Rickers, Anke: Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

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Kapitel 6. Diskussion

Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Modellsystem etabliert, daß zur Untersuchung der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose diente und die Identifikation Apoptose-assoziierter Proteine, durch den subtraktiven Vergleich der zweidimensionalen Proteinmuster vor und nach Apoptose Stimulation ermöglichte. Im weiteren wurde die Bedeutung der identifizierten Proteine für die Apoptose untersucht. In diesem Zusammenhang konnte die zentrale Rolle der Caspase 3 für die anti-IgM induzierte Apoptose aufgezeigt werden, die hier im Zusammenhang mit einigen der identifizierten Proteinen diskutiert wird.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden über verschiedene Methoden der subtraktiven Klonierung und differentiellen Hybridisierung von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken Apoptose spezifisiche Sequenzen angereichert. Es sollten Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten Apoptose differentiell exprimiert werden und damit potentielle Regulatoren der Apoptose darstellen. Die verschiedenen Methoden und die Ergebnisse werden hier diskutiert.

Apoptose läuft nach einem genetischen Programm ab und ist durch charakteristische morphologische Merkmale gekennzeichnet (2). Die Regulatoren, die diese morphologischen und biochemischen Prozeß steuern, sind noch weitgehend unbekannt. Zu Beginn dieser Arbeit waren bereits einige der pro-und anti-apoptotischen Proteine der bcl-2 Familie bekannt, deren Bedeutung in der Apoptose von besonderem Interesse war (105). In den letzten Jahren konnten weitere wichtige Regulatoren, die zum Zelltod führen, besonders durch Studien an dem Nematoden Caenorhabditis elegans identifiziert werden. Dazu gehören vor allem die Gene ced 3, ced 4, und ced 9, deren humane Homologe mittlerweile identifiziert wurden. Ced 9 ist das humane Homologe zu bcl-2 und ced-3 das humane Homologe zur Caspase 3 (14, 15). Das humane Homologe zu ced-4, Apaf 1 konnte ebenfalls kürzlich identifiziert werden und stellt ein Bindeglied zwischen der Familie der Caspasen und der bcl-2 Familie dar (56). Mechanismen der Apoptose sind evolutionär konserviert, aber auch Zelltyp-spezifisch und abhängig von dem Stimulus, der die Apoptose auslöst. Am besten aufgeklärt ist die Aktivierungskaskade die über das Apoptose-spezifische Antigen FAS ausgelöst wird (106). Ähnliche Kaskaden wurden für die TNF-Rezptor induzierte Apoptose identifiziert. Im Gegensatz dazu ist die anti-IgM induzierte B-Zell Apoptose noch weitgehend unverstanden, was nicht zuletzt darauf zurückzuführen ist, daß es bisher kein sensitives Modellsystem gab. Als Modell für die bisherigen Studien diente im wesentlichen die Maus Zellinie WEHI 231.

Die Identifikation neuer Proteine und Gene, die an der anti-IgM induzierten Apoptose beteiligt sind, bietet Einblick in das Verständnis der Apoptose Prozesse und damit eventuell Ansatzpunkte für Therapien verschiedener Krankheiten, die auf einer Fehlregulation Apoptose regulierender Proteine beruhen.


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6.1. Identifikation Apoptose-assoziierter Proteine

Um Proteine identifizieren zu können, die in dem Prozeß der anti-IgM induzierten Apoptose eine wichtige Rolle spielen, wurde zunächst ein Modellsystem etabliert.

Durch extensive Subklonierung der humanen Burkitt Lymphom Zellinie BL 60 wurde ein Subklon erhalten, der hoch sensitiv auf den Stimulus ist. Nach 24 Stunden anti-IgM Induktion sind 40-60 Prozent der Zellen apoptotisch (gemessen an der Anzahl fragmentierter Kerne nach Acridinorange-Färbung bzw. Annexin-V/FITC Markierung und anschließender FACS Analyse). Je höher der prozentuale Anteil apopotischer Zellen, desto leichter lassen sich Proteine in einem subtraktiven Vergleich identifizieren, die spezifisch für apoptotische Veränderungen sind.

Um die Sensititvität noch zu erhöhen, wurde eine Methode etabliert, durch die apoptotische von nicht apoptotischen Zellen getrennt werden können. Apoptotische Zellen sind durch die Translokation von Phosphatidylserin (PS) auf die Außenseite der Zelle gekennzeichnet (8). Annexin-V bindet spezifisch an PS, was die Markierung der apoptotischen Zellen mit Annexin-V/FITC ermöglichte (107). In einem zweiten Schritt wurden diese Zellen an anti-FITC magnetische beads gekoppelt und über eine Säule, die sich in einem Magnetfeld befindet, von nicht apoptotischen Zellen separiert. Die dabei erreichte Reinheit betrug 95 Prozent. Mit dieser Methode wurden auch spontan apoptotische Zellen, deren Anteil in einer unstimulierten Population BL60-2 Zellen ca. 3-10 Prozent ausmacht, abgetrennt. Die hochsensitive BL60-2 Zellinie und die anschließende magnetische Separation erlaubte zum ersten mal den Vergleich apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen mittels der 2D-Gelelektrophorese. Gesamtzellysate der beiden Zellpopulationen wurden mit der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Im visuellen, subtraktiven Vergleich der silbergefärbten 2D-Gele konnten ca. 80 Proteinspots von insgesamt ca. 3300 identifiziert werden, die nach Apoptose-Induktion verändert waren. Veränderungen im Proteinmuster können dabei auf Proteine zurückzuführen sein, deren Expression sich während der Apoptose verändert, was zu einer Intensitätsänderung der Spots nach Apoptoseinduktion führt. Diese Regulation kann auf transkriptioneller oder auf translationeller Ebene erfolgen. Ebenso können Veränderungen detektiert werden, die auf die Modifikation von Proteinen zurückzuführen sind, falls damit eine Ladungsänderung des Proteins einhergeht. In der ersten Dimension der 2D-Gelelektrophorese, werden Proteine nach ihrer Ladung getrennt. Die Änderung des isolelektrischen Punktes eines Proteins hat somit eine Änderung der Lage des entprechenden Proteins in der ersten Dimension zur Folge. 15 differentielle Proteinspots wurden bisher in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. B. Wittmann-Liebold durch Edman Abbau und Massenspektrometrie identifiziert (s. Tab. 1). Einige der identifizierten Proteine konnten Fragmenten schon bekannter Proteine zugeordnet werden. Dabei handelt es sich u.a. um Strukturproteine wie ß-Aktin, Lamin, oder neutrales Calponin. In Publikationen der letzten Jahren wurde eine Spaltung von ß-Aktin und Lamin während der Apoptose beschrieben, wobei angenommen wird, daß die Spaltung dieser Proteine mit der


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Umstrukturierung des Cytoskeletts während des Prozesses der Apoptose im Zusammenhang steht (52, 108). Andere identifizierte Proteine gehören zur Familie der heterogenen nukleären Ribonucleoproteine, hnRNPC1/C2, hnRNPA1, hnRNPK, deren Bedeutung unter 6.1.3 diskutiert wird. Außerdem wurde der GTPase Inhibitor für Proteine der Rho Familie, das D4-GDI identifiziert, dessen Rolle unter 6.1.4 näher betrachtet wird. Weitere identifizierte Proteine sind das RAD 23 homolge Protein (HHR23B), ein DNA-Reparaturenzym, das 60 S ribosomale Protein P0, das dem Heterochromatin Protein 1 alpha homologe Protein (HP1 alpha), Nucleolin, Deoxyuridin 5´-triphosphat Nukleotidohydrolase (dUTPase) und das Lymphozyten spezifische Protein LSP1.

Die Veränderungen dieser Proteine wurden bisher noch nicht näher untersucht und werden hier nicht weiter diskutiert.

6.1.1. Die Rolle des D4-GDI Proteins während der anti-IgM induzierten Apoptose

Im subtraktiven Vergleich der 2D-Gele apoptotischer und nicht apoptotischer BL60-2 Zellen wurde das D4-GDI Protein identifiziert. D4-GDI ist ein Inhibitor für GTPasen der Rho Proteinfamilie. Das Protein wird spezifisch im hematopoietischen System exprimiert. Ein Proteinspot, der als D4-GDI identifiziert wurde, nahm nach anti-IgM induzierter Apoptose an Intensität im 2D-Gel stark ab (Abb 10, Spot D). Im weiteren Verlauf der Identifikation differentieller Proteinspots wurde ein Spot identifiziert, der nach Apoptose Stimulation stark zunahm. Dieser Spot wurde als ein Spaltprodukt des D4-GDI Proteins identifiziert (Abb. 10, Spot D´). In der eindimensionalen Western Blot Analyse konnte der Zeitverluaf der Spaltung des 27 KDa D4-GDI Proteins in das 23 KDa große Fragment nach 8 Stunden anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose bestimmt werden (Abb. 11). Ein Sequenzvergleich der Aminosäuren des D4-GDI Proteins mit den Erkennungssequenzen für Caspasen, ergab eine Konsensussequenz (DXXD) spezifisch für Caspase 3 an der Position Aspartat19 des D4-GDI Proteins. Die Spaltung an dieser Stelle würde ein 23 KDa großes und ein 5 KDa großes Fragment generieren. Die Spaltung in ein 23 KDa großes Fragment entspricht dem Ergebnis der eindimensionalen Western Blot Analyse. Das 5 KDa Fragment konnte allerdings nicht detektiert werden, da es nicht vom Antikörper erkannt wird. Das D4-GDI Protein bindet an das C-terminale Ende von Rho-GTPasen, so daß diese nicht mehr mit anderen Proteinen interagieren können, und dadurch inaktiviert werden. Es konnte kürzlich gezeigt werden, daß der C-Terminus des D4-GDI Proteins für die Bindung an Rho Proteine und der N-terminus für den Nukleotid Austausch der GTPasen verantwortlich ist (109). Die Spaltung des D4-GDI Proteins in ein 5 KDa N-terminales Fragment und ein 23 KDa großes C-terminales Fragment muß somit Auswirkungen auf die inhibitorische Funktion des Proteins haben. In zukünfigen Experimenten ist die Überexpression der Spaltprodukte sowie die Expression nicht spaltbarer Mutanten geplant und soll Einblick in die Bedeutung des D4-GDI Proteins während der anti-IgM induzierten Apoptose geben. Rho GTPasen sind an der


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Regulation der Protein Kinase p38 und der c-jun-N-terminalen Kinase, sowie der Organisation des Aktin Cytoskeletts beteiligt (110, 111). Die Spaltung des D4-GDI ist somit eventuell auch für die morphologischen Veränderungen während der Apoptose verantwortlich. Danley et al. beschrieben ebenfalls die D4-GDI Spaltung in Jurkat T-Zellen nach FAS induzierter Apoptose (112). Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Arbeit wurde die Spaltung in zwei Fragmente beobachtet. Die Spaltung in ein 17 KDa großes Fragment erfolgt durch die Spaltung der Caspase 1 an der Position LLGD55G. Dieses Spaltprodukt konnte nach anti-IgM induzierter Apoptose nicht detektiert werden. Die Spaltung in das 23 KDa große Fragment stimmt hingegen mit den Ergebnissen dieser Arbeit überein und ist durch die Caspase 3 bedingt. Das die Caspase 3 für die spezifische Spaltung verantwortlich ist, wurde durch die Zugabe des zellpermeablen, irreversiblen Inhibitors z-DEVD-fmk, der spezifisch für Proteasen der Caspase 3 Familie ist, überprüft. Die Zugabe dieses Inhibitors vor der Apoptose-Induktion mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten hemmt die Spaltung des D4-GDI Proteins dosisabhängig (s. Abb.12). Die Zugabe des Inhibitors ac-YVAD-fmk, einem Inhibitor für Proteasen der Caspase 1 Familie konnte die Spaltung hingegen nicht hemmen. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, das D4-GDI während der anti-IgM induzierten Apoptose durch Caspase 3, nicht aber durch Caspase 1 gespalten wird.

6.1.2. Heterogene nukleäre Ribonucleoproteine während der anti-IgM induzierten Apoptose

Heterogene nukleäre Ribonucleoproteine (hnRNPs) binden preRNAs und hnRNAs und sind an der Bildung der Ribonucleokomplexe und Splicosomenkomplexe. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Prozessierung von RNA sowie der Regulation der Transkription und Translation. Es sind ca. 40 verschiedene Ribonukleoproteine mit unterschiedlichen Funktionen bekannt. HnRNP Proteine haben auch strukurelle Funktion, wie die Verpackung von pre-mRNA-Molekülen. Für das hnRNP A1 wurde gezeigt, daß es an dem Export von RNA aus dem Zellkern beteiligt ist (113-115). Das hnRNP K Protein ist an der transkriptionellen Aktivierung verschiedener Gene beteiligt (116).

Die Komplexität dieser großen Proteinfamilie wird unter anderem durch alternatives Splicing der mRNA erreicht. So unterscheiden sich die hnRNP C1 und C2 Proteine durch eine 13 Aminosäure große Insertion, die durch Verwendung alternativer Splicesites in der RNA zustande kommt (117).

In dieser Arbeit wurden Spaltprodukte der hnRNP C1/C2 und hnRNP A1 Proteine identifiziert, die während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose generiert wurden. Das hnRNP K Protein ist nach anti-IgM induzierter Apoptose im 2D-Gel nicht mehr zu detektieren. Für das hnRNP A1 Protein konnte in der eindimensionalen Western Blot Analyse gezeigt werden, daß 3 Spaltprodukte, der Größen 30 KDa, 19 KDa und 16 KDa sukzessiv, mit zunehmender Inkubationszeit der BL60-2 Zellen mit anti-IgM F(ab)2-Fragmenten nach 8, 12 und 24 Stunden generiert werden (Abb. 13). Da das hnRNPA1


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Protein während der anti-IgM induzierten Apoptose, spezifisch in 3 Fragmente gespalten wird, lag die Vermutung nahe, daß an dieser Spaltung ebenso Caspasen beteiligt sind. Diese Vermutung wurde durch ein Experiment bestätigt, in dem die Spaltung durch den Inhibitor für Proteasen der Caspase 3 Familie, z-DEVD-fmk blockiert wurde (Abb. 14). Ein Vergleich der hnRNP A1 Aminosäuresequenz mit der Konsensussequenz für Caspasen gab keinen Aufschluß über eine potentielle Spaltstelle. Ob Capsase 3 hnRNP A1 spaltet, sollte in einem in vitro Assay geklärt werden. Dazu wurde die hnRNP A1 cDNA kloniert und in E.coli Bakterien exprimiert. Das rekombinante, aufgereinigte Protein wurde mit rekombinanter Caspase 1 und Caspase 3, mit oder ohne entsprechendem Inhibitor ac-YVAD-fmk oder z-DEVD-fmk inkubiert und in einem Western Blot analysiert. Nach Inkubation mit rekombinanter Caspase 3 war das hnRNPA1 Protein vollständig abgebaut. Die zuvor in vivo, nach anti-IgM induzierter Apoptose detektierten, spezifischen Spaltprodukte konnten aber nicht detektiert werden. Die Zugabe des Caspase 3 spezifischen Inhibitors konnte aber den Abbau durch Caspase 3 in vitro blockieren. Caspase 1 hingegen konnte rekombinantes hnRNP A1 nicht spalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, das Caspase 3 hnRNP A1 spalten kann, wobei unklar bleibt, warum die Spaltprodukte nicht detektiert werden können. Möglicherweise sind die Spaltprodukte in vitro nicht stabil und degradieren. Ein weiterer Grund könnte die Verunreinigung der rekombinanten Caspase mit bakteriellen Proteasen sein, die die Spaltprodukte abbauen.

Bis vor wenigen Jahren nahm man an, daß hnRNP Proteine streng kernlokalisiert sind. Mittlerweile konnte hnRNP A1 als Protein identifiziert werden, das für den Transport der mRNA zwischen Kern und Cytoplasma verantwortlich ist (118). Welche Folgen die Spaltung des hnRNP A1 Proteins auf die Funktion des Proteins hat, muß in weiteren Untersuchungen geklärt werden. Es ist bisher kein hnRNP Protein identifiziert worden, das die Funktion dieses hnRNP A1 Proteins übernehmen könnte. In weiteren Publikationen konnte gezeigt werden, daß das hnRNP A1 Protein an AUUUA Sequenzen im 3´-untranslatierten Bereich verschiedener mRNAs bindet und somit auch eine wichtige Rolle bei der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression spielt. Damit ist hnRNP A1 am turnover von mRNA Molekülen beteiligt. Ebenso konnte gezeigt werden, das hnRNPA1 Proteine an der Wahl der 5´-Splicestellen beteiligt sind, wobei die relative Menge des Proteins im Verhältnis zu anderen Splicing Faktoren entscheidend ist, und hohe Mengen hnRNP A1 zum preferentiellen Splicing an 5´-distalen Splicesites führt (113).

Waterhouse et al. konnten kürzlich zeigen, daß in BL30 Zellen, einer Burkitt Lymphom Zellinie, in denen Apoptose durch Etoposide, Bestrahlung, Ceramide oder EGTA ausgelöst wurde, hnRNPC1/C2 Proteine gespalten werden (117). Diese Spaltung führt sowohl zu einem verkürzten hnRNP C1, als auch hnRNP C2 Protein. Die gleichen Spaltprodukte wurden in vitro durch Capase 3, Caspase 6 und Caspase 7 generiert. In der eindimensionalen Western Blot Analyse wurde gezeigt, daß die Spaltprodukte des hnRNP C1/C2 Proteins nach anti-IgM induzierter Apoptose nicht identisch sind mit den publizierten


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Fragmente. Die Spaltung von hnRNP C1/C2 Proteinen ist hier eventuell auf die Aktivität anderer Caspasen, die andere Spaltstellen erkennen, oder die Spaltung der gleichen Caspasen an anderen Stellen zurückzuführen. Die Spaltstellen sollen in weiteren Experimenten sequenziert und die Bedeutung der Spaltung während der anti-IgM induzierten Apoptose untersucht werden. Die zweidimensionale Western Blot Analyse, mit einem spezifischen Antiserum, zeigte für die hnRNP C1/C2 Proteine eine Änderung der Lage im 2-D Gel. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, das die hnRNP C1/C2 Proteine nach Apoptose-Induktion nicht nur gespalten, sondern auch modifiziert werden.

Die hnRNP K Proteine kommen in verschiedenen Isoformen vor, wobei die Funktion dieser Isoformen bisher ungeklärt ist. hnRNPK Proteine binden an CT- reiche Regionen der RNA, an doppelsträngiger DNA, aber bevorzugt an einzelsträngiger DNA. Es sind bisher nur wenige Gene bekannt, die durch hnRNP K transkriptionell reguliert werden. Es wurde allerdings gezeigt, daß hnRNP K die CT-Reporter gesteuerte Gen-Expression von c-myc aktiviert und in vivo im Promotor von c-myc bindet (116). In dieser Arbeit konnten hnRNP K Proteine 24 Stunden nach anti-IgM induzierter Apoptose im silbergefärbten 2D-Gel nicht mehr detektiert werden, was durch eine starke Abnahme der Expression oder der Degradierung der mRNA als Folge der Apoptoseinduktion begründet sein kann. In einer Northern Blot Analyse konnte allerdings keine Abnahme der hnRNP K mRNA Menge beobachtet werden. Die Abnahme der hnRNP K Proteinmenge während der anti-IgM induzierten Apoptose ist somit auf eine Regulation der Translation, der Proteinstabilität oder ebenfalls durch eine Caspase Spaltung bedingt. Allerdings konnten in der eindimensionalen und der zweidimensionalen Western Blot Analyse keine Spaltprodukte des hnRNP K Proteins detektiert werden. Die funktionelle Rolle des hnRNP K Proteins während der anti-IgM induzierten Apoptose soll in weiteren Experimenten untersucht werden.


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6.2. Der Transkriptionsfaktor SP1 während der anti-IgM induzierten Apoptose

Der humane Transkriptionsfaktor SP1 wird in fast allen humanen Zellen exprimiert, wobei die Expressionsstärke, abhängig vom Zelltyp variiert und sich mit dem Entwicklungzustand der Zelle ändert. SP1 bindet an Methyl-CG-Sequenzen verschiedene Promotoren, sowohl gewebsspezifischer, als auch ubiquitärer Gene über eine Zink-Finger-Domäne (119). Die verschiedenen Domänen des 95/105 KDa (nicht glycosylierte/glycosylierte Form) Proteins wurden von Kadonaga et al. sowohl biochemisch, als auch strukturell charakterisiert. N-terminale Deletionsmutanten zeigten, das die 168 C-terminalen Aminosäuren des Proteins die DNA-Bindungsdomäne enthalten. In diesem Bereich liegen die 3 Zink Finger Motive. Die transkriptionelle Aktivität des dieses Deletionsproteins nimmt deutlich ab. Die Transaktivierungsdomäne liegt somit N-terminal der DNA-Bindungsdomäne innerhalb der letzten 327 C-terminalen Aminosäuren (120, 121).

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das der Transkriptionsfaktor SP1 nach anti-IgM induzierter B-Zell Apoptose in ein 68 KDa und ein 45 KDa großes Fragment gespalten wird. Der Zeitpunkt der Spaltung wurde in einer eindimensionalen Western Blot Analyse bestimmt. Acht Stunden nach anti-IgM Induktion wurde zunächst das 68 KDa große Fragment, 16 Stunden nach Iduktion das 45 KDa große Fragment detektiert. Das 95/105 KDa große Protein war nach 24 Stunden anti-IgM Induktion hingegen nur noch schwach zu detektierten. Die Spaltung des SP1 Proteins konnte wie zuvor für das hnRNPA1 und D4-GDI Protein gezeigt, durch die Zugabe des Caspase-Inhibitors z-DEVD-fmk gehemmt werden.

In einem in vitro Assay wurden die gleichen Spaltprodukte (68 KDa, 45 KDa), die zuvor in vivo nach anti-IgM Induktion detektiert wurden, generiert. In dieser Arbeit konnte somit ein weiteres Protease Substrat der Caspase 3 Familie identifiziert werden, dessen Bedeutung in der anti-IgM induzierten Apoptose in einem electro mobility shift assay näher untersucht wurde (Abb. 22). Die Intensität der drei SP1 spezifischen DNA-Komplexe (glycosylierte/nicht glycosylierte Form) nahm nach anti-IgM induzierter Apoptose ab. Nach 10 Stunden wurde ein kleinerer Komplex detektiert, der nach 24 Stunden in Intensität noch zunahm. Die Spezifität der SP1/DNA-Komplexe wurde mit einer mutierten SP1 Bindungssequenz betätigt. Dieser kleinere Komplex ließ darauf schließen, daß eines der beiden Spaltprodukte an die spezifische DNA-Bindungssequenz bindet. Da das 45 KDa große Spaltprodukt im Western Blot detektierbar ist und die Antikörper Bindungsstelle bekannt ist (Aminosäure 215-217 C-terminal) muß dem 45 KDa großen SP1 Spaltprodukt der N-Term fehlen, oder ein Teil des N-Terms und des C-Terms.

Die Spaltung führt möglicherweise zu einem nicht funktionellen Transkriptionsfaktor. Inwieweit die Transaktivierungsaktivität des Transkriptionsfaktors von der Spaltung betroffen ist, wird momentan in einem ß-Galaktosidase Reporter Assay untersucht. Möglicherweise wird durch die Spaltung ein dominant negativ wirkender


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Transkriptionsfaktor generiert, der wiederum für die transkriptionelle Regulation ander Gene verantwortlich ist.

6.3. Die Rolle der Caspasen während der anti-IgM induzierten Apoptose

Die Rolle der Caspasen, Apoptose-spezifischer Proteasen, während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose war bisher völlig ungeklärt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das die Proteasen der Caspase 3 Familie eine zentrale Bedeutung in der anti-IgM induzierten Apoptose haben.

Im subtraktiven Vergleich der Proteinmuster apoptotischer und nicht apoptotischer BL60-2 Zellen wurden Proteinspots identifiziert, die nach Apoptose-Induktion differentiell erschienen. Durch Edman Abbau und/oder Massenspektrometrie wurden einige dieser Spots als Fragmente von verschiedenen Proteinen identifiziert. Die Spaltung in distinkte Fragmente im Verlauf der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose wurde in der eindimensionalen Western Blot Analyse bestimmt. Das D4-GDI Protein, hnRNP A1-, hnRNP C1/C2-, hnRNP K-Protein, sowie der humane Transkriptionsfaktor SP1 werden gespalten (6.1, 6.2). Da die molekularen Mechanismen der Apoptose evolutionär konserviert sind, und Moleküle der bcl-2 Familie und der Caspasen bereits in verschiedenen Zelltypen als Regulatoren der Apoptose beschrieben wurden, lag die Vermutung nahe, das auch die Proteinspaltungen während der anti-IgM induzierten Apoptose durch Caspasen ausgelöst werden. Mit dem Tetrapeptid Inhibitor z-DEVD-fmk, der spezifisch für Proteasen der Caspase 3 Familie ist, konnte die Spaltung der Proteine nach anti-IgM Induktion der BL60-2 Zellen gehemmt werden. Dabei stellt DEVD die Erkennungssequenz für Proteasen der Caspase 3 Familie dar. Z-DEVD-fmk ist zellpermeabel und bindet irreversibel im aktiven Zentrum der Caspasen, wodurch diese inaktiviert werden. Der Tetrapeptid Inhibitor ist allerdings nicht nur für Caspase 3 spezifisch. Für Caspase 6 und Caspase 7 wurde ebenfalls eine Hemmung durch z-DEVD-fmk gezeigt (46). Für das D4-GDI wurde bereits gezeigt, daß es durch Caspase 3, in vivo und in vitro gespalten wird (122). Allerdings kann diese Spaltstelle auch von Caspase 7 erkannt werden. Die Spaltung des D4-GDI Proteins kann also eventuell durch Caspase 3 oder 7 erfolgen, die Spaltung von SP 1 durch Caspase 3, 6 oder 7, wobei Caspase 6 und 7 in vitro durch Caspase 3 aktiviert werden können. Welche Caspase nun für die Spaltung der einzelnen Proteine in vivo verantwortlich ist, läßt sich aufgrund der mangelnden Selektivität der Caspase-Inhibitoren zur Zeit nicht klären.

Für den humanen Transkriptionsfaktor SP1 konnte in dieser Arbeit in vitro gezeigt werden, daß Caspase 3 und Caspase 7 die gleichen Fragmente generieren (68 und 45 KDa), die zuvor in vivo detektiert wurden. Caspase 7 hingegen spaltet rekombinantes SP1 hauptsächlich in ein 68 KDa großes Fragment (Abb. 21). Caspase 3 oder Caspase 7 sind somit wahrscheinlich auch in vivo für die SP1 Spaltung verantwortlich. Ob Caspase 3 dabei zuerst aktiviert wird und dann Caspase 7 aktiviert, bleibt unklar. Eine Kaskade ähnliche Aktivierung der Caspase wurde bisher für die Fas und TNF-Rezeptor induzierte Apoptose


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gezeigt. Es wurde bereits postuliert, daß Caspase 3 und 6 die wichtigsten Proteasen im Prozeß der Apoptose sind (123).

Die Spaltung der in dieser Arbeit identifizierten Proteine erfolgte also nicht durch unspezifische Proteolyse, sondern durch spezifische Spaltung der Caspasen, was die Befunde unterstreicht, das Apoptose ein hochregulierter Prozeß ist, der durch bestimmte biochemische Prozesse zu gerichteten morphologischen Änderungen der Zelle führt.

In einem colorimetrischen Assay wurde die Caspase Aktivität während der anti-IgM induzierten Apoptose bestimmt. Die Caspase Aktivität nahm bereits nach 2 Stunden anti-IgM Inkubation zu, steigt bis 8 Stunden stark an und erreichte ihr Maximum nach 16 Stunden. Nach 27 Stunden anti-IgM Induktion nimmt die Aktivität bereits langsam ab (Abb.23). Diese Befunde stimmen mit den Spaltkinetiken des D4-GDI, hnRNP A1 und SP1 Proteins überein. In der Western Blot Analyse konnten erste Spaltprodukte nach 8 Stunden anti-IgM induzierter Apoptose identifiziert werden. Nach 24 Stunden waren die Proteine beinahe vollständig gespalten.

Die zentrale Bedeutung der Proteasen der Caspase 3 Familie während der anti-IgM induzierten Apoptose wurde ebenfalls durch die z-DEVD-fmk bedingte Hemmung der Apoptose-spezifischen morphologischen Veränderungen belegt. Nicht nur die Spaltung bestimmter Proteine, sondern auch die Apoptose-spezifische Kernfragmentierung (Abb. 16), sowie die Translokation von Phosphatidylserin auf die Membranoberfläche konnten gehemmt werden (Abb. 17).

Ebenso wurde gezeigt, daß die meisten Änderungen auf Proteinebene die zuvor im 2D-Gel identifiziert wurden, durch den Caspase-Inhibitor z-DEVD-fmk gehemmt werden können. Ein Vergleich der 2D-Proteinmuster von BL60-2 Zellen, die vor der anti-IgM Induktion mit z-DEVD-fmk inkubiert wurden und unstimulierten Zellen zeigten auch für das P0, Lamin B1, Nucleolin und hnRNP C1/C2 eine Hemmung der anti-IgM induzierten Veränderungen (101). Es bleibt dabei zu klären, ob alle Veränderungen im Proteinmuster direkt auf die Spaltung durch Caspasen zurückzuführen sind.

Proteinspots, die in Intensität nach anti-IgM induzierter Apoptose abnehmen, wurden entweder direkt durch eine Caspase gespalten, oder die Transkription dieser Proteine wurde abgeschaltet. Die veränderte Transkription könnte wiederum durch die Spaltung von Transkriptionsfaktoren wie SP1 oder hnRNPK bedingt sein und wäre dann ebenfalls durch den Caspase-Inhibitor hemmbar. Außerdem können Proteine, die für die Stabiltiät von Transkripten (hnRNP Proteine) oder Proteinen verantwortlich sind, durch Caspasen gespalten werden, was dann ebenfalls zu einer Zu- oder Abnahme der Intensität des entsprechenden Proteinspots im 2D-Gel führen würde und durch z-DEVD-fmk hemmbar wäre.

Die bisherigen Ergebnisse lassen darauf schließen, das Proteasen der Caspase 3 Familie zentrale Regulatoren während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose sind. Möglicherweise sind die Caspasen aber auch direkt im Apoptose-Signaltransduktionsweg,


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initiiert über das membranständige IgM beteiligt, ähnlich wie es für die Apo1/Fas oder TNF induzierte Apoptose gezeigt wurde. Die hier identifizierten Caspasen Substrate stellen eventuell wichtige Effektoren im Verlauf der Apoptose dar, deren Spaltung für den weiteren Verlauf der Apoptose von entscheidender Bedeutung sein kann. In der folgenden Abbildung sind die wichtigsten molekularen Veränderungen und Effektoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose, die in dieser Arbeit identifiziert werden konnten, zusammenfassend dargestellt (Abb. 31).

Abb. 31 Modell der molekularen-Prozesse während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose
Die Vernetzung der membranständigen Immunglobuline M durch anti-IgM F(ab)2-Fragmente führt zur Apoptoseinduktion über die IgM assoziierten Moleküle Igalpha und Igß. Dies hat die Aktivierung der Apoptose-spezifischen Caspase 3 durch proteolytische Spaltung der proCaspase 3 zur Folge. Die aktive Caspase 3 spaltet verschiedene Substrate eventuell über die Aktivierung weiterer Proteasen der Caspase 3 Familie. HnRNP A1, hnRNP C1/C2, ß-Aktin, D4-GDI, Lamine, sowie SP1 werden nach anti-IgM Induktion der BL60-2 Zellen gespalten. Die hnRNP K Proteinmenge nimmt nach anti-IgM induzierter Apoptose stark ab. HnRNP K und SP1 sind somit eventuell für die transkriptionelle Regulation von Genen während der Apoptose verantwortlich. Die Aktivierung der Caspasen hat ebenfalls die Translokation von Phosphatiydylserin auf die Zelloberfläche zur Folge.


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6.4. Methoden zur Identifikation Apoptose-assoziierter Gene

Im zweiten Teil der Arbeit sollten über die Methoden der differentiellen Hybridisierung und subtraktiven Klonierung Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose differentiell exprimiert werden.

Dazu wurden zunächst hochtitrige lambda-Zap cDNA-Phagenbanken von stimulierten und nicht stimulierten BL41-3s Zellen hergestellt. Ebenfalls wurde eine subtraktive lambda-Zap cDNA-Phagenbank hergestellt, in der Apoptose-spezifische Sequenzen angereichert wurden. Die lambda-Zap cDNA-Phagenbank der stimulierten Zellen und die subtraktive cDNA-Phagenbank wurden ausplattiert und auf differentiell exprimierte Gene durchmustert.

Differentielles Screening von lambda-Zap cDNA-Phagenbanken

Die differentielle Hybridisierung erfolgte mit einer cDNA-Sonde aus B-Zellen, die zuvor 4 h mit anti-IgM induziert wurden oder mit einer zuvor subtrahierten Probe im Vergleich zu einer cDNA-Sonde aus unstimulierten B-Zellen.

Um die große Zahl der gepickten Klone einzuengen und falsch positive Klone zu eliminieren, wurden sie erneut in einer Slot Blot Analyse differentiell hybridisiert. Klone, die in der Slot Blot Analyse ebenfalls differentiell hybridisierten, wurden in einer Run-on- und Northern Blot -Analyse auf ihre differentielle Expression überprüft.

Alle Hybridisierungsansätze, wie auch die Run-on-Analyse und die Northern Blot Analyse ließen keine eindeutige Identifikation Apoptose-spezifscher Sequenzen zu. Die differentielle Expression der in der Slot Blot Analyse und Run-on-Analyse identifizierten Klone konnte in der Northern Blot Analyse nicht bestätigt werden.

Ein möglicher Grund dafür ist die geringe Sensitivität der B-Zellinie auf den anti-IgM Stimulus. Nur 40-60 Prozent der B Zellen sterben auf den Stimulus durch Apoptose, gemessen am prozentualen Anteil fragmentierter Kerne. Diese Zellen waren Ausgangsmaterial für die Herstellung einer lambda-Zap cDNA-Phagenbank nach 4 Stunden anti-IgM Stimulation, die auf Apoptose-spezifische Sequenzen durchmustert wurde. Somit sind nur ca. 50 Prozent der klonierten Sequenzen spezifisch für Zellen, in denen das Apoptose-Programm initiiert wurde.

Diese lambda-Zap cDNA-Phagenbanken wurden dann mit radioaktiv markierter cDNA von nicht stimulierten im Vergleich zu radioaktiv markierter cDNA von stimulierten Zellen hybridisiert, wobei ca. 3-10 Prozent der Burkitt-Lymphom Zellen der nicht stimulierten Population durch Spontanapoptose starben und ca. 50 Prozent der stimulierten Zellen nicht apoptotisch waren.

Eine weitere Fehlerquelle ist die Qualität der RNA apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen, die als Ausgangsmaterial für die radioaktiven cDNA Sonden dienten. Sowohl die RNA Präparation, als auch die cDNA-Synthese müssen, ebenso wie die radioaktive Markierung, qualitativ absolut identisch sein, um die Hybridisierungen mit beiden Proben vergleichen zu können. Schon geringe Qualitätsunterschiede führen zu Hybridisierungsunterschieden und zur Isolierung falsch positiver Klone.


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Ein weiteres Problem stellt die nicht synchronisierte Zellpopulation dar. Zum Zeitpunkt der anti-IgM Stimulation befinden sich die Zellen in unterschiedlichen Phasen des Zellzykluses und reagieren somit mit zeitlicher Verzögerung auf den Stimulus. Es wurde bereits für die Mauszellinie WEHI 231 gezeigt, daß die Zellen nach anti-IgM Stimulation zunächst in der G1 Phase im Zellzyklus arrettieren, bevor das Apoptose Programm initiiert wird.

Die mangelnde Spezifität der lambda-Zap cDNA-Phagenbank und der Sonden ist somit Grund für die falsch positiven Hybridisierungsergebnisse des Screens der Phagenbanken, der Slot Blot- und Run-on-Analysen.

Subtraktive lambda-Zap cDNA-Phagenbank und subtraktive Proben

Häufig handelt es sich bei Genen, die nach Apoptose-Induktion spezifisch exprimiert werden um Gene, die im Verhältnis zu “house keeping“ Genen einer Zelle in einer sehr geringen Kopienzahl vorliegen. Während “house keeping“ Gene, wie z.B. ß-Aktin, bis zu 10 Prozent der mRNA Moleküle einer Zelle repräsentieren, stellen Transkriptionsfaktoren wie Nak-1 ca. 0,1-0,01 Prozent der mRNA einer Zelle dar. Eine gute Subtraktion gemeinsamer Sequenzen ist somit wichtige Voraussetzung für die Isolierung spezifischer Sequenzen. Eine Erhöhung der Sensitivität sollte mit einer subtraktiven cDNA-Phagenbank und dem Screening mit einer subtrahierten Probe, in denen Apoptose-spezifische Sequenzen angereichert wurden, erreicht werden. Gemeinsame Sequenzen der stimulierten und nicht stimulierten Zellen wurden durch Hybridisierung abgetrennt und Apoptose-spezifische in einer PCR-Reaktion amplifiziert. Die Subtraktionseffizienz wurde anhand einer Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde für das konstitutiv exprimierte ß-Aktin Gen überprüft. Die subtraktive cDNA-Phagenbank zeigte ca. 5 % positiv hybridisierende ß-Aktin Sequenzen, was auf eine Reduzierung dieser Sequenzen hinwies. Eine Hybridisierung mit einer Sonde für das Gen Nak-1, für das bereits gezeigt wurde, daß es Apoptose-spezifisch exprimiert wird, bewies eine Anreicherung dieser differentiell exprimierten Sequenzen. Ein Southern Blot der subtrahierten Probe mit einer ß-Aktin Sonde zeigte ebenfalls eine deutliche Abnahme dieser Sequenzen nach Subtraktion (s. Abb. 26).

Trotz einer Anreicherung Apoptose-spezifischer Sequenzen und der Reduktion gemeinsamer Sequenzen, stellte sich heraus, daß nach der differentiellen Hybridisierung der lambda-Zap cDNA-Phagenbanken ebenfalls keine Klone identifiziert werden konnten, deren differentielle Expression sich in der Northern Blot Analyse bestätigen ließ.

Mögliche Gründe werden kurz diskutiert:

Für die Subtraktion wurde ein 10-facher Überschuß nicht apoptotischer RNA-Sequenzen mit komplementären Sequenzen apoptotischen Zellen hybridisiert. Das Problem stellt auch hier der Anteil spontan apoptotischer Zellen in der unstimulierten Zellpopulation und die 50 Prozent der induzierten Zellen dar, die nicht sensitiv auf den Stimulus sind.

Bei der Herstellung der subtraktiven cDNA-Phagenbank, wie der subtrahierten Probe folgte im letzten Schritt die Amplifikation der angereicherten Sequenzen in einer Polymerase-


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Kettenreaktion. Die Polymerasekettenreaktion ist eine exponentielle Reaktion und verläuft nur in den ersten Zyklen linear. Schlecht subtrahierte Sequenzen, ausgehend von der Anzahl der Moleküle in der Ausgangsreaktion, werden so mit unterschiedlicher Effizienz amplifiziert. Selbst wenn gemeinsame Sequenzen konstitutiv exprimierter Gene, die in verhältnismäßig großer Zahl in der Zelle vorhanden sind, zuvor stark dezimiert wurden, werden sie eventuell in der PCR Reaktion wieder vervielfältigt und angereichert. Die Amplifikation kann somit Verhältnisse zwischen differentiell exprimierten, die meist schwach exprimiert sind (Nak-1, bax-alpha) und den konstitutiv exprimierten Sequenzen verschieben.

Eine Sensitivitätserhöhung durch eine effizientere Subtraktion gemeinsamer Sequenzen apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen sollte die differentielle Klonierung über die klassische Hydroxyapatit-Chromatographie bieten. Dabei wurde die poly(A)+-RNA zunächst in zwei hintereinandergeschalteten Hybridisierungsschritten aus dem Pool Gesamt-RNA isoliert. Dieser Schritt dezimiert t-RNA und r-RNA Sequenzen, die ca. 98 % der Gesamt-RNA einer Zelle ausmachen. Die cDNA apoptotischer Zellen wurde dann zweimal mit je 5-fachem Überschuß komplementärer poly(A)+-RNA nicht stimulierter Zellen hybridisiert. Nicht hybridisierende, einzelstängige Sequenzen sollten spezifisch für Apoptose stimulierte Zellen sein und wurden durch die Phosphat-Pufferkonzentration von cDNA/mRNA Hybriden auf Hydoxyapatit-Säulen getrennt. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. In der anschließenden positiven Selektion sollten nur Apoptose-spezifische Sequenzen hybridisieren. Diese Sequenzen wurden isoliert und kloniert.

Die erfolgreiche Anreicherung spezifischer Sequenzen über die Hydroxyapatit-Chromatographie zeigte die Dot Blot Hybridisierung mit der radioaktiv markierten subtrahierten Probe im Vergleich zu einer cDNA aus unstimulierten BL60-2 Zellen (Abb. 29). Gene, für die bereits bekannt war, daß sie nach anti-IgM induzierter Apoptose verstärkt exprimiert werden, hybridisieren stark mit der subtrahierten Probe (bax-alpha, Nak 1, bak). Konstitutiv exprimierte Sequenzen, wie ß-Aktin hybridisieren nicht, was auf eine fast vollständige Subtraktion dieser Sequenzen schließen läßt. Ein Nachteil dieser Methode ist, daß in der anschließenden PCR Reaktion die synthetisierte DNA nicht hemimethyliert werden kann. Die DNA kann so nicht vor Restriktionsschnitten geschützt werden. Durch die EcoRI Klonierung werden deshalb sehr kurze Sequenzen erhalten, die häufig keinen bekannten Sequenzen der Datenbank zugeordnet werden können (s. Tab. 3). Die meisten über diese Methode isolierten Sequenzen sind somit unbekannt, d.h. ein Sequenzvergleich mit schon bekannten Sequenzen von Genen in der DNA-Datenbank (NCBI) zeigte keine Homologie (ca. 90 Prozent der sequenzierten Klone). Da die cDNA Synthese durch den poly(dT) Primer initiiert wurde, befinden sich viele dieser sehr kurzen Sequenzen im 3´-untranslatierten Bereich, der für viele Gene nicht genau identifiziert ist. Die unbekannten


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Sequenzen sollen in weiteren Versuchen auf ihre differentielle Expression während der anti-IgM induzierten Apoptose untersucht werden. Es wurden zwei Klone identifiziert, die eine hohe Homologie zu einem bakteriellen Acriflavin resistance Protein, MexB besitzen. In einer Northern Blot Analyse sollte die differentielle Expression während der anti-IgM induzierten Apoptose überprüft werden. Es konnte aber keine spezifische Expression nachgewiesen werden, was auf eine schwache Expression hinweist. Hingegen konnte die gewebsspezifische Expression in einer Northern Blot Analyse auf dem 2 µg poly(A)+-RNA verschiedener humaner Gewebe aufgetrennt waren, gezeigt werden (Abb. 30). Die spezifische Hybridisierung zeigte, daß ein humanes Homologes existiert. Die komplette cDNA-Sequenz soll in folgenden Experimenten kloniert werden. Außerdem soll die spezifische Expression in einem poly(A)+-RNA Blot während der anti-IgM Stimulation überprüft werden.

6.4.1. Vergleich proteinchemischer und molekularbiologischer Methoden

Die hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese ermöglicht die Auftrennung der Proteine einer Zelle in immer wieder reproduzierbaren Mustern in zwei Dimensionen. So können differentielle Proteinspots apoptotischer und nicht apoptotischer Zellen leicht identifiziert werden. Allerdings sind die Färbemethoden limitierend. Bei der hochauflösenden gelelektophoretischen Trennung aller Proteine einer Zelle können nur ca. 30 Prozent der Proteine nach Silberfärbung der Gele detektiert werden. Dabei sind Proteine wie Transkripitonsfaktoren oder andere wichtige regulatorische Proteine, die nur in geringer Kopienzahl im Vergleich zu Strukturproteinen in einer Zelle vorliegen, schwer zu detektieren.

Die Silberfärbung ist gegenüber der Coomassie Färbung eine sehr sensitive Methode. Silbergefärbte Proteine können aber aufgrund des Glutaraldehyds nicht für die Proteinsequenzierung und Massenspektrometische Analyse eingesetzt werden und müssen dem Comassie gefärbten 2D-Gel zugeordnet werden, was nicht immer möglich ist.

Eine wichtige Voraussetzung zur Sensitivitätserhöhung ist deshalb die Vorfraktionierung. Durch die Fraktionierung kann die Komplexität der Proteine reduziert und in größerer Menge auf dem Gel aufgetrennt werden. In dieser Arbeit konnte eine Sensitivitätserhöhung durch die magnetische Trennung apoptotischer von nicht apoptotischen Zellen erreicht werden. Um besonders regulatorische Proteine der Apoptose, die im Kern und den Mitochondrien lokalisiert sind, zu identifizieren, sollen in weiteren Versuchen diese Zellbestandteile zuvor fraktioniert und dann in der zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt werden.

DNA Methoden wie subtraktive Klonierungen oder differentielle Hybidisierungen bieten den Vorteil der höheren Sensitivität gegenüber proteinchemischen Methoden. Viele der in den letzten Jahren identifizierten Transkriptionsfaktoren, die in der Regulation zellulärer Differenzierung oder im Zusammenhang mit der Apoptose identifiziert wurden, wurden über differentielle Hybridisierungen (z.B. Nur 77, das murine Homologon zu Nak1), oder die


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Differential Display Methode identifiziert. Diese Transkriptionsfaktoren werden zu schwach exprimiert, um in der 2D-Gelelektrophorese mit Gesamtzellysaten identifiziert werden zu können. Andere Proteine können aufgrund ihres extremen isoelektrischen Punktes oder ihrer sehr kleinen oder sehr großen Masse im 2D-Gel nicht identifiziert werden.

Die DNA Methoden bieten somit gegenüber proteinchemischen Methoden den Vorteil, daß selbst Transkripte, von denen nur wenige Kopien (n) pro Zelle vorliegen, in 30 Zyklen einer PCR n30 mal amplifiziert werden. Diese Amplifikation hat andererseits den Nachteil, daß sie nur in den ersten Zyklen linear ist und kurze Sequenzen preferentiell amplifiziert werden.

Die Anreicherung differentiell exprimierter Sequenzen über Subtraktionen bedingt eine Amplifikation der nicht hybridisierten Sequenzen, was bei schlechter Subtraktionseffizienz häufig zur Ampifikation konstitutiv exprimierter Sequenzen führt, die dann als falsch positive Sequenzen isoliert werden. Andererseits reichen kurze DNA Sequenzen eines differentiell exprimierten Gens aus, um über den Screen einer cDNA-Phagenbank oder in einer RACE-PCR das gesamte Gen zu identifizieren.

Phagenbanken können ebenfalls dazu verwendet werden, die entsprechenden kodierenden Gene der Proteinfragmente, die im subtraktiven Vergleich der Proteinmuster stimulierter und nicht stimulierter BL60-2 Zellen erhalten wurden und keiner bekannten Sequenz zugeordnet werden konnten, zu identifizieren. Dazu ist es nötig, möglichst lange Peptidsequenzen durch Edmann Abbau zu erhalten. Aufgrund dieser Aminosäuresequenzen können dann kurze Oligonukleotide hergestellt, und die spezifische DNA-Sequenz in einer Polymerase Kettenreaktion vervielfältigt werden. Diese spezifischen DNA-Fragmente werden radioaktiv markiert und können als Sonde für den spezifischen Screen einer cDNA-Phagenbank eingesetzt werden. Unbekannte Gene, die während der anti-IgM stimulierten Apoptose eine Rolle spielen, können so isoliert werden.

Die Kombination der Methoden bietet somit optimale Möglichkeiten, sowohl differentiell exprimierte Gene, als auch Proteine und ihre Modifikationen zu identifizieren.


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