Rickers, Anke: Identifikation molekularer Regulatoren der anti-IgM induzierten B-Zell Apoptose

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Kapitel 7. Zusammenfassung

Apoptose spielt eine entscheidende Rolle bei der Generierung eines funktionellen Lymphozytenrepertoirs. Die anti-IgM induzierte B-Zell Apoptose ist dabei ein wichtiger Mechanismus, bei dem autoreaktive Zellen eliminiert werden. Die molekularen Mechanismen der Apoptose sind aber weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollten Proteine und Gene identifiziert werden, die an der Apoptose beteiligt sind.

Etablierung eines B-Zell Modellsystems

Durch extensive Subklonierung wurde ein Subklon der humanen Burkitt Lymphom Zellinie BL60 generiert, bei dem nach 24 Stunden anti-IgM Stimulation 40-60 Prozent der Zellen durch Apoptose sterben. Um reine Fraktionen für die folgenden Analysen zu erhalten, wurde eine Methode entwickelt, in der apoptotische, Phosphatidylserin positive Zellen, über eine magnetische Separation mit einer Reinheit von bis zu 99 Prozent angereichert werden können.

Identifikation Apoptose-assoziierter Proteine

Die aufgereinigten Fraktionen wurden in der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese analysiert. In Kooperation mit der Gruppe von Prof. B. Wittman-Liebold am MDC Berlin, konnten im Vergleich apoptotischer und nicht apoptotischer 2D-Proteinmuster ca. 80 differentielle Spots identifiziert werden. Veränderungen im Proteinmuster können dabei auf Änderungen der Transkription, der Translation, aber auch auf Stabilitätsänderungen der mRNA oder Proteine, wie auf Modifikationen und Proteinspaltungen zurückzuführen sein. Durch massenspektrometrische Analysen und Edman Abbau konnten bisher 15 der 80 differentiellen Proteinspots identifiziert werden. Dabei handelt es sich um die folgenden Proteine: Lamin B1, ß-Aktin, neutrales Calponin, Nucleolin, einen Inhibitor für Rho-GTPasen, das D4-GDI, Proteine des Ribonukleokomplexes hnRNP A1, hnRNP C1/C2, hnRNP K, ein Lymphozyten spezifisches Protein LSP1, das DNA Reparatur Protein HHR23B, das FUSE binding Protein, dUTPase, das P0 ribosomale Protein, sowie ein Heterochromatin Protein (HP1 alpha). Die Proteine der hnRNP Familie und D4-GDI wurden näher untersucht.

In einer eindimensionalen Western Blot Analyse konnte die Spaltung des D4-GDI in ein 23 KDa großes Spaltprodukt nach 8 Stunden anti-IgM Induktion, sowie die Spaltung des hnRNP A1 Proteins in drei Fragmente, ein 30 KDa, ein 19 KDa und 16 KDa großes Fragment nach 8, 16 und 24 Stunden bestimmt werden. Daß es sich hierbei nicht um unspezifische Degradation handelt, konnte durch die Zugabe eines Tetrapeptidinhibitors z-DEVD-fmk, der Apoptose-spezifische Proteasen der Caspase 3 Familie hemmt, gezeigt werden. Diese Hemmung Apoptose-spezifischer Veränderungen wurde ebenfalls in der 2D-Gelelektrophorese für das ß-Aktin, P0, Lamin B1, Nucleolin, hnRNP C1/C2 gezeigt.

Der Transkriptionsfaktor SP1 und die Rolle der Caspasen

In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Transkription des proliferationsabhängigen Transkriptionsfaktors c-myc während der anti-IgM induzierten Apoptose abgeschaltet wird.


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Um die Regulation des c-myc Gens zu untersuchen, wurden weitere, im Promotor bindende Proteine, im Western Blot analysiert. Dabei wurde die spezifische Spaltung des Transkriptionsfaktors SP1 in ein 68 KDa großes Spaltprodukt nach 8 Stunden anti-IgM induzierter Apoptose und in ein 45 KDa großes Spaltprodukt nach 16 Stunden anti-IgM induzierter Apoptose detektiert. Die Spaltung ließ sich durch Zugabe von z-DEVD-fmk hemmen. In einem elektro mobility shift assay wurde gezeigt, daß die Intensität des SP1/DNA-Komplexes nach Apoptose-Induktion stark abnimmt, hingegen ein kleinerer Komplex an Intensität stark zunimmt. Dieses Ergebnis zeigt die DNA-Bindung eines der Spaltprodukte, das möglicherweise nicht mehr transkriptionell aktiv ist. Ebenfalls wurde gezeigt, daß SP1 in vitro durch Caspase 3 und 7 in ein 68 und 45 KDa großes Fragment gespalten wird, Caspase 6 hingegen nur ein 68 KDa großes Spaltprodukt generiert.

Der Inhibitor z-DEVD-fmk konnte auch die für die Apoptose charakteristischen, morphologischen Veränderungen, wie Kernfragmentierung und Phosphatidyserintranslokation auf die Zelloberfläche hemmen. Damit wurden die Proteasen der Caspase 3 Familie erstmalig als zentrale Regulatoren während der anti-IgM induzierten Apoptose identifiziert.

Identifikation Apoptose-assoziierter Gene

Über verschiedene Methoden der differentiellen Hybridisierung, wie der subtraktiven Klonierung sollten Gene identifiziert werden, die während der anti-IgM induzierten Apoptose differentiell exprimiert werden und damit potentielle Regulatoren der Apoptose darstellen. Dazu wurden zunächst lambda-Zap cDNA-Phagenbanken von nicht stimulierten und anti-IgM stimulierten BL41-3s Zellen hergestellt. Die cDNA-Phagenbank der stimulierten Zellen wurde ausplattiert und mit radioaktiv markierter Gesamt-cDNA nicht stimulierter, und stimulierter Zellen im Vergleich, bzw. einer subtrahierten Probe hybridisiert. Ebenso wurde eine subtraktive cDNA-Phagenbank erstellt und differentiell hybridisiert. Die identifizierten Klone wurden in einer Slot Blot Analyse, und in einer Run-on- und Northern Blot -Analyse auf ihre differentielle Expression überprüft. Über die differentiellen Hybridisierungen der cDNA-Phagenbanken wurden im wesentlichen Sequenzen bekannter Gene identifiziert, deren differentielle Expression aber in der Northern Blot Analyse nicht bestätigt werden konnte.

Über die klassische Hydoxyapatit-Methode wurden ebenfalls Apoptose-spezifische Sequenzen angereichert, kloniert und sequenziert. Diese Klone waren zum größten Teil unbekannt, zeigten aber teilweise Homologien auf Proteinebene. So konnte eine Sequenz identifiziert werden, die eine Homologie zu einem bakteriellen Acriflavin resistance Gen (MexB) hat. Diese DNA-Sequenz eines bisher unbekannten humanen Gens hybridisiert im multiple tissue Northern und wird spezifisch in Zellen des humanen Immunsystems, im Sekelettmuskel und Herz exprimiert.


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