Schmidt, Kathrin: Charakterisierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle an glialen Vorläuferzellen der Maus



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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Shaker-Kaliumkanäle auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

4.1.1. Charakterisierung der Zellkultur

Als Modellsystem für die Untersuchungen wurden Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen der Maus genutzt. Die Primärkulturen aus dem Gesamthirn von 14 Tage alten Maus-Embryonen wurden nach ca. 14 Tagen in Kultur auf einem Monolayer von Astrozyten ausplattiert und dann innerhalb von 2-7 Tagen für die Messungen verwendet. Unter diesen Kulturbedingungen bleibt durch das von den Astrozyten konditionierte Medium der Anteil der undifferenzierten Vorläuferzellen hoch ( Raff et al., 1988 ). Oligodendrozytenvorläuferzellen lassen sich aufgrund ihrer Morphologie (s. Abb. 9) gut von dem darunterliegenden Astrozytenrasen unterscheiden.

Zur Feststellung des Differenzierungsgrades der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurde durch immunozytochemische Färbungen (s. Material und Methoden) die Expression von stadienspezifischen Antigenen getestet. Alle Zellen zeigten eine positive Expression des Intermediärfilaments Vimentin, wie sie für gliale Vorläuferzellen charakteristisch ist ( Fanarraga et al., 1995 ). Die Expression des GD3-Antigens ( Curtis et al., 1988 ) ist für frühe Vorläuferzellen typisch. In den verwendeten Zellkulturen exprimieren 17,3 % (±4,7 %, n(Zellen)=1008; N(Experimente)=4) der Zellen das GD3-Antigen. Morphologisch sind diese Zellen durch einen relativ kleinen Zellkörper (<10 µm) und nur wenige Ausläufer charakterisiert (Abb. 8 A, B). Zellen, die das O4-Antigen ( Sommer und Schachner, 1981 ) exprimieren, sind bereits etwas größer und besitzen weiter verzweigte Ausläufer (Abb. 8 C, D). Diese werden als späte Vorläuferzellen bezeichnet. Der Anteil dieser Zellen in der Kultur nimmt kontinuierlich zu, im untersuchten Zeitraum waren 28,7 % (±9,4 %, n=2056, N=8) der Zellen O4-positiv. Zellen, die das für frühe Oligodendrozyten typische O1 Antigen exprimierten, waren in der Zellkultur nur in geringen Mengen vorhanden (9,2 % ±2,6 %, n=879, N=4). Diese Zellen sind morphologisch durch relativ große Zellkörper und weitverzweigte Ausläufer gekennzeichnet (Abb. 8 E, F) Bei keiner der Zellen konnte die Expression des für reife Oligodendrozyten typischen O10-Antigens festgestellt werden.


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Abbildung 9: Immunozytochemische Charakterisierung der Kultur anhand stadienspezifischer Antigene

Zur Bestimmung des Differenzierungsgrades der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurde mit indirekten Immunfluoreszenzfärbungen die Expression von stadienspezifischen Antigenen getestet.

Die Expression des GD3-Antigens ist für relativ frühe Vorläuferzellen charakteristisch. Diese zeichnen sich morphologisch durch einen relativ kleinen Zellkörper und nur wenige Ausläufer aus (A-Phasenkontrastaufnahme, B-Fluoreszenzbild desselben Bildausschnitts).

In den verwendeten Zellkulturen exprimierten 29 % der Zellen das für späte Vorläuferzellen typischen O4-Antigen (C-Phasenkontrastaufnahme, D-Fluoreszenzbild desselben Bildausschnitts).

Die Expression des für frühe Oligodendrozyten typischen O1-Antigens beginnt nach ca. 15 Tagen in Kultur (E-Phasenkontrastaufnahme, F-Fluoreszenzbild desselben Bildausschnitts).


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4.1.2. Eigenschaften der Auswärtsströme

Die Membranströme von kultivierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik im ”whole-cell-“ Modus ( Hamill et al., 1981 ) innerhalb von 2 bis 7 Tagen nach Abschütteln von den Kulturflaschen untersucht. Das Ruhemembranpotential der Zellen betrug direkt nach Erreichen der ”whole-cell-“ Konfiguration Vm=-53 mV (±16 mV, n=176).

In allen Zellen wurden durch depolarisierende Spannungssprünge zu Potentialen positiver als -40 mV auswärts rektifizierende Kaliumströme aktiviert. Die mittlere Stromdichte betrug bei der Aktivierung durch einen depolarisierenden Spannungssprung auf +20 mV 117,4 pA/pF (±63, n=26). In den meisten Zellen (93 %) inaktivierte ein Teil dieses Stromes (35% des Peak-Stromes ±17%, n=27) innerhalb von 50 ms. Der Zeitverlauf der zeitlichen Inaktivierung folgt einer fallenden Exponentialfunktion mit der Zeitkonstante \|[tgr ]\|= 34,21 ms (±4,19, n=10) (s. Gl. 1). Der inaktivierende Anteil der Ströme läßt sich vom nicht inaktivierenden Anteil trennen, indem der durch einen depolarisierenden Spannungssprung hervorgerufene Strom mit einer Exponentialfunktion

(Gl. 1)

angepaßt wird (Im: Membranstrom, In: konstanter Stromanteil,t: Zeit, t: Zeitkonstante der Inaktivierung). Der konstante Anteil entspricht dann dem zeitlich nicht inaktivierenden Anteil des Stromes (Abb. 10).

Die bei hyperpolarisierenden Potentialen aktivierten Einwärtsströme waren mit 26 % ±23 % (n=27) des Gesamtzellstromes sehr klein (Stromdichte: 37,6 ±43,6 pA/pF, n=26). Das Verhältnis der Einwärtsströme zu den Auswärtsströmen wird als Rektifizierungsindex bezeichnet. Dieser ist bei den weniger weit entwickelten Zellen sehr klein und wird dann mit zunehmender Zelldifferenzierung eins (oder etwas größer). Bei den untersuchten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen betrug der mittlere Rektifizierungsindex 0,35 (±0,39; n=27).

Zur Messung des Umkehrpotentials der Ströme wurden sog. ”tail-current-“ Protokolle (siehe Material und Methoden) angewendet. Das so gemessene Reversionspotential der Membranströme betrug Rp= -61,33 mV (n=8) und liegt nahe bei dem für die verwendete Bad-und Pipettenlösung errechneten Nernstpotential für K+ von -80 mV.

Zur Untersuchung der steady-state-Aktivierungseigenschaften der Kalium-Auswärtsströme wurden die Zellen ausgehend vom Haltepotential von -70 mV für jeweils 50 ms auf eine Serie von depolarisierenden Spannungen (-70 mV bis +80 mV) geklemmt. Die resultierenden Membranströme wurden entsprechend der Gleichung Gk=Ik/(Vmem-Ek) in Leitfähigkeiten umgerechnet. Die jeweiligen Leitfähigkeiten wurden auf die maximale Leitfähigkeit der Zelle Gmax normiert. Bei Auftragung der G/ Gmax -Werte gegen das Membranpotential ergaben sich sigmoide Leitfähigkeits-Spannungskurven. (s. Abb. 10 E) Um die Spannung der halbmaximalen Kanalaktivierung zu erhalten, wurden diese Kurven mit sigmoiden Boltzmann-Funktionen (4 Parameter)

(Gl. 2)

gefittet (Vm: Membranpotential, dV: Steilheit der Inaktivierung V1/2: halbmaximale Inaktivierungsspannung, P: Anteil der nicht inaktivierenden Stromkomponente). Für die von uns untersuchten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen ergab sich eine halbmaximale Kanalaktivierung bei V1/2=-1 mV (±6,4 mV, n=28).

Die Spannungsabhängigkeit der steady state-Inaktivierung wurde mit Hilfe eines Vorpuls-Stimulationsprotokolls (s. Spannungssprungprotokoll 4, Material und Methoden bzw. Abb. 7d) untersucht. Nach verschiedenen Vorpulsen (-130 mV bis +10 mV für 300 ms) wurde die Membran für 50 ms auf +20 mV geklemmt und die resultierenden Ströme gemessen. Es wurden wiederum die Leitfähigkeiten errechnet, normiert und gegen das Vorpuls-Potential aufgetragen. Bei allen untersuchten Zellen ergab sich ein biphasischer Verlauf der Inaktivierungskurven. Für den Fit wurde eine Summe aus zwei Boltzmannfunktionen verwendet (7 Parameter).


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(Gl. 3)

(Vm: Membranpotential, dV bzw. dU: Steilheit der Inaktivierung V1/2 bzw. U1/2: halbmaximale Inaktivierungsspannung, P: Anteil der nicht inaktivierenden Stromkomponente). Der größere Anteil des Gesamtstromes (52 % ± 14 %, n=19) inaktivierte mit einer halbmaximalen Inaktivierungsspannung von V1/2 = -60 mV (±6 mV, n=19), während eine zweite Stromkomponente (35 % ± 19 %, n=19) erst bei positiveren Vorpulspotentialen (-12 mV ± 8 mV, n=19) inaktivierte. 13 % des Gesamtzellstromes (± 13 %, n=19) zeigte keine spannungsabhängige Inaktivierung. Die biphasische Inaktivierungskurve deutet auf das Vorhandensein von mindestens zwei Kanalpopulationen mit unterschiedlichen Inaktivierungseigenschaften hin. Die Anteile der unterschiedlichen Stromkomponenten variierte bei den verschiedenen Zellen stark.


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Abbildung 10: Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung von kultivierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Maus

Zur Charakterisierung der Zellmorphologie wurden kultivierte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen während der elektrophysiologischen Untersuchung im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik mit dem Fluoreszenzfarbstoff Luzifer Gelb gefüllt. Anschließend wurde die Färbung mit einem gegen den Farbstoff gerichteten Antikörper mit Hilfe der Avidin-Biotin-Peroxidase Technik dargestellt. Die Zellkörper waren zwischen 8 und 15 mm groß und besaßen wenige (2-8) relativ schwach verzweigte Ausläufer. Zwei typische Zellen sind in A) und B) dargestellt. Der Balken entspricht 20 mm.


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Zur Aktivierung von auswärts rektifizierenden Strömen wurden die Zellen ausgehend vom Haltepotential von -70 mV für 50 ms auf verschiedene depolarisierende Potentiale (von -70 mV bis +90 mV) geklemmt. Ab ca. -40 mV werden zeitlich leicht inaktivierende Auswärtsströme aktiviert (C und D für die oben dargestellten Zellen). Die Strom-Spannungs-Kurve der Ströme ist in E) dargestellt. Zur Untersuchung der Kanalinaktivierung wurde ein Vorpuls-Stimulationsprotokoll (s. Material und Methoden, 3.2.4.4.) verwendet. Die biphasische Inaktivierungskurve spricht für das Vorhandensein von zwei Kanalpopulationen mit unterschiedlichen Inaktivierungseigenschaften (F).

Kultivierte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen besitzen also spannungsaktivierte, auswärts rektifizierende Kaliumströme mit relativ langsamer Inaktivierung. Diese Ströme lassen sich durch die Spannunsabhängigkeit der Kanalaktivierung sowie der Kanalinaktivierung und durch das Zeitverhalten der Inaktivierung beschreiben.

4.1.3. Pharmakologie der K+-Auswärtsströme

Zur weiteren Charakterisierung der Kaliumströme wurden die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen während der Patch-Clamp-Untersuchung im Ganzzellmodus mit einer Reihe von Kaliumkanalblockern behandelt. Dabei konnte durch keinen der gängigen Kaliumkanalblocker eine vollständige Hemmung der Kaliumströme erreicht werden.

Durch Tetraethylammoniumchlorid (TEA, 1-100 mM) wurden die nicht inaktivierenden Ströme geblockt. Der im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Konfiguration bei einer Membrandepolarisation auf +20 mV aktivierte Strom (Peakstrom, Ip) wird durch die extrazelluläre Applikation von 100 mM TEA auf 57,5 % des Kontrollstromes reduziert. Um die inaktivierenden bzw. nicht inaktivierenden Stromanteile zu bestimmen, wurde der durch einen Spannungssprung aktivierte Strom mit einer fallenden Exponentialfunktion

angepasst (Im: Membranstrom, In: konstanter Stromanteil, t: Zeit, t: Zeitkonstante der Inaktivierung). Der konstante Anteil (In) entspricht dem zeitlich nicht inaktivierenden Stromanteil, die Differenz zwischen diesem und dem Peakstrom ist der inaktivierende Anteil des Stromes (Ii). Die Dosis-Wirkungskurve in Abb. 11 C zeigt, daß der nicht inaktivierende Strom in Abhängigkeit von der TEA-Konzentration gehemmt wird (65 % Reduktion), während der inaktivierende Strom keine signifikanten Änderungen zeigt (25 % Reduktion). Aus der Dosis-Wirkungskurve für den Gesamtstrom (Ip, Peakstrom) wurde die halbmaximale Dosis für den Block durch TEA bestimmt. Diese ergibt sich als der Konzentrationswert der angepaßten Exponentialfunktion an der Stelle der halben Differenz zwischen dem Kontrollwert des Stromes (bei 0 mM TEA) und der Asymptote der Exponentialfunktion. Für den Block des Gesamtzellstromes durch TEA betrug die halbmaximale Dosis I50=29 mM.


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Abbildung 11: Block der K+ Auswärtsströme durch Tetraethylammonium (TEA)

Auswärts rektifizierende Kaliumströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik durch depolarisierende Spannungssprünge (-60 mV bis +20 mV, s. Inset) bei Vorhandensein von 100 mM TEA sowie in Abwesenheit des Blockers aktiviert. Durch Differenzbildung kann der geblockte Stromanteil dargestellt werden. Wie in A) dargestellt, werden durch 100 mM TEA die nicht inaktivierenden Ströme vollständig inhibiert.


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Membranströme bei Depolarisierung der Membran auf +20 mV bei verschiedenen TEA-Konzentrationen (10 bis 100 mM) (B).

Dosis-Wirkungs-Kurve für den Gesamtstrom(Peak-Strom), den inaktivierenden und den nicht inaktivierenden Stromanteil (s. Abb. 11 C, Inset). Während der inaktivierende Anteil keine signifikanten Änderungen aufweist, wird der nicht inaktivierende Anteil mit zunehmenden TEA-Konzentrationen gehemmt (C).

Durch 4-Aminopyridin (4-AP, 0,125-1 mM) dagegen wurde vorwiegend der inaktivierende Stromanteil gehemmt (s. Abb. 12). K+-Auswärtsströme wurden durch eine Serie von depolarisierenden Spannungssprüngen (-70 mV bis +20 mV) aktiviert. Die extrazelluläre Zugabe von 1 mM 4-AP führte zum Block von 55,5 % des bei einem Spannungssprung auf +20 mV aktivierten Peak-Stromes. Die Anteile von inaktivierenden und nicht inaktivierenden Strömen wurden wie oben errechnet. Während bei Anwesenheit von 1 mM 4-AP und einer Depolarisation auf +20 mV der inaktivierende Strom um 72,8 % des Kontrollstromes gehemmt wurde, betrug der Block des nicht inaktivierenden Anteils lediglich 18,7 %. Die halbmaximale Dosis wurde wie oben beschrieben aus der Dosis-Wirkungskurve des Gesamtstromes (Ip, Peakstrom) berechnet und betrug für den Block durch 4-AP IC50= 190 mM.

Abbildung 12: Block der Auswärtsströme von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch 4-Aminopyridin (4-AP)

  1. Auswärts rektifizierende Kaliumströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der Patch-Clamp-

    33

    Technik durch depolarisierende Spannungssprünge (-60 mV bis +20 mV, s. Inset) bei Vorhandensein von 1 mM 4-AP in der Badlösung sowie in Abwesenheit des Blockers aktiviert. Durch Differenzbildung kann der geblockte Stromanteil dargestellt werden. Wie unter A) dargestellt, werden durch 1 mM 4-AP die inaktivierenden Ströme (vollständig) inhibiert.
  2. Membranströme bei Depolarisierung der Membran auf +20 mV bei verschiedenen 4-AP-Konzentrationen (0,125 bis 1 mM).
  3. Dosis-Wirkungs-Kurve für den Gesamtstrom(Peak-Strom), den inaktivierenden und den nicht inaktivierenden Stromanteil. Während der nicht inaktivierende Anteil keine signifikanten Änderungen aufweist, wird der inaktivierende Anteil mit zunehmenden 4-AP-Konzentrationen zunehmend gehemmt.

Der Gesamtzellstrom der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen besteht aus zwei Komponenten mit unterschiedlichen Inaktivierungseigenschaften (s. Abb. 10 FXX). Diese Stromanteile wurden hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber den Kaliumkanalblockern TEA und 4-AP verglichen. Dazu wurde der nach einem depolarisierenden Vorpuls (-30 mV für 300 ms) durch einen Testpuls auf +20 mV aktivierte Stromanteil hinsichtlich seiner Sensitivität mit dem Gesamtstrom (unter Standardbedingungen, ohne Vorpuls) verglichen. Die halbmaximalen Blockerkonzentrationen wurden wie oben beschrieben aus der Dosis-Wirkungskurve ermittelt. Während der Gesamtzellstrom durch TEA mit einer halbmaximalen Konzentration von 29 mM geblockt wird, beträgt die IC50 für den bei einem Potential von V1/2=-12 mV inaktivierenden Strom 1,2 mM (s. Abb. 12 C). Ebenso zeigten beide Stromkomponenten Unterschiede hinsichtlich der 4-AP-Sensitivität mit einer IC50 von 26 mM für den bei -12 mV inaktivierenden Strom im Vergleich zu einer IC50 von 190 mM für den Gesamtzellstrom. Die bei V1/2=-12 mV inaktivierende Stromkomponente ist also durch eine sehr viel höhere Sensitivität für die Kaliumkanalblocker TEA (24-fach) und 4-AP (7-fach) gekennzeichnet.


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Abbildung 13: Geringe Konzentrationen von TEA und 4-AP hemmen eine Teilkomponente des Stromes

Die Zellmembran von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurde im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik auf unterschiedliche Vorpuls-Potentiale (-130 mV bis +10 mV für 300 ms) geklemmt und der danach bei Vm=+20 mV aktivierbare Strom gemessen. Dieser zeigt in Abhängigkeit vom Vorpulspotential einen biphasischen Verlauf mit einer bei ca. -60 mV bzw. bei ca. -12 mV inaktivierenden Komponente (A, B).

Die Dosis-Wirkungs-Kurve des Gesamtstromes (Quadrat) sowie der bei stark depolarisierenden Potentialen inaktivierenden Komponente (Kreis) sind in C) für 4-AP sowie in D) für TEA aufgetragen.

Die Toxine Charybdotoxin (CTX) und a-Dendrotoxin (DTX), sowie MCDP (mast cell degranulating peptide) stellen in verschiedenen Expressionssystemen wirksame Blocker für einige homomere Kv1-Kanäle (insbesondere Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3 und Kv1.6) ( Grissmer et al., 1994 ; Stühmer et al., 1989 , Übersicht s. Chandy und Gutman, 1995 ) dar. Bei Anwendung dieser Substanzen in den


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Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden die Kaliumströme jedoch nicht signifikant gehemmt. Die Membranströme, hervorgerufen durch einen depolarisierenden Spannungssprung auf +20 mV, wurden in Gegenwart des Blockers sowie (davor und danach) in Standardbadlösung gemessen. Bei Zugabe von 1 mM Charybdotoxin wurden noch 96 % (±5 %, n=3) des Kontrollstromwertes gemessen, in der Gegenwart von 2 mM a-Dendrotoxin 92 % (±10 %, n=3) und bei Zugabe von 4 mM MCDP 94 % (±8 %, n=4). Die Funktionalität der Blocker wurde in Kontrollexperimenten an C6-Astrozytoma-Zellen nachgewiesen.

Abbildung 14: Blockierbarkeit der K+ Ströme durch a-Dendrotoxin (DTX), Charybdotoxin (CTX) und MCDP (mast cell degranulating peptide)

Die Applikation von CTX (1 mM) (A), DTX (2 mM) (B) sowie MCDP (4 mM) (C) führte zu keiner signifikanten Reduktion der Auswärtsströme. Die Ströme wurden durch jeweils einen Spannungssprung für 50 ms vom Haltepotential von -70 mV zu einem Potential von +20 mV in Anwesenheit (*) sowie in Abwesenheit des Blockers aktiviert.

Die Verwendung des K+-Kanalblockers Chinidin (5 mM bis 100 mM) (spezifisch für Kanäle der Kv1 ( Grissmer et al., 1994 ; Fedida, 1997 ) und Kv3 Familien ( Grissmer et al., 1994 ; Rettig et al., 1992 ) führte zur weitgehenden Blockierung der Auswärtsströme an Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. In


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Anwesenheit von 100 mM Chinidin inaktivierten die durch depolarisierende Spannungspulse (-70 mV bis +90 mV) hervorgerufenen Ströme innerhalb von 50 ms nahezu vollständig (4-7A), in Kontrollexperimenten in Standardbadlösung dagegen wurde unter den selben Bedingungen lediglich eine Inaktivierung von 35 % (±17 %, n=27) des Gesamtstromes beobachtet. Bei Anwesenheit von 100 mM Chinidin wurden 56,8 % (±15,4 %; n=6) des Peakstromes bei +20 mV sowie 76,5 % (±8,5 %; n=6) des Stromes am Ende eines 50 ms Pulses auf +20 mV gehemmt. Die halbmaximale Blockerkonzentration beträgt 16,6 mM für den Strom am Ende eines 50 ms Pulses auf +20 mV sowie 36,13 mM für den Peakstrom bei +20 mV. Durch Anpassen einer fallenden Exponentialfunktion an die Stromspur erhält man die für die Inaktivierung charakteristische Zeitkonstante. Mit zunehmender Chinidinkonzentration fällt diese Zeitkonstante von 34,2 ±4,2 ms unter Kontrollbedingungen (n=10) auf 4,9 ±1,3 ms bei 100 mM Chinidin. Dies entspricht einer Reduktion auf 12,3 % des Kontrollwertes bei Anwesenheit von 100 mM Chinidin.


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Abbildung 15: Block der Auswärtsströme von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch Chinindin

  1. Auswärts rektifizierende Kaliumströme wurden in der Ganzzellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik durch depolarisierende Spannungssprünge (-60 mV bis +90 mV, s. Inset) bei Vorhandensein von 100 mM Chinidin in der Badlösung sowie in Abwesenheit des Blockers aktiviert (A). In Anwesenheit des Blockers ist die Inaktivierung der Ströme stark beschleunigt. Durch Differenzbildung kann der geblockte Stromanteil dargestellt werden.
  2. Membranströme bei Depolarisierung der Membran auf +20 mV bei verschiedenen Chinidin-Konzentrationen (bis 100 mM) (B).


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Während die spezifischen Toxine DTX, CTX sowie MCDP keinen Einfluß auf die Kaliumkanalaktivität von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen haben, zeigten Chinidin sowie TEA und 4-AP in relativ hoher Konzentration eine blockierenden Effekt. Während TEA die nicht inaktivierenden Stromanteile blockt, werden durch 4-AP die inaktivierenden Ströme gehemmt. Es konnte gezeigt werden, daß ein Teil des Stromes, der sich durch eine höhere halbmaximale Inaktivierungsspannung auszeichnet, eine sehr viel höhere Sensitivität gegenüber 4-AP und TEA besitzt.

4.1.4. Expression von Kv1 Proteinen

Die Expression einer Gruppe von Kaliumkanälen des "delayed rectifier-" Typs auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurde durch immunozytochemische Färbungen mit der ABC-DAB-Technik untersucht. Dazu wurden auf einem Monolayer von Astrozyten ausplattierte Oligodendrozytenvorläuferzellen mit speziell gegen die Kaliumkanalproteine Kv1.1 bis Kv1.6 gerichteten polyklonalen Antikörpern gefärbt (Kv1.2, Kv1.4 and Kv1.5; Alomone Labs, Israel und Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4 and Kv1.6 beschrieben in: Veh et al., 1995 ).

Es zeigte sich, daß bei der Mehrzahl der Vorläuferzellen die Kanalmoleküle Kv1.4 (85 % der Zellen, n=525, N=2), Kv1.5 (99 % der Zellen, n=635, N=1) und Kv1.6 (99 % der Zellen, n=1055, N=3) exprimiert werden. Kv1.1 dagegen wurde nur von einem geringen Prozentsatz der Zellen (10 %, n=1835, N=5) exprimiert. Die K+ Kanalmoleküle Kv1.2 und Kv1.3 konnten auf diesen Zellen nicht nachgewiesen werden. Um die Spezifität der Antikörpers zu testen, wurden als Positivkontrolle Schnitte vom Kleinhirn der Maus parallel angefärbt. Diese zeigten die bei Veh et al., 1995 beschriebenen Färbemuster (s. Abb. 19).

Abbildung 16: Expression der Kv1 Kaliumkanalmoleküle in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Maus

Oligodendrozytenvorläuferzellen der Maus wurden auf einen Astrozytenmonolayer ausplattiert und mit spezifischen Antikörpern gegen die Kanalmoleküle Kv1.1 (A), Kv1.2 (B), Kv1.3 (C), Kv1.4 (D), Kv1.5 (E) und Kv1.6 (F) mit der ABC-DAB-(Avidin-Biotin-Peroxidase-) Technik (s. Material und Methoden)


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immunozytochemisch gefärbt.

Während die Mehrzahl der Zellen Kv1.4, Kv1.5 sowie Kv1.6 exprimierten, wurde Kv1.1 nur in ca. 10 % der Zellen gefunden. Kv1.2 und Kv1.3 Kanäle konnten nicht gefunden werden. Der Balken entspricht 50 mm.

Kv1.1-Kanalmoleküle wurden sowohl auf unreifen Vorläuferzellen mit 2-3 Ausläufern als auch auf reiferen Zellen mit zahlreichen, weitverzweigten Ausläufern gefunden. Auf diesen Zellen befindet sich das Protein gleichmäßig sowohl auf dem Zellkörper als auch auf den Ausläufern. Besonders stark sind die Wachstumskegel/Verzweigungspunkte der Ausläufer gefärbt. Der Astrozyten-Monolayer zeigt keine Kv1.1-Färbung.

Die Mehrzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, jedoch keine Astrozyten, zeigen eine positive Kv1.4-Färbung. Kv1.4 Proteine befinden sich auf den Zellen auf dem Soma und hauptsächlich auf einigen Ausläufern (häufig nur einem besonders langen Ausläufer). Dünnere und verzweigtere Ausläufer wurden nicht oder nur schwach angefärbt (Abb. 17).

Abbildung 17: Lokalisation von Kv1.1 und Kv1.4 K+ Kanalmolekülen auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden auf einem Monolayer von Astrozyten ausplattiert und mit


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Kv1.1 bzw. Kv1.4 spezifischen polyklonalen Antikörpern immunozytochemisch gefärbt. Die Färbung wurde mit der Avidin-Biotin-Peroxidase-Technik (s. Material und Methoden, Kap. 3.3.b) dargestellt.

Ein Teil der Vorläuferzellen (10 %), jedoch keine Astrozyten exprimierten Kv1.1 (A). Eine Expression von Kv1.1 wurde sowohl bei bipolaren Vorläuferzellen (C), als auch bei größeren und weiter verzweigten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (D) gefunden. Eine besonders starke Färbung zeigten die Wachstumskegel sowie die Verzweigungspunkte der Ausläufer (Pfeile).

Ein relativ großer Anteil der Oligodendrozyten (85 %) zeigte eine positive Färbung mit dem Kv1.4 spezifischen Antikörper (F). Dabei wurde häufig ein Ausläufer (Hauptausläufer) besonders stark angefärbt. Bei höherer Vergrößerung wird auch hier eine besondere Färbung der Wachstumskegel und Verzweigungspunkte sichtbar (G, H). Als Positivkontrolle wurden jeweils Schnitte vom Kleinhirn der Maus verwendet (B, F). Der Balken entspricht 50 mm (A, B, E, F) bzw. 20 mm (C, D, G, H).

Kv1.5 wurde nicht nur in der überwiegenden Mehrzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, sondern auch auf Zellen des darunterliegenden Astrozytenrasen gefunden. Die relativ stark punktierte Färbung läßt die Bildung von Kanalaggregaten vermuten. In Astrozyten wurde ebenfalls ein punktiertes Färbemuster festgestellt (Abb. 18 C).

Kv1.6-Proteine wurden in so gut wie allen Zellen der Oligodendrozyten-Abstammung gefunden (99% der Zellen). Dabei wurden sowohl Vorläuferzellen mit wenigen Ausläufern als auch Vorläuferzellen mit komplexerer Morphologie auf Soma und Ausläufern gefärbt (Abb. 18 E-H).


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Abbildung 18: Lokalisation von Kv1.5 und Kv1.6 K+ Kanalmolekülen auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Auf einem Monolayer von Astrozyten ausplattierte gliale Vorläuferzellen wurden mit der Avidin-Biotin-Peroxidase-Technik mit Kv1.5 bzw. Kv1.6 spezifischen polyklonalen Antikörpern gefärbt.

Sowohl alle Oligodendrozyten-Vorläuferzellen als auch der darunterliegende Astrozytenrasen exprimieren das Kv1.5 Protein (A). Die punktierte Färbung deutet auf eine punktförmige Anhäufung von Kanalmolekülen in der Membran (Klusterbildung) der Kv1.5 Proteine hin (C, D). An den Zellkörpern ist eine sehr viel stärkere Färbung als an den Ausläufern zu erkennen.

Die überwiegende Mehrheit der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, jedoch keine Astrozyten exprimierten das Kv1.6 Protein (E). Dabei zeigten sowohl die bipolaren Vorläuferzellen als auch die Vorläuferzellen mit komplexerer Morphologie und zahlreichen Ausläufern eine positive Färbung.

Als Positivkontrolle wurden jeweils Schnitte von Maus Kleinhirn verwendet (B, F). Balken entspricht 20 mm (D, G, H) bzw. 50 mm (A, B, C, E, F).


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Abbildung 19: Keine Expression von Kv1.2 und Kv1.3 Proteinen auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Auf einem Monolayer von Astrozyten ausplattierte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden mit der Avidin-Biotin-Technik auf das Vorhandensein von Kv1.2 und Kv1.3 Proteinen getestet.

  1. Kultivierte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimieren kein Kv1.2 Protein.
  2. Kultivierte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimieren kein Kv1.3 Protein.
  3. Als Positivkontrolle wurden Maus-Kleinhirnschnitte verwendet. Die Kv1.2-Färbung zeigt das bei Veh et al., 1995 beschriebene Färbemuster. Es wurden spezifisch Zellen aus der Purkinje-Zellschicht sowie die Molekularschicht (m) angefärbt.
  4. Die Kv1.3-Färbung des als Positivkontrolle verwendeten Kleinhirnschnitts zeigt das in der Literatur beschriebene Färbemuster. Es sind vor allem die Zellkörper der Purkinje-Zellen sowie sowie deren Ausläufer gefärbt.

Der Balken entspricht 20 mm (A, B) bzw. 50 mm (C, D). (m- Molekularschicht, p- Purkinje- Zellschicht, k- Körnerzellschicht)

Kultivierte Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimieren mehrere Proteine aus der Kv1-Familie der spannungsaktivierten K+ Kanäle gleichzeitig. Während manche Proteine (insbesondere Kv1.6) mehr oder weniger homogen über die Zelloberfläche verteilt sind, kommen andere Kv1 Proteine (Kv1.4, Kv1.1) verstärkt in bestimmten Bereichen (wie Ausläufer, Wachstumskegel) vor.

4.1.5. Expression von Kv1 Transkripten

In Kombination mit einer elektrophysiologischen Untersuchung im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik wurde das Zytoplasma von insgesamt 17 Zellen geerntet und auf das Vorhandensein von Kv1 spezifischen Transkripten (mRNA) untersucht.

Durch die Benutzung von degenerierten Primern war es möglich, alle Kv1 spezifischen Transkripte (Kv1.1 bis Kv1.6) in einer Zelle gleichzeitig nachzuweisen. Die amplifizierten Fragmente unterscheiden sich in ihrer Länge (Abb. 20 A). Die Auftrennung in einem Agarosegel zeigt zwar das Vorhandensein von Fragmenten unterschiedlicher Länge, ergibt aber keine genügende Auftrennung (Abb. 20 B). Für eine weitere Auftrennung wurden die PCR-Produkte durch die Verwendung von fluorescein-gekoppelten Primern fluoreszenzmarkiert und anschließend mit einem automatischen Kapillarsequenzierer aufgetrennt.


43

Die Messungen ergaben, daß die meisten Zellen mehrere (2-3) Kv1 Transkripte gleichzeitig exprimieren. Bei 4 (von 17) Zellen) konnte nur ein Kv1 Transkript nachgewiesen werden. Die exprimierten Transkripte waren am häufigsten Kv1.2 (64,7 % der Zellen), Kv1.6 (58,8%), Kv1.5 (52,9 %), Kv1.3 (29,4 %), Kv1.4 (23,5 %) sowie. Kv1.1 (5,9 %).

Die relativen Anteile der einzelnen Zellen an Kv1 spezifischen Transkripten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 2: Anteile von Kv1 Transkripten in einzelnen Oligodendrozytenvorläuferzellen

#

Kv1.1

Kv1.2

Kv1.3

Kv1.4

Kv1.5

Kv1.6

226/2






100

234/1





13

87

234/10


13

3


2

81

234/2




27

25

48

226/4


29


46


25

226/1


76




24

226/7


36



48

17

234/7


75



9

16

226/6





90

10

226/5


86

5


6

4

226/8


100





234/6


100





234/4



100




226/10

40




60


234/11


27

73




226/9


80


6

15


234/3


56

39

6



#

1/17

11/17

5/17

4/17

9/17

10/17

%

5.9

64.7

29.4

23.5

52.9

58.8


44

Erstaunlicherweise wurde das Kv1.2 Transkript in einem großen Teil der Zellen (64,7 % der Zellen) und Kv1.3 in 29,4 % der Zellen gefunden, obwohl die Expression der entsprechenden Proteine mit den immunozytochemischen Untersuchungen nicht nachgewiesen werden konnte. Trotz der sehr heterogenen Transkriptexpression konnten bei den untersuchten Zellen keine Unterschiede hinsichtlich des Strommusters festgestellt werden (Abb. 21).

Abbildung 20: Analyse der Kv1-Transkriptexpression mit Hilfe der Einzelzell-PCR-Technik

  1. Bei der Einzelzell-PCR können durch die Nutzung von degenerierten Primern die amplifizierten cDNA-Fragmente aufgrund ihrer Länge unterschieden werden. Die PCR wurde zuerst mit dem Primerpaar Kv1-S6antisense und Kv-S3sense und danach mit dem Primerpaar Kv1-Pantisense und Kv1-S3sense durchgeführt (seminested).
  2. Die cDNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Ethidiumbromid sichtbar visualisiert.


45

Abbildung 21: Kv1 Transkriptexpression und Ganzzellstrommuster von einzelnen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

  1. Die Auftrennung der amplifizierten cDNA-Fragmente erfolgte durch Kapillarelektrophorese. Durch die Nutzung von Molekulargewichtsmarkern (rot) kann die Fragmentlänge auf ein Basenpaar genau bestimmt werden. Kv1-Transkripte treten in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in sehr unterschiedlichen Kombinationen auf. Zum Teil wurde nur ein Transkript pro Zelle gefunden (z.B. Zelle 8, zweite Spur von oben), meist jedoch zwei bis drei Transkripte (z.B. Zelle 10, oberste Spur).

    46

  2. Vor dem Ernten des Zytoplasmas wurden die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Konfiguration elektrophysiologisch untersucht. Zur Aktivierung der K+ Auswärtsströme wurden depolarisierende Spannungssprünge (-70 mV bis +20 mV) für 50 ms ausgeführt. Trotz der heterogenen Transkriptexpression konnten keine signifikanten Unterschiede im Strommuster der Zellen festgestellt werden.

4.1.6. Einfluß der Kv1.1 bzw. Kv1.4-Expression auf die elektrophysiologischen Eigenschaften

Um den Beitrag der einzelnen Kaliumkanäle zu den elektrophysiologischen Eigenschaften des Gesamtzellstromes zu testen, wurden einzelne Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zuerst elektrophysiologisch untersucht und danach auf das Vorhandensein der Kanalproteine Kv1.4 (n=9) bzw. Kv1.1 (n=18) getestet. Das Wiederfinden der Zellen wurde durch ein auf den Deckgläschen vorhandenes Beschriftungssystem ("cellocate-" Deckgläser, Fa. Eppendorf, Hamburg) ermöglicht. Im Anschluß wurden die Unterschiede hinsichtlich der Stromeigenschaften zwischen Kv1.4-positiven (n=5) und Kv1.4-negativen Zellen (n=4) bzw. zwischen Kv1.1-positiven (n=1) und Kv1.1-negativen Zellen (n=17) verglichen.

Abbildung 22: Elektrophysiologische Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Vergleich zur Expression des Kv1.1-Proteins


47

Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik untersucht und anschließend immunozytochemisch auf die Expression von Kv1.1 getestet.

  1. Kv1.1 positive Oligodendrozyten-Vorläuferzelle. K+ Auswärtsströme wurden durch depolarisierende Spannungspulse (-70 bis +90 mV) aktiviert.
  2. Kv1.1 negative Oligodendrozyten-Vorläuferzelle. K+ Auswärtsströme zeigen eine leichte zeitliche Inaktivierung.
  3. mittlere Strom-Spannungskurve von 11 Kv1.1 negativen Zellen (Kreis) und einer Kv1.1 (Quadrat) positiven Zelle. Es treten keine Unterschiede in der Stromaktivierung auf.
  4. Mit Hilfe eines Vorpuls-Stimulationsprotokolls (s. Material und Methoden, 3.2.4.4.) wurde die Inaktivierung der K+ Ströme bei Kv1.1 negativen (Kreis) und Kv1.1 positiven (Quadrat) Zellen untersucht. Bei der Kv1.1 positiven Zelle ist der Anteil des zweiten, erst bei stärkerer Depolarisierung inaktivierenden Stromes größer (60 %) als bei der Kv1.1 negativen Zelle (34 %). Die halbmaximalen Inaktivierungsspannungen liegen innerhalb der Schwankungsbreite der Zellen.

Die Membranströme der kultivierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik im Ganzzellmodus untersucht. Das direkt nach dem Herstellen der Ganzzellkonfiguration unter Stromklemme gemessene Membranpotential lag für die Kv1.1 negativen Zellen mit Vm=-47 mV (±10 mV, n=17) nahe dem Mittelwert für diese Zellen (Vm=-53 mV ±16 mV; n=176). Das Membranpotential der Kv1.1 positiven Zelle lag mit -64 mV etwas weiter im negativen Bereich. Durch eine Serie von depolarisierenden Spannungspulsen (-70 mV bis +90 mV für 50 ms) wurden bei allen Zellen K+ Auswärtsströme aktiviert. Die Stromwerte wurden entsprechend Gleichung 4-2 (s. oben) in Leitfähigkeiten umgerechnet und gegen die Spannung aufgetragen. Der Verlauf dieser Kurven war bei den Kv1.1 positiven und Kv1.1 negativen Zellen nahezu identisch (Abb. 22 C). Die Anpassung mit einer Boltzmann-Funktion ergab eine mittlere halbmaximale Aktivierungsspannung von V1/2=0,9 mV (±9,4 mV, n=15) bei den Kv1.1 negativen Zellen sowie einen Wert von-2,8 bei der Kv1.1 positiven Zelle. Die Spannungsabhängigkeit der Kanalinaktivierung wurde mit Hilfe eines Vorpuls-Stimulationsprotokolls (Spannungssprungprotokoll 4, Abb. 7 D, Material und Methoden) untersucht. Die Auftragung der Leitfähigkeiten gegen das Membranpotential ergibt biphasisch sigmoid abnehmende Kurven (Abb. 22 D). Diese wurden durch eine Summe von zwei Boltzmannfunktionen angepaßt. Es ergaben sich keine Unterschiede der Kanalinaktivierung zwischen Kv1.1 positiven und Kv1.1 negativen Zellen. Die halbmaximale Inaktivierungsspannungen betrugen V1/2=-63,4 (±5,5; n=4) und V1/2=-15,7 (±1,9; n=4) für die Kv1.1 negativen Zellen und V1/2=-58 mV bzw. V1/2=-11,9 mV für die Kv1.1 positive Zelle.

Die relativen Anteile der beiden Stromfraktionen unterschieden sich bei Kv1.1 negativen und positiven Zellen. Während bei den Kv1.1 negativen Zellen 65 % (±5 %, n=4) des Stromes durch die erste Boltzmannfunktion (mit V1/2=-60 mV) angepasst werden konnten, waren es bei der Kv1.1 positiven Zelle lediglich 35 %. Diese Werte liegen aber im Bereich der Schwankungen innerhalb der Zellen.

Kombinierte elektrophysiologische und immunozytochemische Untersuchungen wurden (wie oben beschrieben) ebenfalls für die Expression des Kv1.4 K+ Kanalmoleküls durchgeführt. Im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Konfiguration wurde unter Spannungsklemme das Membranpotential bestimmt. Bei den Kv1.4 negativen Zellen ergaben sich etwas kleinere Membranpotentialwerte (Vm = -33 ±13 mV, n=4) als bei den Kv1.4 positiven Zellen (Vm =-51 ±14 mV, n=7). K+ Auswärtsströme wurden durch eine Reihe von depolarisierenden Spannungspulsen (-70 mV bis +90 mV) aktiviert. Die aus den Stromwerten errechneten Leitfähigkeiten wurden gegen die Spannung aufgetragen. Wie in Abb. 23 C dargestellt, ergeben die Leitfähigkeits-Spannungs-Kurven der Kv1.4 negativen und Kv1.4 positiven Zellen leicht unterschiedliche Verläufe. Während die Leitfähigkeiten der Kv1.4 negativen Zellen bei stark depolarisierenden Potentialen wieder abnehmen, zeigt die Kurve der Kv1.4 positiven Zellen keine Sättigung. Die aus dem Boltzmann-Fit der Leitfähigkeits-Spannungs-Kurve errechnete halbmaximale Aktivierungsspannung betrug V1/2=-4,8 ±5,81 mV (n=4) für die Kv1.4 negativen Zellen sowie V1/2=+3,7 ±9,71 mV (n=5) für die Kv1.4 positiven Zellen. Die Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung ergab keine Unterschiede hinsichtlich der Expression von Kv1.4 Proteinen. Die halbmaximalen Inaktivierungsspannungen betrugen V1/2=-60,1 mV (±1,7 mV, n=3) und V1/2=-20,9 mV (±3,2 mV n=3) für die Kv1.4 negativen Zellen sowie V1/2=-59,1 mV (±4,5 mV, n=4) und V1/2=-12,6 mV (±1 mV, n=4) für die Kv1.4 negativen Zellen. Der Anteil der ersten Stromkomponente betrug bei den Kv1.4 positiven Zellen 50 % ± 9 %, n=4 sowie 49 % ±21 %, n=3 bei den Kv1.4 negativen Zellen und zeigten somit keine Unterschiede hinsichtlich der Kv1.4 Expression.


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Abbildung 23: Elektrophysiologische Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Vergleich zur Expression des Kv1.4-Proteins

Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik untersucht und anschließend immunozytochemisch auf die Expression von Kv1.4 getestet.

  1. Kv1.4 positive Oligodendrozyten-Vorläuferzelle. K+ Auswärtsströme wurden durch depolarisierende Spannungspulse (-70 bis +90 mV) aktiviert und zeigen eine leichte zeitliche Inaktivierung.
  2. Kv1.4 negative Oligodendrozyten-Vorläuferzelle.
  3. mittlere Strom-Spannungskurve von fünf Kv1.4 positiven Zellen (Quadrat) und vier Kv1.4 (Kreis) negativen Zellen.
  4. Mit Hilfe eines Vorpuls-Stimulationsprotokolls (s. Material und Methoden, 3.2.4.4.) wurde die Inaktivierung der K+ Ströme bei Kv1.4 positiven (Quadrat) und Kv1.1 negativen (Kreis) Zellen untersucht. Es treten keine Unterschiede in der Strominaktivierung auf.


49

4.2. Rolle von Kaliumkanälen bei der Neurotransmitterantwort

4.2.1. Hemmung von auswärts rektifizierenden K+ Kanälen durch GABA

Auswärts rektifizierende Kaliumkanäle von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen können durch ionotrope Glutamatrezeptoren reguliert werden (Kainat-Typ) ( Borges et al., 1994 ; Borges und Kettenmann, 1995 ). Da Oligodendrozyten-Vorläuferzellen auch ionotrope GABAA Rezeptoren exprimieren, ist es interessant zu untersuchen, ob die Aktivierung dieser Kanäle ebenfalls zu einer Modulation von spannungsabhängigen Kaliumkanälen führt. Da Körnerzellen in Kultur eine sehr viel höhere Dichte an GABA-Rezeptoren exprimieren, wurden diese Zellen als Modellsystem für die Untersuchungen gewählt.

Körnerzellen aus den Kleinhirn von perinatalen Mäusen wurden in Zellkultur mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik im Ganzzell- und Einzelkanalmodus bezüglich ihres Kaliumkanalstromes bei Applikation des inhibitorischen Neurotransmitters GABA untersucht.

Das Membranstrommuster der Körnerzellen ist durch die Expression von schnell inaktivierenden Na+-Strömen, auswärts rektifizierenden Kaliumströmen mit langsamer Inaktivierung oder keiner zeitlichen Inaktivierung ("delayed rectifier"-Typ) sowie schnell inaktivierenden Kaliumströmen ("A-Typ-" Ströme) geprägt (Abb. 24 A). Die Strom-Spannungs-Kurve (Abb. 24 B) zeigt, daß bei hyperpolarisierenden Potentialen nur sehr kleine Einwärtsströme fließen, bei Depolarisierung ab ca. -40 mV jedoch starke Auswärtsströme aktiviert werden.

GABAA-Rezeptoren sind ionotrope Membranrezeptoren, die bei Aktivierung mit der Öffnung eines intrinsischen Cl--Kanals reagieren. Appliziert man GABA in einer Konzentration von 10-4 M für 15 s über die Badperfusion, kommt es bei einem Haltepotential von -60 mV zur Aktivierung eines Einwärtsstromes mit einer mittleren Amplitude von 450 pA (Bereich von 250 bis 950 pA; n=27). Zur weiteren Untersuchung dieses Stromes wurden die Kaliumströme durch Vorinkubation der Zellen für 3 min mit dem Kaliumkanalblocker Ba2+ gehemmt und GABA (10-4 M) wurde in der Anwesenheit von Ba2+ appliziert (Abb. 24 C). Um dabei den zeitlichen Verlauf der Strom-Spannungskurven während der Applikation von GABA untersuchen zu können, wurde die Membran wiederholt jeweils für 50 ms von einem Haltepotential von -60 mV auf eine Reihe von de-und hyperpolarisierenden Potentialen geklemmt (Abb. 24 C, oben). Die Strom-Spannungs-Kurve des GABA-induzierten Stromes wurde durch Subtraktion des Stromes vor der GABA-Zugabe vom Strom während der GABA-Antwort erhalten (Abb. 24 D). Das mittlere Reversionspotential des GABA-induzierten Stromes lag bei -2,4 mV (Bereich von -10 mV bis 0 mV, n=5). Dies entspricht in guter Näherung dem Gleichgewichtspotential für Cl- (Nernst-Potential) von ECl=-4,5 mV für die verwendete Bad- und Pipettenlösung.


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Abbildung 24: Kultivierte Körnerzellen reagieren auf die Applikation von GABA (10-4 M) mit der Aktivierung eines Auswärtswärtsstromes von Cl- Ionen.

  1. Körnerzellen in Zellkultur wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik im Ganzzellmodus auf eine Reihe von de- und hyperpolarisierenden Spannungen geklemmt und die resultierenden Ströme gemessen.
  2. Die Strom-Spannungs-Kurve wurde aus den in A) dargestellten Membranströmen zum Zeitpunkt 40 ms nach Beginn des Spannungssprunges gewonnen. Bei Hyperpolarisation werden nur kleine Ströme aktiviert, während bei Depolarisation ab ca. -40 mV (typisch für "delayed rectifier") große Auswärtsströme aktiviert werden.

  3. 51

    Während kontinuierlicher Stimulation der Zelle mit dem oben dargestellten Stimulationsprotokoll (s. auch Material und Methoden 3.2.4.2.) wurde GABA für 15 s über die Badperfusion appliziert. Zur Blockierung der K+ Ströme wurden die Zellen für 3 min mit Ba2+ (10 mM) vorinkubiert und war Ba2+ während der gesamten Messung in der Perfusionslösung vorhanden. Durch die Zugabe von GABA wird ein Einwärtsstrom von ca. 750 pA aktiviert.
  4. Die Strom-Spannungs-Kurve des GABA-induzierten Stromes wurde durch Subtraktion des Stromes vor der GABA-Applikation von dem Strom während der GABA-Applikation gewonnen. Die resultierende Strom-Spannungs-Kurve ist annähernd linear und hat ein Reversionspotential nahe 0 mV.

Durch Anwendung des spezifischen Agonisten Muscimol soll getestet werden, ob die GABA-Antwort auf Körnerzellen durch GABAA-Rezeptoren vermittelt wird.

Der für GABAA-Rezeptoren spezifische Agonist Muscimol (10-4 M) führte ebenfalls zur Induktion eines Einwärtsstromes und zu einem Block von auswärts rektifizierenden K+ Strömen (Abb. 25). Die durchschnittliche Leitfähigkeitserhöhung bei hyperpolarisierenden Potentialen betrug 10,1 nS (Bereich von 7,6 bis 14,3 nS; n=7), die durch Muscimol induzierte mittlere Leitfähigkeitsreduktion bei Depolarisation betrug 28,5% (Bereich von 19,5 bis 38,3 %; n=7), vergleichbar mit den bei GABA erhaltenen Werten.

Abbildung 25: Der GABAA-Rezeptor-Agonist Muscimol reproduziert die durch GABA hervorgerufenen Effekte an kultivierten Körnerzellen


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  1. Membranströme von kultivierten Körnerzellen wurden im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Technik mit dem in Fig. 4-15C beschriebenen Stimulationsprotokoll gemessen. Die Applikation von Muscimol (10-4 M) führt (wie die Applikation von GABA) zur Induktion eines Cl- Einwärtsstromes und zur Blockierung von K+-Auswärtsströmen. Die Strom-Spannungs-Kurve (rechte Darstellung) wurde durch Subtraktion des Stromes vor der Zugabe von GABA vom Strom bei maximalem Block der K+-Ströme erhalten.
  2. Muscimol (10-4 M) blockiert im "cell-attached-" Modus der Patch-Clamp-Technik registrierte K+ Kanäle. Durch Membrandepolarisierung (+30 mV) werden mehrere unter der Pipette befindliche auswärts rektifiziernde K+ Kanäle geöffnet. Diese werden durch die Zugabe von Muscimol (10-4) geblockt.

Die Antwort der Körnerzellen auf die Applikation von GABA führt in Abwesenheit des Kaliumkanalblockers Ba2+ zu einer komplexen Stromantwort bestehend aus einer Leitfähigkeitserhöhung bei hyperpolarisierenden Potentialen (Einwärtsstrom) und einer Leitfähigkeitserniedrigung bei Depolarisation (Abb. 26 A, obere Darstellung). Die Aktivierung des Rezeptors führt zu einem Chlorid-Auswärtsstrom über den in den Rezeptor integrierten Chloridkanal sowie zu einer Hemmung von auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen. Diese beiden Effekte können aufgrund ihrer Spannungsabhängigkeit getrennt werden. Bei Potentialen von -60 mV (und negativer) kommt es bei der Zugabe von GABA durch die Aktivierung eines Cl- Auswärtsstromes zu einer linearen Leitfähigkeitserhöhung von durchschnittlich 8,6 nS (Bereich von 3,4 bis 13,6 nS, n=8 bei -60 mV), die innerhalb von 3 min vollständig reversibel ist. Die Inhibierung der Kaliumkanäle wird bei Depolarisierung auf Potentiale von -35 mV (und positiver) meßbar. Durch die Hemmung der Kaliumströme kommt es zu einer Leitfähigkeitsreduktion von durchschnittlich 27 % (19 bis 43 %, n=24). Um die beiden sich überlagernden Effekte zu trennen, wurde die Leitfähigkeit bei Hyperpolarisation von der jeweiligen Leitfähigkeit bei Depolarisation abgezogen (Abb. 26 A, untere Darstellung). Auf diesem Wege erhält man eine Reduktion der Kaliumleitfähigkeit von 22,3 nS (Bereich von 18,6 bis 25,3 nS; n=8) vor GABA-Applikation auf 6,5 nS (Bereich von 2,9 bis 8,7 nS), was einer Reduktion um durchschnittlich 71% (Bereich von 66 bis 85 %; n=8) entspricht.


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Abbildung 26: Die GABA-Antwort bei kultivierten Körnerzellen besteht aus zwei Komponenten.

  1. Applikation von GABA (10-4 M) führt bei kultivierten Körnerzellen zu einer komplexen Stromantwort bestehend aus der Induktion des Cl--Auswärtsstromes und einer Hemmung von K+-Auswärtsströmen. Die Membranströme wurden durch die in Abb. 24 C beschriebene Stimulation erzeugt. Der Zeitverlauf der durch GABA hervorgerufenen Leitfähigkeitsänderungen (untere Darstellung) wurde aus der Stromspur (obere Darstellung) berechnet. Dazu wurde die Einwärtsleitfähigkeit aus den Stromwerten bei Potentialen zwischen -60 und -110 mV berechnet und die Leitfähigkeit vor der Applikation von GABA abgezogen (Dreiecke). Die Leitfähigkeit steigt schnell an und fällt dann innerhalb von 3 min wieder auf den Ruhewert ab. Die Auswärtsleitfähigkeit wurde aus den Stromwerten bei Potentialen zwischen -10 und +40 mV bestimmt und die Einwärtsleitfähigkeit wurde von der so berechneten Auswärtsleitfähigkeit abgezogen (Kreise).
  2. Strom-Spannungs-Kurve des durch GABA induzierten Stromes zum Zeitpunkt der maximalen Stromantwort, Ströme vor der Applikation von GABA wurden subtrahiert.
  3. Strom-Spannungs-Kurve zum Zeitpunkt des maximalen K+ Kanalblocks, die Ströme vor der Applikation von GABA wurden subtrahiert.

Die auswärts rektifizierenden Kaliumströme setzen sich bei Körnerzellen aus zwei unterschiedlichen Anteilen zusammen, den "delayed rectifier-" K+-Strömen und den "A-Typ-" K+-Strömen. Die schnell inaktivierenden "A-Typ-" K+-Ströme werden durch vorhergehende Hyperpolarisierung aktiviert. Zur Isolation der A-Strom-Komponente wurde ein Spannungssprung jeweils vom Haltepotential (-50 mV) und von -120 mV ausgeführt und die Ströme subtrahiert (Abb. 27 B Inset). Die Applikation von GABA (10-4 M) führt sowohl zur Hemmung des nicht inaktivierenden "delayed rectifier-" Stromes (um 27,8 %, n=5) (Abb. 27 A) als auch zur Hemmung des schnell inaktivierenden "A-Typ-" Stromes (30,8 %,


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n=5) (Abb. 27 B).

Abbildung 27: Effekt von GABA auf den "delayed rectifier-" und den "A-Typ-" Strom bei Körnerzellen

  1. -Ströme vom "delayed rectifier-" Typ wurden auf kultivierten Körnerzellen durch depolarisierende Spannungspulse im Ganzzellmodus der Patch-clamp-Technik für 50 ms auf +30 mV aktiviert. Die Zugabe von GABA (10-4 M) hemmt den "delayed rectifier-" Strom.
  2. Zur Isolation des A-Strom-Anteils wurden depolarisierende Spannungssprünge auf +30 mV nach vorhergehender Hyperpolarisation für 300 ms auf -120 mV ausgeführt und die durch die in A) beschriebene Stimulation hervorgerufenen "delayed rectifier-" Ströme wurden subtrahiert. Die resultierenden Ströme zeigen die für A-Typ-Ströme typische schnelle Inaktivierung. Die Zugabe von GABA (10-4 M) hemmt ebenfalls die A-Strom-Komponente von kultivierten Körnerzellen.

4.2.2. GABA blockiert die K+ Einzelkanalaktivität

Um den Mechanismus des K+ Kanalblocks bei Aktivierung des GABA-Rezeptors zu analysieren, wurden weitere Untersuchungen im Einzelkanalmodus der Patch-Clamp-Technik durchgeführt. Dazu wurden sowohl Einzelkanal- als auch Vielkanalpatches im "cell-attached" Modus untersucht. K+ Kanäle wurden aufgrund ihres Reversionspotentiales von 0-10 mV relativ zum Ruhepotential der Zelle (K+ Nernst-Potential) identifiziert. Zur Charakterisierung der Kanäle wurden ausgehend von einem Haltepotential von 0 mV (Membranruhepotential) Spannungssprünge zu verschiedenen depolarisierenden Potentialen ausgeführt (Abb. 28 B, linke Darstellung). Im Falle von Vielkanalpatches wurden depolarisierende Spannungssprünge auf 50, 70 und 90 mV wiederholt (50mal) ausgeführt und die resultierenden Ströme wurden gemittelt. Diese gemittelten Stromspuren zeigten entweder "delayed rectifier-" (Abb. 28 B, rechte Darstellung) oder "A-Strom-" Charakter (Abb. 25 B).

GABA (oder Muscimol) wurden über die Badperfusion appliziert und wirkten somit auf die Membranrezeptoren außerhalb des unter der Patchpipette befindlichen Membranstücks (s. Abb. 28 A). Das Signal zur Beeinflussung der K+ Kanäle muß also über das Zytoplasma übertragen werden. Die Applikation von GABA führte zur Reduktion oder vollständigen Blockierung der K+ Einzelkanalströme (Abb. 28 C) oder Vielkanalströme (Abb. 25B). Dabei ändert sich die Leitfähigkeit der Kanäle nicht, sondern die Öffnungswahrscheinlichkeit der Kanäle wird zum Teil bis zum kompletten Schließen des Kanals verringert. Diese entspricht dem zeitlichen Anteil, der vom Kanal im offenen Zustand verbracht wird. Die Reduktion der Kanalaktivität war nach Auswaschen von GABA nicht immer vollständig reversibel.


55

Abbildung 28: GABA blockiert auswärts rektifizierende K+ Kanäle in der "cell-attached-" Konfiguration


56

  1. Einzelkanäle (bzw. Vielkanalströme) auf dem von der Pipette isolierten Membranstück wurden mit der Patch-clamp-Technik in der "cell-attached-" Konfiguration gemessen. GABA (10-4 M) wurde über die Badperfusion appliziert und konnte somit nur auf Membranrezeptoren außerhalb der Patchpipette wirksam werden. Das Signal von den GABA-Rezeptoren zu den unter der Patchpipette befindlichen Kaliumkanälen wird somit auf dem Wege über das Zytoplasma weitergeleitet.
  2. Ströme durch auswärts rektifizierende Kaliumkanäle bei verschiedenen depolarisierenden Haltepotentialen (relativ zum Membranruhepotential). Die Kanalöffnungen sind nach oben aufgetragen. Aus der Strom-Spannungs-Kurve (rechts) ergibt sich eine Einzelkanalleitfähigkeit von g= 80,5 pS und ein Reversionspotential nahe 0 mV (dem Membranruhepotential). Die durch Mittlung der Ströme von jeweils 50 Spannungssprüngen auf 50, 70 und 90 mV entstehende Stromspur zeigt eindeutig das Zeitverhalten eines "delayed rectifier-" K+ Kanals (Darstellung oben rechs).
  3. Die Zugabe von GABA führt zu einem nahezu vollständigen Block der K+ Ströme (selbe Zelle wie in B). Auswaschen von GABA führt hier nicht nur zur Wiederherstellung der ursprünglichen Aktivität, sondern zu erhöhter Kanalaktivität. Die Öffnungswahrscheinlichkeit des Kanals wurde zu verschiedenen Zeitpunkten vor, während und nach der Applikation von GABA berechnet und zeitlich aufgetragen (Darstellung rechts).

Die Stärke des Rauschens (d.h. der Amplitudenschwankungen) einer Stromspur ist ein Maß für die Anzahl der geöffneten Kanäle. Die Analyse des Stromrauschens stellt also eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung von Ionenkanalaktivitäten dar. Dazu wurde in der Ganzzellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik das Stromrauschen beim Haltepotential von -60 mV und bei einem Potential von 0 mV bestimmt. Da -60 mV annähernd mit dem Reversionspotential von K+ übereinstimmt, wird bei dieser Membranspannung das Rauschen ausschließlich durch Cl- Ionen bestimmt, während bei 0 mV, dem Reversionspotential von Cl-, das Rauschen durch K+ Ionen verursacht wird. Diese beiden Potentiale wurden alternierend für jeweils 500 ms (für mehrere Minuten) appliziert und die resultierenden Ströme wurden mit hoher Zeitauflösung (10 kHz) aufgezeichnet. GABA oder Muscimol (10-4 M) wurden während der Aufzeichnung für 15 s appliziert. Die Häufigkeit der gemessenen Stromamplituden während einer bestimmten Zeitspanne vor, während und nach der GABA-Antwort wurden jeweils in einem Histogramm (Amplitudenhistogramm) dargestellt (s Abb. 29 unten). Da der Strom in diesem Zeitfenster um einen bestimmten Wert variiert, haben die Amplitudenhistogramme die Form einer Gauß-Kurve. Die Höhe des Stromrauschens entspricht der Breite der Gauß-Kurven und ergibt sich aus der Standardabweichung der Gaußverteilung. Bei einem Membranpotential von 0 mV betrug die mittlere Varianz der Gaußverteilung 5,2*10-5 nA2 (n=5) und verringerte sich während der Zugabe von GABA (bzw. Muscimol) auf 4,1*10-5 nA2, was einer Reduktion um 21 % entspricht. Im Gegensatz dazu erhöhte sich das Stromrauschen bei -60 mV in Gegenwart von GABA (oder Muscimol) von 0,8*10-5 nA2 auf 7,2*10-5 nA2 auf 900 % des Kontrollwertes.


57

Abbildung 29: Analyse des Stromrauschens während der Applikation von Muscimol (10-4 M)

Die Zellmembran von kultivierten Körnerzellen wurde im Ganzzellmodus der Patch-clamp-Konfiguration jeweils für 500 ms alternierend auf -60 mV und 0 mV geklemmt und die resultierenden Ströme wurden aufgezeichnet (obere Darstellung). Daraus wurden die Amplitudenhistogramme vor (1, 3) und während der Zugabe von Muscimol (2, 4) berechnet und mit einer Gauß-Funktion angepaßt. Die Varianz der Gaußfunktion ist ein Maß für das Rauschen und damit für die Anzahl geöffneter Kanäle. Applikation des GABAA-Agonisten Muscimol führt zu einem Einwärtsstrom verbunden mit einem erhöhten Stromrauschen bei -60 mV und zur Reduktion von Auswärtsströmen bei 0 mV. Die Varianz der Gaußverteilung bei 0 mV verringerte sich von 11,2*10-5 nA2 vor der Applikation auf 6,7*10-5 nA2 während der Zugabe von Muscimol (unten links). Bei einem Haltepotential von -60 mV hingegen erhöhte sich das Stromrauschen von 1,4*10-5 nA2 vor der Muscimol-Applikation auf 45,2*10-5 nA2 während der Muscimolapplikation (unten rechts).


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