Rickers, Anke: Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

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Kapitel 5. Ergebnisse-Teil 2

5.1. Identifikation Apoptose-assoziierter Gene

Aus vorangegangenen Experimenten wie aus der Literatur war bekannt, daß die de novo Synthese von RNA für die anti-IgM induzierte B-Zell Apoptose notwendig ist. Die Transkription verschiedener Gene wird während der anti-IgM induzierten Apoptose reguliert und scheint eine wichtige Bedeutung zu haben. In dieser Arbeit sollten Gene identifiziert werden, deren Transkription während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose abgeschaltet oder angeschaltet wird.

Verschiedene Methoden ermöglichen die Isolierung Apoptose-regulierender Gene. Mittels der Differential Display-RT-PCR (DDRT-PCR) und subtraktiver Hybridisierungstechniken können Gene identifiziert werden, die in der einen Zellpopulation exprimiert werden, in der anderen nicht.

Die Differential Display Methode beruht auf der Amplifikation exprimierter Sequenzen einer Zelle nach Reverser Transkription der mRNA. Die in einer Polymerase Kettenreaktion amplifizierten Sequenzen werden dann auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Expressionsunterschiede in den zu vergleichenden Zellpopulationen führen zu einem differentiellen Bandenmuster. Diese differentiellen Sequenzen können dann isoliert und sequenziert werden.

Differentielle Hybridisierungen von cDNA-Phagenbanken erlauben ebenso die Identifizierung unterschiedlich exprimierter Gene. Phagenbanken repräsentieren die Information der mRNA einer Zelle in lambda-Vektoren. Die Hybridisierung einer cDNA-Phagenbank mit cDNA-Sonden aus zwei Zellpopulationen läßt die Identifizierung unterschiedlich stark hybridisierender Phagenplaques zu, was auf unterschiedliche Expression der mRNA hinweist.

Eine Anreicherung spezifischer Sequenzen kann durch eine Subtraktion erreicht werden. Dabei werden gemeinsame cDNA-Moleküle (oder mRNA-Moleküle) der ersten Zellpopulation durch Hybridisierung mit mRNA (oder cDNA) der zweiten Zellpopulation eliminiert (subtrahiert). Die nicht hybridisierenden Sequenzen sind spezifisch für eine der beiden Zellpopulationen und können dann zur subtraktiven Hybridisierung einer lambda-Zap Phagenbank verwendet werden. Sie können aber auch in lambda-Phagen verpackt (subtraktive lambda-Zap cDNA-Phagenbanken) oder direkt in Plasmide kloniert werden (subtraktive Klonierung).

In dieser Arbeit wurden oben genannte Methoden der differentiellen Hybridisierung einer lambda-Zap cDNA-Phagenbank, einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank, sowie der subtraktiven Klonierung angewandt, um Apoptose-spezifische Sequenzen zu identifizieren.

Unter 5.1.1 wird zunächst die Herstellung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken vor und nach anti-IgM Stimulation der BL41-3s Zellinie beschrieben, da zu diesem Zeitpunkt der Arbeit der sensitivere und stabilere BL60-2 Klon noch nicht zur Verfügung stand.


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Der BL60-2 Klon diente der Herstellung einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank, die unter 5.1.2 beschrieben wird.

In einem Screening wurde dann sowohl die lambda-Zap cDNA-Phagenbank aus stimulierten B-Zellen, wie auch die subtraktive cDNA-Phagenbank auf differentiell exprimierte Gene durchmustert. Diese differentielle Hybridisierung erfolgte mit einer cDNA-Sonde aus B-Zellen, die zuvor 4 h mit anti-IgM induziert wurde im Vergleich zu einer cDNA-Sonde aus unstimulierten B-Zellen und wird unter 5.1.3 näher beschrieben. Die Herstellung einer subtraktiven Sonde, wie der differentielle Screen mit dieser Sonde wird unter 5.1.4 beschrieben. Zur Sensitivitätssteigerung wurde in einem zweiten Ansatz versucht, apoptotische Sequenzen über die klassische Hydroxyaptit-Matrix anzureichern (5.1.7).

5.1.1. Herstellung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken

Zur Herstellung der lambda-ZAP cDNA-Phagenbanken wurde mRNA aus stimulierten und nicht stimulierten BL41-3s Zellen isoliert und je eine cDNA-Phagenbank jeden RNA-Pools hergestellt. Die lambda-Zap cDNA-Phagenbank aus stimulierten BL41-3s Zellen sollte Apoptose-spezifische Sequenzen enthalten, die durch differentielle Hybridisierung der cDNA-Phagenbank identifiziert werden sollten.

Der BL41-3s Subklon ist sensitiv auf den anti-IgM Apoptose Stimulus. Nach 24 Stunden Induktion zeigen etwa 40 Prozent der Zellen fragmentierte Kerne, was dem Anteil apoptotischer Zellen entpricht (Färbung mit Acridinorange). Da die Regulation der Transkription eine sehr schnelle Antwort für die Zelle auf einen Stimulus sein kann, und bereits gezeigt wurde, daß nach 4 Stunden anti-IgM Induktion die Expression von c-myc, Nak-1 und bax-alpha stark verändert ist, wurde dieser Zeitpunkt für die Herstellung der lambda-Zap cDNA-Phagenbank gewählt.

Die Herstellung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken erfolgte nach dem Protokoll des “lambda Zap II cDNA cloning Kits“ von Stratagene (s. 3.1.2 und Abb. 3). Der Titer der hergestellten cDNA-Phagenbank betrug 2,6 x 1010 pfu für die cDNA-Phagenbank aus nicht stimulierten Zellen und 1 x 1010 pfu für die cDNA-Phagenbank aus stimulierten BL41-3s Zellen. Das lambda-Zap-System bietet den Vorteil, daß die cDNA-Sequenzen in einen Blueskript-Vektor kloniert werden, der mittels Helpherphagen durch in vivo Exzision aus der lambda-DNA isoliert werden kann (3.1.5). Anhand der Größe der klonierten Inserts, sowie dem Anteil konstitutiv exprimierter und spezifisch exprimierter Gene wurde die Qualität der cDNA-Phagenbank überprüft.

Eine gute cDNA-Phagenbank sollte viele lange Sequenzen enthalten, die Kopien der mRNA Population vollständiger Länge sind. Das erleichtert u.a. die Klonierung der kompletten kodierenden Sequenzen unbekannter Gene. Die Größe der klonierten Fragmente wurde nach in vivo Exzision des Blueskript Plasmids und anschließender EcoRI/XhoI Restriktionsspaltung bestimmt und lag zwischen 500 Bp und 4 Kb. Die meisten RNA-Moleküle liegen in ihrer Größe zwischen einigen hundert Basenpaaren und einigen Kilopasenpaaren. Die


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erstellten cDNA-Phagenbanken enthalten somit wahrscheinlich vollständige Kopien vieler RNA-Moleküle. Weniger als 0.02% der cDNA-Phagen waren ohne Insert, was ebenfalls auf eine gute Ligationseffizienz schließen ließ.

Die lambda-Zap cDNA-Phagenbank, hergestellt von unstimulierten bzw. anti-IgM stimulierten BL41-3s Zellen sollte nun die Sequenzen enthalten, die der mRNA der Zelle zum jeweiligen Zeitpunkt der RNA-Präparation entsprechen. Die cDNA-Phagenbank, die nach 4 Stunden anti-IgM Stimulation hergestellt wurde, konnte nun in einer differentiellen Hybridisierung auf spezifische Sequenzen, die nach anti-IgM Induktion exprimert werden durchmustert werden (5.1.3).

5.1.2. Herstellung einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank

Die Herstellung einer subtraktiven cDNA-Phagenbank erlaubt eine Anreicherung Apoptose-spezifischer Transkripte und erleichtert die Identifizierung Apoptose-spezifischer Sequenzen.

Zunächst wurde mRNA von unstimulierten und stimulierten (4 h anti-IgM) BL60-2 Zellen präpariert. Die RNA der stimulierten Zellen wurde in cDNA konvertiert und mit einem 10-fachen Überschuß an photobiotinylierter RNA unstimulierter Zellen hybridisiert. Sequenzen, die in beiden Zellpopulationen vorhanden sind hybridisieren, während Sequenzen, die nur in den stimulierten Zellen vorhanden sind nicht hybridisieren. Die RNA/cDNA Hybride wurden über Phenol/Chloroform Extraktion abgetrennt. Nicht hybridisierte cDNA-Sequenzen wurden in doppelsträngige cDNA konvertiert, die Enden wurden aufgefüllt und mit EcoRI-Linkern ligiert. Die Fragmente wurden in einer Polymerase Kettenreaktion amplifiziert, EcoRI gespalten, in lambda-Zap DNA kloniert und in Phagen verpackt (Abb. 24). Der Titer der subtraktiven cDNA-Phagenbank betrug 7.5 x 1010pfu. Da der Klonierung eine PCR vorausgeht, konnten die doppelsträngigen Sequenzen nicht hemimethyliert,und interne EcoRI Schnittstellen nicht geschützt werden. Die klonierten Sequenzen sind somit verhältnismäßig klein, und die Klonierung kompletter cDNA-Sequenzen ist nicht zu erwarten. Die Größe der klonierten Inserts wurde durch PCR einzelner Phagen mit Blueskript spezifischen SP6 und T7 Primern überprüft und lag zwischen 200-600 Basenpaaren. Die Qualität der subtrahierten cDNA-Phagenbank wurde durch Hybridisierung mit einer Sonde, spezifisch für das konstitutiv exprimierte ß-Aktin Gen, sowie einer Sonde für den Transkriptionsfaktor Nak-1, für den gezeigt wurde, daß die mRNA-Menge nach anti-IgM induzierter Apoptose zunimmt, überprüft. Dazu wurden 105 pfu auf XL1-blue Zellen ausplattiert und die Phagenplaques auf Nylon Filter transferiert. Die Filter wurden mit den entsprechenden, radioaktiv markierten Sonden hybridisiert. Die positiven ß-Aktin Signale betrugen weniger als 5 % in Bezug auf die Gesamtzahl der ausplattierten Phagenplaques. Diese Ergebnis bewies eine Subtraktion konstitutiv exprimierter Gene. Die Hybridisierung von nur 105 Phagenplaques ergab ein positives NAK-1 Signal, was auf eine Anreicherung der Sequenz dieses schwach exprimierten Gens hinwies.


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Abb. 24 Herstellung einer subtraktiven lambda-Zap cDNA-Phagenbank
Aus stimulierten (4h anti-IgM F(ab)2) und nicht stimulierten BL60-2 Zellen wurde die poly(A)+-RNA isoliert. Die RNA der nicht stimulierten Zellen wurde photobiotinyliert und mit der cDNA induzierter Zellen hybridisiert. Nicht hybridisierte cDNA wurde durch Phenol/Chloroform (P/C) Extraktion isoliert und in doppelstängige-cDNA konvertiert. Die Enden wurden aufgefüllt und mit spezifischen EcoRI-Linkern ligiert. Diese Fragmente wurden in einer PCR amplifiziert, EcoRI gespalten, in lambda-Zap-DNA kloniert und in Phagen verpackt.


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5.1.3. Differentielle Hybridisierung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken

Um Gene zu identifizieren, die nach Apoptose-Induktion differentiell exprimiert werden, wurden die cDNA-Phagenbanken der stimulierten BL41-3s Zellen sowie die subtraktive lambda-Zap cDNA-Phagenbank ausplattiert und differentiell hybridisiert (Abb. 25).

Es wurden soviele Phagen ausplattiert, daß gewährleistet ist, daß alle Transkripte einer Zelle repräsentiert sind. Das enstpricht ca. 106 pfu der stimulierten Phagenbank (4 h anti-IgM), bzw. bei einer 10-fachen Anreicherung ca. 105 pfu der subtraktiven cDNA-Phagenbank. Das Prinzip der differentiellen Hybridisierung ist in Abb. 25 dargestellt.

Abb. 25 Schematische Darstellung der differentiellen Hybridisierung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken
lambda-Zap cDNA-Phagenbanken, hergestellt von nicht stimulierten, und Apoptose induzierten BL41-3s Zellen (4 h anti-IgM F(ab)2) wurden ausplattiert und die Phagenplaques auf je 2 Nylonmembranen transferiert. Je eine Membran wurde mit einer 32P-markierten cDNA-Probe von nicht stimulierten BL41-3s Zellen, und mit einer 32P-markierten cDNA-Probe von stimulierten BL41-3s Zellen hybridisiert. Differentiell hybridisierende Plaques wurden gepickt, erneut ausplattiert und hybridisiert. Klonierte Sequenzen wurden nach in vivo excision sequenziert.


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5.1.4. Hybridisierung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken mit einer subtrahierten Probe

Zur Sensitivitätssteigerung sollte die lambda-Zap cDNA-Phagenbank ebenfalls mit einer subtrahierten Probe im Vergleich zu einer cDNA-Sonde aus nicht stimulierten Zellen differentiell hybridisiert werden.

Die subtrahierte Sonde wurde mit dem “PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit“ von Clontech hergestellt und diente ebenfalls der Anreicherung spezifischer Sequenzen, die nach anti-IgM induzierter Apoptose exprimiert werden (s. 3.1.6). Sequenzen, die in unstimulierten und anti-IgM stimulierten Zellen exprimiert werden, werden dabei über zwei Hybridisierungsschritte subtrahiert. Nicht hybridisierende Sequenzen wurden in einem anschließenden PCR-Schritt, sowie einer internen, nested PCR, amplifiziert. Diese amplifizierte Sonde wurde für die differentielle Hybridisierung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken eingesetzt.

Zunächst wurde die Anreicherungseffizienz der subtrahierten Probe überprüft. Sequenzen konstitutiv exprimierter Strukturgene wie z.B. ß-Aktin sind im Vergleich zu vielen spezifisch exprimierten Genen in großen Mengen in einer Zelle vorhanden. Diese mRNA Sequenzen sollten durch die Subtraktion in Bezug auf die Gesamt RNA Menge deutlich vermindert werden. Um die Subtraktionseffizienz zu überprüfen wurden in einem Southern Blot gleiche Mengen des PCR-Ansatzes der subtrahierten Sonde, einer subtrahierten Kontrolle, und der entsprechenden nicht subtrahierten Proben mit einer radioaktiv markierten ß-Aktin Sonde hybridisiert. Die Signale wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht (Abb. 26).


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Abb. 26 Southern Blot Analyse der subtrahierten Probe mit einer ß-Aktin Sonde
Die DNA von BL60-2 Zellen vor und nach Subtraktion Apoptose-spezifischer Sequenzen (PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit von Clontech), sowie einer Kontrolle wurden auf einem 2 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf eine Nylonmembran wurden die Blots mit einer 32P-markierten ß-Aktin Sonde hybridisiert. Die deutliche Abnahme der ß-Aktin Signale zeigt die erfolgreiche Subtraktion.

Die Hybridisierung zeigte, daß der Anteil an ß-Aktin Sequenzen nach Subtraktion deutlich vermindert und eine Anreicherung Apoptose-spezifischer Sequenzen somit wahrscheinlich ist.

Diese subtrahierte Sonde wurde nun ebenfalls für den differentiellen Screen der cDNA-Phagenbanken eingesetzt. Dazu wurde die lambda-Zap cDNA-Phagenbank von stimulierten BL41-3s Zellen, bzw. die subtrahierte cDNA-Phagenbank ausplattiert, und wie unter 5.1.3 beschrieben mit einer radioaktiv markierten Sonde von cDNA nicht stimulierter BL41-3s Zellen im Vergleich mit der subtraktiven Sonde hybridisiert.

Die gepickten Klone wurden durch in vivo Exzision in das Blueskript Plasmid konvertiert. Die erhaltenen Sequenzen wurden in einer Slot Blot Analyse auf ihre differentielle Expression hin überprüft und sind ebenfalls in Tab. 2 (s. Anhang) aufgelistet.

5.1.5. Slot Blot Analyse

Alle identifizierten, differentiell hybridisierenden Klone wurden nun in einer Slot Blot Analyse erneut hybridisiert. Da die Zahl der gepickten Klone sehr groß war, sollten falsch positiv gepickte Klone identifiziert werden, bevor sie in der vergleichsweise aufwendigen Northern Blot- und Run-on-Analyse auf ihre differentielle Expression überprüft werden.

Dazu wurde pro Klon ca. 1 µg der Plasmid DNA mit einer Slot Blot Apparatur von Schleicher und Schüll auf eine Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde geteilt, so daß zwei identische Hälften entstanden. Eine Hälfte wurde mit einer 32P-markierten cDNA-Sonde von stimulierten, oder einer subtrahierten Sonde, die andere Hälfte mit einer Sonde von nicht stimulierten BL60-2 Zellen hybridisiert. Das Ergebnis konnte durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden und ist für einige Plasmide in Abb. 27 dargestellt.


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Abb. 27 Slot Blot Analyse gepickter Klone mit 32P-markierten cDNA-Sonden
DNA verschiedener Klone wurde auf eine Nylonmembran transferiert und UV-fixiert. Die Membranen wurden halbiert und mit einer radioaktiv markierten cDNA nicht stimulierter BL60-2 Zellen bzw. einer subtrahierten Probe hybridisiert.

Klone, von denen bekannt war, daß die Expression während der anti-IgM induzierten Apoptose reguliert wird, dienten als Kontrolle. Für Nak-1 war bekannt, das die Transkriptmenge stark zunimmt, und die DNA diente hier als Positiv-Kontrolle. Klone, die in der Slot Blot Analyse ebenfalls differentiell hybridisierten, wurden in einer Run-on-Analyse sowie einer Northern Blot Analyse untersucht.

5.1.6. Run-on-Analyse

Die Run-on-Analyse dient dem Nachweis neu synthetisierter RNA in Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Diese Methode bietet somit die Möglichkeit, nur die nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose neu synthetisierte mRNA zu identifizieren, was eventuell einen Sensitivitätsvorteil gegenüber anderen Methoden bietet, die den “steady state level“ in Zellen vergleichen.

Die differentielle Genexpression der zuvor identifizierten Klone sollte nun in der Run-on-Analyse bestätigt werden. Dazu wurde die neu synthetisierte mRNA in isolierten Kernen von


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unstimulierten und stimulierten BL60-2 Zellen (4 h anti-IgM) durch Zugabe von alpha32 P-UTP radioaktiv markiert. Mittels der Slot Blot Apparatur wurden die identifizierten Klone, sowie die Kontrollen (GAPDH, Nak1, Bak) auf Nylonmembranen transferiert. Zur Hybridisierung der Slot Blots wurde die radioaktiv markierte RNA präpariert. Je eine Membran wurde mit der RNA gleicher Zellzahl von stimulierten und nicht stimulierten BL60-2 Zellen hybridisiert. Nach Exposition konnten die Signale detektiert und verglichen werden (s. Abb. 28). Die Intensität der Signale entspricht der Menge neu synthetisierten RNA vor und nach 4 Stunden anti-IgM Stimulation.

Abb. 28 Run-on-Analyse von BL60-2 Zellen vor und nach anti-IgM induzierter Apoptose
BL60-2 Zellen wurden für 4 Stunden mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten (+) bzw. ohne (-) kultiviert. Die Kerne dieser Zellen wurden präpariert und die neu synthetisierte mRNA durch Zugabe von alpha32P-UTP radioaktiv markiert. DNA verschiedener Klone wurde in einer Slot Blot Apparatur auf eine Nylonmembran transferiert und mit der radioaktiv-markierten RNA von stimulierten (+), bzw. nicht stimulierten (-) BL60-2 Zellen hybridisiert. Die spezifischen Signale wurden mittels Autoradiographie detektiert.

Als Negativ-Kontrolle diente GAPDH, ein konstitutiv exprimiertes Gen, von dem bekannt war, daß es während der anti-IgM Apoptose transkriptionell nicht reguliert wird. Die Intensität der der GAPDH-Signale war vor und nach anti-IgM Stimulation fast identisch, was auf gleiche Mengen neu synthetisierter 32P-markierter RNA hinwies. Die Intensität des NAK-1 Signals nahm nach anti-IgM Stimulation stark zu, was zeigt, daß NAK-1 transkriptionell reguliert wird. Dieses Ergebnis entspricht den bereits publizierten


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Ergebnissen, die zeigten, daß die Expression dieses Zink-Finger Transkriptionsfaktors nach anti-IgM induzierter Apoptose stark zunimmt. Die Intensität anderer Klone, die in der subtraktiven Hybridisierung der cDNA-Phagenbanken identifiziert wurden, hybridisierten in der Run-on-Analyse ebenfalls differentiell. Besonders stark nahm das Signal des Translations kontrollierten Tumorproteins (TCTP) zu, wie das schon in der Slot Blot Analyse identifizierte “single strand DNA binding protein“ (ssDNA binding protein). Die transkriptionelle Regulation dieser Klone während der anti-IgM induzierten Apoptose wurde in einer Northern Blot Analyse überprüft.

Die Northern Blot-Analyse ergab für alle bisher differentiell hybridisierenden Klone keine eindeutige Zunahme der mRNA Menge. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, daß sich die RNA-Menge während der anti-IgM Stimulation nicht ändert, bzw. in so geringem Maße, daß keine eindeutige Aussage getroffen werden konnte. Die Northern Blot Analysen widersprechen den vorangegangenen Experimenten, der differentiellen Hybridisierungen der Phagenbanken, der Slot Blot Analyse und der Run-on-Analyse. Deshalb sollte die subtraktive Anreicherung über eine klassische Methode, in der einzelne Schritte verbessert wurden, erreicht werden.

5.1.7. Subtraktive Klonierung mittels Hydroxyapatit-Chromatographie

In diesem Experiment sollten ebenfalls Sequenzen, die nach anti-IgM induzierter Apoptose-spezifisch exprimiert werden, angereichert und direkt in pGEM-T Plasmide kloniert werden. Um eine höhere Subtraktionseffizienz zu erreichen, wurde differentielle DNA über Hydroxyapatit (HAP)-Säulen getrennt. Sowohl einzelsträngige, als auch doppelsträngige DNA oder DNA/RNA-Hybride binden an HAP und können durch verschiedene Phosphat-Pufferkonzentrationen voneinander getrennt werden.

Einzelsträngige, nicht hybridisierende cDNAs sollten spezifisch für Apoptose stimulierte Zellen sein und wurden in zwei Hybridisierungsschritten von cDNA/mRNA Hybriden, die Sequenzen darstellen, die in beiden Zellpopulationen vorhanden sind, getrennt (3.1.7).

Nach einer weiteren positiven Selektion wurden diese nicht hybridisierenden Sequenzen in doppelstängige DNA umgeschrieben und in einer PCR amplifiziert. Zur Überprüfung der Subtraktionseffizienz wurde die Probe radioaktiv markiert und im Vergleich mit einer radioaktiv markierten Probe nicht stimulierter BL60-2 Zellen in einer Slot Blot Analyse getestet (Abb. 29). Die Autoradiographie der Slot Blots zeigte eine starke Anreicherung Apoptose-spezifischer Sequenzen, wie Nak-1, Bak und Bax-alpha während Sequenzen wie ß-Aktin, deren Expression sich während der anti-IgM induzierten Apoptose nicht ändert, komplett subtrahiert wurden. Dieses Ergebniss deutete auf eine gute Anreicherung von Sequenzen, die nach anti-IgM Induktion exprimiert werden.

Die angereicherten Sequenzen wurden in pGEM-T Vektoren kloniert und sequenziert. Alle sequenzierten Klone sind in Tab. 3 (Anhang) aufgelistet. Dabei wurden die Insertgrößen und die nach Datenbankvergleich erhaltenen DNA- und Proteinhomologien angegeben.


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Abb. 29 Slot Blot Analyse der 32P-markierten Probe nach Hydroxyapatit Anreicherung
DNA verschiedener Klone wurde mit einer Slot Bot-Apparatur auf eine Nylonmembran transferiert und UV-fixiert. Die Membranen wurden halbiert und mit je einer radioaktiv markierten cDNA nicht stimulierter BL60-2 Zellen und radioaktiv markierten subtrahierten DNA-Sonde (oder von stimulierten Zellen) hybridisiert. Apoptose-spezifische Sequenzen (Nak-1, bax-alpha, bak) sind in der subtrahierten Probe angereichert.

Ca. 90 Prozent der identifizierten Sequenzen sind unbekannt, d.h. es gibt keine Homologien zu schon bekannten Sequenzen in der Datenbank. Der Klon B54 hingegen hat eine hohe Homologie zur DNA-Sequenz von Mex B, einem bakteriellen Acriflavin resistance Protein. Der Klon B8 hat keine DNA-Homologie zu schon bekannten Genen, ist aber auf Proteinebene ebenfalls homolog zu dem Mex B Protein. Beide Klone überlappen aber in ihrer DNA Sequenz nicht. Es ist bisher kein zu dem Acriflavin resistance Protein homologes humanes Protein bekannt. Die Klone B8 und B54 sind somit eventuell Sequenzen eines bisher unbekannten, humanen Proteins, das nach anti-IgM induzierter Apoptose transkriptionell angeschaltet wird.

Die differentielle Expression des B54-Klons sollte in einer Northern Blot Analyse überprüft werden. Dazu wurden je 10 µg RNA pro Spur von unstimulierten und stimulierten BL60-2


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Zellen nach unterschiedlichen Zeitpunkten nach anti-IgM Induktion aufgetrennt. Selbst nach zweiwöchiger Exposition des Autoradiogramms konnte kein Signal nachgewiesen werden.

Eine Sensitivitätserhöhung konnte hingegen durch die Hybridisierung eines multiple tissue Northern Blots von Clontech, mit jeweils 2 µg poly(A)+-mRNA verschiedener humaner Gewebe erreicht werden.

Abb. 30 Analyse der gewebsspezifischen Expression des Klons B54
Multiple tissue Northern Blots, die je 2 µg elektrophoretisch getrennter poly(A)+-RNA verschiedener Gewebe enthalten (Clontech). Diese Membranen wurden mit einer radioaktiv markierten DNA des identifizierten Klons B54 hybridisiert. Der Pfeil zeigt die B54-spezifischen Signale nach Autoradiographie.

Die Northern Blot Analyse zeigte eine gewebsspezifische Expression dieses bisher unbekannten Gens. Eine starke Expression konnte in den unterschiedlichen Zellen des Immunsystems nachgewiesen werden, sowie im Skelettmuskel und Herz (Abb. 30).

Die entsprechende komplette cDNA-Sequenz des Klons B54 soll nun durch Hybridisierung der lambda-Zap cDNA-Phagenbank kloniert und die funktionelle Bedeutung in Bezug auf die anti-IgM induzierte Apoptose untersucht werden.


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