Rickers, Anke: Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

Kapitel 1. Einleitung

1.1. Apoptose: Ein Programm zellulärer Selbstzerstörung

Während der Entwicklung, Differenzierung und Homöostase von Geweben und Organismen unterliegen Zellen ständig dem Einfluß verschiedener äußerer und innerer Faktoren, die für die Erhaltung des Gleichgewichtes zwischen Proliferation und Apoptose verantwortlich sind (1). Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, ist ein aktiver biochemischer Prozeß, der nach einem genetisch festgelegten Programm abläuft und schließlich zum Tod der Zelle führt. Fast jede Zelle eines vielzelligen Organismus kann durch Apoptose sterben, wobei je nach Zelltyp, Differenzierungszustand der Zelle, sowie zellulärem Kontext unterschiedliche Signale Apoptose auslösen können (2).

Apoptose kann über Signale wie z.B. Röntgenstrahlen, Glucocorticoide und einige Zytostatika, die direkt im Zytoplasma wirken, oder über den Entzug von Wachstumsfaktoren ausgelöst werden (3). Bei epithelialen Zellen kann der Verlust der Zelladhäsion zur Apoptose führen (4). Ebenso können Signale, die durch membranständige Rezeptoren vermittelt werden, wie z.B. Apo1/FAS, CD3, TNF bei T-Zellen oder IgM bei B-Zellen Apoptose induzieren (5).

Während der Differenzierung des Immunsystems ist Apoptose ein entscheidender Mechanismus zur Eliminierung nicht-funktioneller bzw. autoreaktiver Lymphozyten. Unreife T- und B-Zellen, die keinen funktionellen T- bzw. B-Zell-Antigenrezeptor exprimieren sterben durch Apoptose. In einer zweiten Selektionsrunde werden unreife B-Zellen, die mit körpereigenen Antigenen reagieren, ebenfalls durch Apoptose eliminiert. In diesem Differenzierungsschritt “erlernt“ das Immunsystem die Toleranz gegenüber Autoantigenen. Diese Form der Apoptose wird als negative Selektion oder Aktivierungs-induzierter-Zelltod bezeichnet, da hier ein über den Antigenrezeptor vermitteltes Signal den programmierten Zelltod auslöst (6).

Viele Viren blockieren den Prozeß der Apoptose, der von den befallenen Zellen selbst oder durch das Immunsystem eingeleitet wird, durch die Expression von anti-apoptotischen Proteinen (7).

Apoptose ist durch morphologische Kriterien gekennzeichnet und kann so deutlich von der Nekrose unterschieden werden. Wichtige morphologische Kennzeichen sind: Chromatin-Kondensation, Kern- und DNA- Fragmentierung, charakterisiert durch das Auftreten der DNA-Leiter, “membrane-blebbing“ und Änderungen der Membransymmetrie, Umstrukturierung des Cytoskeletts und Zellschrumpfung (2).

Im Körper werden apoptotische Zellen aufgrund von Membranänderungen schnell erkannt und phagozytiert, wodurch die Freisetzung zytoplasmatischer Bestandteile und damit Entzündungsreaktionen verhindert werden (8).

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Molekülen identifiziert, die an der Regulation des programmierten Zelltodes beteiligt sind. Dabei handelt es sich vor allem um pro- und anti- apoptotische Proteine der bcl-2 Familie, der immer größer werdenden Familie der Caspasen,


2

Apoptose-spezifische Proteasen und deren Substrate, sowie mit diesen Proteinen assoziierte und interagierende Moleküle (9).

Eine Fehlregulation der Expression dieser Proteine kann Ursache verschiedener Erkrankungen sein. In follikulären B-Zell Lymphomen führt eine chromosomale Translokation zur Überexpression von bcl-2, einem anti-apoptotischen Protein (10). Beim Mammakarzinom wird bax-alpha, ein pro-apoptotisches Protein nicht exprimiert (11). Auch bei neurodegenerativen Erkrankungen, sowie HIV spielt die Fehlregulation der Apoptose eine wichtige Rolle (12). Interessanterweise sind Proteine der bcl-2 Familie, sowie der Caspasen evolutionär konserviert (Caenorhabditis elegans, Drosophila, Mensch). Damit bietet die Aufklärung der apoptotischen Prozesse Einblicke in das Verständnis allgemein gültiger molekularer Prinzipien der Apoptose, sowie Ansatzpunkte für mögliche Therapien von Krankheiten, deren Ursache auf die Fehlregulationen der Apoptose zurückzuführen sind (13).

1.2. Molekulare Regulatoren der Apoptose

Eine Schlüsselrolle bei der Identifizierung wichtiger Apoptoseregulatoren spielte der Nematode Caenorhabditis elegans. Genetische Studien führten zunächst zur Isolierung von drei Genen, deren Bedeutung für die Entwicklung des Wurms entscheidend ist. Die Aktivität der Gene ced-3 und ced-4 ist für den programmierten Zelltod von 131 somatischen Zellen im Verlaufe der Entwicklung des Nematoden verantwortlich (14). Ced-9 ist ced-3 und ced-4 übergeordnet und verhindert Apoptose, indem es die Aktivierung von ced-3 und ced-4 blockiert (15). Durch die Identifikation von bcl-2 als das humane Homologe von ced-9 wurde deutlich, daß es sich beim programmierten Zelltod um einen evolutionär konservierten Mechanismus handelt. Im humanen System zeichnet sich allerdings ein sehr viel komplexeres Bild ab. Es konnten mittlerweile ganze Genfamilien identifiziert werden, die den Prozeß der Apoptose steuern. Die wichtigsten regulatorischen Proteine der Apoptose und ihre Interaktionen werden in folgenden Kapiteln kurz vorgestellt (1.2.1-1.2.4).

1.2.1. Proteine der bcl-2 Familie

Bcl-2 wurde als erstes Mitglied einer Apoptose-regulierenden Genfamilie beim Menschen identifiziert. Bei follikulären B-Zell-Lymphomen wurde bcl-2 zuerst als Onkogen beschrieben. Hier führt eine chromosomale Translokation (t (14;18)) zu einer konstitutiven Überexpression von bcl-2, und die anti-apoptotische Wirkung führt zur Bildung von Lymphomen (10, 16). Darüber hinaus wurde von Vaux et al. beschrieben, das bcl-2 eine regulierende Rolle im programmierten Zelltod spielt (17). Die Transfektion und Expression von bcl-2 in IL3 abhängigen T-Zellen unterdrückt die Apoptose in Abwesenheit von IL3.


3

Dieses Ergebnis wurde in anderen Zellen bestätigt und bewies die anti-apoptotische Wirkung von bcl-2. Bcl-2 Transfektanten werden Zytostatika resistent (18). In einer kürzlich erschienenen Publikation konnte gezeigt werden, das eine bcl-2-antisense-Therapie humane Melanome in SCID Mäusen gegenüber Chemotherapie sensitiviert (19).

Weitere Mitglieder der bcl-2 Familie bzw. verwandte Proteine wurden durch Sequenzhomologien oder aufgrund ihrer Wechselwirkung mit dem bcl-2 Protein identifiziert (20). Dabei können die Mitglieder der bcl-2 Familie funktionell in zwei Gruppen unterteilt werden: in Antagonisten der Apoptose (bcl-2, bcl-xL, mcl-1, A1) und in Agonisten der Apoptose (bax, bak, bcl-xS, bad, bok). Die Proteine der bcl-2 Familie sind durch die konservierten Regionen BH1-4 (bcl-2 homology region) charakterisiert, die für die biologische Aktivität, sowie die Dimerisierung und Heterodimerisierung wichtig sind (20-22).

Am Besten charakterisiert sind die Proteine bcl-x und bax. Bcl-x kann in zwei Splicevarianten nachgewiesen werden, wobei die lange Splicevariante bcl-xL Zellen vor Wachstumsfaktorentzug induzierter Apoptose schützt. Die kurze Splicevariante bcl-xS kann hingegen die bcl-2 Wirkung antagonisieren und somit proapoptotisch wirken. Bcl-xS wird vor allem in Geweben mit hohem “Zell-Turnover“ exprimiert, bcl-xL dagegen hauptsächlich in langlebigen, postmitotischen Zellen (23). Die dreidimensionale Struktur von bcl-xL gab Aufschluß über mögliche funktionelle Domänen des Proteins. Es besteht aus zwei zentralen, hydrophoben alpha-Helices, die von amphiphatischen Helices umgeben sind. Ein 60 Aminosäure großer loop verbindet Helix alpha 1 und alpha 2. Die drei BH1-3 Domänen liegen eng beieinander und bilden eine hydrophobe Spalte, die evtl. für die Dimerisierung mit anderen Proteinen der bcl-2 Familie notwendig ist (24).

Bax kann ebenfalls in unterschiedlichen Splicevarianten vorkommen. Bax-alpha verstärkt die durch Wachstumsfaktor-Depletion induzierte Apoptose und kann die bcl-2 Wirkung wahrscheinlich über die Ausbildung von Heterodimeren (bcl-2/bax) antagonisieren (21, 25). Eine Heterodimerbildung wurde auch für bcl-xL und bax beschrieben. Allerdings konnte gezeigt werden, daß für den antiapoptotischen Effekt von bcl-xL eine Dimerbildung mit bax nicht notwendig ist (26). Neuere Daten aus transgenen Tiermodellen zeigen, daß bax-alpha und bcl-2 unabhängig voneinander anti- bzw.- proapoptotisch wirken können (27). So kann in bcl-2-knock-out-Mäusen eine Genkopie von bax-alpha Apoptose fördern. Ebenso kann in bax-knock-out-Mäusen die Überexpression von bcl-2 Apoptose blockieren (28). In vivo wird bax-alpha vor allem in Geweben exprimiert, in denen vermehrt Apoptose stattfinden kann, wie z.B. im Keimzentrum von Lymphfollikeln. In einer kürzlich erschienenen Publikation konnte anhand von Deletionsmutanten im yeast two-hybrid System gezeigt werden, das die antiapoptotische Domäne und die für die Interaktion mit anderen Molekülen der bcl-2 Familie wichtige Region in der BH3 Domäne des bax Proteins liegt (29).

Entfernter verwandte Proteine (Blk, Bld, Bim, Bad) besitzen nur die BH3 Domäne. Mutagenese Studien an Bld und Bad zeigen, daß diese BH3 Domäne für die Bindung an bcl-2 und bcl-xL sowie die proapoptotische Funktion notwendig ist (30).


4

1.2.2. Regulation und mögliche Funktionsweisen der Proteine der bcl-2 Genfamilie

Die Regulation und die Funktion der verschiedenen Proteine der bcl-2-Familie ist noch weitgehend ungeklärt und wird kontrovers diskutiert. Aus der Stukturaufklärung des bcl-xL Proteins und seiner Homologie zu anderen Proteinen ergaben sich allerdings Hinweise auf mögliche Regulationsmechanismen und Funktionen (24).

Ein wichtiger Regulationsmechanismus scheint die bereits erwähnte Bildung von Homo- und Heterodimeren zu sein. In ersten Modellen ging man davon aus, das bcl-2 und bax sowohl heterodimerisieren, als auch homodimerisieren können und das Verhältnis von bcl-2 und bax Molekülen über das Schicksal der Zelle entscheidet. Mittlerweile zeichnet sich ein viel komplexeres Bild ab (31). Im folgenden Abschnitt werden die wichtigsten Befunde dargelegt.

Die Dimerisierung von bcl-2 mit sich selbst scheint für die anti-apoptotische Funktion des Proteins essentiell zu sein. Bcl-2 Mutanten, die nicht dimerisieren können, verlieren ihre anti-apoptosiche Wirkung. Andere bcl-2 Familien Mitglieder können nur beschränkt heterodimerisieren. Bak z.B. bindet bcl-xL, nicht aber bcl-2, bcl-xS oder bax. Bad hingegen kann nicht homodimerisieren (22, 32, 33).

Andere bcl-2 verwandte Proteine werden gewebsspezifisch exprimiert, wie z.B. das Protein bok, das nur im reproduktiven Gewebe nachgewiesen wurde (34). Die meisten Mitglieder der bcl-2 Familie, werden allerdings ubiquitär exprimiert (35).

Mittlerweile sind mindestens elf weitere Proteine verschiedener Funktion identifiziert worden, die Proteine der bcl-2 Familie binden. Die Proteinkinase Raf1 bindet an die BH4 Domäne von bcl-2 und wird dann an die Mitochondrienmembran transportiert (36). Bag-1 ist mit dem HGF- (hepatocyte growth factor) Rezeptor assoziiert und ist somit vielleicht ein Adaptor-Molekül zwischen dem Tyrosin Kinase Rezeptor und der anti-apoptotischen Maschinerie (37).

Ein weiterer Regulationsmechanismus ist wahrscheinlich die posttranslationelle Phosphorylierung der loop Region von bcl-xL und bcl-2. Die Bedeutung dieser Modifikation wird kontrovers diskutiert und einige Publikationen deuten auf eine Inaktivierung von bcl-2 durch die Phosphorylierung dieser Region hin. Es konnte allerdings gezeigt werden, daß Deletionen der loop Struktur die anti-apoptotische Funktion von bcl-xL und bcl-2 unterdrücken (38). Die loop Region wird wiederum zumindest in vitro durch Caspase 3, eine Apoptose-spezifische Protease, gespalten, wodurch ein proapopotisches Fragment entsteht. Dieses Ergebnis wurde auch durch die Expression des verkürzten Proteins, der ?N34-bcl-2 Mutante bestätigt, die vermehrt zur Apoptose führt (39, 40).

Es gibt Hinweise dafür, daß bcl-2 als Anti-Oxidans wirken kann, die entsprechenden Befunde sind aber umstritten.

Die Aufklärung der Kristallstruktur von bcl-xL zeigte strukturelle Homologien zu den Colicinen, bakteriellen Proteinen, die in der Lage sind, Poren auszubilden. In Experimenten


5

mit rekombinanten Proteinen der bcl-2-Genfamilie und künstlichen Lipidmembranen konnten elektrophysiologisch Ionenströme gemessen werden, worauf für bcl-2 eine Funktion als Ionenkanal postuliert wurde (41). Unklar ist zur Zeit, ob diese Kanäle mit der Freisetzung mitochondrialer Proteine bei der Apoptose in Zusammenhang stehen, da bcl-2 und bcl-xL unter anderem in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert sind (42).

Proteine der bcl-2 Familie interagieren über verschiedene Cofaktoren mit den Caspasen. Hier scheint ebenfalls ein wichtiger Mechanismus der Apoptose Regulation vorzuliegen. Er wird unter 1.2.4 erläutert.

1.2.3. Caspasen und Caspasen-Substrate

Die Klonierung des ced-3-Gens aus Caenorhabditis elegans zeigte eine Homologie zu dem humanen Protein ICE (interleukin I converting enzyme) auf, einer Cysteinprotease, die aus dem Vorläuferprotein pro-IL-1ß das biologisch aktive IL-1ß freisetzt. Damit war das erste Mitglied einer ständig wachsenden Familie von Proteasen definiert, die als Effektoren bei dem Prozeß der Apoptose wirken. Diese Klasse von Proteasen wird als Caspasen (cysteine aspartate-specific proteases) bezeichnet, da sie ein konserviertes Cystein enthalten und nach Aspartat in der Position P1 spalten (43). Sie werden als ca. 35 KDa große Proenzyme synthetisiert und sind in der aktiven Konformation heterotetramere Proteine aus zwei ca. 10 KDa und zwei ca. 20 KDa großen Untereinheiten (44). Neben der autokatalytischen Aktivierung scheinen die Proteasen sich zum Teil auch gegenseitig zu aktivieren. Inzwischen wurden mindestens 11 Mitglieder dieser Familie kloniert. Eine phylogenetische Analyse erlaubt eine Gruppierung in zwei Untergruppen. Dabei scheint die ICE-Untergruppe (Caspase-1, -4 und -5) überwiegend bei Entzündungsreaktionen eine Rolle zu spielen. Die ced-3 Untergruppe (Caspase-2, -3, -6, -7 ,-9 und -10) ist für den Prozeß der Apoptose wichtig, was durch folgende Befunde belegt wird:

In ist ced-3, das die höchste Homologie zu der humanen Caspase 3 besitzt, für die Entwicklung des Nematoden notwendig (14). Caspase 3 knock-out-Mäuse zeigen schwere Defekte in der Hirnentwicklung, ein Prozeß bei dem extensiv Apoptose stattfindet (45). Viren hingegen haben Mechanisman entwickelt, um die von ihnen befallenen Zellen vor Apoptose zu schützen. Die dafür verantwortlichen viralen Proteine (z.B. CrmA, p35, IAPs) interagieren dabei spezifisch mit den Caspasen und blockieren sie (46).

Caspasen stellen somit eine neue Klasse von Proteasen dar, die während der Apoptose aktiviert werden und spezifisch spalten. Sie stellen damit wichtige Proteine in dem Signaltransduktionsweg der Apoptose dar. Neben den Caspasen selbst konnten in den letzten Jahren einige spezifische Substrate der Caspasen identifiziert werden, wie z.B. das 70 KDa U1 Ribonukleoprotein, Lamine, Proteinkinase-C?Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase, verschiedene Komponenten des Cytoskeletts, die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PK), pRB Tumorsuppressor und das Onkoprotein MDM2 (47-51). Welche Bedeutung die Spaltung dieser Proteine im Prozeß der Apoptose hat


6

ist bisher weitgehend ungeklärt. Die Spaltung verschiedener Strukturproteine wie ß-Aktin ist eventuell für die Umstrukturierung des Cytoskeletts wichtig (52). Die Spaltung des ICAD Proteins (), das aus Mauszellen isoliert wurde, hat die Freisetzung der Endonuclease CAD zur Folge, die wiederum für die charakteristische DNA Fragmentierung während der Apoptose verantwortlich ist. Aus dem Cytosol von HeLa Zellen wurde nun ein Faktor (DFF genannt) isoliert, der das humane Homologe zu ICAD darstellt (53-55). Die Aktivität der Caspasen scheint somit wichtig zu sein, um die notwendigen Apoptose-Effektoren einer Zelle zu aktivieren. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die Transfektion der Caspase 3 alleine nicht ausreicht, um Apoptose zu induzieren. Die zelltypspezifische Aktivierung verschiedener Caspasen und deren Substrate stellen aber noch weitgehend ungeklärte Signaltransduktionsnetzwerke der Apoptose dar. Die Regulation der Caspasenaktivität unterliegen einer genauen Kontrolle. Die Aktivierungskaskade der Caspasen ist bisher am besten in der Apo1/FAS induzierten T-Zell Apoptose untersucht und wird unter 1.3.1 dargestellt. Publikationen des letzten Jahres konnten eine Verbindung zwischen den Caspasen und den Mitgliedern der bcl-2 Genfamilie aufzeigen (1.2.4).

1.2.4. Interaktion der Proteine der bcl-2 Genfamilie mit den Caspasen

Die biochemische Aufreinigung Apoptose-induzierender Faktoren aus dem Cytosol apoptotischer HeLa Zellen führte im letzten Jahr zur Identifikation der Proteine Apaf-1, Apaf-2 und Apaf-3 (). Apaf 3 konnte als Caspase-9 identifiziert werden und ist damit zu ced-3 homolog. Apaf-1 ist das lange gesuchte humane Homologe zu Ced-4 während Apaf-2 das Protein Cytochrom c ist.

Es konnte gezeigt werden, daß Ced-4 sowohl mit Ced-9 (homolog zu bcl-2) als auch mit Ced-3 (homolog zu Caspase 3) assoziieren kann und einen “Apoptosom“ genannten Komplex bildet. Die Expression von Ced-4 in humanen Zellen konnte ebenso eine Assoziation mit bcl-2 und Caspase-9, d.h. einen trimolekularen Komplex herstellen. Interessanterweise kann bax-alpha diese Assoziation blockieren. Ced-4 und das humane Homologe Apaf-1 spielen somit eine zentrale Rolle im Signaltransduktionsweg der Apoptose, indem sie die Proteine der bcl-2 Familie und die Caspasen biochemisch verbinden (56, 57).

Cytochrom c scheint in humanen Zellen ein wichtiger Cofaktor für die Aktivierung der Caspase 9 zu sein. Bisher wurde angenommen, daß Cytochrom c über PT-Poren (permeability transition-Poren) aus den Mitochondrien freigesetzt wird (58-60). Neueste Ergebnisse zeigen, daß die Cytochrom c Freisetzung unabhängig von der mitochondrialen Depolarisation und zu einem früheren Zeitpunkt stattfindet (61). Ungeklärt bleibt, warum in Zellen, die bcl-2 oder bcl-xL überexprimieren, und keine Anzeichen von Apoptose zeigen, die Cytochrom c Freisetzung blockiert ist. Das die antiapoptotische Wirkung von bcl-2 nicht alleine auf die Blockade der Cytochrom c Freisetzung zurückzuführen ist, zeigte die Injektion


7

von Cytochrom c in bcl-2 überexprimierenden Transfektanten. Diese Transfektanten sind gegenüber nicht transfizierten Zellen nach Cytochrom c Injektion vermindert Apoptose sensitiv. Außerdem ist bcl-2 nicht nur in der Mitochondrienmembran, sondern auch im Endoplasmatischen Retikulum und der Kernmembran lokalisiert (62, 63). In einem zellfreien System kann Cytochrom c Apoptose-spezifische Veränderungen über die Aktivierung der Caspase 9 induzieren, die dann Caspase 3 aktiviert. Dieser Prozeß ist ebenfalls dATP abhängig (58). In einer kürzlich erschienenen Publikation konnte hingegen in vitro gezeigt werden, daß die Caspase 9 Aktivierung auch unabhängig von Cytochrom c abläuft. Apaf-1 induziert die Oligomerisierung der Procaspase-9, was die autokatalytische Spaltung und Aktivierung der Caspase 9 zur Folge hat. Ebenso konnte gezeigt werden, das C-terminale Deletionsmutanten von Apaf-1 konstitutiv aktiv sind und Procaspase 9 unabhängig von Cytochrom c und dATP prozessieren und aktivieren können (64).

1.3. Apoptose im Immunsystem

Der progammierte Zelltod stellt einen wichtigen Mechanismus während der Differenzierung des Immunsystems dar. Dabei spielt die Eliminierung von Immunzellen in verschiedenen Stadien der Reifung von T und B-Zellen eine wichtige Rolle (65).

Apoptose kann über Signale verschiedener Oberflächenmoleküle ausgelöst werden. In bestimmten Stadien der Entwicklung sind aber ebenso verschiedene Signale notwendig, um das Überleben der Zellen zu sichern und Apoptose zu unterdrücken. IL2 oder IL3 Mangel z.B. kann zur Apoptose von reifen T-Zellen führen. Unreife Thymocyten, die über ihren CD3/T-Zell-Rezeptor Komplex stimuliert werden, sterben durch Apoptose (negative Selektion). Ebenso werden Thymocyten, die Rezeptoren besitzen, die keine “Eigen“-MHC-Moleküle erkennen, eliminiert (positive Selektion). Ein direkt mit der Apoptose-assoziiertes Antigen bei T-Zellen ist der Apo1/FAS Rezeptor, der zur Familie der TNF-Rezeptoren gehört (66).

Ein dem T-Zell Modell analoges Prinzip der negativen Selektion führt zur Eliminierung autoreaktiver B-Zellen. Autoreaktive, unreife B-Zellen durchlaufen den Prozeß des receptor editing, wobei für den Rezeptor kodierende Genloci neu rearrangiert werden und die Zellen eine neue Spezifität erhalten, oder sie sterben durch Apoptose, wodurch ebenfalls Selbsttoleranz erreicht wird. Die Rezeptor-induzierte Apoptose führt somit zur Ausbildung eines spezifischen B- und T-Zell Repertoirs (67-69).

Apoptose kann somit über verschiedene Stimuli ausgelöst werden, wobei die Signaltransduktion in die Zelle noch weitgehend ungeklärt ist. Die molekularen Mechanismen der Apoptose sind am besten in der Apo1/FAS induzierten T-Zell Apoptose untersucht worden. Die Signalkaskade wird unter 1.3.1 kurz dargestellt.


8

1.3.1. Apo1/FAS induzierte T-Zell Apoptose

Mit der Identifikation des Apo1/Fas Rezeptors und seines Liganden wurden wichtige Mediatoren der Apoptose identifiziert. Die Bedeutung des FAS/FAS-L Systems wurde zunächst in lpr Mäusen klar. Diese Mäuse besitzen einen Gendefekt im FAS Rezeptor und leiden unter lymphoproliferativer und systemischer Autoimmunität. Mäuse, die einen Gendefekt im Fas Liganden haben (gld-Mäuse), leiden ebenfalls unter Lymphoadenopathie und Autoimmunität (70, 71). Der gegen den Apo1/FAS-Rezeptor gerichtete monoklonale Antikörper anti-Apo1/FAS oder der Apo1/FAS-Ligand führt zur Induktion von Apoptose bei einer Reihe von unterschiedlichen Zellen

Der Apo1/FAS-Rezeptor gehört zur Familie der TNF/NGF-Rezeptoren, die gekennzeichnet sind durch cysteinreiche, extrazelluläre Domänen sowie eine cytoplasmatische death domain. (72). In den letzten Jahren konnten Rezeptor-assoziierte Proteine identifiziert werden, die an der Signalweiterleitung in der Zelle beteiligt sind. Am Beispiel des Apo1/FAS-Rezeptors soll hier kurz die Aktivierungskaskade verschiedener Caspasen dargelegt werden. Eine ähnliche Reaktionskette konnte auch für den TNF-Rezeptor aufgeklärt werden.

Nach Trimerisierung des Apo1/FAS-Rezeptors durch den FAS-Liganden oder anti-FAS-Antikörper kommt es zur Assoziation des Adaptorproteins FADD (FAS associated death domain an den Rezeptor. Die Wechselwirkung kommt durch die in beiden Proteinen vorhandene death domain) zustande. An FADD bindet dann pro-FLICE (FADD like-ICE), über die death effector domain, die sowohl in pro-FLICE als auch in FADD enthalten ist (73, 74). Nach Assoziation dieses DISC genannten Komplexes wird aus pro-FLICE die aktive Caspase FLICE (Caspase-8) durch proteolytische Spaltung freigesetzt. Diese wiederum kann weitere Caspasen, wie Caspase 3 aktivieren und so die proteolytischen Spaltungen, die zum Zelltod führen, auslösen (Abb. 1).

Neben den bereits erwähnten viralen Proteinen, die die Apo1/FAS-vermittelte Apoptose blockieren können, wurden inzwischen auch inhibitorische (dominant negative) Proteine aus Säugern kloniert. Die Proteine I-FLICE/FLAME können wie FLICE an FADD oder ähnliche Adaptormoleküle binden, sind aber im Gegensatz zu FLICE katalytisch inaktiv. Dies bedeutet, daß ihre Bindung an den aktivierten Apo1/FAS-Rezeptor die Signalweiterleitung terminiert, da keine aktive Caspase generiert werden kann (75, 76).


9

Abb. 1 Modell der Caspase-Aktivierung nach anti-FAS induzierter Apoptose
Die Trimerisierung des FAS Rezeptors durch den FAS Liganden oder anti-FAS Antikörper führt zur Bindung von FADD über die death domain des Rezeptors. Pro-FLICE bindet dann über die death effector domain an FADD. Dieser Rezeptor-Komplex wird als DISC bezeichnet und führt durch proteolytische Spaltung von Pro-FLICE zur aktiven Caspase FLICE. FLICE aktiviert weitere Caspasen, die wiederum zelluläre Substrate spalten.

1.3.2. B-Zelldifferenzierung und anti-IgM induzierte Apoptose

Die B-Zelldifferenzierung führt von der naiven Stammzelle zur reifen B-Zelle und schließlich zur Antikörper sezernierenden Plasmazelle oder zur Memory Zelle. Die einzelnen Differenzierungsschritte sind durch die aufeinanderfolgende Expression verschiedener Gene, Genrearrangements der Immunglobulinloci, der kontrollierten Expression der Recombinase-aktivierenden Gene (RAG1/RAG-2), sowie der Terminalen Transferase während der V-D-J Rearrangements gekennzeichnet (77). Die einzelnen Stadien der Reifung finden in verschiedenen Kompartimenten des Immunsystems statt und sind durch die Expression unterschiedlicher Oberfächenmoleküle charakterisiert (Abb. 2) .

Bei der B-Zelldifferenzierung spielen Signale, die über den B-Zellrezeptor vermittelt werden eine entscheidende Rolle. Während der B-Zellentwicklung wird zunächst ein vorläufiger Rezeptor-Komplex exprimiert, der nach erfolgreichem Rearrangement der Gene, aus der schweren Kette des Immunglobulins besteht und in Assoziation mit einer Surrogat-Leicht-Kette (lambda-5, VpreB) auf der Oberfläche der Pro-/Pre-B-Zellen exponiert wird (69). Mit


10

diesem Oberflächen-Immunglobulin ist nichtkovalent ein signaltransduzierender Molekülkomplex assoziiert. Zu diesem Komplex gehören die Proteine Ig-alpha und Ig-ß. Die erfolgreiche Expression dieses Pre-B-Zellrezeptor Komplexes führt über noch nicht verstandene Signaltransduktionsketten zum Rearrangement der leichten Ketten-Gene und damit zur Expression des reifen B-Zellrezeptors, der sich aus dem funktionellen Immunglobulin (IgM, IgD) und den beiden Ig-alpha und Ig-ß Ketten zusammensetzt. Jede B-Zelle generiert eine schwere und eine leichte Kette, so daß jede reife Zelle nur Rezeptoren mit einzigartiger Spezifität exprimiert (allelic exclusion). Unreife B-Zellen exponieren zunächst nur IgM auf der Zelloberfläche, während reife B-Zellen IgM und IgD positiv sind. Nach der Reifung im Knochenmark wandern die B-Zellen zu den peripheren lymphoiden Organen. Antigenstimulation sowie Stimulation durch T-Helfer Zellen führt zur Bildung von Keimzentren, in der die B-Zellen proliferieren und zu Memory-B-Zellen oder Antikörper sezernierenden Plasmazellen differenzieren. Durch somatische Hypermutation wird eine weitere Diversifikation des sekundären Antikörper Repertoirs erreicht (69, 78).

Abb. 2 Modell der B-Zelldifferenzierung
Nach Proliferation und Differenzierung der Stammzellen, sowie Rearrangement der Immunglobulingene werden die schwere Kette mit einer vorläufigen Surrogat-Leicht-Kette (lambda-5, Vpre-B) in Assoziation mit den Igalpha und Igß-Ketten auf der Zelloberfläche der Pro-/Pre-B-Zelle exponiert. Nach erfolgtem Rearrangement der leichten Ketten exponiert die unreife B-Zelle das IgM auf der Zelloberfläche. Die reifen, IgM, IgD positiven B-Zellen können sich nach nach Antigenstimulation in Plasmazellen entwickeln, die kein membranständiges Immunglobulin mehr haben und Antikörper sezernieren, oder sie entwickeln sich nach Antigenstimulation in den Keimzentren zu Memory-B-Zellen.


11

Die Selektion autoreaktiver Zellen findet auf verschiedenen Stufen der B-Zell Differenzierung statt. Alle Zellen, in denen nicht funktionelle Rearrangements der Gene stattgefunden haben, sterben durch Apoptose. Ebenso werden unreife B-Zellen, die “Eigen“-Antigene über das membranständige IgM erkennen, durch Apoptose eliminiert. Reife B-Zellen (IgM, IgD positiv), die durch Autoantigene stimuliert werden, sterben ebenso durch Apoptose oder werden anergisiert (6). Die funktioelle Bedeutung des Wechsels vom IgM zum IgD während der B-Zell-Entwicklung ist unklar. Es konnte aber kürzlich gezeigt werden, das IgM-knock-out-Mäuse eine normale B-Zellentwicklung haben, und das membranständige IgD die Funktion des IgM in der B-Zell Entwicklung, Reifung und Funktion substituieren kann (79).

Die Signaltransduktion in die B-Zelle erfolgt über die Proteine Ig-alpha und Ig-ß. Diese besitzen eine ca. 26 Aminosäuren lange ITAM (immunoreceptor tyrosin based activation motif) genannte Sequenz, die durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK) phosphoryliert werden kann. Mit dem B-Zell-Rezeptor assoziiert sind Proteinkinasen der Src-Familie (Lyn, Blk, Fyn) und die Kinasen Syk und Btk. Nach dem cross-linking des B-Zell-Rezeptors phosphorylieren Kinasen der Src-Familie zwei Tyrosine in der ITAM-Sequenz von Ig-alpha und Ig-ß. Diese doppelt phosphorylierten Sequenzen können dann die Kinase Syk über seine SH2-Domäne binden, die dann wahrscheinlich ebenfalls von Mitgliedern der Rezeptor assoziierten Src-Familie phosphoryliert und damit aktiviert werden. Weiterhin wird in diesem Komplex auch Btk aktiviert. Diese Src- und Btk-Kinasen können dann eine Reihe von Signaltransduktionswegen aktivieren (80).

Der zuerst identifizierte Signalweg führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von Phospholipase C-gamma2 (PLC-gamma2), die Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat in Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) hydrolysiert. DAG aktiviert die meisten Isoformen der Proteinkinase-C (PKC). Ein wichtiges Substrat der PKC in B-Zellen ist der Transkriptionsfaktor CREB. IP3 führt zur cytoplasmatischen Freisetzung von Ca2+, was sowohl zur Aktivierung der Calcium-Calmodulin-abhängigen Protein-Kinase-II, als auch der Calmodulin-aktivierten Serin/Threonin-Phosphatase Calcineurin führt. Scott et al. konnte zeigen, daß die Calcium Mobilisierung und die Proteinkinase C-Aktivität nicht notwendig sind für die anti-IgM induzierte Apoptose (81, 82).

Ein anderer, wichtiger Signalweg ist die Aktivierung des Ras-MAP-Kinase-Weges, der über die Familie der ETS-Transkriptionsfaktoren zur Expression der Gene c-fos und egr-1 führen kann. Die aktivierte Rezeptor-assoziierte Kinase Syk kann auch das Protoonkogenprodukt Vav phosphorylieren. Vav knock-out-Mäuse zeigen Defekte in der T- und B-Zellentwicklung und in der Signaltransduktion des Antigenrezeptors (83, 84).

Ein wichtiges Substrat der Kinasen in hämatopoetischen Zellen ist HS1. Es konnte gezeigt werden, daß HS1 mit der Proteinkinase Lyn assoziiert ist und nach Phosphorylierung an die SH2-Domänen der Src-Kinasen bindet. Da die de novo Synthese von Proteinen für die über


12

das membranständige IgM-vermittelte Apoptose notwendig ist, stellt HS1 als potentieller Transkriptionsfaktor ein für diesen Prozeß möglicherweise wichtiges Protein dar (85).

Weitgehend ungeklärt ist zur Zeit, wie und in welchem Zusammenhang die oben skizzierten Signaltransduktionswege zu Apoptose, Proliferation oder Wachstumsstop führen können. Eine wichtige Rolle spielt dabei, in welchem Kontext das Antigen der B-Zelle präsentiert wird, welches Differenzierungsstadium die B-Zelle besitzt, und welche mit dem B-Zell-Rezeptor assoziierten Moleküle beteiligt sind.

1.4. Regulation der Genexpression während der Apoptose

Die transkriptionelle Regulation verschiedener Gene spielt eine wichtige Rolle während der Differenzierung von B-Zellen. Die kontrollierte Expression der Rekombinase-aktivierenden Gene (RAG 1 und RAG 2), sowie B-Zell spezifischer Gene führt zur sequenziellen B-Zell Reifung (s. 1.3.2) (77). Ebenso gibt es Hinweise, das der Aktivierungs-induzierte Zelltod von der Genexpression, d.h. der Neusynthese von RNA bzw. Proteinen abhängig ist. Inhibitoren der Transkription (Actinomycin D) oder der Translation (Cycloheximid) blockieren die Apoptose in vielen Fällen, was z.B. für die CD3 induzierte T-Zell Apoptose gezeigt wurde. In den letzten Jahren wurden einige Gene identifiziert, deren Expression während der Apoptose reguliert wird. Hierbei konnten allerdings bisher keine “Zelltod spezifischen Gene“ identifiziert werden, es kann hier vielmehr von “Induktions-spezifischen Zelltod assoziierten Genen“ gesprochen werden.

Als Modell für die anti-IgM induzierte Apoptose dienten bisher vor allem zwei Mauszellinien, die WEHI-231 und die CH31 (86, 87). Beide Zellinien exprimieren das membranständige IgM auf der Zelloberfäche und die anti-IgM Stimulation führt bei diesen Zellen zu einem Arrest des Zellzyklus in der frühen G1-Phase, d.h. die Zellen proliferieren nicht mehr und das Apoptose Programm wird ausgelöst (88). Dieser G1 Arrest scheint für die Apoptose Induktion essentiell zu sein. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Arrest durch Cycline und das Retinoblastom Protein reguliert wird. Die anti-IgM Stimulation verhindert die Phosphorylierung von dem Retinoblastom Protein in der G1 Phase des Zellzyklus, was den Übergang in die S-Phase blockiert (89). Es ist bisher nicht geklärt, was die Signaltransduktion vom membranständigen Immunglobulin bei Induktion der Proliferation, bzw. Apoptose unterscheidet. Es konnte aber gezeigt werden, das Ig-alpha nach anti-IgM Stimulation phosphoryliert wird, nach IgD Stimulation hingegen nicht (90). Die Regulation der Phosphorylierung des Immunglobulin assoziierten Igalpha könnte somit der erste Schalter in der Regulation zwischen Apoptose und Proliferation sein.

Für mehrere Transkriptionsfaktoren konnte eine Genregulation während der anti-IgM induzierten Apoptose gezeigt werden.

Egr-1 ist ein Zink Finger Transkriptionsfaktor, dessen Expression in humanen B-Zell Lymphomen bereits 30 Minuten nach anti-IgM induzierter Apoptose abgeschaltet wird. C-myc ist ein proliferationsabhängiger Transkripionsfaktor. Die Regulation der c-myc


13

Expression scheint für die Apoptose entscheidend zu sein, wobei die Ergebnisse hier sehr widersprüchlich sind. Fischer et al. konnte zeigen, daß die Injektion von antisense-c-myc-Oligonukleotiden Apoptose induziert. Andererseits konnte gezeigt werden, das die c-myc Transkription nach Apoptose Induktion schnell abgeschaltet wird und c-myc antisense-Oligonukleotide den anti-IgM induzierten Wachsumsarrest in der G1 Phase des Zellzyklus und die Apoptose hemmen (91). McCormack et al. konnten zeigen, daß die c-myc mRNA Menge in der murinen B-Zellinie WEHI 231 in den ersten Stunden nach anti-IgM Stimulation stark zunimmt, nach 8 Stunden wieder abnimmt und nach 24 Stunden nicht mehr zu detektierten ist (92). Zielgene die durch den c-myc Transkriptionsfaktor reguliert werden, sind nicht bekannt. Wie die duale Funktion von c-myc während der Proliferation und Apoptose zu erklären ist, bleibt ebenfalls ungeklärt.

Ebenso wurde gezeigt, das NAK-1, ein Transkriptionsfaktor der Steroidrezeptorfamilie nach der anti-IgM induzierten Apoptose verstärkt exprimiert wird. Sowohl die mRNA Menge nimmt nach anti-IgM Induktion zu, als auch die spezifische DNA-Bindungsaktivität des Transkriptionsfaktors (93). Das NAK-1 homologe Protein Nur77 der Maus spielt in der CD3 vermittelten Apoptose von T-Zellen eine wichtige Rolle (94). Die Inhibition der Nur77 Aktivität durch antisense-Oligonukleotide, bzw. die Expression einer dominant-negativen Nur77 Mutante konnte die CD3 vermittelte Apoptose blockieren. Es ist bisher nicht bekannt, welche Gene durch den Transkriptionsfaktor Nur77 bzw. das humane Homologe Nak1 reguliert werden.

Für die Proteine der bcl-2 Familie wurde ebenfalls eine Apoptose-spezifische Genregulation gezeigt. Es konnte gezeigt werden, daß bax-alpha nach anti-IgM induzierter Apoptose der Burkitt Lymphomzellinie BL41-3s verstärkt exprimiert wird. Sowohl die Menge der mRNA, als auch die Proteinmenge nahm nach IgM Kreuzvernetzung deutlich zu. Die Expression von bcl-2 und bcl-x blieb hingegen nach anti-IgM Stimulation gleich (95).

Es bleibt also weitgehend ungeklärt, welche Gene die Apoptose regulieren, wobei die Genexpression ebenfalls Zelltyp-spezifisch und abhängig vom Stimulus zu sein scheint.


14

1.5. Ziele der vorliegenden Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es Proteine und Gene zu identifizieren, die mit der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose-assoziiert sind und damit mögliche Regulatoren darstellen. Als Modell sollte eine Burkitt Lymphom Zellinie dienen, die nach Quervernetzung ihres B-Zellrezeptors, des membranständigen IgM durch Apoptose stirbt. Dieser Mechanismus spiegelt den Prozeß der B-Zelldifferenzierung wieder, in dem unreife, potentiell autoreaktive Zellen im Knochenmark eliminiert werden, und ist ein wichtiger Schritt in dem das Immunsystem Toleranz gegenüber Autoantigenen erlernt.

Weitgehend ungeklärt ist bisher, wie diese Prozesse der Apoptose initiiert und reguliert werden, d.h. welche Proteine für den Ablauf der Apoptose verantwortlich sind und welche Gene diese Prozesse steuern.

Zunächst sollte ein Modellsystem etabliert werden, das den Vergleich möglichst reiner Fraktionen apoptotischer und nicht apoptotischer B Zellen nach hochauflösender zweidimensionaler Gelelektrophorese ermöglicht. Differentielle Proteinspots sollten mittels der Edman Sequenzierung und massenspektrometrischen Analyse in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. B. Wittman-Liebold identifiziert werden. Dabei können Proteine identifiziert werden, deren Expression sich während der anti-IgM induzierten Apoptose ändert, die modifiziert werden und dadurch eine veränderte Lage im Gel haben, sowie Proteine, die im Verlauf der Apoptose durch Caspasen gespalten werden. Die funktionelle Relevanz der identifizierten Proteine sollte dann in Bezug auf die Apoptose untersucht werden.

Im weiteren sollte die c-myc Transkription während der anti-IgM induzierten Apoptose untersucht werden, sowie Proteine, die im c-myc Promotor binden und möglicherweise an der transkripionellen Regulation des c-myc Gens während der anti-IgM induzierten Apoptose beteiligt sind.

Im zweiten Teil der Arbeit sollten Gene identifiziert werden, deren Expression während der anti-IgM induzierten Apoptose verändert ist. Die Identifikation sollte über verschiedene Methoden der differentiellen Hybridisierung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken und subtraktiven Klonierung erfolgen. Dazu sollten im ersten Schritt lambda-Zap cDNA-Phagenbanken von anti-IgM stimulierten B-Zellen und unstimulierten B-Zellen hergestellt und differentiell hybridisiert werden. Um eine Anreicherung Apoptose-spezifischer Sequenzen zu erreichen, sollte eine subtraktive lambda-Zap cDNA-Phagenbank hergestellt werden, sowie eine subtrahierte Probe, die ebenfalls in die differentielle Hybridisierung eingesetzt werden sollten. Über eine weitere, klassische Methode der Hydroxyapatit Säulen Chromatographie sollten Apoptose-spezifische Sequenzen angereichert, direkt kloniert und sequenziert werden. Alle identifizierten, differentiellen Sequenzen sollten in der Slot Blot-, Run on- oder Northern Blot Analyse überprüft werden.


[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [Bibliographie] [Anhang] [Abkürzungsverzeichnis] [Selbständigkeitserklärung] [Lebenslauf] [Danksagung] [Anhang]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Nov 26 14:02:57 1999