Rickers, Anke: Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

Max-Delbrück Centrum für Molekulare Medizin


Dissertation
Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin

Dipl. Biol. Anke Rickers

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J.P. Rabe

Gutachter:
Prof. Dr. B. Dörken
Prof. Dr. B. Wittmann-Liebold
Prof. Dr. B. Friedrich

eingereicht: 27.10.1998

Datum der Promotion: 16. 02.1999

Schlagwörter:
anti-IgM, B Zelle, Apoptose, Caspasen

Keywords:
anti-IgM, b cell, apoptosis, caspases

Zusammenfassung

Apoptose spielt eine wichtige Rolle bei der Generierung eines funktionellen Lymphozytenrepertoirs. Während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose werden potentiell autoreaktive Zellen eliminiert.

Da die molekularen Mechanismen der B-Zell Apoptose weitgehend unbekannt sind, sollten in dieser Arbeit assoziierte Proteine und Gene identifiziert werden. Durch Subklonierung wurde eine Burkitt Lymphom B Zellinie BL60-2 generiert, die sensitiv auf den anti-IgM Stimulus ist. Für den Vergleich apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen wurde eine Methode entwickelt in der apoptotische, Phosphatidylserin (PS) positive Zellen, über eine magnetische Separation mit einer Reinheit von bis zu 95 Prozent von nicht apoptotischen Zellen angereichert werden konnten. Mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese wurden die aufgereinigten Fraktionen apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen analysiert und die Proteinmuster verglichen. Anhand massenspektrometrischer Analysen und Edman Abbau konnten bisher folgende differentiell erscheinende Proteinspots identifiziert werden: Lamin B1, beta-Aktin, neutrales Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, das FUSE-binding Protein, dUTPase, P0, HP1 alpha.

Die Proteine D4-GDI, hnRNPA1 und der Transkriptionsfaktor SP1 werden spezifisch während der anti-IgM induzierten Apoptose gespalten. Der zeitliche Verlauf wurde in einer eindimensionalen Western Blot Analyse bestimmt. Das diese Spaltungen ein Resultat der Aktivierung der Proteasen der Caspase 3 Familie sind, konnte durch Inhibitor Studien mit dem Tetrapeptid z-DEVD-fmk bewiesen werden. Die Spaltung des Transkriptionsfaktors SP1 wurde ebenfalls in in vitro untersucht. Rekombinante Caspase 3 und 7 generieren die gleichen Spaltprodukte, die zuvor in vivo nach anti-IgM induzierter Apoptose detektiert wurden, Caspase 6 hingegen generiert nur ein Fragment. Die spezifische Spaltung des Transkriptionsfaktors beinflußt die DNA Bindungsaktivität, was in einem elektro mobility shift assay gezeigt werden konnte. Die Intensität des SP1/DNA-Komplexes nimmt nach Apoptose-Induktion stark ab, hingegen nimmt die Intensität eines kleineren Komplexes stark zu, was auf die Bindung eines der Spaltprodukte schließen ließ, das möglicherweise transkriptionell inaktiv ist und damit einen wichtigen Apoptose Effektor darstellt.

Die Proteasen der Caspase 3 Familie konnten erstmalig als zentrale Regulatoren während der anti-IgM induzierten Apoptose identifiziert werden. Durch die Hemmung mit dem Inhibitor z-DEVD-fmk konnte die Apoptose, sowie charakteristische morphologische Veränderungen, wie die Kernfragmentierung und PS auf die Zelloberfläche gehemmt werden und als Caspase 3 abhängige Veränderungen bestimmt werden.

Über verschiedene Methoden der differentiellen Hybridisierung von neu hergestellten lambda-Zap cDNA-Phagenbanken von nicht stimulierten und anti-IgM stimulierten Burkitt Lymphom Zellen sowie der subtraktiven Klonierung sollten Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten Apoptose differentiell exprimiert werden. Apoptose spezifische Sequenzen wurden angereichert, kloniert und sequenziert.

Abstract

Apoptosis or programmed cell death is essential in the process controlling lymphocyte growth and selection. During anti-IgM induced B cell apoptosis autoreactive cells are eliminated. Since the molecular mechanisms underlying the process of B cell apoptosis are still not well understood the goal of this study was to identify proteins and genes in apoptosis.

Subcloning lead to the selection of a human Burkitt lymphoma B cell line clone (BL60-2) which is highly sensitive towards the anti-IgM stimulus. In order to compare apoptotic and non apoptotic cells a novel method was established, which allows separation of apoptotic, Phosphatidylserine (PS) positive cells from non apoptotic, PS negative cells by magnetic cell sorting. This method generates fractions of apoptotic and non apoptotic cells with a purity of up to 95 %. Cell lysates from those fractions were analyzed using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and the protein patterns were compared. Using mass spectrometry and Edman sequencing the following differentially appearing proteins were identified: Lamin B1, beta-Actin, neutral Calponin, Nucleolin, D4-GDI, hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, LSP1, HHR23B, FUSE-binding protein, dUTPase, P0, HP1alpha.

The specific cleavage of the D4-GDI, hnRNPA1 and the transcription factor SP1 which occurs after anti-IgM induced apoptosis was detected by western blot analysis. It was determined by inhibition studies with the tetrapeptide inhibitor z-DEVD-fmk that the cleavage is a result of the Caspase 3 family. Cleavage of the transcription factor SP1 was also investigated by in vitro cleavage assays. The activity of recombinant caspase 3 and 7 generate the same cleavage products as observed in vivo after anti-IgM induction. The specific cleavage of the transcription factor influences it´s DNA binding activity as observed by the decrease of the full lenght protein-DNA complex. The increase of a smaller protein-DNA complex was apparent, which may represent the binding of at least one cleavage product.

In this work proteases of the Caspase 3 family could be identified as central regulators during anti-IgM induced apoptosis. Anti-IgM induced apoptosis can be completly inhibited by inhibition of Caspase 3 proteases. Characteristic morphological changes, nuclear fragmentation and PS translocation to the outer membrane leaflet of the cells could be determined as a consequence of the Caspase 3 activation during the process of apoptosis.

By differential hybridisation of newly generated lambda-Zap c-DNA librarys from unstimulated and anti-IgM stimulated B cells as well as with subtractive cDNA librays, it should be feasable to identify newly transcribed genes. Apoptosis specific sequences were enriched, cloned and sequenced.


1


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [ 106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteIdentifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
1 Einleitung
1.1. Apoptose: Ein Programm zellulärer Selbstzerstörung
1.2. Molekulare Regulatoren der Apoptose
1.2.1. Proteine der bcl-2 Familie
1.2.2. Regulation und mögliche Funktionsweisen der Proteine der bcl-2 Genfamilie
1.2.3. Caspasen und Caspasen-Substrate
1.2.4. Interaktion der Proteine der bcl-2 Genfamilie mit den Caspasen
1.3. Apoptose im Immunsystem
1.3.1. Apo1/FAS induzierte T-Zell Apoptose
1.3.2. B-Zelldifferenzierung und anti-IgM induzierte Apoptose
1.4. Regulation der Genexpression während der Apoptose
1.5. Ziele der vorliegenden Arbeit
2 Materialien
2.1. Chemikalien
2.2. Enzyme, Proteine und Peptide
2.3. Antikörper
2.4. Kits
2.5. Membranen
2.6. Radioaktive Nukleotide
2.7. Zellinien
2.8. Plasmide
2.9. Bakterienstämme
2.10. Oligonukleotide
2.11. Medien und Puffer
2.12. besondere Verbrauchsmaterialien
3 Methoden
3.1. Molekularbiologische Methoden
3.1.1. DNA Standardprozeduren
3.1.2. Herstellung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken
3.1.3. Herstellung einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank
3.1.3.1. Photobiotinylierung von RNA
3.1.3.2. Subtraktive Hybridisierung von einzelsträngiger cDNA mit photobiotinylierter RNA
3.1.3.3. Herstellung von Linkeroligonukleotiden
3.1.3.4. Trennung der subtrahierten cDNAs und Klonierung in lambda-Zap DNA
3.1.4. Screening der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken
3.1.4.1. Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde
3.1.4.2. Differentielle Hybridisierung
3.1.5. In vivo Exzision
3.1.6. Herstellung einer subtrahierten DNA-Probe
3.1.7. Subtraktive Klonierung über Hydroxyapatit-Chromatographie
3.1.8. RNA Präparation
3.1.8.1. Präparation von Gesamt-RNA
3.1.8.2. Präparation von poly(A)ä-RNA
3.1.9. Northern Blot Anlayse
3.1.9.1. RNA Agarose Gelelektrophorese
3.1.9.2. Kapillartransfer von RNA
3.1.9.3. Northern Blot Hybridisierung
3.1.10. Run-on-Analyse
3.1.11. Southern Blot Analyse
3.1.12. Radioaktive Markierung von DNA
3.1.13. Endmarkierung von DNA mit der T4-Polynucleotidkinase
3.1.14. Herstellung von antisense-RNA Sonden
3.1.15. Slot Blot Analyse
3.1.16. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.1.17. Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten
3.2. Proteinchemische Methoden
3.2.1. Subtraktive Proteinanalyse
3.2.1.1. Präparation der Protein-Proben
3.2.1.2. Zweidimensionale-Gelelektrophorese
3.2.1.3. Enzymatische Im-Gel-Spaltung
3.2.1.4. Reversed-Phase-HPLC und Edman Sequenzierung
3.2.1.5. MALDI-MS
3.2.2. Protein Identifizierung mittels Datenbankvergleich
3.2.3. Western Blot Analyse
3.2.4. Expression rekombinanter Proteine durch IPTG-Induktion
3.2.5. In vitro Spaltung durch rekombinante Caspase
3.2.6. In vitro Translation im TNT Retikulozyten Lysat
3.2.7. EMSA (elektro mobility shift assay)
3.2.8. Caspase 3 Aktivitätsmessung
3.3. Methoden der Zellkultur
3.3.1. Kulturbedingungen für die Burkitt Lymphom Zellinie
3.3.2. Subklonierung der BL60 Zellen
3.3.3. Induktion der B-Zell Apoptose mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten
3.3.4. Inkubation der BL60 Zellen mit Caspase-Inhibitoren
3.3.5. Zellmarkierung mit Annexin-V/FITC
3.3.6. Magnetische Zellseparation und Depletion
3.3.6.1. Magnetische Depletion
3.3.6.2. Magnetische Separation
3.3.7. Acridinorange Färbung
3.3.8. Proliferationsassay
3.3.9. FACS (fluorescence activated cell sorting)
3.3.10. Elektronenmikroskopie
4 Ergebnisse-Teil1
4.1. Etablierung eines B-Zell Modells zur Untersuchung der anti-IgM induzierten Apoptose
4.1.1. Subklonierung der Burkitt Lymphom Zellinie BL60
4.1.2. Morphologische Veränderungen während der Apoptose-Elektronenmikroskopische Charakterisierung
4.1.3. Magnetische Separation von apoptotischen und nicht apoptotischen BL60-2 Zellen
4.2. Identifkation Apoptose-assoziierter Proteine mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese
4.2.1. Etablierung des hochauflösenden 2D-Gelelektrophoresesystems
4.2.2. Identifikation differentieller Proteinspots nach anti-IgM induzierter Apoptose
4.3. D4-GDI als Protease-Substrat während der anti-IgM induzierten Apoptose
4.3.1. Zeitverlauf der D4-GDI Spaltung
4.3.2. Hemmung der D4-GDI Spaltung durch z-DEVD-fmk
4.4. Heterogene nukleäre Ribonucleoproteine während der anti-IgM induzierten Apoptose
4.4.1. Spaltung von hnRNP A1 während der anti-IgM induzierten Apoptose
4.4.2. Hemmung der hnRNP A1 Spaltung durch z-DEVD-fmk
4.4.3. In vitro Spaltung von hnRNP A1 durch Caspase 3
4.5. Hemmung der morphologischen und biochemischen Veränderungen während der anti-IgM induzierten Apoptose durch z-DEVD-fmk
4.6. Untersuchungen des Transkriptionsfaktors SP1 während der anti-IgM induzierten Apoptose der Burkitt Lymphom Zellinie BL60-2
4.6.1. Die Regulation der c-myc Transkription während der anti-IgM induzierten Apoptose
4.6.2. SP1 Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose
4.6.3. Hemmung der SP1 Spaltung durch z-DEVD-fmk
4.6.4. In vitro Spaltung von SP1 durch Proteasen der Caspase 3 Familie
4.6.5. Untersuchung der SP1/DNA-Bindungsaktivität während der Apoptose
4.6.6. Messung der Aktivität von Proteasen der Caspase 3 Familie während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
5 Ergebnisse-Teil 2
5.1. Identifikation Apoptose-assoziierter Gene
5.1.1. Herstellung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken
5.1.2. Herstellung einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank
5.1.3. Differentielle Hybridisierung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken
5.1.4. Hybridisierung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken mit einer subtrahierten Probe
5.1.5. Slot Blot Analyse
5.1.6. Run-on-Analyse
5.1.7. Subtraktive Klonierung mittels Hydroxyapatit-Chromatographie
6 Diskussion
6.1. Identifikation Apoptose-assoziierter Proteine
6.1.1. Die Rolle des D4-GDI Proteins während der anti-IgM induzierten Apoptose
6.1.2. Heterogene nukleäre Ribonucleoproteine während der anti-IgM induzierten Apoptose
6.2. Der Transkriptionsfaktor SP1 während der anti-IgM induzierten Apoptose
6.3. Die Rolle der Caspasen während der anti-IgM induzierten Apoptose
6.4. Methoden zur Identifikation Apoptose-assoziierter Gene
6.4.1. Vergleich proteinchemischer und molekularbiologischer Methoden
7 Zusammenfassung
Bibliographie Literatur
Anhang A Anhang
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Danksagung
Anhang B Publikationsliste

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Liste der identifizierten, Apoptose-assoziierten Proteine
Proteine der BL60-2 Zellen, die im subtraktiven Vergleich der 2D-Proteinmuster eine Veränderung in der Intensität oder Lage zeigten, wurden isoliert und identifiziert. 15 Proteine konnten nach Peptidsequenzierung und/oder massenspektrometrischen Analyse schon bekannten Proteinen der Datenbank zugeordnet werden. Die Veränderung der Spotintensität nach anti-IgM Stimulation der BL60-2 Zellen wird für jedes Protein, bzw. deren Fragment angegeben. (-) = abnehmende Spotintensität nach anti-IgM Stimulation; (+) = zunehmende Spotintensität nach anti-IgM Stimulation. Wurden nach dem tryptischen-Verdau Peptide über Edman-Abbau sequenziert, sind die Aminosäuresequenzen angegeben.
Tab. 2 Liste der identifizierten Sequenzen nach differentieller Hybridisierung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken Differentiell hybridisierende Sequenzen der lambda-Zap cDNA-Phagenplaques wurden in einer in vivo Exzision isoliert und sequenziert. Für jeden Klon ist die Bezeichnung des Klons, sowie die DNA Homologie angegeben (EST = Expressed sequence tag).
Tab. 3 Liste der sequenzierten Sequenzen nach Hydroxyapatit-Chromatographie Subtraktive Klone, die nach Hydroxyapatit-Chromatographie isoliert, kloniert und sequenziert wurden, sind aufgelistet. Für jeden Klon ist die Bezeichnung des Klons, die Länge der klonierten Sequenz, sowie die DNA oder Proteinhomologie angegeben.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Modell der Caspase-Aktivierung nach anti-FAS induzierter Apoptose
Die Trimerisierung des FAS Rezeptors durch den FAS Liganden oder anti-FAS Antikörper führt zur Bindung von FADD über die death domain des Rezeptors. Pro-FLICE bindet dann über die death effector domain an FADD. Dieser Rezeptor-Komplex wird als DISC bezeichnet und führt durch proteolytische Spaltung von Pro-FLICE zur aktiven Caspase FLICE. FLICE aktiviert weitere Caspasen, die wiederum zelluläre Substrate spalten.
Abb. 2 Modell der B-Zelldifferenzierung
Nach Proliferation und Differenzierung der Stammzellen, sowie Rearrangement der Immunglobulingene werden die schwere Kette mit einer vorläufigen Surrogat-Leicht-Kette (lambda-5, Vpre-B) in Assoziation mit den Igalpha und Igß-Ketten auf der Zelloberfläche der Pro-/Pre-B-Zelle exponiert. Nach erfolgtem Rearrangement der leichten Ketten exponiert die unreife B-Zelle das IgM auf der Zelloberfläche. Die reifen, IgM, IgD positiven B-Zellen können sich nach nach Antigenstimulation in Plasmazellen entwickeln, die kein membranständiges Immunglobulin mehr haben und Antikörper sezernieren, oder sie entwickeln sich nach Antigenstimulation in den Keimzentren zu Memory-B-Zellen.
Abb. 3 Herstellung einer lambda-Zap cDNA-Phagenbank
Die Gesamt-RNA von BL41-3s Zellen vor bzw. nach Apoptose Stimulation (4h anti-IgM) wurde präpariert. Die poly(A)+-RNA wurde isoliert und mit einem oligo(dT)-Linkeroligonukleotid als Primer in cDNA konvertiert. Die Enden der doppelsträngigen cDNA-Fragmente wurden aufgefüllt und an Linkerfragmente ligiert. Nach XhoI Spaltung wurde die cDNA gerichtet in lambda-Zap Vektor-Arme ligiert. Die lambda-DNA wurde in Phagen verpackt.
Abb. 4 Trennung der dscDNA nach Sephacryl-Säulenchromatographie
In die Zweitstrangsynthese der cDNA stimulierter BL41-3s Zellen (4), sowie unstimulierter Zellen (0) wurde alpha-32P-dATP eingebaut. Über Sephacryl-Säulen wurden doppelsträngige cDNAs der Größe nach fraktioniert und von nicht-ligierten Linker, sowie abgespaltenen Linkerfragmenten abgetrennt. Die einzelnen Fraktionen der Chromatographie (Fraktion 1-3) wurden eluiert und 1/10 V auf einem 5 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. Als Kontrolle (K) wurde eine RNA von 1,8 Kb Größe in die cDNA-Synthese eingesetzt. Die Detektion erfolgte durch Autoradiographie.
Abb. 5 Fluoreszenzaufnahme apoptotischer und nicht apoptotischer BL60-2 Zellen nach Acridinorangefärbung
Stimulierte, apoptotische BL60-2 Zellen (24 Stunden anti-IgM F(ab)2) und nicht stimulierte Zellen wurden mit Acridinorange angefärbt und im UV-Licht visualisiert. Apoptotische Zellen zeigen deutlich fragmentierte Kerne (rechts), während nicht apoptotische Zellen einen intakten Zellkern haben (links).
Abb. 6 Elektronenmikroskopische Aufnahme nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen vor Stimulation (links) und nach 8 Stunden (rechts) anti-IgM induzierter Apoptose. Die apoptotische Zelle ist geschrumpft, zeigt ein kondensiertes Chromatin, Fragmentierung des Kernes sowie lappige Zellmembranwände.
Abb. 7 Magnetische Trennung apoptotischer und nicht-apoptotischer BL60-2 Zellen
Apoptotische Zellen exponieren Phosphatidylserin (PS) auf der äußeren Zellmembran. Annexin-V bindet spezifisch an PS, so daß apoptotische Zellen durch die Bindung von Annexin-V/FITC markiert werden können. Die Bindung an anti-FITC magnetische beads ermöglichte die Trennung über magnetische Säulen. Apoptotische Zellen binden an die Säule, solange diese im Magnetfeld steht (A), während nicht apopotische Zellen sich im Durchlauf befinden. Die apoptotischen, PS positiven Zellen wurden durch Entnahme der Säulen aus dem Magneten eluiert (B).
Abb. 8 FACS-Analyse apoptotischer BL60-2 Zellen nach Annexin-V/FITC Färbung und magnetischer Separation und Depletion
BL60-2 Zellen wurden für 20 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert und mit dem Annexin-V/FITC Konjugat markiert. Apoptotische Zellen wurden nach Inkubation mit anti-FITC magnetischen beads über MACS-Säulen getrennt. Nicht apoptotische Zellen wurden von spontan apoptotischen Zellen depletiert. A) FACS-Analyse von anti-IgM stimulierten BL60-2 Zellen nach Annexin-V/FITC Färbung, vor der magnetischen Trennung. B) FACS-Analyse, nicht apoptotischer, PS negativer Zellen nach magnetischer Depletion. C) FACS-Analyse von apoptotischen, PS-positiven Zellen nach magnetischer Separation.
Abb. 9 2 D-Gele nicht apoptotischer- und apoptotischer-BL60-2 Zellen
Silbergefärbte 2-D Gelmuster von Gesamtzellextrakten nicht stimulierter und anti-IgM stimulierter BL60-2 Zellen nach Separation über MACS-Säulen. Die isoelektrische Trennung in der ersten Dimension erfolgte mit Trägerampholyten im Bereich von pH 2-4 (pI = isoelektrischer Punkt), in der zweiten Dimension auf einem 15 %-igen SDS-Polyacrylamidgel. Das Molekulargewicht und der pI wurden anhand von Referenzpots (A, B, C) kalibriert.
Abb. 10 Vergößerter Ausschnitt der Region um Spot D und D´
Spot D wurde nach Elution und Massenspektrometischer Analyse als D4-GDI Protein identifiziert. Der Spot D nahm nach anti-IgM Inkubation der BL60-2 Zellen deutlich an Intensität ab. Spot D´ konnte als Fragment des D4-GDI Proteins identifiziert werden. Die Intensität des Spots D´ nahm nach Apoptose Induktion stark zu.
Abb. 11 Zeitverlauf der D4-GDI Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellysate wurden, auf einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und mit einem Rho-GDI spezifischen polyklonalen-Antiserum (kreuzreaktiv mit D4-GDI) im Western Blot analysiert. Die Pfeile weisen auf das 28 KDa Rho-GDI, das 27 KDa D4-GDI (eine Bande), sowie das 23 KDa große Spaltprodukt des D4-GDI hin. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.
Abb. 12 Dosisabhängige Hemmung der D4-GDI Spaltung duch z-DEVD-fmk
BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk kultiviert (0-200 µM) und mit oder ohne anti-IgM ( 1,3 µgml) für 24 Stunden inkubiert. Gesamtzellysate wurden auf einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. Die Spaltung des D4-GDI Proteins wurde im Western Blot mit einem D4-GDI spezifischen polyklonalen-Antiserum analysiert. Die D4-GDI Spaltung wurde durch steigende Konzentrationen z-DEVD-fmk gehemmt. Die Pfeile weisen auf das 27 KDa D4-GDI, sowie das 23 KDa große Spaltprodukt. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.
Abb. 13 Zeitverlauf der hnRNP A1-Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellysate wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. Die Spaltung wurde nach Western Blot Analyse mit einem hnRNP A1 spezifischen, monoklonalen-Antikörper 4B10 detektiert. Die Pfeile deuten auf das 36 KDa hnRNP A1 Protein, bzw. die nach 8, 12 und 24 Stunden Apoptose-Induktion auftretenden Spaltprodukte mit einer Größe von 30 KDa, 19 KDa und 16 KDa. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.
Abb. 14 Hemmung der hnRNP A1 Spaltung durch z-DEVD-fmk
BL60-2 Zellen wurden mit z-DEVD-fmk vorinkubiert (200 µM) und mit oder ohne anti-IgM F(ab)2-Fragmenten für 24 Stunden kultiviert. Gesamtzellysate dieser Zellen wurden auf einem 15 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und in einem Western Blot mit einem monoklonalen hnRNP A1-Antikörper analysiert. Die hnRNPA1 Spaltung wurde durch z-DEVD-fmk blockiert, was durch kurze (A) und längere Exposition (B) des Autoradiographie Films analysiert wurde.
Abb. 15 In vitro Spaltung von hnRNP A1
Rekombinantes hnRNP A1-DHFR Fusionsprotein wurde mit rekombinanter, gereinigter Caspase 1 oder Caspase 3 (60 ng) für 1 Stunde mit oder ohne z-DEVD-fmk oder ac-YVAD-cmk inkubiert. Die Proben wurden auf einem 15 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und in einem Western Blot mit einem hnRNP A1 spezifischen, monoklonalen Antikörper 4B10 analysiert. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.
Abb. 16 Hemmung der anti-IgM induzierten Apoptose durch z-DEVD-fmk
BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk vorinkubiert, und 24 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten kultiviert (1,3 µg/ml). Der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen, mit charakteristischen fragmentierten Kernen, wurde durch Acridinorangefärbung bestimmt.
Abb. 17 Hemmung der Phosphatidylserintranslokation BL60-2 Zellen wurden über verschiedene Zeiträume (4 - 48 h) mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert und mit Annexin-V/FITC markiert. Der Anteil Annexin-V/FITC positiver Zellen, der dem prozentualen Anteil apoptotischer Zellen entspricht, steigt während der anti-IgM induzierten Apoptose auf über 50 % (B). Wurden die Zellen mit z-DEVD-fmk vorinkubiert (200 µM) nahm der Anteil apoptotischer Zellen während der anti-IgM Inkubation nicht zu (C). Zur Kontrolle wurden BL60-2 Zellen ohne anti-IgM und z-DEVD-fmk inkubiert. Der Anteil spontan apoptotischer Zellen lag zwischen 3 und 7 Prozent (A).
Abb. 18 Northern Blot Analyse der c-myc Expression während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen wurden ohne, bzw. für 2 oder 4 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. RNA dieser Zellen (10 µg Spur) wurde auf einem 1,2 %-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt und auf eine Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde mit einer spezifischen, 32P-markierten c-myc Sonde, bzw. GAPDH Sonde hybridisiert. Die c-myc spezifische mRNA konnte bereits 2 Stunden nach anti-IgM Stimulation nicht mehr detektiert werden. Die GAPDH mRNA blieb dagegen nach anti-IgM Stimulation konstant exprimiert.
Abb. 19 Zeitverlauf der SP1-Spaltung während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellextrakte wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. In einer Western Blot Analyse mit einem SP1-spezifischem polyklonalen Antikörper konnte die Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose detektiert werden. Die Pfeile deuten auf das 95/105 kDa SP1 Protein, sowie die 68 KDa und 45 KDa großen Spaltprodukte hin. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.
Abb. 20 Dosisabhängige Hemmung der SP1-Spaltung
BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk vorinkubiert (0-200 µM) und mit oder ohne anti-IgM F(ab)2-Fragmenten für 24 Stunden inkubiert. Die Hemmung der SP1 Spaltung wurde in einer Western Blot Analyse mit einem SP1 spezifischen polyklonalem-Antiserum detektiert. Die Pfeile weisen auf das 95/105 kDa Protein, sowie das 68 KDa und 45 KDa große Spaltprodukt. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.
Abb. 21 In vitro Spaltung von SP1
A) Rekombinantes SP1 Protein (2 fpu, Promega) wurde mit rekombinanter, gereinigter Caspase 1, 3, 6 oder 7 (60 ng) für 2 Stunden, mit oder ohne z-DEVD-fmk (Caspase 3 Inhibitor) inkubiert. Die Proben wurden auf einem 10 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und in einem Western Blot mit einem SP1-spezifischen polyklonalen-Antikörper analysiert. Die Detektion erfolgte mit dem ECL-System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper. B) In vitro Spaltung von 35S-markiertem proIL1ß in IL1ß durch rekombinante Caspase 1. ProIL1ß wurde in vitro translatiert und und mit 60 ng rekombinanter Caspase 1 mit oder ohne ac-YVAD-cmk für 90 Min inkubiert. Die Proben wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und nach Autoradiographie detektiert.
Abb. 22 SP1 Bindungs-Aktivität nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen wurden über verschiedene Zeiträume mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Die Kernextrakte dieser Zellen wurden mit 32P-markierten SP1-spezifischen Oligonukleotiden (Spur 1-9), mutierten 32P-markierten SP1 Oligonukleotiden (Spur 10-12) oder Oct-2 spezifischen Oligonukleotiden inkubiert (Spur 13-15). Drei spezifische SP1 Komplexe konnten detektiert werden, die in Intensität während der anti-IgM Inkubation abnahmen (Spur 1-3). Diese Intensitätsabnahme konnte im Supershift mit einem SP1-spezifischen Antikörper bestätigt werden (Spur 4-6). Die Spezifität des Supershifts wurde durch Peptid-Kompetiton überprüft (Spur 7-9). Ein kleinerer Komplex (SP1-Spaltprodukt) erschien nach 10 Stunden anti-IgM Inkubation und nahm an Intensität nach 24 Stunden stark zu. Die Bindung des konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Oct-2 an die spezifische Oligonukleotidsequenz wies auf gleiche Qualitäten der Kernextrakte zu verschiedenen Zeitpunkten der anti-IgM Stimulation hin (Spur 13-15).
Abb. 23 Anstieg der Caspase 3-Aktivität nach anti-IgM induzierter Apoptose
Die Caspase 3 Aktivität wurde durch die Spaltung des Substrates DEVD-pNA bestimmt. 106 BL60-2 Zellen wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten anti-IgM-Stimulation lysiert und mit DEVD-pNA inkubiert. Die Freisetzung des Chromophors pNA wurde bei einer optischen Dichte von 400 nm gemessen. Lysate, die zuvor mit z-DEVD-fmk inkubiert wurden, zeigten eine starke Reduktion der Caspase 3-Aktivität (Pfeil).
Abb. 24 Herstellung einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank
Aus stimulierten (4h anti-IgM F(ab)2) und nicht stimulierten BL60-2 Zellen wurde die poly(A)+-RNA isoliert. Die RNA der nicht stimulierten Zellen wurde photobiotinyliert und mit der cDNA induzierter Zellen hybridisiert. Nicht hybridisierte cDNA wurde durch Phenol/Chloroform (P/C) Extraktion isoliert und in doppelstängige-cDNA konvertiert. Die Enden wurden aufgefüllt und mit spezifischen EcoRI-Linkern ligiert. Diese Fragmente wurden in einer PCR amplifiziert, EcoRI gespalten, in lambda-Zap-DNA kloniert und in Phagen verpackt.
Abb. 25 Schematische Darstellung der differentiellen Hybridisierung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken
lambda-Zap cDNA-Phagenbanken, hergestellt von nicht stimulierten, und Apoptose induzierten BL41-3s Zellen (4 h anti-IgM F(ab)2) wurden ausplattiert und die Phagenplaques auf je 2 Nylonmembranen transferiert. Je eine Membran wurde mit einer 32P-markierten cDNA-Probe von nicht stimulierten BL41-3s Zellen, und mit einer 32P-markierten cDNA-Probe von stimulierten BL41-3s Zellen hybridisiert. Differentiell hybridisierende Plaques wurden gepickt, erneut ausplattiert und hybridisiert. Klonierte Sequenzen wurden nach in vivo excision sequenziert.
Abb. 26 Southern Blot Analyse der subtrahierten Probe mit einer ß-Aktin Sonde
Die DNA von BL60-2 Zellen vor und nach Subtraktion Apoptose-spezifischer Sequenzen (PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit von Clontech), sowie einer Kontrolle wurden auf einem 2 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf eine Nylonmembran wurden die Blots mit einer 32P-markierten ß-Aktin Sonde hybridisiert. Die deutliche Abnahme der ß-Aktin Signale zeigt die erfolgreiche Subtraktion.
Abb. 27 Slot Blot Analyse gepickter Klone mit 32P-markierten cDNA-Sonden
DNA verschiedener Klone wurde auf eine Nylonmembran transferiert und UV-fixiert. Die Membranen wurden halbiert und mit einer radioaktiv markierten cDNA nicht stimulierter BL60-2 Zellen bzw. einer subtrahierten Probe hybridisiert.
Abb. 28 Run-on-Analyse von BL60-2 Zellen vor und nach anti-IgM induzierter Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für 4 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten (+) bzw. ohne (-) kultiviert. Die Kerne dieser Zellen wurden präpariert und die neu synthetisierte mRNA durch Zugabe von alpha32P-UTP radioaktiv markiert. DNA verschiedener Klone wurde in einer Slot Blot Apparatur auf eine Nylonmembran transferiert und mit der radioaktiv-markierten RNA von stimulierten (+), bzw. nicht stimulierten (-) BL60-2 Zellen hybridisiert. Die spezifischen Signale wurden mittels Autoradiographie detektiert.
Abb. 29 Slot Blot Analyse der 32P-markierten Probe nach Hydroxyapatit Anreicherung
DNA verschiedener Klone wurde mit einer Slot Bot-Apparatur auf eine Nylonmembran transferiert und UV-fixiert. Die Membranen wurden halbiert und mit je einer radioaktiv markierten cDNA nicht stimulierter BL60-2 Zellen und radioaktiv markierten subtrahierten DNA-Sonde (oder von stimulierten Zellen) hybridisiert. Apoptose-spezifische Sequenzen (Nak-1, bax-alpha, bak) sind in der subtrahierten Probe angereichert.
Abb. 30 Analyse der gewebsspezifischen Expression des Klons B54
Multiple tissue Northern Blots, die je 2 µg elektrophoretisch getrennter poly(A)+-RNA verschiedener Gewebe enthalten (Clontech). Diese Membranen wurden mit einer radioaktiv markierten DNA des identifizierten Klons B54 hybridisiert. Der Pfeil zeigt die B54-spezifischen Signale nach Autoradiographie.
Abb. 31 Modell der molekularen-Prozesse während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
Die Vernetzung der membranständigen Immunglobuline M durch anti-IgM F(ab)2-Fragmente führt zur Apoptoseinduktion über die IgM assoziierten Moleküle Igalpha und Igß. Dies hat die Aktivierung der Apoptose-spezifischen Caspase 3 durch proteolytische Spaltung der proCaspase 3 zur Folge. Die aktive Caspase 3 spaltet verschiedene Substrate eventuell über die Aktivierung weiterer Proteasen der Caspase 3 Familie. HnRNP A1, hnRNP C1/C2, ß-Aktin, D4-GDI, Lamine, sowie SP1 werden nach anti-IgM Induktion der BL60-2 Zellen gespalten. Die hnRNP K Proteinmenge nimmt nach anti-IgM induzierter Apoptose stark ab. HnRNP K und SP1 sind somit eventuell für die transkriptionelle Regulation von Genen während der Apoptose verantwortlich. Die Aktivierung der Caspasen hat ebenfalls die Translokation von Phosphatiydylserin auf die Zelloberfläche zur Folge.

[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [Bibliographie] [Anhang] [Abkürzungsverzeichnis] [Selbständigkeitserklärung] [Lebenslauf] [Danksagung] [Anhang]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Nov 26 14:02:57 1999