Rickers, Anke: Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

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Kapitel 4. Ergebnisse-Teil1

4.1. Etablierung eines B-Zell Modells zur Untersuchung der anti-IgM induzierten Apoptose

4.1.1. Subklonierung der Burkitt Lymphom Zellinie BL60

Zur Identifizierung von Proteinen und Genen, die in der anti-IgM vermittelten Apoptose eine Rolle spielen wurde zunächst ein Modellsystem etabliert. Duch Subklonierung der Burkitt Lymphom Zellinie BL60 konnte ein Klon selektioniert werden (BL60-2) der sensitiv auf den Stimulus ist. Die Zellen dieses Subklons sterben nach Quervernetzung des membranständigen IgM durch Apoptose, was dem Prozeß der Eliminierung potentiell autoreaktiver B-Zellen entspricht. In einem Proliferationsassay wurde gezeigt, daß die Zellen nach anti-IgM Stimulation in ihrem Wachstum gehemmt sind und nach 24 Stunden zeigen 40-60 Prozent der Zellen, die für die Apoptose typischen fragmentierten Kerne, was mittels des membranpermeablen DNA-Farbstoffs Acridinorange unter UV-Licht sichtbar gemacht wurde (Abb. 5).

Abb. 5 Fluoreszenzaufnahme apoptotischer und nicht apoptotischer BL60-2 Zellen nach Acridinorangefärbung
Stimulierte, apoptotische BL60-2 Zellen (24 Stunden anti-IgM F(ab)2) und nicht stimulierte Zellen wurden mit Acridinorange angefärbt und im UV-Licht visualisiert. Apoptotische Zellen zeigen deutlich fragmentierte Kerne (rechts), während nicht apoptotische Zellen einen intakten Zellkern haben (links).

Dieser Subklon wurde in einer FACS-Analyse (fluorescense activated cell sorting) hinsichtlich seiner Oberflächenmoleküle charakterisiert. Der BL60-2 Subklon ist stark IgM, CD10, CD19, CD20, CD38, CD21 und Apo1/FAS positiv, schwach positiv für IgD, CD40 und CD5 negativ.


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4.1.2. Morphologische Veränderungen während der Apoptose-Elektronenmikroskopische Charakterisierung

Apoptose ist duch folgende morphologische Veränderungen gekennzeichnet: Zellschrumpfung, Kern-Fragmentierung, “membrane blebbing“, Chromatinkondensation, dem Verlust der Membransymmetrie, sowie der Umstrukturierung des Cytoskeletts. Einige Veränderungen können bereits 8 Stunden nach anti-IgM Stimulation in der Elektronenmikroskopie detektiert werden (Abb. 6).

Abb. 6 Elektronenmikroskopische Aufnahme nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen vor Stimulation (links) und nach 8 Stunden (rechts) anti-IgM induzierter Apoptose. Die apoptotische Zelle ist geschrumpft, zeigt ein kondensiertes Chromatin, Fragmentierung des Kernes sowie lappige Zellmembranwände.

Der Zellkern der BL60-2 Zellen ist 8 Stunden nach anti-IgM Stimulation deutlich fragmentiert. Die Zellen und Zellkerne haben ihre runde Form verloren, was auf die Umstrukturierung des Cytoskeletts hinweist. Die apoptotische Zelle ist geschrumpft und zeigt lappige Zellwände sowie ein stark kondensiertes Chromatin.


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4.1.3. Magnetische Separation von apoptotischen und nicht apoptotischen BL60-2 Zellen

Für die Identifikation von Apoptose assozierten Proteinen ist es vorteilhaft, möglichst reine Fraktionen apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen einzusetzen. Da nach anti-IgM Stimulation nur ca. 40-60 % der Zellen apoptotisch sind, wurde zunächst eine Methode entwickelt, um die Zellpopulationen voneinander zu trennen (Abb. 7).

Zellen, die durch Apoptose sterben, verlieren innerhalb weniger Stunden ihre Membransymmetrie, wodurch es zur Exposition von Phosphatidylserin (PS) auf der äußeren Zellmembran kommt. Annexin-V/FITC bindet spezifisch an PS und ist somit ebenso, wie die durch Arcidinorange sichtbar gemachte Kernfragmentierung, eine zuverlässige Nachweismethode für die Apoptose. 24 Stunden nach anti-IgM Stimulation waren 45 Prozent der BL60-2 Zellen Annexin-V/FITC positiv, was in der FACS-Analyse gemessen und quantifiziert wurde (Abb. 8 A).

Abb. 7 Magnetische Trennung apoptotischer und nicht-apoptotischer BL60-2 Zellen
Apoptotische Zellen exponieren Phosphatidylserin (PS) auf der äußeren Zellmembran. Annexin-V bindet spezifisch an PS, so daß apoptotische Zellen durch die Bindung von Annexin-V/FITC markiert werden können. Die Bindung an anti-FITC magnetische beads ermöglichte die Trennung über magnetische Säulen. Apoptotische Zellen binden an die Säule, solange diese im Magnetfeld steht (A), während nicht apopotische Zellen sich im Durchlauf befinden. Die apoptotischen, PS positiven Zellen wurden durch Entnahme der Säulen aus dem Magneten eluiert (B).


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Um apoptotische Zellen von nicht apoptotischen zu trennen, wurden BL60-2 Zellen 20 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten stimuliert, Annexin-V/FITC markiert und an anti-FITC magnetische beads gebunden. Diese markierten, apoptotischen Zellen wurden dann in einer magnetischen Separation von nicht apoptotischen Zellen getrennt (Abb.7). Die Fraktionen wurden in einer FACS-Analyse auf ihre Reinheit überprüft (Abb. 8).

Abb. 8 FACS-Analyse apoptotischer BL60-2 Zellen nach Annexin-V/FITC Färbung und magnetischer Separation und Depletion
BL60-2 Zellen wurden für 20 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert und mit dem Annexin-V/FITC Konjugat markiert. Apoptotische Zellen wurden nach Inkubation mit anti-FITC magnetischen beads über MACS-Säulen getrennt. Nicht apoptotische Zellen wurden von spontan apoptotischen Zellen depletiert. A) FACS-Analyse von anti-IgM stimulierten BL60-2 Zellen nach Annexin-V/FITC Färbung, vor der magnetischen Trennung. B) FACS-Analyse, nicht apoptotischer, PS negativer Zellen nach magnetischer Depletion. C) FACS-Analyse von apoptotischen, PS-positiven Zellen nach magnetischer Separation.

Nach magnetischer Separation konnte eine Reinheit von 95 Prozent apoptotischer, Annexin-V/FITC positiver Zellen erreicht werden (Abb. 8 C). Unstimulierte Zellen zeigen


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eine spontane Apoptoserate von 3-10 Prozent. Diese spontan-apoptotischen Zellen wurden von der Population nicht apoptotischer Zellen abgetrennt. Der Anteil apoptotischer Zellen betrug nach der Depletion nur noch 1,4 Prozent (Abb. 8 B).

Gesamtzellextrakte dieser aufgereinigten Fraktionen stimulierter und nicht stimulierter Zellen wurden mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese analysiert, und in einem subtraktiven Vergleich wurden Veränderungen im Proteinmuster nach anti-IgM Stimulation analysiert.

4.2. Identifkation Apoptose-assoziierter Proteine mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese

4.2.1. Etablierung des hochauflösenden 2D-Gelelektrophoresesystems

Es ist bisher weitgehend ungeklärt, welche Proteine an dem Prozeß der anti-IgM induzierten Apoptose beteiligt sind. Anhand des Vergleichs der zweidimensionalen Gelmuster von Proteinen der BL60-2 Zellen vor und nach anti-IgM Stimulation, sollten Apoptose-assoziierte Proteine identifiziert werden. Dabei können Veränderungen wie Proteinmodifikationen, Phosphorylierungen oder enzymatische Spaltungen ebenso verfolgt werden, wie die Regulation der Proteinexpression. Voraussetzung für einen solchen Ansatz ist die Auftrennung möglichst aller Proteine einer Zelle in einem Trennvorgang. Die beste Auflösung in der 2D-Technik wird in dem von Klose ausgearbeiten System erreicht, bei dem mehr als 5000 Proteine der Zellen ohne jede Vorfraktionierung aufgetrennt werden können. Mittels dieser hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese wurden Zellextrakte der BL60-2 Zellinie nach magnetischer Aufreinigung der apoptotischen und nicht-apoptotischen Zellen aufgetrennt und die Proteinmuster nach Silberfärbung verglichen (Abb. 9).

Die Silberfärbung ist deutlich sensitiver, als die Coomassie-Färbung und eignet sich damit für analytische Gele. Die Nachweisgrenzen für Coomassie-Färbung liegt bei 100 ng - 1 µg Protein, bei der Silberfärbung hingegen im Subnanogramm Bereich, so daß nur ca. 60 µg Gesamtprotein einer Zelle für die Analyse von bis zu 5000 Proteinspots ausreichend ist. Die Silberfärbung modifiziert Proteine chemisch so, daß sie nicht in der Massenspektrometrie bzw. für den Edman Abbau eingesetzt werden können. Deshalb wurden Proteinspots, die nach Apoptose Induktion im silbergefärbten-Gel in Intensität oder Lage, im Vergleich zum silbergefärbten-Gel unstimulierter Zellen verändert waren, dem präparativen Coomassie gefärbten Gel zugeordnet. Präparative, Coomassie gefärbte Gele wurden mit ca. 30-facher Proteinmenge beladen, und differentielle Proteinspots wurden aus dem Coomassie gefärbten Gel isoliert und im Gel tryptisch verdaut.


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Abb. 9 2 D-Gele nicht apoptotischer- und apoptotischer-BL60-2 Zellen
Silbergefärbte 2-D Gelmuster von Gesamtzellextrakten nicht stimulierter und anti-IgM stimulierter BL60-2 Zellen nach Separation über MACS-Säulen. Die isoelektrische Trennung in der ersten Dimension erfolgte mit Trägerampholyten im Bereich von pH 2-4 (pI = isoelektrischer Punkt), in der zweiten Dimension auf einem 15 %-igen SDS-Polyacrylamidgel. Das Molekulargewicht und der pI wurden anhand von Referenzpots (A, B, C) kalibriert.


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Diese so gewonnenen Peptide wurden in einer Reversed-Phase-HPLC getrennt und massenspektrometrisch analysiert. Sie konnten eindeutig zugeordnet werden, falls es sich um ein bekanntes Protein handelte, das schon in der Datenbank aufgeführt ist und der hypothetische Trypsin-Verdau der bekannten Proteine mit den analysierten Fragmenten der massenspektrometrischen Analyse übereinstimmt. Peptide, die so nicht identifiziert werden konnten, wurden mittels Edman-Abbau identifiziert (s. Tab. 1). Die Präparation der 2D-Gele, wie die Identifizierung differentieller Proteinspots erfolgte in der AG Proteinchemie am MDC, von Prof. B. Wittmann-Liebold.

Zunächst wurden drei Spots identifiziert, die vor und nach Apoptose Stimulation unverändert blieben, die Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (36 KDa; pI 8,6; Spot C), das Fettsäure bindende Protein (15 KDa; pI 6,6; Spot B) und Mitochondrien Matrix Protein P1 (61 KDa; pI 5,7; Spot A). Diese Proteine, bekannter Masse und isoelektrischen Punktes (pI) dienten zur Kalibrierung auf den 2D-Gelen.

4.2.2. Identifikation differentieller Proteinspots nach anti-IgM induzierter Apoptose

Proteinspots, die nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose eine veränderte Lage oder Intentsität im silbergefärbten 2D-Gel zeigten und dem Comassie gefärbten Gel zugeordnet werden konnten, wurden isoliert und identifiziert. In Tab. 1 sind alle bisher identifizierten Proteine, bzw. deren Fragmente alphabetisch aufgelistet, die in Intensität nach anti-IgM Stimulation entweder abnahmen (-)(-) oder zunahmen (+). Die nach Edmann Abbau erhaltenen Peptidsequenzen der entsprechenden Proteine und die Aminosäureposition sind ebenfalls aufgelistet. Einige der Proteine, wie z.B. Aktin, Lamin, hnRNPC1/C2 wurden bereits von anderen Arbeitsgruppen im Zusammenhang mit der Apoptose beschrieben. Allerdings ist es bisher unklar, ob die Veränderungen nach anti-IgM induzierter Apoptose mit den bereits beschriebenen identisch sind. Die molekularen Mechanismen der Apoptose scheinen zwar evolutionär konserviert zu sein, allerdings gibt es zellspezifische Apoptosemechanismen, d.h. je nach Zelltyp und Apoptosestimulus werden verschiedene Signaltransduktionswege aktiviert. Die Komplexität dieser Apoptose regulierenden Mechanismen ist aber noch nicht vollständig geklärt. Einige identifizierte Proteine sollten nun im funktionellen Zusammenhang der Apoptose näher charakterisiert werden.

Einige differentielle Proteine konnten nach massenspektrometrischer Analyse keinen bekannten Proteinen zugeordnet werden. Dabei handelt es sich eventuell um bisher unbekannte Proteine, die nicht in der Datenbank aufgeführt sind. Alle identifizierten Proteine der Burkitt Lymphom Zellinie BL60 werden in einer 2D-Proteindatenbank im www aufgeführt, die momentan erstellt wird (In Kooperation mit der Gruppe Prof. B. Wittmann Liebold).


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Tab. 1 Liste der identifizierten, Apoptose-assoziierten Proteine
Proteine der BL60-2 Zellen, die im subtraktiven Vergleich der 2D-Proteinmuster eine Veränderung in der Intensität oder Lage zeigten, wurden isoliert und identifiziert. 15 Proteine konnten nach Peptidsequenzierung und/oder massenspektrometrischen Analyse schon bekannten Proteinen der Datenbank zugeordnet werden. Die Veränderung der Spotintensität nach anti-IgM Stimulation der BL60-2 Zellen wird für jedes Protein, bzw. deren Fragment angegeben. (-) = abnehmende Spotintensität nach anti-IgM Stimulation; (+) = zunehmende Spotintensität nach anti-IgM Stimulation. Wurden nach dem tryptischen-Verdau Peptide über Edman-Abbau sequenziert, sind die Aminosäuresequenzen angegeben.

Datenbank Protein-Identifikation

Spot Intensität

AS-Position

Interne Sequenz

Aktin (Fragment)

+

96-103

VAPEEHPV

Aktin (Fragment)

+

292-303

DLYANTVLSGGT

D4-GDI

-

5-14

APEPHVEEDD

D4-GDI (Fragment)

+

dUTPase

-

8-17

LSEHATAPTR

FBP

-

171-185

GRPAPGFHHGDGPGN

HHR23B

-

145-155

SEKPAEKPAET

hnRNP A1 (Fragment)

+

146-155

XFAFVTFDDH

hnRNP C1/C2

-

152-157

AVVPSK

hnRNP C1/C2 (Fragment)

+

43-50

IVGCSVHK

hnRNP C1/C2 (Fragment)

+

152-158

AVVPSKR

hnRNPK

-

68-79

XXTXYNASVSVP

HP1 alpha

+

132-144

XKDTDEADLVLAK

Lamin B1 (Fragment)

+

51-65

SLETENSALQLQVTE

LSP 1

-

143-157

EGPGPEDTVQDNLGA

Nucleolin (Fragment)

+

577-590

XLSEDTTEETLKES

Neutrales Calponin

-

215-227

CASQVGMTAPGTR

P0

-

267-276

XFLADPSAEV

P0 (Modifikation)

+

267-281

XFLADPSAEVAAAPV


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4.3. D4-GDI als Protease-Substrat während der anti-IgM induzierten Apoptose

Im Vergleich der silbergefärbten, zweidimensionalen Proteinmuster von BL60-2 Zellen vor und nach anti-IgM Stimulation wurde zunächst ein Spot D identifiziert, der in Intensität nach Apoptose-Induktion stark abnimmt (Abb. 10). Der Spot wurde aus dem Coomassie gefärbten Gel isoliert und Trypsin verdaut. Nach Elution und Reversed-Phase-HPLC wurde die Aminosäuresequenz eines Peptid Peaks durch Edman Abbau bestimmt (APEPHVEEDD). Sie ist identisch zur Aminosäuresequenz 5-14 des D4-GDI Proteins. Während der Identifikation weiterer differentieller Proteinspots wurde der Spot D´ identifiziert, der nach MALDI-MS als ein Spaltprodukt des D4-GDI Proteins identifiziert werden konnte (Abb. 10). Dieser Spot nimmt nach anti-IgM Stimulation der BL60-2 Zellen in Intensität auf dem zweidimensionalen silbergefärbten-Gel stark zu. Die Identifikation der Spots D und D´ ließ somit darauf schließen, daß das D4-GDI Protein während der anti-IgM induzierten Apoptose gespalten wird. D4-GDI ist ein GDP Dissoziations-Inhibitor für Rho GTPasen und wird stark im hematopoietischen System exprimiert.

Abb. 10 Vergößerter Ausschnitt der Region um Spot D und D´
Spot D wurde nach Elution und Massenspektrometischer Analyse als D4-GDI Protein identifiziert. Der Spot D nahm nach anti-IgM Inkubation der BL60-2 Zellen deutlich an Intensität ab. Spot D´ konnte als Fragment des D4-GDI Proteins identifiziert werden. Die Intensität des Spots D´ nahm nach Apoptose Induktion stark zu.


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4.3.1. Zeitverlauf der D4-GDI Spaltung

In einer Western Blot Analyse wurde der zeitliche Verlauf der D4-GDI Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose bestimmt. Dazu wurden zunächst BL60-2 Zellen über verschiedene Zeiträume mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellysate wurden auf einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembran geblottet. Die Spaltung des D4-GDI Proteins wurde mit einem polyklonalen-Antiserum, das ein Epitop von Aminosäure 178-198 des Rho-GDI Proteins erkennt, detektiert (Abb.11). Da sich das Rho-GDI Protein im Bereich des Epitops nur in 3 Aminosäuren vom D4-GDI unterscheidet, erkennt der verwendete Antikörper auch das D4-GDI Protein. Abb. 11 zeigt deutlich die Spaltung des 27 KDa großen D4-GDI Proteins in ein 23 KDa Fragment. Diese Spaltung erfolgt 8 Stunden nach anti-IgM Stiumlation der BL60-2 Zellen. Das ungespaltene, 28 KDa große Rho-GDI erscheint im Western Blot mit dem D4-GDI als eine Bande, weshalb die Abnahme des 27 KDa D4-GDI-Proteins hier nicht zu sehen ist. Bei kurzer Exposition des Autoradiogramms können die beiden Banden jedoch visuell aufgelöst werden.

Abb. 11 Zeitverlauf der D4-GDI Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellysate wurden, auf einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und mit einem Rho-GDI spezifischen polyklonalen-Antiserum (kreuzreaktiv mit D4-GDI) im Western Blot analysiert. Die Pfeile weisen auf das 28 KDa Rho-GDI, das 27 KDa D4-GDI (eine Bande), sowie das 23 KDa große Spaltprodukt des D4-GDI hin. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.

Die Größe des 23 KDa D4-GDI Spaltproduktes korrespondiert mit der erwarteten Größe, die sich aus der Spaltung des D4-GDI Proteins am Aspartat 19, einer Caspase 3 Konsensus-Spaltstelle (DDDELD19SKLN) ergibt. Diese Konsensus-Spaltstelle ist nicht im Rho-GDI vorhanden (ENEED21EHSVN). Das D4-GDI Protein besitzt ebenfalls eine spezifische Spaltstelle für ICE Proteasen, LLGD55G. Eine Spaltung an dieser Stelle würde ein 17 KDa großes Spaltprodukt generieren, das nach anti-IgM induzierter Apoptose nicht detektiert werden konnte.


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4.3.2. Hemmung der D4-GDI Spaltung durch z-DEVD-fmk

Die Größe des 23 KDa großen D4-GDI Spaltproduktes gab einen Hinweis darauf, daß dieses Fragment durch die Spaltung der Caspase 3, an der Konsensus-Spaltstelle Aspartat19, erfolgen könnte. Inhibitoren der Caspase 3 müßten also die D4-GDI Spaltung blockieren. Deshalb wurden BL60-2 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk, einem spezifischen, irreversiblen, zellpermeablen Inhibitor für Proteasen der Caspase 3 Familie, bzw. ac-YVAD-cmk, einem spezifischen, irreversiblen Inhibitor für Proteasen der Caspase 1 Familie vor Stimulation mit anti-IgM inkubiert. 24 Stunden nach anti-IgM Inkubation wurden die Zellen lysiert und die D4-GDI Spaltung im Western Blot analysiert (Abb. 12).

Abb. 12 Dosisabhängige Hemmung der D4-GDI Spaltung duch z-DEVD-fmk
BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk kultiviert (0-200 µM) und mit oder ohne anti-IgM ( 1,3 µgml) für 24 Stunden inkubiert. Gesamtzellysate wurden auf einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. Die Spaltung des D4-GDI Proteins wurde im Western Blot mit einem D4-GDI spezifischen polyklonalen-Antiserum analysiert. Die D4-GDI Spaltung wurde durch steigende Konzentrationen z-DEVD-fmk gehemmt. Die Pfeile weisen auf das 27 KDa D4-GDI, sowie das 23 KDa große Spaltprodukt. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.

Die Abb.12 zeigt die konzentrationsabhängige Hemmung der D4-GDI Spaltung durch die Zugabe von z-DEVD-fmk (0-200 µM) vor der anti-IgM Stimulation. Bei einer Konzentration von 200 µM dieses Inhibitors, der für Proteasen der Caspase 3 Familie spezifisch ist, ist die Spaltung nahezu komplett gehemmt, während ac-YVAD-cmk, ein Inhibitor für Proteasen der Caspase 1 Familie die Spaltung nicht blockiert. Diese Ergebnisse ließen den Schluß zu, daß das D4-GDI Protein während der anti-IgM induzierten Apoptose durch eine Protease der Caspase 3 Familie in das 23 KDa große Fragment gespalten wird.


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4.4. Heterogene nukleäre Ribonucleoproteine während der anti-IgM induzierten Apoptose

Heterogene nukleäre Ribonucleoproteine (hnRNP-Proteine) sind Bestandteil der Splicosomenkomplexe und an der Prozessierung von RNA Molekülen beteiligt. Sie spielen aber auch eine wichtige Rolle bei der Transkription und Translation.

Im Vergleich der Proteinmuster von BL60-2 Zellen vor und nach anti-IgM Stimulation wurden differentielle Proteinspots isoliert, die nach Edman Abbau als hnRNP Proteine identifiziert werden konnten (s. Tab. 1). Dabei handelt es sich um das hnRNP C1/C2, hnRNP K und hnRNP A1 Protein.

Das hnRNPK Protein wurde 24 Stunden nach anti-IgM induzierter Apoptose im silbergefärbten Gel nicht mehr detektiert, was auf eine transkriptionelle Regulation, eine Stabilitätsänderung der RNA oder des Proteins, eine Degradierung oder Spaltung durch eine Caspase hinweist. In der Northern Blot Analyse konnte aber keine Abnahme der Transkriptmenge nach anti-IgM induzierter Apoptose detektiert werden, was auf eine Regulation auf Proteinebene hindeutete. Die Abnahme des hnRNP K spezifischen Signals nach anti-IgM induzierter Apoptose konnte in der eindimensionalen Western Blot-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper bestätigt werden. Es konnte allerdings kein Spaltprodukt detektiert werden.

Im subtraktiven Vergleich der Proteinmuster wurden ebenfalls 6 Spots detektiert, die als hnRNP C1/C2 Proteine identifiziert wurden. Nach anti-IgM Induktion wurden im silbergefärbten Gel nur noch 4 Spots mit geringerer Masse detektiert. In einer eindimensionalen Western Blot Analyse mit dem monoklonalen Antikörper 4F4, sollte dieses Ergebnis verifiziert werden. Es wurden drei Spaltprodukte des hnRNP C1/C2 Proteins nach 24 Stunden anti-IgM induzierter Apoptose detektiert. Die 2D-Western Blot Analyse, mit dem spezifischen Antiserum, zeigte ebenfalls eine Änderung in der Lage dieser Proteine und damit des isoelektrischen Punktes. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, daß die hnRNP C1/C2 Proteine nach Apoptose Induktion gespalten und modifiziert werden. Die Spaltstellen sollen in weiteren Experimenten identifiziert werden.

Für das hnRNP A1 konnte ebenfalls eine Spaltung in drei spezifische Fragmente im Verlauf der anti-IgM induzierten Apoptose detektiert werden (4.4.1).

4.4.1. Spaltung von hnRNP A1 während der anti-IgM induzierten Apoptose

Im differentiellen Vergleich der Proteinmuster von BL60-2 Zellen vor und nach Stimulation mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten wurde ein 16 KDa großes Spaltprodukt des hnRNPA1 Proteins identifiziert (s. Tab.1). Dieses Spaltprodukt erschien nach Apoptose Stimulation mit zunehmender Intensität im 2D-Gel und konnte nach Isolation und tryptischen Verdau als Fragment des hnRNP A1 Proteins identifiziert werden. In einer eindimensionalen Western Blot Analyse mit einem monoklonalen Antikörper wurde der zeitliche Verlauf der Spaltung während der anti-IgM Stimulation bestimmt (Abb. 13).


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Abb. 13 Zeitverlauf der hnRNP A1-Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellysate wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. Die Spaltung wurde nach Western Blot Analyse mit einem hnRNP A1 spezifischen, monoklonalen-Antikörper 4B10 detektiert. Die Pfeile deuten auf das 36 KDa hnRNP A1 Protein, bzw. die nach 8, 12 und 24 Stunden Apoptose-Induktion auftretenden Spaltprodukte mit einer Größe von 30 KDa, 19 KDa und 16 KDa. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.

Das hnRNP A1 Protein wird während der anti-IgM induzierten Apoptose in 3 spezifische Fragmente gespalten. Ein ca. 30 KDa großes Fragment des hnRNP A1 Proteins erschien bereits 8 Stunden nach anti-IgM Stimulation, ein zweites, 19 KDa großes Fragment nach 12 Stunden und ein 16 KDa große Spaltprodukt, konnte nach 24 Stunden anti-IgM Stimulation detektiert werden.

4.4.2. Hemmung der hnRNP A1 Spaltung durch z-DEVD-fmk

Um zu prüfen, ob die spezifische Spaltung des hnRNP A1 Proteins während der anti-IgM induzierten Apoptose ebenfalls durch Proteasen der Caspase 3 Familie erfolgt, wurden BL60-2 Zellen vor der anti-IgM Stimulation mit 200 µM z-DEVD-fmk, dem Inhibitor, der spezifisch für Proteasen der Caspase 3 Familie ist, inkubiert. Die Spaltung des hnRNP A1 Proteins wurde in einem Western Blot , mit einem spezifischen, monoklonalen Antiserum analysiert (Abb. 14). Alle 3 Spaltprodukte (30 KDa, 19 KDa, 16 KDa) des hnRNP A1 Proteins konnten nach Inkubation mit z-DEVD-fmk und anschließender anti-IgM Stimulation im Western Blot nicht mehr detektiert werden (Abb. 14 A und B). Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, daß das hnRNP A1 Protein während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose ebenfalls durch eine Protease der Caspase 3 Familie gespalten wird.


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Abb. 14 Hemmung der hnRNP A1 Spaltung durch z-DEVD-fmk
BL60-2 Zellen wurden mit z-DEVD-fmk vorinkubiert (200 µM) und mit oder ohne anti-IgM F(ab)2-Fragmenten für 24 Stunden kultiviert. Gesamtzellysate dieser Zellen wurden auf einem 15 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und in einem Western Blot mit einem monoklonalen hnRNP A1-Antikörper analysiert. Die hnRNPA1 Spaltung wurde durch z-DEVD-fmk blockiert, was durch kurze (A) und längere Exposition (B) des Autoradiographie Films analysiert wurde.

4.4.3. In vitro Spaltung von hnRNP A1 durch Caspase 3

Die spezifische Spaltung des hnRNP A1 Proteins während der anti-IgM induzierten Apoptose sowie die Hemmung der Spaltung durch z-DEVD-fmk, deutet darauf hin, daß diese Spaltung durch eine Protease der Caspase 3 Familie erfolgt. Der Vergleich der Aminosäuresequenz des hnRNP A1 Proteins mit den bekannten Konsensuspaltstellen gab hingegen keinen Hinweis auf eine potentielle Caspase Spaltstelle. Da zu diesem Zeitpunkt der Arbeit nur die rekombinante Caspase 1 und Caspase 3 zur Verfügung stand, wurde überprüft, ob hnRNP A1 in vitro durch Caspase 1 oder Caspase 3 gespalten wird.

Für die in vitro Spaltung des hnRNP A1 Proteins wurde das Protein zunächst rekombinant exprimiert. Dazu wurde die cDNA zunächst mit spezifischen Oligonukleotiden in einer PCR-Reaktion amplifiziert und in den pQE16 Expressionsvektor kloniert. Das Plasmid wurde in den Bakterienstamm M15 transformiert und nach IPTG-Stimulation als DHFR-Fusionsprotein exprimiert. Da die pQE Vektoren für sechs Histidin-Sequenzen kodieren, die in Fusion mit dem Protein der klonierten Sequenz exprimiert werden, konnte das hnRNP A1 Protein über Nickelsäulenchromatographie unter denaturierenden Bedingungen (8 M Harnstoff) aufgereinigt werden. Zur Entfernung des Harnstoffs wurde das rekombinante Protein über eine Reversed-Phase-HPLC aufgereinigt.


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Abb. 15 In vitro Spaltung von hnRNP A1
Rekombinantes hnRNP A1-DHFR Fusionsprotein wurde mit rekombinanter, gereinigter Caspase 1 oder Caspase 3 (60 ng) für 1 Stunde mit oder ohne z-DEVD-fmk oder ac-YVAD-cmk inkubiert. Die Proben wurden auf einem 15 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und in einem Western Blot mit einem hnRNP A1 spezifischen, monoklonalen Antikörper 4B10 analysiert. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.

Das rekombinante hnRNP A1-DHFR Fusionsprotein Protein (1 µg) wurde für 1 Stunde bei 37 0C mit oder ohne Caspase 1 oder Caspase 3 inkubiert. Als Spezifitätskontrolle wurde jeder Ansatz auch mit dem entsprechenden Inhibitor (z-DEVD-fmk und ac-YVAD-cmk) versetzt. Die Proben wurden auf einem 10-%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und in einem Western Blot mit dem hnRNP A1 spezifischen Antiserum 4B10 analysiert. Das Fusionsprotein (60 KDa) konnte nach Inkubation mit Caspase 3 nicht mehr detektiert werden. Allerdings konnten die drei, nach anti-IgM Stimulation detektierten Spaltprodukte (30 KDa, 19 KDa, 16 KDa) ebenfalls nicht detektiert werden. Der Abbau des hnRNP A1 Proteins durch Caspase 3 wurde durch Zugabe von z-DEVD-fmk nahezu vollständig gehemmt (Abb. 15). Rekombinante Caspase 1 hingegen konnte das rekombinante hnRNP A1 Protein nicht abbauen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß das hnRNP A1 Protein durch Caspase 3 gespalten wird. Die Spaltprodukte sind in diesem in vitro Ansatz nicht stabil, was eventuell auf Verunreinigungen mit bakteriellen Proteasen zurückzuführen ist.

4.5. Hemmung der morphologischen und biochemischen Veränderungen während der anti-IgM induzierten Apoptose durch z-DEVD-fmk

Im folgenden Experiment sollte der Einfluß des Caspase 3 Inhibitors z-DEVD-fmk auf die anti-IgM induzierte B-Zell Apoptose, gemessen an den typischen morphologischen Veränderungen, untersucht werden. BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Caspase 3 Inhibitors z-DEVD-fmk (0-200 µM) vorinkubiert und 24 Stunden mit anti-IgM stimuliert.


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Abb. 16 Hemmung der anti-IgM induzierten Apoptose durch z-DEVD-fmk
BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk vorinkubiert, und 24 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten kultiviert (1,3 µg/ml). Der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen, mit charakteristischen fragmentierten Kernen, wurde durch Acridinorangefärbung bestimmt.

24 Stunden mit anti-IgM stimuliert. Der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen wurde anhand der fragmentierten Kerne durch Acridinorange Färbung bestimmt (Abb.16).

Der Anteil apoptotischer Zellen nahm mit zunehmender Konzentration des Inhibitors z-DEVD-fmk ab. Bei einer Konzentration von 200 µM z-DEVD-fmk ist die anti-IgM induzierte Apoptose fast vollständig gehemmt. Der Caspase 3 Inhibitor hemmt somit nicht nur die spezifische Spaltung des D4-GDI und hnRNPA1 Proteins, sondern auch die morphologischen Veränderungen während der anti-IgM induzierten Apoptose. Ac-YVAD-cmk hingegen konnte diese Veränderungen nicht hemmen. Die Blockade der morphologischen Veränderungen war auch nach 48 h z-DEVD-fmk und anti-IgM Inkubation noch zu beobachten.

In einem weiteren Experiment sollte überprüft werden, ob die Phosphatidylserintranslokation, eines der ersten charakteristischen Merkmale für apoptotische Zellen, ebenfalls durch z-DEVD-fmk gehemmt werden kann. Dazu wurden BL60-2 Zellen mit z-DEVD-fmk vorinkubiert, und dann über verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten stimuliert. Die Zellen, sowie unstimulierte und anti-IgM stimulierte Kontrollzellen, wurden


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mit Annexin-V/FITC inkubiert. Der prozentuale Anteil Phosphatidylserin (PS) positiver Zellen wurde in einer FACS-Analyse bestimmt (Abb. 17).

Abb. 17 Hemmung der Phosphatidylserintranslokation BL60-2 Zellen wurden über verschiedene Zeiträume (4 - 48 h) mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert und mit Annexin-V/FITC markiert. Der Anteil Annexin-V/FITC positiver Zellen, der dem prozentualen Anteil apoptotischer Zellen entspricht, steigt während der anti-IgM induzierten Apoptose auf über 50 % (B). Wurden die Zellen mit z-DEVD-fmk vorinkubiert (200 µM) nahm der Anteil apoptotischer Zellen während der anti-IgM Inkubation nicht zu (C). Zur Kontrolle wurden BL60-2 Zellen ohne anti-IgM und z-DEVD-fmk inkubiert. Der Anteil spontan apoptotischer Zellen lag zwischen 3 und 7 Prozent (A).

Die FACS-Analyse zeigte, daß BL60-2 Zellen, die vor der anti-IgM Stimulation mit z-DEVD-fmk inkubiert wurden, nahezu keine Phosphatidyltranslokation auf die äußere Plasmamembran zeigen. Sogar 48 Stunden nach anti-IgM Stimulation ist die Translokation nahezu komplett geblockt (12,7 %), die Zellen bleiben Annexin-V/FITC negativ. Dieses Experiment läßt darauf schließen, daß die Phosphatidyltranslokation ebenfalls auf die Aktivität von Proteasen der Caspase 3 Familie zurückzuführen ist.

Die Hemmung der morphologischen Veränderungen während der Apoptose, wie auch die Spaltung der Proteine D4-GDI und hnRNPA1 durch z-DEVD-fmk, bewies eine zentrale Rolle der Proteasen der Caspase 3 Familie in der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose. Mittels der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese sollte nun überprüft werden, ob bisher identifizierten Veränderungen im Proteinmuster (s. Tab.1) ebenfalls durch Zugabe des Caspase 3 Inhibitors z-DEVD-fmk blockiert werden können. Dazu wurde z-DEVD-fmk in einer Enkonzentration von 200 µM zu der BL60-2 Zellkultur gegeben bevor die Zellen für 24 Stunden mit anti-IgM stimuliert wurden. Gesamtzellysate dieser Zellen wurden dann in der 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit den Proteinmustern von Zellen, die ebenfalls 24 Stunden mit anti-IgM stimuliert wurden, bzw. Proteinmustern von Zellen, die nicht


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stimuliert wurden, verglichen. Die zuvor beobachteten Veränderungen nach Apoptose Stimulation, wie die Spaltung der Proteine Aktin, hnRNP C1/C2, hnRNP A1, P0, Lamin B1 und Nucleolin, wurden durch Vorinkubation der Zellen mit z-DEVD-fmk gehemmt. Dieses Experiment ließ darauf schließen, daß die meisten Apoptose bedingten Proteinveränderungen, die im 2D-Gelmuster detektierbar sind, durch Proteasen der Caspase 3 Familie bedingt sind.

4.6. Untersuchungen des Transkriptionsfaktors SP1 während der anti-IgM induzierten Apoptose der Burkitt Lymphom Zellinie BL60-2

4.6.1. Die Regulation der c-myc Transkription während der anti-IgM induzierten Apoptose

Der Transkriptionsfaktor c-myc spielt eine wichtige Rolle in der Proliferation von Zellen, verschiedene Studien zeigen seine Bedeutung für die Apoptose. Allerdings sind die bisher veröffentlichten Ergebnisse hinsichtlich der transkriptionellen Regulation von c-myc widersprüchlich. McCormack et al. konnten zeigen, daß die c-myc Expression in der murinen B-Zellinie WEHI 231 in den ersten 8 Stunden nach anti-IgM Stimulation zunächst stark zunimmt, nach 8 Stunden dann abnimmt und nach 24 Stunden nicht mehr zu detektierten ist. Die Regulation der c-myc Transkription, sowie die durch den Transkriptionsfaktor c-myc regulierten Gene, sind bisher weitgehend unbekannt.

Die Regulation der c-myc Transkription sollte nun in der humanen BL60-2 Zellinie während der anti-IgM induzierten Apoptose in einer Northern Blot Analyse untersucht werden. Dazu wurde die RNA von BL60-2 Zellen ohne anti-IgM Induktion, bzw. nach 2 und 4 Stunden anti-IgM Stimulation über einen Cäsium-Clorid Gradienten präpariert. Die Gesamt RNA wurde auf einem Formamid-Agarose Gel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran geblottet. Der Blot wurde mit einer 32P-markierten, c-myc spezifischen Sonde hybridisiert und die c-myc mRNA durch Autoradiogarphie sichtbar gemacht (Abb. 18).


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Abb. 18 Northern Blot Analyse der c-myc Expression während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen wurden ohne, bzw. für 2 oder 4 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. RNA dieser Zellen (10 µg Spur) wurde auf einem 1,2 %-igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt und auf eine Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde mit einer spezifischen, 32P-markierten c-myc Sonde, bzw. GAPDH Sonde hybridisiert. Die c-myc spezifische mRNA konnte bereits 2 Stunden nach anti-IgM Stimulation nicht mehr detektiert werden. Die GAPDH mRNA blieb dagegen nach anti-IgM Stimulation konstant exprimiert.

Die c-myc mRNA konnte bereits 2 Stunden nach anti-IgM Stimulation im Northern Blot nicht mehr nachgewiesen werden, wobei die Kontrollhybridisierung mit der einer 32P-markierten GAPDH Sonde eine gleichbleibende Expression zu den verschiedenen Zeitpunkten zeigte. Dieses Experiment zeigte, daß die c-myc Transkriptmenge nach anti-IgM Stimulation der humanen BL60-2 Zellen stark abnimmt.

4.6.2. SP1 Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose

Um die Regulation der c-myc Transkription während der anti-IgM induzierten Apoptose zu untersuchen, wurden verschiedene Proteine, die im c-myc Promotor binden, in einer Western Blot Analyse untersucht.

Aus den vorangegangenen Experimenten, dem subtraktiven Vergleich der 2D-Gelmuster vor und nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose war bekannt, daß hnRNP K nach anti-IgM induzierter Apoptose auf Proteinebene nicht mehr zu detektieren ist. hnRNP K bindet u.a. im c-myc Promotor und ist somit evtl. für die c-myc Regulation verantwortlich. Andere Transkriptionsfaktoren die im c-myc Promotor binden können, wurden in einer Western Blot Anlayse untersucht, und sowohl für E2F als auch für RB konnte keine veränderte Expression oder Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose beobachtet werden. Mit einem spezifischen polyklonalem Antikörper für den Transkriptionsfaktors SP1 konnte jedoch gezeigt werden, daß der Transkriptionsfaktor SP1 während der anti-IgM induzierten Apoptose-spezifisch gespalten wird (Abb.19)


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Abb. 19 Zeitverlauf der SP1-Spaltung während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für verschiedene Zeitintervalle mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Gesamtzellextrakte wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt. In einer Western Blot Analyse mit einem SP1-spezifischem polyklonalen Antikörper konnte die Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose detektiert werden. Die Pfeile deuten auf das 95/105 kDa SP1 Protein, sowie die 68 KDa und 45 KDa großen Spaltprodukte hin. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.

Das SP1 Protein hat eine Größe von 95 KDa (nicht glykosylierter Zustand), bzw. 105 KDa (glycosylierter Zustand). Die Intensität dieses, dem vollständigen SP1 Protein entsprechenden Signals nahm nach anti-IgM induzierter Apoptose stark ab und konnte nach 24 Stunden Stimulation nur noch schwach im Western Blot detektiert werden.

Der Transkriptionsfaktor SP1 wird 8 Stunden nach anti-IgM Stimulation in ein 68 KDa Fragment gespalten. 16 Stunden nach Stimulation konnte ein zweites, 45 KDa großes Spaltprodukt detektiert werden (Abb.19).

4.6.3. Hemmung der SP1 Spaltung durch z-DEVD-fmk

Da in vorherigen Experimenten schon gezeigt wurde, daß sowohl die Apoptose-spezifischen, morphologischen Veränderungen, wie auch die Spaltung der Proteine hnRNP A1 und D4-GDI während der anti-IgM induzierten Apoptose durch z-DEVD-fmk gehemmt werden können, lag die Vermutung nahe, daß auch die Spaltung des Transkriptionsfaktors SP1 durch den Caspase 3 Inhibitor z-DEVD-fmk blockiert werden kann. Abb. 20 zeigt die konzentrationsabhängige Hemmung der SP1 Spaltung durch z-DEVD-fmk in einer Western Blot Analyse mit einem SP1 spezifischen Antikörper.


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Abb. 20 Dosisabhängige Hemmung der SP1-Spaltung
BL60-2 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen z-DEVD-fmk vorinkubiert (0-200 µM) und mit oder ohne anti-IgM F(ab)2-Fragmenten für 24 Stunden inkubiert. Die Hemmung der SP1 Spaltung wurde in einer Western Blot Analyse mit einem SP1 spezifischen polyklonalem-Antiserum detektiert. Die Pfeile weisen auf das 95/105 kDa Protein, sowie das 68 KDa und 45 KDa große Spaltprodukt. Die Detektion erfolgte mit dem ECL System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper.

BL 60-2 Zellen wurden mit verscheidenen Konzentrationen z-DEVD-fmk (0-200 µM) vorinkubiert, bevor sie für 24 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten stimuliert wurden. Die Hemmung der Spaltung ist dosisabhängig, und bei einer Konzentration von 200 µM ist die Spaltung fast vollständig gehemmt.

4.6.4. In vitro Spaltung von SP1 durch Proteasen der Caspase 3 Familie

Vorangegangene Experimente, wie die Hemmung der SP1 Spaltung durch z-DEVD-fmk, einem Inhibitor, spezifisch für Proteasen der Caspase 3 Familie, ließen darauf schließen, daß der Transkriptionsfaktor SP1 während der anti-IgM indzierten Apoptose durch eine Caspase gespalten wird. Die Aminosäuresequenz des Transkriptionsfaktors SP1 wurde mit der Konsensussequenz für die Caspase 3 und Caspase 7 Spaltstelle DXXD, wie der Caspase 6 Spaltsellte (IVL)XXD verglichen. Es gibt keine Homologie mit einer potentiellen Spaltstelle für Caspase 3, 6 oder 7 in der Aminosäuresequenz des SP1 Proteins. Es war also anzunehmen, das SP1 entweder durch eine andere, bisher nicht identifizierte Caspase gespalten wird, die ebenfalls durch z-DEVD-fmk hemmbar ist, oder das die bekannten Caspasen bisher nicht beschriebene Aminosäuremotive als Spaltstellen erkennen. Möglicherweise hemmt der Inhibitor aber auch eine Caspase, die in der Aktivierungskaskade erst durch eine Protease der Caspase 3 Familie gespalten und aktiviert wird.

In einem in vitro Assay sollte geprüft werden, durch welche Caspase SP1 gespalten wird. Rekombinantes SP1 (Promega) wurde mit rekombinanter Caspase 1, 3, 6 oder 7, mit oder ohne z-DEVD-fmk inkubiert. Die Ansätze wurden auf einem 10 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt, und die Spaltung des SP1 Proteins wurde im Western Blot analysiert (Abb. 21).


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Abb. 21 In vitro Spaltung von SP1
A) Rekombinantes SP1 Protein (2 fpu, Promega) wurde mit rekombinanter, gereinigter Caspase 1, 3, 6 oder 7 (60 ng) für 2 Stunden, mit oder ohne z-DEVD-fmk (Caspase 3 Inhibitor) inkubiert. Die Proben wurden auf einem 10 %-igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und in einem Western Blot mit einem SP1-spezifischen polyklonalen-Antikörper analysiert. Die Detektion erfolgte mit dem ECL-System nach Inkubation mit einem Peroxidase gekoppelten Zweitantikörper. B) In vitro Spaltung von 35S-markiertem proIL1ß in IL1ß durch rekombinante Caspase 1. ProIL1ß wurde in vitro translatiert und und mit 60 ng rekombinanter Caspase 1 mit oder ohne ac-YVAD-cmk für 90 Min inkubiert. Die Proben wurden auf einem 10 %-igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt und nach Autoradiographie detektiert.

Die Western Blot Analyse zeigte, daß SP1 in vitro durch Caspase 3, 6 und 7 gespalten wird. Die Spaltung durch Caspase 6 und Caspase 7 führte zu Spaltprodukten gleicher Größe wie nach anti-IgM induzierter Apoptose der BL60-2 Zellen. Das 95/105 KDa SP1 Protein wurde in ein 68 und 45 KDa großes Fragment gespalten. Die Spaltung durch Caspase 6 führte hingegen nur zu einem 68 KDa großen Spaltprodukt. Z-DEVD-fmk hemmte die durch Caspase 3, 6 und 7 bedingte, spezifische Spaltung des SP1 Proteins vollständig. Rekombinante Caspase 1 konnte den Transkriptionsfaktor SP1 nicht spalten (Abb. 21 A). Zur Aktivitätskontrolle der rekombinanten Caspase 1 wurde, S35-markiertes proIL1ß im TNT System (Promega) in vitro translatiert und mit rekombinanter Caspase 1 inkubiert. ProIl1ß ist ein physiologisches Substrat für Caspase 1. Abb. 21 B zeigt die spezifische


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Spaltung in das physiologisch aktive IL1ß durch die rekombinante Caspase 1. Diese Spaltung konnte durch ac-YVAD-fmk, einem spezifischen Inhibitor für Proteasen der Caspase 1 Familie gehemmt werden.

4.6.5. Untersuchung der SP1/DNA-Bindungsaktivität während der Apoptose

In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß der Transkriptionsfaktor SP1 nach anti-IgM induzierter Apoptose in ein 68 und 45 KDa großes Fragment gespalten wird. Dabei bleibt unklar, welche Domäne des Proteins abgespalten wird, und welche funktionellen Veränderungen die Spaltung des Proteins zur Folge hat. SP1 bindet über 3 Zink Finger Motive, die in den letzten 168 Aminosäuren C-terminal lokalisiert sind, an GC-Boxen verschiedener Promotoren. Die Transaktivierungsdomäne ist hingegen in den letzten 327 C-terminalen Aminosäuren lokalisiert. In einem elektro mobility shift assay (EMSA) wurde das DNA-Bindungsverhalten des Transkriptionsfaktors während der anti-IgM induzierten Apoptose untersucht (Abb. 22).

BL60-2 Zellen wurden für 0, 10, und 24 Stunden mit anti-IgM F(ab)2--Fragmenten kultiviert. Die Kernextrakte wurden mit einer 32P-markierten SP1/DNA-Bindungssequenz inkubiert (Spur 1-9). Die spezifischen SP1 Protein/DNA Komplexe wurden auf einem 5 %-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Zur Qualitätskontrolle der Kernextrakte wurde ein 32P-markiertes Oligonukleotid, das spezifisch ist für Oct-2, einen konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktor, eingesetzt (Abb. 22, Spur 13-15). Die Untersuchung der SP1 Bindungsaktivität zeigte drei spezifische SP1/DNA Komplexe (Klammer in Abb. 22). Die Intensität dieser SP1/DNA-Komplexe nahm während der anti-IgM Stimulation ab (Spur 1-3). Dieses Ergebnis wurde in einem Supershift mit einem spezifischen SP1 bindenden Antikörper bestätigt (SP1*, Spur 4-5). Die Spezifität des Supershifts wurde durch Kompetition mit einem Peptid, das ebenfalls von dem Antikörper erkannt wird bewiesen (SP1 *, Spur 7-9). Ein Signal, das auf einen kleineren DNA-Protein-Komplex hinwies, konnte 10 Stunden nach anti-IgM Inkubation detektiert werden und die Intensität dieses Komplexes nahm nach 24 Stunden stark zu (Spur 1-3). Dieser kleinere DNA-Protein-Komplex ließ auf die Bindung eines SP1 Spaltproduktes an die SP1 Bindesequenz schließen. Die Spezifität der SP1 Komplexe wurde mit einem mutierten Oligonukleotid überprüft, an das das SP1 Protein nicht binden kann (Spur 10-12).

Der EMSA zeigte, daß ein SP1 Spaltprodukt immer noch an die DNA bindet. Möglicherweise ist dieses Spaltprodukt funktionell inaktiv und wirkt dominant negativ.


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Abb. 22 SP1 Bindungs-Aktivität nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose
BL60-2 Zellen wurden über verschiedene Zeiträume mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten inkubiert. Die Kernextrakte dieser Zellen wurden mit 32P-markierten SP1-spezifischen Oligonukleotiden (Spur 1-9), mutierten 32P-markierten SP1 Oligonukleotiden (Spur 10-12) oder Oct-2 spezifischen Oligonukleotiden inkubiert (Spur 13-15). Drei spezifische SP1 Komplexe konnten detektiert werden, die in Intensität während der anti-IgM Inkubation abnahmen (Spur 1-3). Diese Intensitätsabnahme konnte im Supershift mit einem SP1-spezifischen Antikörper bestätigt werden (Spur 4-6). Die Spezifität des Supershifts wurde durch Peptid-Kompetiton überprüft (Spur 7-9). Ein kleinerer Komplex (SP1-Spaltprodukt) erschien nach 10 Stunden anti-IgM Inkubation und nahm an Intensität nach 24 Stunden stark zu. Die Bindung des konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Oct-2 an die spezifische Oligonukleotidsequenz wies auf gleiche Qualitäten der Kernextrakte zu verschiedenen Zeitpunkten der anti-IgM Stimulation hin (Spur 13-15).

4.6.6. Messung der Aktivität von Proteasen der Caspase 3 Familie während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

In einem kolorimetrischen Versuch konnte die Caspase 3 Aktivität während der anti-IgM induzierten Apoptose gemessen werden. BL60-2 Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach anti-IgM Stimulation lysiert und mit dem Substrat DEVD-pNA (p-Nitroanilid) inkubiert. Die aktive Caspase 3 spaltet das Chromophor pNA vom Tetrapeptid DEVD, der Caspase 3 Erkennungssequenz ab. Die Freisetzung des Chromophors pNA kann dann im Photometer bei einer Wellenlänge von 400 nm gemessen werden und ist proportional zur Caspase 3 Aktivität. Abb. 23 zeigt den Anstieg der Caspase 3 Aktivität während der anti-IgM induzierten Apoptose.


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Abb. 23 Anstieg der Caspase 3-Aktivität nach anti-IgM induzierter Apoptose
Die Caspase 3 Aktivität wurde durch die Spaltung des Substrates DEVD-pNA bestimmt. 106 BL60-2 Zellen wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten anti-IgM-Stimulation lysiert und mit DEVD-pNA inkubiert. Die Freisetzung des Chromophors pNA wurde bei einer optischen Dichte von 400 nm gemessen. Lysate, die zuvor mit z-DEVD-fmk inkubiert wurden, zeigten eine starke Reduktion der Caspase 3-Aktivität (Pfeil).

Die Caspase 3 Aktivität nahm während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose zunächst langsam zu, stieg nach 8 Stunden stark an und erreichte die maximale Aktivität nach 16 Stunden Induktion. Nach 27 Stunden anti-IgM Inkubation nahm die Caspase-Aktivität wieder leicht ab. Die pNA-Freisetzung konnte durch Vorinkubation mit z-DEVD-fmk (5 µM), dem spezifischen Inhibitor für Proteasen der Caspase 3 Familie, stark vermindert werden (Pfeil in Abb. 23). Die Caspase 3 Aktivitätskinetik korreliert mit den bisherigen Ergebnissen, der Spaltung der Proteine D4-GDI, hnRNP A1, SP1, wie der Phosphatidylserintranslokation.


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