnen Varianten ermittelten LSP dienten als Grundlage für die Messung der Photorespirationsraten und der RSL unter sättigenden Lichtbedingungen (s. Tab. 2, Kap. 2.2.4). Als Lichtkompensationspunkte werden in der Literatur Werte von 5 µmol Quanten m-2 s-1 (Schattenpflanzen) bzw. 20 - 40 µmol Quanten m-2 s-1 (Sonnenpflanzen) angegeben (Larcher, 1994). Der LKP der unter HL- bzw. LL angezogenen Pflanzen der #57 war um 47 bzw. 60 % und der #25 um 31 bzw. 27 % geringer als bei dem entsprechenden WT, wogegen die Blätter der #42 sogar einen um 1/5 höheren (HL) bzw. vom WT nicht verschiedenen LKP aufwiesen (LL). Die bei 30 µmol Quanten m-2 s-1 kultivierten Pflanzen zeigten einen LKP, der


67

bei 1/3 bis 1/5 des Wertes der bei der 10fachen Lichtintensität angezogenen Pflanzen lag (Tab. 7). Die ermittelten apparenten Quantenausbeuten (Tab. 8) entsprachen den in der Literatur für C3-Pflanzen angegebenen typischen Werten von ca. 0.05 mol CO2 (mol Quanten)-1 (Ehleringer und Björkman, 1977) und lassen die Tendenz zu höheren Werten in den LL- als in den HL-Pflanzen erkennen (um 10 - 70 %). Die Blätter der #57 nahmen im linearen Bereich der Lichtabhängigkeitskurve pro mol eingestrahlte Quanten ebensoviel CO2-Moleküle wie der WT auf. Bei den Blättern der #25 waren geringere Fapp-Werte im Vergleich zur SNN um 14 % und der #42 um 54 bis 31 % zu verzeichnen (Tab. 8). Die Tabakpflanzen unter
LL-Bedingungen zeigten eine signifikante Erhöhung der reellen Quantenausbeuten um 24 bis 47 % im Vergleich zu den unter HL angezogenen Pflanzen. Tabakblätter mit Chl-Defizienz nahmen um bis zu 70 % (HL) bzw. 90 % (LL) mehr CO2 pro absorbierte Quanten auf als die des entsprechenden WT´s (Tab. 8).

3.4.2.3. Dnkelrespirationsraten

Abb. 23 Dunkelrespirationsraten (RD; in µmol CO2 m-2 s-1) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n ³ 5).


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Für die mitochondriale Atmung im Dunkeln wurden für die unter HL bzw. LL angezogenen SNN-Pflanzen Werte von 0.79 bzw. 0.29 µmol CO2 m-2 s-1 ermittelt (Abb. 23). Die RD-Werte der Blätter der transgenen Pflanzen betrugen ca. die Hälfte (39 - 58 %) des am entsprechenden WT gemessenen Wertes (signifikant mit mind. p < 0.05), wobei die TF jeweils unter Stark- bzw. Schwachlicht im Vergleich untereinander keinen signifikanten Unterschied aufwiesen. LL-Bedingungen während der Anzucht bewirkten eine um 63 (SNN) bis 71 % (#42) niedrigere Dunkelrespirationsrate als in der entsprechenden HL-Variante (Abb. 23).

3.4.2.4. CO2- und H2O-Gaswechsel unter Anzucht-Lichtintensitäten

Beim Vergleich der Netto-CO2-Aufnahmeraten, deren Messung bei Bedingungen, die den Anzuchtbedingungen entsprachen, erfolgte, wird deutlich, dass die #57 sowohl unter HL als auch unter LL gleiche Raten aufwiesen wie der WT (Abb. 24A). Die Blätter der #25 und #42 nahmen unter HL 37 bzw. 66 % und unter LL 24 bzw. 48 % weniger CO2 pro Fläche und Zeit als der WT auf. Unter LL-Bedingungen betrug die CO2-Aufnahmerate der Tabakpflanzen ca. 1/8 (SNN), 1/7 (#57), 1/6 (#25) bzw. 1/5 (#42) des Wertes der vergleichbaren HL-Variante (Abb. 24A).

Die Blattleitwerte für Wasserdampf (gH2O, Abb. 24B) waren für die TF sowohl unter HL als auch unter LL nicht signifikant verschieden zum WT. Die Werte, die unter LL-Anzuchtbedingungen für die einzelnen Varianten gemessen wurden (25 ± 5 mmol H2O m-2 s-1), lagen etwa bei 22 bis 38 % des für die HL-Pflanzen durchschnittlichen Wertes von 78 ± 8 mmol H2O m-2 s-1 (Abb. 24B).

Die ermittelten Werte für die CO2-Konzentration in den Interzellularen (ci, Abb. 24C) ergeben, dass bei den unter HL angezogenen Pflanzen ein Anstieg mit sinkendem Chl-Gehalt von 193 ppm beim WT auf 296 ppm bei der #42 zu beobachten war, unter LL dagegen der Wert in allen Varianten konstant bei ca. 293 ± 10 ppm lag. Daraus ergibt sich, dass in den
LL- im Vergleich zu den HL-Pflanzen der SNN, #57 und #25 um 46 %, 37 % bzw. 12 % höhere ci-Werte ermittelt wurden, die der #42 jedoch gleich waren (Abb. 24C).

Die ermittelten Quotienten JH2O/JCO2 (1/WUE, Abb. 24D) lassen keine Korrelation zwischen dem Chl-Gehalt und der Menge an abgegebenem H2O pro aufgenommenem CO2 erkennen, es liegt jedoch eine Tendenz zu erhöhten Werten bei stark reduziertem Chl-Gehalt vor. Unter LL betrugen die JH2O/JCO2-Werte das 1,5 bis 2.9fache der an den HL-Pflanzen gemessenen Werte (1/WUE, Abb. 24D).


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Abb. 24 Netto-CO2-Aufnahmeraten (A; JCO2, in µmol CO2 m-2 s-1), Blattleitwerte für Wasserdampf (B; gH2O, in mmol H2O m-2 s-1), CO2 -Konzentration in den Mesophyll-Interzellularen (C; ci, in ppm) und Quotient JH2O/JCO2 (D; Kehrwert des water use efficiency, 1/WUE, in mmol H2O (µmol CO2)-1) unter Anzucht-PPFD´s inBlättern von unter HL (je links) und LL (je rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n ³ 5).

3.4.3. Photorespirationsraten

Die in Kap. 2.2.4 beschriebene Methode erlaubt die Bestimmung des Anteiles, um den die Netto-CO2-Aufnahmerate unter ambienten Luft-Bedingungen (21 % O2, 0.035 % CO2) infolge der RubisC/O-Oxygenase-Aktivität vermindert ist und somit indirekt der Rate, mit der CO2 durch die Photorespiration im Licht freigesetzt wird. Durch die Reduzierung der O2-Konzentration in der Luft auf 2 % ist die Photorespiration vollständig inhibiert, diese Bedingungen erlauben aber das Funktionieren anderer O2-abhängiger Prozesse, v. a. der mitochondrialen Atmung (Larcher, 1994; von Willert et al., 1995; Andrews und Baker, 1997).


70

Abb. 25 Photorespirationsraten (RPh, in µmol freigesetztes CO2 m-2 s-1) unter Anzuchtlicht in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 3 - 6).

Die unter beiden Anzuchtlichtbedingungen durch die Photorespiration freigesetzte Menge an CO2 in den Blättern der #57 unterschied sich nicht von der in den SNN-Blättern (Abb. 25). Mit stärkerer Verringerung des Chl-Gehaltes (Abb. 6) und der CO2-Aufnahmeraten (Abb. 24A) in den TF wurden jedoch auch verminderte Photorespirationsraten gemessen. So lag diese in den Blättern der #25 bei ca. 70 % und in denen der #42 bei ca. 40 % des Wertes der entsprechenden WT-Blätter. Beim Vergleich der unterschiedlichen Anzuchtlichtintensitäten zeigte sich, dass alle Pflanzen unter LL eine Photorespirationsrate von ca. 15 % der in den vergleichbaren HL-Varianten gemessenen Rate aufwiesen (Abb. 25). Da diese Tendenz sehr ähnlich der der CO2-Aufnahmeraten in Abhängigkeit von Anzuchtlicht und Chlorophyllgehalt (Abb. 24A) ist, ergaben sich kaum Unterschiede in dem durch die photorespiratorische Aktivität verminderten Anteil der CO2-Fixierung (Tab. 9). Unter Anzuchtlicht zeigte nur die #42-LL mit einer durch RPh um 26.6 % verminderten Netto-CO2-Austauschrate einen signifikant unterschiedlichen Wert im Vergleich zu denen der anderen Varianten, bei denen dieser Anteil bei 29.2 bis 32.3 % lag. Unter sättigendem Mess-Licht ergaben sich Prozentsätze von 23.2 bis 32.9 %, jedoch zeichnete sich hier in den chl-armen LL-Pflanzen eine signifkante Erhöhung dieses Wertes ab (Tab. 9).


71

Tab. 9 Anteil der Photorespiration (% RPh; in % Verlust von CO2) unter Anzuchtlicht und unter sättigendem Licht für Blätter von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 3 - 6). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

% RPh

Anzuchtlicht

t-Test

I II

% RPh

sättig. Licht

t-Test

I II

HL

SNN

29.3 ± 1.6

29.3 ± 3.6

#57

29.7 ± 2.1

-

26.4 ± 1.1

-

#25

31.0 ± 2.5

-

28.2 ± 2.2

-

#42

32.3 ± 2.6

-

32.9 ± 1.4

-

LL

SNN

29.6 ± 1.2

-

23.2 ± 2.4

-

#57

30.2 ± 2.2

-

-

25.4 ± 3.2

-

-

#25

29.2 ± 2.9

-

-

30.6 ± 1.8

++

-

#42

26.6 ± 0.9

++

+

30.2 ± 1.8

+

-

3.4.4. Relative stomatäre Limitierung des CO2-Austausches

Um einschätzen zu können, inwieweit morphologische und funktionelle Veränderungen der stomatären Appertur zu den aufgeführten Unterschieden in den Parametern des CO2- und H2O-Gaswechsels innerhalb der Tabak-Varianten beitragen, wurde neben der Stomataanzahl und -dichte (Kap. 3.2.2.2) die Limitierung der CO2-Austauschrate durch die Stomata und Epidermis ermittelt. Die Methode zur Bestimmung dieser relativen stomatären Limitierung (RSL; Kap. 2.2.4) beruht auf der Annahme, dass bei fehlender stomatärer Limitierung die innere CO2-Konzentration der in der Umgebungsluft entsprechen würde (Farquhar und Sharkey, 1982). Sie wird für C3-Pflanzen unter Lichtsättigung in der Literatur mit ca. 10 bis 20 % angegeben (von Willert et al., 1995). Unter sättigendem Messlicht zeigte sich bei dem Vergleich der transgenen zu den SNN-Pflanzen erst bei den chl-ärmeren TF eine Verringerung der RSL um 74 % (HL) bzw. um ca. 40 % (LL). Unter LL-Anzuchtbedingungen ist die stomatäre Limitierung von JCO2 bei den Pflanzen der SNN, #57 und #25 geringer ausgeprägt als bei den vergleichbaren Starklicht-Varianten (61, 67 bzw. 41 % des HL-Wertes), wogegen die #42 unter LL einen um 36 % höheren RSL-Wert aufweist (Abb. 26).


72

Abb. 26 Relative stomatäre Limitierung (RSL, in %) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 12 - 27).

3.5. Energiestoffwechsel

Die im Kapitel 3.3 beschriebene verringerte Lichtabsorption infolge von Chlorophyll-Defizienz bzw. Schwachlichtbedingungen kann unterschiedliche photochemische Reaktionen zur Folge haben, die ihrerseits Veränderungen in der ATP- und NADPH+H+-Bereitstellung hervorrufen würden. Ebenso lassen die Unterschiede im CO2-Gaswechsel (Kap. 3.4), die auf ungleiche Aktivitäten des Calvin-Zyklus - d. h. der wichtigsten Energie- und Reduktionsequivalente-verbrauchenden Dunkelreaktionen der Photosynthese - hinweisen, Veränderungen im Adenylat- und Pyridinnucleotid-Stoffwechsel erwarten.

Die Berechtigung, von aus Ganzblattextrakten gewonnenen Befunden auf chloroplastidäre Prozesse zu schließen, ergibt sich aus folgenden Tatsachen: Der gesamte zelluläre Pool der AdN verhält sich sowohl im Licht als auch im Dunkeln als ein uniformer Pool und ist unabhängig von Temperatur, PPFD und ci (Kobayashi et al., 1982; Gilmore und Björkman, 1994). Die Änderungen der AdN im Chloroplasten und Zytosol folgen sehr ähnlichen Kinetiken infolge eines rapiden direkten sowie indirekten AdN-Energie-Transfers zwischen diesen


73

Kompartimenten (Heber und Santarius, 1970; Raymond et al., 1987), der v. a. durch einen ATP/ADP-Translokator in der Chloroplastenhülle vermittelt wird (Raymond et al., 1987; Krömer, 1995; Neuhaus et al., 1997). Außerdem liegt im Licht in der Zelle der größte Anteil an Adenylaten (ca. 70 %) in den Chloroplasten vor (Stitt et al., 1982; Gardeström, 1987; Raymond et al., 1987) und 90 % des synthetisierten ATP stammen aus den Chloroplasten (Hampp et al., 1982; Hoffmann, 1985; Lawlor, 1990). In den Mitochondrien wurden nur sehr geringe AdN-Mengen in Relation zu den anderen Kompartimenten gefunden (Raymond et al., 1987).

Auch bei den Pyridinnucleotiden findet ein ständiger Austausch zur Versorgung und zum Erreichen eines Gleichgewichtes zwischen den Kompartimenten statt. Ein Malat-shuttle in der Chloroplastenhülle (Scheibe, 1987 und 1990) erfüllt diese Funktion zwischen Chloroplast und Zytoplasma für das NADP(H+H+)-System. Trotzdem liegt der größere Anteil des NADP(H+H+)-Pools im Zytosol vor (ca. 50 - 65 %), der NAD(H+H+)-Pool ist dagegen aufgrund geeigneter Transportsysteme in allen Kompartimenten gleich (Raymond et al., 1987). Daher wurde zusätzlich die Aktivität der NADP+-abhängigen MDH ermittelt, da diese, v. a. der Aktivierungsstatus des Enzyms (Verhältnis von in vivo-Aktivität zu Vollaktivität), generell als ein metabolischer Indikator für den Reduktionsstatus des stromalen NADP+-Pools verwendet wird (Scheibe und Stitt, 1988; Scheibe, 1990; Foyer et al., 1990; Harbinson et al., 1990; Quick et al., 1991; Leegood, 1993; Ivanitzev und Kurganov, 1993; Biehler, 1995; Batini et al., 1995; Kitzmann, 1996; Grace und Logan, 1996).

3.5.1. Adenylate

Bei den chl-defizienten TF war im Vergleich zum WT nur eine geringe Veränderung im Gesamtgehalt an Adenylaten pro Fläche zu verzeichnen (Abb. 27). Unter HL-Bedingungen zeigten die Pflanzen der #57 einen (mit p < 0.001) signifikant höheren AdN-Gehalt um 18 %, die der #25 keine signifikante Veränderung und die der #42 einen (mit p < 0.001) signifikant niedrigeren Gesamt-AdN-Pool um 20 % als die SNN-Pflanzen. Die reduzierten Gesamt-Gehalte bei der #42 resultieren aus einer Verringerung von ATP um 14 %, ADP um 9 % und AMP um 63 %. Unter LL-Bedingungen waren die Gehalte an Adenylaten - außer in der #42 mit einer 12 %igen Erhöhung (statistisch abgesichert auf dem 5 %-Niveau) - in den TF gleich


74

Abb. 27 Gehalte an ATP ( ), ADP ( ) und AMP ( ) (in nmol cm-2) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( +/- s, n = 30 - 61).

zum WT. LL-Bedingungen während der Anzucht bewirkten eine Reduzierung des Adenylatgehaltes pro Fläche auf 24 bis 39 % der entsprechenden HL-Variante. Diese verminderten Gehalte resultierten aus einer Verringerung von sowohl ATP als auch ADP und AMP, wobei aber AMP um 88 bis 96 %, ATP dagegen nur um 51 bis 71 % reduziert war (Abb. 27). Aufgrund dieser unterschiedlichen Veränderung der Gehalte der einzelnen AdN in den Tabak-Varianten ergaben sich Verschiebungen im Pool-Verhältnis der Adenylate zueinander (Abb. 28). Es zeigt sich, dass unter HL mit sinkendem Chlorophyllgehalt in den Tabakblättern eine Verringerung des AMP- (von 17 auf 8 %) sowie tendenziell eine leichte Erhöhung des ATP-Anteiles (von 48 auf 52 %; nicht signifikant) zu verzeichnen war (Abb. 28). Daraus ergaben sich auch die erhöhten EC-Werte in den TF (Tab. 10). Unter Schwachlichtbedingungen wiesen die TF und der WT konstante Relationen der AdN zueinander (ATP: 63 - 67 %, ADP: 30 - 34 %, AMP: 2 - 3%) (Abb. 28) und gleiche EC-Werte (Tab. 10) auf. In allen unter LL im Vergleich zu den entsprechenden unter HL angezogenen Varianten war der prozentuale Anteil an ATP signifikant (mit p < 0.001) um 13 bis 20 % erhöht, der AMP-Anteil am Gesamt-Adenylatpool dagegen um 6 bis 15 % vermindert (Abb. 28). Dieses führte zu einem deutlichen Anstieg der EC-Werte um 0.09 bis 0.18 (Tab. 10). Die TF zeigten in beiden Anzucht-Licht-


75

intensitäten im Vergleich zu den SNN-Pflanzen keinen Unterschied in den ATP/ADP-Verhältnissen, dagegen waren diese Werte bei den LL- im Vergleich zu den HL-Pflanzen um 1/3 bis 2/3 höher (Tab. 10).

Abb. 28 Prozentualer Anteil von ATP ( ), ADP ( ) und AMP ( ) am Gesamt-Adenylat-pool in Blättern von unter HL (oben, A - D) und LL (unten, E - H) angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A, E), #57 (B, F), #25 (C, G) und #42 (D, H). Die relativen Werte wurden aus den in Abb. 27 dargestellten Gehalten (in nmol cm-2) berechnet.

Tab. 10 ATP/ADP-Verhältnisse und energy charge (EC) in Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 30 - 61). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

ATP/ADP

t-Test

I II

EC

t-Test

I II

HL

SNN

1.36 ± 0.50

0.66 ± 0.06

#57

1.35 ± 0.46

-

0.64 ± 0.09

-

#25

1.38 ± 0.61

-

0.69 ± 0.06

++

#42

1.28 ± 0.43

-

0.72 ± 0.05

+++

LL

SNN

1.92 ± 0.81

+++

0.80 ± 0.06

+++

#57

2.23 ± 0.72

-

+++

0.82 ± 0.07

-

+++

#25

1.84 ± 0.88

-

++

0.80 ± 0.08

-

+++

#42

1.99 ± 0.75

-

+++

0.81 ± 0.03

-

+++


76

3.5.2. Pyridinnucleotide

In den Blättern der Starklicht-TF war ein um 12 bis 42 % verminderter Gesamt-PN-Pool (in nmol cm-2) im Vergleich zum WT zu verzeichnen, wogegen unter LL der Gehalt aller PN in den transgenen Pflanzen gleich dem in den Blättern der SNN (#57, #25) oder sogar um 36 % (#42) höher war (Abb. 29). Daher wiesen beim Vergleich der LL- gegenüber den HL-Varianten die Pflanzen der #42 eine um ca. 60 %, die der SNN, #57 und #25 dagegen eine um ca.
80 % geringere Gesamtmenge der Pyridinnucleotide auf. Diese Änderungen im Pool-Gehalt der PN in den Tabak-Varianten waren auf Veränderungen in den Gehalten aller 4 PN´s zurückzuführen, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß. Daraus ergaben sich Variationen der relativen Anteile von NADP+, NADPH+H+, NAD+ sowie NADH+H+ am Gesamtpool (Abb. 30). So war v. a. in den Blättern der chl-ärmsten TF #42 im Vergleich zum WT sowohl unter Stark- als auch unter Schwachlichtbedingungen eine Verminderung des relativen NADP+- (von 44 auf 37 % bzw. von 39 auf 33 %; p < 0.001) und eine Erhöhung des NADPH+H+-Anteiles (von 22 auf 29 % bzw. von 37 auf 40 %; p mind. < 0.05) zu verzeichnen. Das NAD(H+H)+-Paar war dagegen in weitestgehend konstanter Proportion vorhanden.

Abb. 29 Gehalte an NADP+ ( ), NADPH+H+ ( ), NAD+ ( ) und NADH+H+ ( )
(in nmol cm-2) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( +/- s, n = 16 - 32).


77

LL-Anzuchtbedingungen bewirkten einen signifikanten (p < 0.001) Anstieg des NADPH+H+-Anteiles um 9 bis 16 % gegenüber den HL-Varianten, NADP+ und NADH+H+ zeigten gleiche bis leicht geringere Prozentwerte, NAD+ lag dagegen mit 6 bis 10 % weniger im Gesamtpool vor (p < 0.01) (Abb. 30).

Abb. 30 Prozentualer Anteil von NADP+ ( ), NADPH+H+ ( ), NAD+ ( ) und NADH+H+ ( ) am Gesamt-Pyridinnucleotidpool in Blättern von unter HL (oben, A - D) und LL (unten, E - H) angezogenen Tabakpflanzen der SNN (A, E), #57 (B, F), #25 (C, G) und #42 (D, H). Die relativen Werte wurden aus den in Abb. 29 dargestellten Gehalten (in nmol cm-2) berechnet.

Tab. 11 Reduction charge (RC), anabolic (ARC) und catabolic reduction charge (CRC) in Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 16 - 32). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

RC

t-Test

I II

ARC

[NADP(H)-System]

t-Test

I II

CRC

[NAD(H)-System]

t-Test

I II

HL

SNN

0.26 ± 0.04

0.33 ± 0.05

0.13 ± 0.04

#57

0.25 ± 0.09

-

0.32 ± 0.10

-

0.13 ± 0.06

-

#25

0.26 ± 0.06

-

0.35 ± 0.06

-

0.12 ± 0.05

-

#42

0.32 ± 0.04

+++

0.44 ± 0.04

+++

0.08 ± 0.06

++

LL

SNN

0.39 ± 0.05

+++

0.49 ± 0.04

+++

0.09 ± 0.06

+

#57

0.39 ± 0.08

-

+++

0.48 ± 0.09

-

+++

0.10 ± 0.08

-

-

#25

0.31 ± 0.08

+++

++

0.42 ± 0.09

++

++

0.06 ± 0.05

-

+++

#42

0.43 ± 0.04

+

+++

0.55 ± 0.05

+++

+++

0.10 ± 0.06

-

-


78

Tab. 12 Verhältnisse von reduzierten zu oxidierten PN des Gesamtpools der PN (NAD(P)H+H+/NAD(P)+), des phosphorylierten PN-Paares (NADPH+H+/NADP+) und des nicht-phosphorylierten PN-Paares (NADH+H+/NAD+) in Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 16 - 32). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

NAD(P)H+H+/

NAD(P)+

t-Test

I II

NADPH+H+/

NADP+

t-Test

I II

NADH+H+/

NAD+

t-Test

I II

HL

SNN

0.36 ± 0.08

0.50 ± 0.11

0.16 ± 0.06

#57

0.35 ± 0.17

-

0.50 ± 0.25

-

0.15 ± 0.09

-

#25

0.36 ± 0.10

-

0.54 ± 0.16

-

0.14 ± 0.06

-

#42

0.47 ± 0.09

+++

0.78 ± 0.12

+++

0.09 ± 0.07

++

LL

SNN

0.65 ± 0.13

+++

0.96 ± 0.14

+++

0.12 ± 0.08

-

#57

0.68 ± 0.22

-

+++

0.97 ± 0.37

-

+++

0.13 ± 0.08

-

-

#25

0.48 ± 0.19

++

++

0.77 ± 0.29

+

++

0.07 ± 0.04

-

+++

#42

0.75 ± 0.12

+

+++

1.24 ± 0.26

+++

+++

0.12 ± 0.07

-

-

Die in Tab. 11 und 12 dargestellten Daten lassen erkennen, dass sowohl in der stark chlorotischen #42 im Vergleich zum WT als auch in den LL- im Vergleich zu den HL-Pflanzen der ARC und das NADPH+H+/NADP+-Verhältnis signifikant erhöht waren, wogegen der CRC und das NADH+H+/NAD+-Verhältnis weitgehend konstant blieben. Daraus resultierte in den TF ein um 20 % (#42-HL) bzw. um 9 % (#42-LL) höherer RC-Wert als im entsprechenden WT und in den LL- gegenüber den HL-Pflanzen ein um das 1.2 bis 1.6fache erhöhter RC. Ebenfalls ergibt sich daraus die beobachtete Erhöhung des NAD(P)H+H+/NAD(P)+-Verhältnisses in der #42 auf 130 % (HL) bzw. 116 % (LL) der SNN sowie in den unter LL-Bedingungen angezogenen Pflanzen auf 135 bis 192 % der HL-Blätter (Tab. 11, 12).

3.5.3. NADP+-abhängige MDH

Die blattflächenbezogene in vivo-Aktivität der NADP+-MDH blieb in den unter HL gewachsenen transgenen Pflanzen unverändert (#25) bzw. war um 13 (#57) oder 42 % (#42) im Vergleich zum WT reduziert. Unter LL war eine Erhöhung der MDH-Aktivität um ca. 1/3 des in den Kontrollpflanzen gemessenen Wertes zu beobachten (Abb. 31). Gegenüber den Starklicht-Pflanzen zeigten die unter 30 µmol Quanten m-2 s-1 angezogenen Varianten 83 (SNN) bis


79

Abb. 31 In vivo-Aktivität ( ) und Vollaktivität ( ) der NADP+-abhängigen MDH (in µmol NADPH+H+ cm-2 h-1) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 32 - 49).

Tab. 13 Aktivierungszustand der NADP+-abhängigen MDH (in vivo-Aktivität (A) in % der Vollaktivität (VA)) in Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 32 - 49). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

% A/VA

t-Test

I II

HL

SNN

15.0 ± 3.4

#57

14.3 ± 3.1

-

#25

12.8 ± 2.2

+++

#42

10.6 ± 1.5

+++

LL

SNN

10.8 ± 2.4

+++

#57

10.6 ± 1.6

-

+++

#25

9.2 ± 1.7

+++

+++

#42

9.1 ± 1.3

+++

+++

60 % (#42) geringere Aktivitäten der chloroplastidären MDH. Nach Vollaktivierung des Enzyms zeigte sich, dass nur 9 (#42-LL) bis 15 % (SNN-HL) des Gesamt-Enzyms in vivo unter den gegebenen Bedingungen aktiviert waren (Tab. 13). Dieser relative Anteil der MDH-Aktivität an der maximal möglichen Aktivität, d. h. der Aktivierungszustand des Enzyms, sank mit reduziertem Chl-Gehalt und verringertem Lichtangebot bis auf 70 % des Kontrollwertes. Dieses resultierte v. a. aus der Tatsache, dass die Vollaktivitäten der NADP+-abhängigen MDH


80

in den Tabak-Varianten zwar ähnlich den in-vivo-Aktivitäten variierten, die Werte in Relation zur jeweiligen Kontrolle jedoch höher waren (Abb. 31). So lag die maximale MDH-Aktivität der HL-TF bei 102 (#57), 120 (#25) bzw. 82 % (#42) und der LL-TF beim 1.3- (#57), 1.5- (#25) bzw. 1.6fachen (#42) der in den vergleichbaren WT-Blättern. LL-Bedingungen führten zu einer Reduzierung der Vollaktivität um 75 (SNN) bis 52 % (#42) (Abb. 31).

3.6. Metaboliten des C- und N-Stoffwechsels

Die grünen Blätter sind photosynthetisch aktive Organe, welche die absorbierte Lichtenergie in reduzierte organische Komponenten überführen und speichern. Diese Assimilate repräsentieren den Pool sowohl an Energie als auch an solchen Metaboliten, welche für Wachstum und Entwicklung erforderlich sind. Durch Licht- und Chlorophyllmangel waren die absorbierte Lichtmenge (Kap. 3.3), die CO2-Aufnahme- (Kap. 3.4) und die Wachstumsraten der Tabakpflanzen (Kap. 3.2) beeinflusst, demzufolge waren auch Veränderungen in den Gehalten direkt oder indirekt mit dem Calvin-Zyklus verbundener Metaboliten zu erwarten. Da die photosynthetische Kohlenstoffassimilation die Voraussetzung für die Bildung nicht nur von Kohlenhydraten, sondern auch von Aminosäuren, Proteinen etc. darstellt und die Sequenzen von Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus in Pflanzen parallel moduliert werden (Foyer et al., 1995), war es ebenso von Interesse, welche Auswirkungen die bisher beschriebenen Veränderungen durch Licht- bzw. Chl-Mangel in den Tabakpflanzen auf die C- und N-Gehalte und deren Verhältnis zueinander haben.

3.6.1. Stärke

In den Pflanzen der SNN und #57 waren in den Tagesproben ähnliche (nicht signifikant unterschiedliche) Stärkegehalte von ca. 250 bis 290 µg Glu-Equivalente cm-2 (HL) bzw. 29 bis 32 µg cm-2 (LL) zu beobachten (Abb. 32A). Der Stärkegehalt in den Blättern der #25 betrug 67 (HL) bzw. 84 (LL) % und in denen der #42 nur noch 5 (HL) bzw. 28 (LL) % des vergleichbaren WT-Wertes. Aufgrund des sehr geringen Stärkegehaltes in den Lichtproben der #42-HL kam es bei dieser Variante nicht zu einem signifikanten Unterschied zwischen den unter verschiedenen PPFD angezogenen Pflanzen, wogegen der WT sowie die #57 und #25 unter LL


81

Abb. 32 Stärkegehalte (A; in µg Glu-Equivalenten cm-2) sowie spezifische Trockenmassen (B; in mg cm-2) in Licht- ( ; 0.5 h vor Beendigung der Lichtphase) und Dunkelproben ( ; 0.5 h vor Beendigung der Dunkelphase) von Blättern von unter HL (je links) und LL (je rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 3). Die Werte über den Balken geben in A die über Nacht verbrauchte Stärkemenge in Relation zu der am Ende der Lichtphase vorhandenen Stärke (in %), in B die Differenz der Trockenmassen zwischen Licht- und Dunkelproben (DTM; in mg cm-2) an. Man beachte in A die unterschiedliche Skalierung der y-Achsen für HL und LL!


82

11 - 15 % der in den HL-Pflanzen gemessenen Stärkemenge enthielten. Bei allen Tabak-Varianten wurde der größte Teil der tagsüber akkumulierten Stärke über Nacht wieder verbraucht bzw. aus den Blättern abtransportiert. Dabei lag die Tendenz vor, dass in den LL-Blättern ein größerer Anteil der in den Lichtproben vorhandenen Stärke in der Dunkelheit abgebaut wurde (95 - 98 %) als in den HL-Blättern (81 - 86 %), jedoch war dieser Unterschied nicht signifikant (Abb. 32A; Werte über den Balken). Demzufolge waren am Ende der Dunkelphase in den Tabakblättern noch ca. 1.9 bis 54.0 µg cm-2 unter HL bzw. 0.4 bis 1.5 µg cm-2 unter LL enthalten (Abb. 32A).

Die Akkumulation von transienter Stärke im Laufe der Lichtperiode und der Abbau bzw. Abtransport dieser in der nachfolgenden Dunkelphase wurde auch durch die Differenz der Trockenmassen von am Ende der Licht- und am Ende der Dunkelphase entnommenen Proben verdeutlicht (Abb. 32B). Die Relationen der spezifischen Trockenmassen der einzelnen Tabak-Varianten zueinander blieben in den Dunkel-, ähnlich wie in den Lichtproben, erhalten. Die Differenz der TM (DTM) zwischen den jeweils am Ende der Licht- bzw. Dunkelphase entnommenen Proben nahm in den transgenen Pflanzen mit der Verringerung im Chl-Gehalt der Blätter ab, wobei bei den LL-Pflanzen diese Tendenz statistisch nicht abgesichert war (Abb. 32B; Werte über den Balken). Unter Schwachlicht betrug DTM bei den Blättern der SNN, #57 und #25 ca. 1/9 bis 1/7 der entsprechenden HL-Werte, wogegen die TM-Differenz bei der #42 unter Starklicht ebenso niedrig bei 0.03 mg cm-2 wie unter LL lag (Abb. 32B).

3.6.2. Lösliche Zucker

Da die Gehalte an Saccharose, Glucose und Fructose teilweise an der Nachweisgrenze lagen, sowie aufgrund eines durch die Laborkapazität eingeschränkten Stichprobenumfanges lassen sich zu den löslichen Zuckern z. T. nur tendenzielle Aussagen machen. Die Gehalte an Saccharose, Glucose und Fructose (Abb. 33 A, B, C) waren in den Blättern der unter HL angezogenen SNN-Pflanzen sowohl in den Licht- als auch in den Dunkelproben höher als in den HL-TF. Unter LL-Anzuchtbedingungen scheint die Tendenz zu höheren Zuckergehalten in den transgenen Pflanzen im Vergleich zum WT vorzuliegen, obwohl die meisten Werte nicht signifikant unterschiedlich sind. Die Tabakpflanzen, die unter Schwachlichtbedingungen angezogen wurden, wiesen in Licht- und Dunkelproben sehr viel geringere (um mind. 75 %) Zuckerspiegel als die vergleichbaren HL-Varianten auf (Abb. 33).


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Abb. 33 Gehalte (in ng cm-2) an Saccharose (A), Glucose (B) sowie Fructose (C) in Licht- ( ; 0.5 h vor Beendigung der Lichtphase) und Dunkelproben ( ; 0.5 h vor Beendigung der Dunkelphase) von Blättern von unter HL (je links) und LL (je rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 3). Man beachte die unterschiedliche Skalierung der y-Achsen für HL und LL!


84

Außer in den Pflanzen der #42 kam es während der Dunkelphase zu einer Abnahme der Zuckergehalte, d. h. zum Verbrauch bzw. Abtransport der Zucker. Jedoch liegen die Werte der relativen Mengen an abgebautem Zucker nicht so hoch wie die der Stärke und nur für die Werte der Saccharosegehalte waren die Unterschiede zwischen Licht- und Dunkelproben offensichtlich. Auffallend ist der in den LL-Pflanzen der SNN, 57 und #25 um das 1.3- bis 5.1fache höhere Anteil der in der Dunkelheit abgebauten bzw. abtransportierten Saccharose, Fructose und Glucose von der tagsüber akkumulierten Zuckermenge im Vergleich zu den HL-Pflanzen. Ob die Tendenz in den HL- und LL-Pflanzen der #42 zu einer Erhöhung der Gehalte an Fructose und Glucose und z. T. auch an Saccharose in den dunkeladaptierten Blättern auf eine Akkumulation dieser Zucker hinweisen könnte, ist statistisch nicht erwiesen. Zumindest scheint in dieser TF die Menge der nachts verbrauchten Zucker auf alle Fälle geringer zu sein als in den anderen Varianten (Abb. 33 A, B, C).

3.6.3. Kohlenstoff und Stickstoff

In den Blättern der Tabakpflanzen war unter extremem Chl-Mangel der Gehalt sowohl an Kohlenstoff als auch an Stickstoff bis auf ca. 40 % (HL) bzw. 72 - 80 % (LL) der jeweiligen Kontrollwerte vermindert (Abb. 34). Bei einer Anzucht der Pflanzen unter 30 µmol Quanten m-2 s-1 fanden sich in den Blättern der SNN, #57 und #25 ca. 1/3 bis 1/4 der Kohlen- und Stickstoffgehalte, die in denen der vergleichbaren Starklicht-Varianten gemessen wurden. In der #42 waren die Gehalte in den LL-Blättern aufgrund der unter HL stark verminderten Werte nur um 37 % (C) bzw. 31 % (N) niedriger als in der #42-HL, jedoch war auch hier der Unterschied mit p < 0.001 signifikant (Abb. 34).

Aus den errechneten relativen Gehalten von Kohlen- und Stickstoff an der Gesamt-Trockenmasse (Tab. 14) lässt sich mit sinkendem Chlorophyll-Gehalt in den TF eine Tendenz zur Reduzierung des C-Anteiles (bis um 17 %) bei gleichzeitiger Erhöhung des N-Anteiles (bis um 10 %) erkennen. Daraus ergaben sich unter extremem Chl-Defizit um bis zu 24 % geringere C/N-Verhältnisse (Tab. 14). LL-Bedingungen während der Anzucht bewirkten im Vergleich zu HL-Bedingungen eine um bis zu 20 % stärkere Akkumulation von N pro TM und eine um bis zu 17 % verminderte relative Akkumulation von C, was sich letztendlich in signifikant niedrigeren C/N-Verhältnissen widerspiegelte (Tab. 14).


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Abb. 34 Kohlenstoff- (C, ; in mg cm-2; linke y-Achse) und Stickstoffgehalt (N, ; in mg cm-2; rechte y-Achse) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n = 9 - 16).

Tab. 14 Anteil von Kohlenstoff (% C) und Stickstoff (% N) an der Gesamttrockenmasse sowie C/N-Verhältnis in Blättern von unter HL und LL angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( ± s, n = 9 - 16). Der t-Test wurde für den Vergleich der TF zum WT (I) sowie den Vergleich der LL- mit den HL-Varianten (II) durchgeführt.

Variante

% C

t-Test

I II

% N

t-Test

I II

C/N

t-Test

I II

HL

SNN

38.5 ± 4.3

6.09 ± 0.63

6.35 ± 0.74

#57

40.3 ± 0.9

-

5.91 ± 0.41

-

6.86 ± 0.64

-

#25

38.4 ± 2.2

-

6.59 ± 0.55

+

5.88 ± 0.79

-

#42

32.0 ± 1.3

+++

6.68 ± 0.54

+

4.80 ± 0.45

+++

LL

SNN

32.8 ± 2.4

+++

6.69 ± 0.51

+

4.90 ± 0.15

+++

#57

33.4 ± 1.4

-

+++

7.11 ± 0.22

++

+++

4.70 ± 0.28

+

+++

#25

31.8 ± 2.3

-

+++

6.56 ± 0.56

-

-

4.88 ± 0.50

-

++

#42

30.7 ± 1.4

+

+

7.04 ± 0.48

-

-

4.37 ± 0.18

+++

+


86

3.6.4. Proteine

In den transgenen Pflanzen, die unter 300 µmol Quanten m-2 s-1 aufgezogen wurden, war der Gehalt an löslichem Protein bis auf 44 % des in den WT-Blättern gefundenen Wertes vermindert. Im Vergleich der unter LL angezogenen Tabak-Pflanzen untereinander konnte kein signifikanter Unterschied gefunden werden. Die Verringerung der Proteingehalte in den LL-Varianten um 84 % (SNN) bis 56 % (#42) gegenüber den HL-Pflanzen war mit p < 0.001 signifikant (Abb. 35).

Abb. 35 Gehalt an löslichem Protein (in µg cm-2) in Blättern von unter HL (links) und LL (rechts) angezogenen Tabakpflanzen der SNN, #57, #25 und #42 ( + s, n ³ 4).


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Thu Jan 27 14:39:35 2000