Schmidt, Kathrin: Charakterisierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle an glialen Vorläuferzellen der Maus

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Kapitel 3. Methoden

3.1. Zellkultur

3.1.1. Präparation der Oligodendrozytenkulturen

Die Oligodendrozyten-Primärkulturen wurden nach der Methode von Trotter et al. ( Trotter et al., 1989 ) aus dem Gesamthirn von 14 bis 15 Tage alten Mausembryonen hergestellt. Trächtige NMRI (Naval Medical Research Institut) Mäuse (Tierstall des MDC, Berlin-Buch) wurden getötet, die Embryonen entnommen, dekapitiert und die Gehirne freipräpariert. Nach sorgfältiger Entfernung der Hirnhäute wurden die Gehirne dreimal mit HBSS+ (Hanks balanced salt solution, s. 3.1.3.) gewaschen und anschließend für eine Minute mit 1 % (10 mg/ml) Trypsin (Boehringer, Ingelheim, BRD) und 0,05 % (0,5 mg/ml) DNAse (Worthington, Lakewood, NY) in HBSS- behandelt. Nach einmaligem Waschen mit serumhaltigem BME-Medium (Kulturmedium Basal Medium Eagle, s. 3.1.3.) zur Beendigung der Trypsin-Reaktion wurden die Zellen durch Aufziehen mit verschiedenen rundgeschmolzenen Pasteurpipetten in Anwesenheit von 0,05 % DNAse bis zum Erhalt einer Einzelzellsuspension weiter vereinzelt. Diese wurde anschließend zweimal mit HBSS- gewaschen und mit einer Zelldichte von 2*107 Zellen pro Flasche in10 ml BME+ Medium in Poly-L-Lysin (PLL)-beschichtete Kulturflaschen ausplattiert. Die weitere Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37°C und 5% CO2-haltiger Atmosphäre im Brutschrank.

Die Neurone wurden nach fünf Tagen in Kultur durch Immunzytolyse abgetötet. Dazu wurden die Zellen in den Kulturflaschen mit dem monoklonalen Antikörper M5 ( Keilhauer et al., 1985 ) inkubiert und danach für ca. 20 min mit komplement-aktivem Meerschweinchenserum (7 %) behandelt.

Nach weiteren zwei bis drei Tagen besteht die Kultur aus einem konfluenten Astrozyten-Monolayer und darauf relativ locker sitzenden Mikrogliazellen, Oligodendrozyten und Oligodendrozytenvorläuferzellen. Durch leichtes Schütteln werden zunächst die locker haftenden Mikrogliazellen entfernt und nach Auffüllen des Kulturmediums durch starkes Schütteln die Oligodendrozyten in Lösung gebracht. Diese wurden mit einer Dichte von 1*105 Zellen pro Deckglas auf mit einem Astrozytenmonolayer bewachsenen Deckgläsern ausplattiert und in definiertem Medium nach SATO mit 1 % Pferdeserum für weitere 2-10 Tage kultiviert.

3.1.2. Präparation der Körnerzellkulturen

Die Herstellung der Körnerzellkulturen erfolgte aus sechs Tage alten NMRI Mäusen entsprechend der von Wilkin et al., 1976 und Levi ( Levi et al., 1984 ) für Ratten beschriebenen Methode. Die Mäuse wurden dekapitiert und die Kleinhirne freipräpariert und von den Hirnhäuten befreit. Die Kleinhirne wurden dreimal in HBSS+ gewaschen und dann für 10 Minuten bei 37°C mit 1 % (10 mg/ml) Trypsin behandelt. Anschließend wurde die Trypsinreaktion duch Zugabe von serumhaltigem BME-Medium gestoppt und die Zellen in Anwesenheit von 0,05 % (0,5 mg/ml) DNAse durch Aufziehen mit einer Pasteurpipette vereinzelt. Nach nochmaligem Waschen wurden die Zellen mit einer Dichte von 4*105 Zellen pro Deckglas auf mit PLL-beschichtete Deckgläser ausplattiert. Die weitere Kultivierung erfolgte in BME+ Medium bei 37 °C und 5 % CO2 Gehalt im Inkubator. Die elektrophysiologischen Messungen erfolgten innerhalb von 7-15 Tagen in vitro.

3.1.3. Medien

Kulturmedium Basal Medium Eagle (BME-) Earle’s:

BME Earle’s

9,29 g/l (Seromed)

NaHCO3

2,20 g/l

Glukose

2,24 g/ml

Penicillin

10 000 U/l

Streptomycin

10 000 U/l

L-Glutamin

2 mM


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BME+:

BME--Lösung (siehe oben) mit 10 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum (Seromed/Gibco)

Dulbecco’s modifiziertes Eagle’s Medium (DMEM):

DMEM

13,4 g/l (Serva)

HAM’s F-12

10,6 g/l

NaHCO3

2,4 g/l

HEPES

3,6 g/l

Sato--Medium

( Bottenstein und Sato, 1979 , modifiziert nach Barres et al., 1993 )

DMEM-Pulver

13,4 g/l (Serva)

NaHCO3

2 g/l

Transferrin

100 mg/l

Gentamyzin

25 mg/l

Insulin

10 mg/l

Putreszin

100 nM

Progesteron

200 nM

3,3’,5-Triiod-L-Thryonin

500 nM

Natriumselenit

220 nM

L-Thyroxin

500 nM

Sato+:

Sato--Lösung (siehe oben) mit 1 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum (Seromed/Gibco)

Hanks’ balanced salt solution (HBSS-)

NaCl

8,000 g

KCl

0,400 g/l

KH2PO4

0,060 g

NaHCO3

0,350 g/l

Na2HPO4*2H2O

0,113 g/l

Glucose

1,000 g/l

Phenolrot

0,005 g/l

pH mit NaOH auf 7,3 einstellen

HBSS+

HBSS- (siehe oben) mit 1,5 g/l MgSO4


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3.2. Elektrophysiologie

3.2.1. Methodik

Die von Neher und Sakmann ( Neher und Sakmann, 1976 ) entwickelte Patch-Clamp-Technik ermöglicht es, sowohl Membranströme der gesamten Zellmembran als auch den Strom einzelner Ionenkanäle zu messen (Überblick s. Hamill et al., 1981 ).

Bei dieser Technik wird eine Glasmikroelektrode (Spitzendurchmesser: 1-2 µm) in sehr engen Kontakt mit der Zellmembran gebracht. Die stabile Glas-Membran-Verbindung mit Widerständen im Gigaohm-Bereich bewirkt durch die elektrische Abschirmung des Membranstückes von seiner Umgebung ein sehr gutes Signal-Rausch-Verhältnis.

Die mechanische Stabilität dieser Glas-Membran-Verbindung erlaubt es auch, weitere mechanische Manipulationen durchzuführen, ohne die hochohmige Verbindung zu zerstören. Zur Untersuchung des durch die gesamte Zellmembran fließenden Stromes ("whole-cell“-Konfiguration) wird durch Anlegen eines Unterdruckes das in der Pipette liegende Membranstückchen zerrissen (Abb. 5) und man erhält einen niederohmigen Zugang zum Zellinneren.

Während der Ganzzellableitung tauscht sich die Pipettenlösung durch Diffusion rasch mit dem Zytoplasma aus, so daß die intrazellulären Ionenverhältnisse durch die Pipettenlösung vorgegeben werden.

Die Messung von Einzelkanalströmen erfolgt entweder auf der Zelle im ”cell-attached-Modus“ oder mit von der Zelle abgetrennten Membranstücken im ”inside-out-“ Modus oder im ”outside-out-“ Modus (Abb. 5).

Abbildung 5: Patch-Clamp-Konfigurationen nach Hamill et al., 1981.

Nachdem die Patchpipette auf die Zelle aufgesetzt wurde (Zelle stark verkleinert dargestellt), stellt man durch vorsichtiges Saugen einen engen Pipetten-Membran-Kontakt (Gigaseal) her. In der "cell-attached" Konfiguration können die unter der Patchpipette befindlichen Känale untersucht werden. Durch starkes Saugen kann das Membranstück unter der Patchpipette zerstört werden. Man erhält dann einen leitenden Zugang zur gesamten Zelle und kann die Summenströme der gesamten Zellmembran untersuchen ("whole-cell" Konfiguration). Durch Wegziehen der Pipette aus der "cell-attached" Konfiguration kann man das unter der Pipette befindliche Membranstück von der restlichen Zelle abtrennen und kann bei freiem Zugang zur Zellinnenseite einzelne Ionenkanäle untersuchen ("inside-out" Konfiguration).


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3.2.2. Patch-Clamp Elektroden

Die Elektroden wurden aus Borosilikatglas (Hilgenberg, Malsfeld, BRD) mit einem horizontalen Elektrodenziehgerät (Modell P-2000 und P87, Sutter Instruments, Novato, USA) gezogen. Für die Einzelkanalmessungen wurden Pipetten aus dickerwandigem Glas (Außendurchmesser 1,5 mm, Innendurchmesser 0,75 mm) mit Pipettenwiderständen von 7-10 M\|[OHgr ]\| , für Ganzzellableitungen Pipetten aus dünnerwandigem Glas (Außendurchmesser 1,5 mm, Innendurchmesser 0,9 mm) mit Pipettenwiderständen von 4-7 M\|[OHgr ]\| verwendet.

3.2.3. Messplatz

Für die Patch-Clamp-Messungen wurde eine Meßapparatur bestehend aus einem aufrechten Mikroskop (Zeiss, Oberkochen), Videoüberwachungsanlage und einem über einen Mikromanipulator (SPI, Oppenheim, BRD) fernsteuerbaren Meßpipettenhalter mit Patch-Clamp-Verstärker (EPC 9) (Heka Elektronic, Lambrecht) aufgebaut.

Für die elektrophysiologischen Ableitungen wurden die auf Deckgläschen kultivierten Zellen in eine auf den Mikroskop-Kreuztisch montierte Plexiglaskammer transferiert, die kontinuierlich mit Badlösung durchspült wurde (Durchflußrate ca. 3 ml/min). Über die Badperfusion wurden auch Blocker, Transmitter und andere Substanzen appliziert.

Als Elektroden wurden Ag/AgCl-Elektroden verwendet, die Referenzelektrode befand sich in der mit Badlösung durchspülten Meßkammer, die Meßelektrode in der mit Pipettenlösung gefüllten Meßpipette.

Die Zellen wurden wurden über die Videoüberwachungsanlage ausgewählt und die Meßpipette mit Hilfe des Mikromanipulators auf die Zellmembran aufgesetzt. Durch leichtes Ansaugen wurde dann eine stabile Glas-Membran-Verbindung im G\|[OHgr ]\|-Bereich (3-10 G\|[OHgr ]\|) hergestellt. Patch-Clamp-Untersuchungen wurden sowohl im Ganzzellmodus als auch im ”cell-attached“ und ”inside-out“ Modus ( Hamill et al., 1981 ) durchgeführt. Die Membranströme der Zellen wurden mit einem EPC-9 Verstärker (Heka Elektronic, Lambrecht, BRD) verstärkt, mit 10 kHz aufgenommen, mit einem 3 kHz Tiefpass-Filter gefiltert, digitalisiert und auf der Festplatte eines Computers gespeichert. Da die Kapazität der Zellmembran Spannungsänderungen durch Umladeströme entgegenwirkt und damit eine zeitliche Verzögerung bewirkt, wurde eine automatische Kapazitätskompensation durchgeführt.

Die Aufnahme und Auswertung der Daten sowie die Ansteuerung des Verstärkers und des Mikromanipulators erfolgte mit dem Programm ”Wintida“ (Heka Elektronic, Lambrecht, BRD). Es wurden verschiedene Spannungssprungprotokolle (s.u.) zur Stimulation von Membranströmen verwendet. Der Aufbau eines Patch-Clamp-Meßplatzes ist in Abb. 6 schematisch dargestellt.

Abbildung 6: Aufbau eines elektrophysiologischen Meßplatzes.


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Die Zellen befinden sich unter dem Mikroskop in einer kontinuierlich von Badlösung durchströmten Kammer. In der Patchpipette befindet sich die Meßelektrode, die mit dem Patch-Clamp-Verstärker verbunden ist, die Referenzelektrode befindet sich in der Meßkammer. Der Verstärker stellt ein bestimmtes Potential (Haltepotential) zwischen den Elektroden ein und mißt den fließenden Strom.

3.2.4. Spannungssprungprotokolle

3.2.4.1. Erfassung der spannungsaktivierten Ströme (Spannungsprotokoll 1)

Dieses Protokoll wurde zur Charakterisierung der spannungsaktivierten Ströme der Zellmembran angewandt. Ausgehend von einem Haltepotential von -70 mV wurde die Membran für jeweils 50 ms nacheinander auf 10 depolarisierende und 10 hyperpolarisierende Potentiale geklemmt (Abb. 7A). Das Spannungsintervall betrug pro Sprung 10 mV.

3.2.4.2. Erfassung der ligandenaktivierten Ströme (Spannungsprotokoll 2)

Spannungsprotokoll 2 wurde angewandt, um Änderungen der Leitfähigkeiten bei Applikation von Neurotransmittern zu messen. Vom Haltepotential (-70 mV) aus wurden Sequenzen von de- und hyperpolarisierenden Pulsen zu unterschiedlichen Potentialen (-35, -85, -10, -110, +15, -135, +40, -160, +65 mV) gestartet. Die Pulsdauer betrug 50 ms, die Pause zwischen den einzelnen Pulsen 100 ms. Die Gesamtdauer einer Sequenz betrug zwei Sekunden. Diese Sequenz wurde im Laufe einer Gesamtzeit von 10 Minuten jede sechs Sekunden wiederholt. Die resultierenden Ströme wurden kontinuierlich aufgezeichnet (Abb. 7B).

3.2.4.3. Erfassung von spannungsaktivierten Strömen, die spannungsabhängig inaktivieren (Spannungsprotokoll 3)

Die Aufhebung der Inaktivierung erfolgt durch Hyperpolarisierung. Vom Haltepotential (-70 mV) wurde die Membran zuerst auf -100 mV 400 ms lang hyperpolarisiert. Danach wurde wie bei Sprungprotokoll 1 fortgefahren (Abb. 7C).

3.2.4.4. Messung der "Steady-state"-Inaktivierung von spannungsaktivierten Strömen (Spannungsprotokoll 4)

Um die Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung von Strömen zu messen, wurden nacheinander de- und hyperpolarisierende 3 s lange Präpulse gestartet und die Membran anschließend auf +20 mV geklemmt. Die Vorpuls-Potentiale betrugen zwischen -130 mV bis +10 mV mit einem Spannungsinterval von 10 mV (Abb. 7D).

3.2.4.5. Spannungsrampen

Zur Erfassung der Spannungsabhängigkeit insbesondere von Einzelkanalströmen wurden Spannungsrampen verwendet. Dabei wurde das Pipettenpotential innerhalb von 1s kontinuierlich von 120 mV Hyperpolarisierung zu 120 mV Depolarisierung variiert (Abb. 7E).


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Abbildung 7: Spannungssprungprotokolle zur elektrophysiologischen Charakterisierung von Membranströmen mit der Patch-Clamp-Technik

  1. Spannungssprungprotokoll zur Erfassung der spannungsaktivierten Ströme
  2. Spannungssprungprotokoll zur Erfassung von ligandenaktivierten Strömen
  3. Spannungssprungprotokoll zur Erfassung von spannungsaktivierten Strömen mit spannungsabhängiger Inaktivierung
  4. Protokoll zur Messung der "steady-state-" Inaktivierung von Membranströmen
  5. Spannungsrampe

3.2.5. Lösungen

a) Badlösungen

Soweit nicht anders angegeben, wurde als Standard-Badlösung eine HEPES-gepufferte Salzlösung mit folgender Zusammensetzung verwendet:

NaCl

150 mM

KCl

5,4 mM

CaCl2

2,0 mM

MgCl2

1,0 mM

HEPES

5,0 mM


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Glukose

10 mM

Der pH-Wert wurde durch Zugabe von NaOH auf 7,3 eingestellt.

b) Pipettenlösungen

Für die Ganzzellableitungen wurde, soweit nicht anders angegeben, folgende dem intrazellulären Ionenniveau entsprechende Pipettenlösung verwendet:

KCl

130 mM

CaCl2

1,0 mM

MgCl2

2,0 mM

EGTA

10 mM

HEPES

10 mM

Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von KOH auf 7,3 eingestellt und in einem Teil der Experimente wurde 0,1 % des Fluoreszenzfarbstoffs Lucifer gelb hinzugefügt.

Für die Einzelkanalmessungen im ”cell-attached-“ (sowie im ”outside-out-“ )Modus wurde die Standard-Badlösung als Pipettenlösung verwendet.

3.2.6. Pharmakologie

Zur pharmakologischen Charakterisierung der Kaliumströme wurden elektrophysiologische Untersuchungen mit verschiedenen Kaliumkanalblockern durchgeführt. Die Substanzen mit Ausnahme von CTX, DTX und MCDP wurden über die Badperfusion appliziert.

4-Aminopyridin (4-AP, 0,125 bis 1 mM) wurde direkt in der Standardbadlösung verdünnt und über die Badperfusion appliziert. Tetraethylammonium (Chlorid-Salz, 1-100 mM) wurde in der Standardbadlösung isoosmolar gegen NaCl ausgetauscht und über die Badperfusion appliziert. Die in geringen Konzentrationen wirksamen K+ Kanalblocker Charybdotoxin (CTX), a-Dendrotoxin (DTX), MCDP (mast cell degranulating peptide) sowie Chinidin wurden in geringen Volumina destilliertem Wasser gelöst und dann in Badlösung verdünnt. CTX, DTX und MCDP wurden mit einer Pipette direkt in die Perfusionskammer appliziert.

In einigen Experimenten wurden Natriumkanäle durch die Zugabe von 100 nM Tetrodotoxin (TTX) geblockt. Bei den Einzelkanalexperimenten in "inside-out-" Modus wurde eine der normalen intrazellulären Pipettenlösung entsprechende Badlösung verwendet. Bei einem Teil dieser Experimente wurde ein Teil der KCl-Konzentration durch erhöhte NaCl-Konzentrationen ersetzt.

Die Neurotransmitter sowie ihre Agonisten und Antagonisten wurden je nach Löslichkeit in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Muscimol, Bicucullin) oder destilliertem Wasser (GABA, Kainat) gelöst und in Badlösung verdünnt.

3.3. Immunzytochemische Analyse der Kaliumkanäle und oligodendrozytenspezifischen Marker

a) Indirekte Immunfluoreszenz

Färbung extrazellulärer Antigene

Zum spezifischen Nachweis für das Vorhandensein bestimmter Antigene (Oligodendrozyten-Zellmarker) und zur Analyse der Kaliumkanalexpression wurden Immunfluoreszenz-Färbungen durchgeführt. Dazu wurden die Zellen zuerst zum Absättigen unspezifischer Bindungen für 10 Minuten mit serumhaltigem Medium (10 %) vorinkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS werden die Zellen für 20 min mit dem Primärantikörper, verdünnt in serumhaltigem Medium inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wiederum dreimal mit PBS gewaschen und mit dem gegen den ersten Antikörper gerichteten fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper für 20 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläser für 15 min in 4 % Paraformaldehyd fixiert, dann dreimal mit PBS gewaschen und mit Aqua dest. gespült und auf einen Objektträger in einem Eindeckelmedium bestehend aus 76,9 g/l Moviol 4.88 (Hoechst), 2,5 % Diazabicyclo-[2.2.2]-Octan (DABCO) und 31 % Glyzerin in 0,1 M PBS eingebettet. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte unter dem


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Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen, BRD), ausgestattet mit den entsprechenden Filtern.

Färbung intrazellulärer Antigene

Bei einer Färbung von intrazellulären Antigenen wurden die Zellen zuerst für 25 Minuten in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann dreimal mit 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einer Lösung von 1 % Triton X-100 und 3 % Ziegenserum (NGS) in 0,1 M Phosphatpuffer für 10 Minuten vorinkubiert. Danach wurde der Primärantikörper, verdünnt in einer Lösung aus 0,2 % Triton X-100 und 3 % NGS in 0,1 M Phosphatpuffer für 25 Minuten dazugegeben. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M Phosphatpuffer wurden die Zellen mit dem Sekundärantikörper, wiederum verdünnt in 0,2 % Triton X-100 und 3 % NGS in 0,1 M Phosphatpuffer inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläser dreimal mit PBS gewaschen, mit Aqua dest. gespült und auf einen Objektträger in einem Eindeckelmedium (wie oben beschrieben) eingebettet und unter den Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen, BRD), ausgestattet mit den entsprechenden Filtern, ausgewertet und fotografiert.

b) ABC-DAB-Färbetechnik

Zum Nachweis der Maus-Kv1-Proteine wurde die ABC-DAB/Ni-Färbetechnik (siehe u.a.Trojanowski et al.,1983) angewendet.

Abbildung 8: Prinzip der immunzytochemischen Analyse mit der Avidin-Biotin-Technik.

Nach der Bindung des Primärantikörpers an das zu untersuchende Antigen wird dieser durch einen biotinylierten sekundären Antikörper erkannt. Durch die Zugabe von Avidin und biotin-gekoppelter Peroxidase entstehen durch die hohe Avidin-Biotin-Bindungsaffinität große Komplexe. Der Vorteil dieser Methode liegt in der hohen Verstärkung des Ausgangssignals.

Zuerst wurden die Deckgläser mit den Zellen mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen und dann für 30 Minuten in einer Lösung aus 4 % Paraformaldehyd, 0,05 % Glutaraldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert. Anschließend wurden die Zellen wiederum mit Phoshatpuffer gewaschen und für 1-7 Tage bei 4°C aufbewahrt. Die Färbungen erfolgten in Zusammenarbeit mit Dirk Eulitz und Prof. Dr. R. Veh vom Institut für Anatomie der Charitè Berlin.

Die Deckgläser mit den Zellen wurden nochmals zweimal für 15 min mit PBS gewaschen. Zur Zerstörung der endogenen Peroxidaseaktivität wurden die Oligodendrozyten für 30 min in einer Phenylhydrazinlösung (0,3 % Triton X-100, 10 % NGS und 5 ml Phenylhydrazin in PBS) inkubiert. Die Zellen wurden dann direkt in die Primärantikörperlösung (in der entsprechenden Verdünnung in 0,3 %


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Triton X-100, 10 % NGS, 0,1 % Natriumazid, 0,01 % Ethylmercurthiosalicylsäure (Thimerosal) in PBS) überführt und für ca. 12 Stunden (über Nacht) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen (10 min und 20 min) in PBS und Vorinkubation für 30 min in 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS wurden die Zellen für nochmals ca. 12 Stunden in der Sekundärantikörperlösung inkubiert. Der Sekundärantikörper (goat-anti-rabbit, biotinyliert, Vector/Camon) wurde mit einer Verdünnung von 1:2000 in einer Lösung von 2 mg/ml BSA und 0,1 % Natriumazid in PBS verdünnt. Nach zweimaligem Waschen (10 min und 20 min) in PBS und Vorinkubation für 30 min von 2 mg/ml BSA in PBS wurde der nach Vorschrift angesetzte Elite ABC Komplex (Vector/Camon) für 6 h dazugegeben. Nach zweimaligem Waschen (10 min und 20 min) in PBS wurden die Oligodendrozyten für 15 min in einer Lösung von 50 mM Tris und 10 mM Imidazol in H2O vorinkubiert und dann die Farbreaktion durch die Zugabe von 0,015 % H2O2 und 0,3 % Ammoniumnickelsulfat gestartet. Nach 5-10 min wird die Farbreaktion mit 500 µl PBS und zweimaligem Auswaschen mit PBS gestoppt.

Zum Entwässern wurden die Deckgläser mit den Oligodendrozyten in einer aufsteigenden Alkoholreihe (50, 70, 80, 96, 100, 100 %) (Dauer pro Stufe ca. 10 Sekunden) in Xylol überführt und anschließend in Entellan (Merck, Darmstadt, BRD) eingebettet.

Die Primärantikörper Kv1.1, Kv1.3 und Kv1.6 wurden im Labor von R. Veh (AG Elektronenmikroskopie, Institut für Anatomie, Charitè Berlin) hergestellt (Ref. s. Veh et al., 1995 ). Die Primärantikörper Kv1.2, Kv1.4 und Kv1.5 wurden von der Firma Alomone labs (Israel) bezogen.

Die Verdünnungen für die Primärantikörper waren:

rabbit-anti-Kv1.1

1:500

rabbit-anti-Kv1.2

1:1000

rabbit-anti-Kv1.3

1:50

rabbit-anti-Kv1.4

1:500

rabbit-anti-Kv1.5

1:100

rabbit-anti-Kv1.6

1:500

3.4. Einzelzell-PCR

Die PCR-Experimente wurden in Zusammenarbeit mit Dr. F. Kirchhoff (MDC, FG "Zelluläre Neurowissenschaften, Berlin-Buch) durchgeführt. Die Gewinnung des Zytoplasmas sowie die reverse Transkription erfolgten im wesentlichen wie bei Lambolez et al. ( Lambolez et al., 1992 ) beschrieben.

a) Patch-Clamp-Untersuchung und Gewinnung der RNA

Zur elektrophysiologischen Charakterisierung der Zellen wurden zuerst Messungen im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Konfiguration durchgeführt. Nach Beendigung der Messung wurde das Zytoplasma in die mit 8 µl steriler Pipettenlösung gefüllte Patchpipette eingesaugt. Unmittelbar nach der Messung wurde der Inhalt des Patchpipette in ein PCR-Röhrchen mit folgendem Inhalt überführt: 1 µl (40 U/µl) RNAse-Inhibitor, 1 µl (10 U/µl) DNAse, 1 µl (1 M) NaAzetat und 1 µl (25 mM) MgCl2. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit genomischer DNA aus dem Zellkern wurde die Probe dann für 10 min bei 37 °C mit DNAse (10 U/ml, RNAse-frei) inkubiert. Anschließend wurden die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80°C eingefroren. Während der gesamten Arbeiten wurden sterile Bedingungen eingehalten

Die RNA wurde entsprechend der Methode von Chomczynski ( Chomczynski, 1993 ) gewonnen. Dabei wurde das Material zuerst durch Zugabe von 100 µl Trizol für 10 min bei Raumtemperatur homogenisiert, dann mit 20 µl Chloroform und 0,3 µl Glykogen (20 mg/ml) gemixt und anschließend bei 4 °C 10 min bei 14000 g abzentrifugiert. Anschließend wird die wäßrige Phase, in der sich die RNA befindet, in ein PCR-Röhrchen überführt und durch Zugabe von 30 µl Isopropanol für 10 min präzipitiert, zentrifugiert und der Überstand verworfen. Durch Zugabe von 150 µl Ethanol und anschließende Zentrifugation für 3 min bei 14000 g wird die Probe zweimal gewaschen und überbleibende Reste von Ethanol werden durch Lufttrocknung entfernt Anschließend wird die Probe in 10 µl DEPC (Diethylpyrocarbonat)-Wasser aufgenommen.


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b) Reverse Transkription

Bei der reversen Transkription wird durch das Enzym reverse Transkriptase (Superscript Gibco, BRL) von der mRNA-Matrize komplementäre DNA hergestellt. In Anlehnung an die Empfehlungen des Herstellers setzte sich ein Reaktionsansatz wie folgt zusammen: 0,5 µl (0,5 mM) dNTP’s, 1 µl (50 µM) random Hexamer-Primer, 0,5 µl (15 U) RNAse-Inhibitor, 1 µl (100 U) reverse Transkriptase, 1 µl (10 mM) Dithiothreitol (DTT), 4 µl DEPC-H2O und 2 µl 5x Erststrang-Puffer, zuzüglich der in 10 µl Tris-EDTA (Ethyldiaminotetraessigsäure) aufgenommenen Probe.

Die Ansätze wurden für jeweils 90 min bei 42° im Brutschrank inkubiert und danach entweder sofort in einer PCR eingesetzt oder bei -20 °C eingefroren.

c) PCR

Zur Amplifikation der Kv1-spezifischen cDNA-Sequenzen wurden zwei PCR-Zyklus-Serien mit sogenannten ”semi-nested“ Primerpaaren durchgeführt. Dafür wurde ein Sense-Primer aus der 3. Transmembrandomäne (S3) und ein Antisense-Primer aus der Porenregion sowie ein weiterer Antisense-Primer aus der 6. Transmembrandomäne (S6) verwendet, die im Maus-Kv1-Gen stark konserviert sind. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt:

Sense-Primer:

Kv1-S3 5’-cct tac ttt atc acc ctg gg-3’

Antisense-Primer:

Kv1-p 5’-gtc atg gtt acc act gcc cac ca-3’

Kv1-S6 5’-cac aga gag ccc aca atc ttg ccc cc-3’

In der ersten Amplifikationsrunde wurde das Primerpaar Kv1-S3 und Kv1-S6 verwendet. Danach wurden die die Produkte der ersten PCR Runde einer weiteren PCR mit dem Primerpaar Kv1-S3 und Kv1-P unterworfen.

Der Reaktionsansatz für die PCR setzte sich wie folgt zusammen: 20 mM Tris/HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP’s, 2 µl (0,1 µM) je Sense-und Antisense-Primer, 2,5 U Taq Polymerase zuzüglich der Probe (cDNA).

Bei der ersten PCR wurde das verwendete PCR-Gerät (Perkin Elmer Thermocycler 9600) während der ersten Denaturierungsphase 5 min auf 94 °C gesetzt, dann folgten 40 Zyklen zur Amplifikation (60 s bei 94 °C zur Denaturierung, 30 s bei 50 °C zum "Annealing" und 30 s bei 72 °C zur Elongation). Nach dem letzten Elongationsschritt folgten 10 min bei 72 °C zur Endsynthese, danach wurden die Proben auf 4 °C abgekühlt. und entweder sofort analysiert oder bei -20 °C eingefroren.

Um alle in einer Zelle vorhandenen Kv1-Transkripte gleichzeitig nachweisen zu können, wurden die Primer so ausgewählt, daß sich die amplifizierten Kv1 Fragmente durch ihre Länge unterscheiden:

Kv1.1

323 Basenpaare

Kv1.2

326 Basenpaare

Kv1.3

317 Basenpaare

Kv1.4

329 Basenpaare

Kv1.5

332 Basenpaare

Kv1.6

347 Basenpaare

Die nach der PCR erhaltenen Kv1-Fragmente können anschließend aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe aufgetrennt werden. Da eine Agarose-Gelelektrophorese nicht die nötige Trennschärfe erbrachte, wurde die Auftrennung mit Hilfe eines automatischen Sequenziergerätes durchgeführt. Durch die Nutzung von Fluorescein-isothiocyanat-konjugierten Kv1-S3 Primern wurden fluoreszenzmarkierte PCR-Produkte erhalten. Diese wurden dann durch Kapillarelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (Kapillar-Sequencer ABI 310, POP4) aufgetrennt und der relative Mengenanteil der einzelnen Kv1 Transkripte bestimmt (GeneScan Software package).

Als Positivkontrolle wurden cDNA-Proben aus Maus-Gesamthirn anstatt von RNA aus individuellen Zellen verwendet. Als Negativkontrolle dienten die als Pipettenlösung verwendete gepufferte Salzlösung sowie Zytoplasma-Proben von Mikrogliazellen, die keine Kv1-Gene exprimieren.


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