Schmidt, Kathrin: Charakterisierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle an glialen Vorläuferzellen der Maus



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Kapitel 5. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde die funktionelle Expression spannungsaktivierbarer Kaliumkanäle des Kv1-Typs (Shaker-Typ) in kultivierten glialen Vorläuferzellen der Maus untersucht. Dazu wurden die Expression von Kv1 Transkripten, die Kv1 Proteinexpression sowie die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der Membranströme miteinander verglichen. Weiterhin wurde die Regulierung dieser Kaliumkanäle durch die Aktivierung von Neurotransmitterrezeptoren untersucht.

5.1. Oligodendrozyten verfügen über ein heterogenes Repertoire von Kaliumkanälen

Patch-Clamp-Untersuchungen im Ganzzellmodus zeigten bei allen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen des verwendeten Zellkultursystems eine starke Expression spannungsaktivierter, auswärts rektifizierender Kaliumströme.

Die Eigenschaften von spannungsaktivierten Kaliumströmen in glialen Vorläuferzellen wurden in ähnlichen Zellkultursystemen ( Sontheimer et al., 1989 ; Borges et al., 1994 ) sowie in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in lebenden Hirnschnittpräparaten des corpus callosum ( Berger et al., 1991 ) untersucht. Über die molekulare Identität dieser Ströme sowie deren Beitrag zum Gesamtstrom gibt es derzeitig noch keine Untersuchungen. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Expression von auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen der Kv1 (Shaker) Familie sowie deren Beitrag zum Gesamtzellstrom auf Protein- und mRNA-Ebene analysiert.

Die auswärts rektifizierenden Kaliumströme von der untersuchten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zeigten eine starke Heterogenität ihrer elektrophysiologischen (z.B. Kanalinaktivierung) und pharmakologischen Eigenschaften (Sensitivität gegen spezifische Kaliumkanalblocker). Die Heterogenität der Stromeigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen ist in verschiedenen Arbeiten untersucht worden ( Kettenmann et al., 1991 ; Sontheimer et al., 1989 ).

Bei eigenen Einzelkanalexperimenten im "cell-attached" und im "inside-out" Modus der Patch-Clamp-Konfiguration wurde eine heterogene Leitfähigkeitsverteilung mit einer Vielzahl unterschiedlicher Einzelkanalleitfähigkeiten von auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen gefunden.

Unterschiede der Einzelkanaleigenschaften wurden ebenfalls bei verschiedenen weiteren Oligodendrozyten-Präparationen festgestellt, z.B. kultivierten Oligodendrozyten aus dem Rind McLarnon und Kim, 1989 ), Oligodendrozyten aus dem Rückenmark der Maus ( Kettenmann et al., 1984 ) und Schwannzellen der Maus ( Verkhratsky et al., 1991 ).

Die größte Gruppe spannungsabhängiger Kaliumkanalmoleküle bildet die Kv1 (Shaker) Familie. Die molekulare und funktionale Expression dieser Kanäle wurde in dieser Arbeit mit einer Kombination von molekularbiologischen und elektrophysiologischen Techniken untersucht.

5.2. Expression von Kv1 Kaliumkanalproteinen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Zur Untersuchung der Expression der Kv1 Proteine wurden immunozytochemische Färbungen mit für die Kanalmoleküle Kv1.1 bis Kv1.6 spezifischen polyklonalen Antikörpern durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß die Kanalmoleküle Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6 in fast allen Zellen exprimiert werden; Kv1.1 Kanäle wurden nur in wenigen Zellen (10 %) gefunden.

In Gliazellen sind spannungsabhängige Kaliumkanäle der Kv1 Familie bis jetzt nur in Schwannzellen im peripheren Nervensystem sowie in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen gefunden worden. In kultivierten Oligodendrozytenvorläuferzellen aus neonatalen Ratten wurde die Expression von verschiedenen Kv1 Proteinen (Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6) beschrieben ( Attali et al., 1997 ). In Schwannzellen des Ischiasnervs hingegen wurde die Expression von Transkripten und Proteinen des Kv1.1 und Kv1.5 Kaliumkanals gefunden ( Mi et al., 1995 ).

Die gleichzeitige Expression von mehreren Kv1 Kanälen wurde auch in anderen Zelltypen gefunden. So wurde z.B. in einer Präparation von Herzmuskelzellen des Frettchens die Expression von bis zu 10 Kv Transkripten (4 der 6 Kv1 Transkripte) festgestellt ( Brahmajothi et al., 1997 ).

Um Abschätzungen über die Expressionsrate der Kanäle sowie ihren Beitrag zum Gesamtstrom zu


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machen, wurden diese Experimente mit einer umfassenden elektrophysiologischen und pharmakologischen Untersuchung kombiniert.

5.3. Beitrag der Kv1 Kanäle zum Gesamtstrom

Mit einer Kombination von elektrophysiologischen und pharmakologischen Untersuchungen sowie immunozytochemischen Färbungen wurde die funktionelle Expression von allen bis jetzt bekannten Kv1 Kaliumkanälen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Maus bestimmt.

Die homomeren Kv1 Kanäle sind hinsichtlich ihrer elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften in Expressionssystemen bereits intensiv untersucht worden (z.B. Stühmer et al., 1989 , Grissmer et al., 1994 ).

Vergleicht man die im Rahmen dieser Arbeit an Oligodendrozyten-Vorläuferzellen gemessenen Parameter mit den Literaturdaten, so kommt man zu folgenden Schlußfolgerungen:

  1. Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3 und Kv1.6 haben keinen großen Beitrag am Gesamtzellstrom. Für diese Kanäle ist eine hohe Sensitivität gegen die spezifischen Toxine Dendrotoxin (DTX), Charybdotoxin (CTX) und MCDP (mast cell degranulating peptide) beschrieben ( Stühmer et al., 1989 ; Grissmer et al., 1994 ; Kirsch et al., 1991 ), die auswärts rektifizierenden Kaliumströme von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden durch die Applikation dieser Substanzen jedoch nicht gehemmt. Die Kanäle Kv1.2 und Kv1.3 wurden außerdem mit den immunozytochemischen Färbungen nicht nachgewiesen.
  2. Homomere Kv1.1-Kanäle zeigen bei Expression in Säugerzellen bzw. Xenopus laevis Oozyten eine hohe TEA-Sensitivität ( Stühmer et al., 1989 ; Grissmer et al., 1994 ; Klumpp et al., 1991 ). Die hier gemessene TEA-Sensitivität (29 mM) lag jedoch um zwei Zehnerpotenzen höher als für homomere Kv1.1 Kanäle zu erwarten (0,3 mM, Grissmer et al., 1994). Das Kv1.1 Protein wurde bei 10 % der Zellen gefunden. Um den Beitrag der Kv1.1 Kanäle zum Gesamtzellstrom zu bestimmen, wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von Kv1.1 positiven und Kv1.1 negativen Zellen verglichen. Die dabei gefundenen Unterschiede lagen im Bereich der Schwankungsbreite. Dies läßt vermuten, daß die Kv1.1 Kanäle nur in geringer Anzahl exprimiert werden und keinen großen Beitrag zum Gesamtstrom leisten.
  3. Das Vorkommen von homomeren Kv1.4 Kanälen ist ebenfalls auszuschließen, da diese eine schnelle Inaktivierung im Bereich von wenigen ms ( Lee et al., 1996 ) zeigen (N-Typ-Inaktivierung). Außerdem zeigen diese Kanäle eine kumulative Inaktivierung bei wiederholter Aktivierung der Kanäle ( Bertoli et al., 1996 ; Bertoli et al., 1994 ), die in diesen Zellen ebenfalls nicht beobachtet wurde.
  4. Für das Auftreten von Kv1.5 Homomeren sprechen mehrere Tatsachen. Kv1.5 Kanäle sind insensitiv gegen CTX, DTX und MCDP, jedoch sensitiv für 4-AP und Chinidin ( Grissmer et al., 1994 ; Pak et al., 1991 ). Die halbmaximalen Blockerkonzentrationen für diese beiden Substanzen stimmen in guter Näherung mit den gemessenen Werten überein. Kv1.5 Proteine wurden in allen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (99 %) nachgewiesen.
  5. Ebenfalls ist die Bildung von heteromeren Kv1 Kanälen (Kv1.4 und/oder Kv1.5 und/oder Kv1.6) möglich.

Roy et al., 1996 untersuchten mit Antisense-Oligonukleotiden die funktionale Expression von Kv1 Kanälen in Astrozyten des Rückenmarks der Maus. Dabei fanden sie, daß die Expression von Kv1.5 Kanälen in hohem Maße zum Gesamtzellstrom beiträgt. Weitere Kv1 Kanäle wurden jedoch nicht getestet.

5.4. Einfluß der Kv1.1 bzw. Kv1.4 Expression auf die elektrophysiologischen Eigenschaften

In Oligodendrozyten-Vorläuferzellen werden Kv1.1 und Kv1.4 Kanäle nur in einem Teil der Zellen exprimiert (Kv1.1: 10 % und Kv1.4: 85 % der Zellen). Mit einer Kombination von elektrophysiologischer Analyse im "whole-cell" Modus der Patch-Clamp-Technik und immunozytochemischen Färbungen sollte deren Beitrag zum Gesamtzellstrom bestimmt werden.

Es wurden keine Unterschiede in der Kanalaktivierung und -inaktivierung sowie der Membranpotentiale zwischen Kv1.1 positiven und Kv1.1 negativen bzw. Kv1.4 positiven und Kv1.4


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negativen Zellen festgestellt. Die Unterschiede beim Membranpotential bei Kv1.4 positiven bzw. negativen Zellen sowie bei der Kanalinaktivierung bei den Kv1.1 positiven bzw. negativen Zellen liegen im Bereich der für diese Zellen beobachteten Schwankungen. Aus den Resultaten ist zu schließen, daß spannungsabhängige K+ Kanäle des Kv1.1 und Kv1.4 Typs nur einen geringen Beitrag zum Gesamtzellstrom leisten.

Analoge Experimente sind von Gurantz et al. ( Gurantz et al., 1996 ) an Rückenmarksneuronen durchgeführt worden. Die Autoren untersuchten mit einer Kombination von Einzelzell-PCR und Patch-Clamp-Untersuchung im Ganzzellmodus die Korrelation der Expression der Kv1.1 (und Kv2.2) Transkripte mit Unterschieden im Strommuster von Rückenmarksneuronen. Dabei konnte kein Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein der Kv1.1 Transkripte und elektrophysiologischen Parametern gefunden werden.

5.5. Expression von weiteren spannungsregulierten K+ Kanälen

Die Experimente zur Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung weisen auf das Vorhandensein von zwei Kanalpopulationen mit unterschiedlichen Inaktivierungseigenschaften hin. Die halbmaximale Inaktivierung der ersten Kanalpopulation mit V1/2=-60 mV liegt im Bereich der für Kv1 Kanäle beschriebenen Werte ( Stühmer et al., 1989 ). Die zweite Kanalpopulation inaktiviert mit V1/2= -12 mV bei sehr viel positiveren Potentialen, wie sie für Kv2 (Shab) und Kv3 (Shaw) Kanäle beschrieben wurde ( Shahidullah et al., 1995 ; Salinas et al., 1997 ).

Von den zur Charakterisierung der Kaliumströme eingesetzten Blockern (4-AP, TEA, Chinidin, DTX, CTX und MCDP) wurde jeweils nur ein Teil des Stromes geblockt. Z.B. war der durch 4-AP geblockte Strom zeitlich inaktivierend (s. Abb. 12), durch TEA (1-100 mM) hingegen wurde ein zeitlich nicht inaktivierender Strom geblockt (s. Abb. 11). In Bezug auf diese Blocker können also ebenfalls mindestens zwei unterschiedliche Populationen von Kanälen unterschieden werden.

5.6. Pharmakologie der homomeren Kv1 Kanäle

Die Ganzzellströme der bekannten auswärts rektifizierenden Kaliumkanäle (Homomere) sind in Expressionsexperimenten gut charakterisiert (u.a. Grissmer et al., 1994 ; Stühmer et al., 1989 ).

In der folgenden Tabelle sind die pharmakologischen Parameter der homomeren Kv1 Kanäle bei Expression in Säugerzellen (z.B. Grissmer et al., 1994 ) oder Xenopus Oozyten (z.B. Stühmer et al., 1989 ) zusammengefaßt und mit den an Oligodendrozyten-Vorläuferzellen gemesenen Parametern verglichen. Die Konzentrationsangaben sind halbmaximale Blockerkonzentrationen (IC50-Werte).


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Tabelle 3: Blockierbarkeit von homomeren Kv1 Kanälen durch spezifische K+ Kanalblocker


4-AP

(mM)

TEA

(mM)

Chinidin

(mM)

CTX

(mM)

DTX

(mM)

MCDP

(mM)

Kv1.1

0,29 1)

1 2)

1,1 3)

0,3 1)

0,6 2)

0,4 3)

41 1)

>1 1)

0,022 2)

0,02 1)

0,012 2)

0,49 1)

0,045 2)

Kv1.2

0,59 1)

0,8 2)

0,00056 1)

129 2)

40 7)

0,014 1)

0,006 2)

0,017 1)

0,004 2)

0,44 1)

0,175 2)

Kv1.3

0,195 1)

1,5 2)

10 1)

50 2)


0,0026 1)

0,001 2)

0,25 1)

>0,6 2)

>2 1)

>1 2)

Kv1.4

12,5 2)

>100 2)

22 8)

>0,04 2)

>0,2 2)

>2 2)

Kv1.5

0,27 1)

0,4 5)

330 1)

>40 4)

7,2 9)

>0,1 1)

>0,2 4)

>1 1)

>0,2 4)

>10 1)

>600 4)

Kv1.6

0,3 6)

4 5)

1,7 6)


>3 6)

0,025 6)

0,2 6)

Oligodendrozyten-Vorläuferzellen


0,19

29

16,61/ 36,13

>>1

>>2

>>4

1) Grissmer et al., 1994

2) Stühmer et al., 1989

3) Klumpp et al., 1991

4) Pak et al., 1991

5) Swanson et al., 1990

6) Kirsch et al., 1991

7) Grissmer et al., 1990

8) Grissmer, nicht publiziert

9) Fedida, 1997

Diese Daten lassen sich jedoch nur schwer mit den nativ vorkommenden Strömen vergleichen. In der Literatur gibt es nur wenige Beispiele, in denen die Ströme realer Zellen direkt einem bekannten Typ spannungsabhängiger Kaliumkanäle zugeordnet werden können. So werden z.B. die delayed rectifier K+ Kanäle von C6-Glioma-Zellen sowie von Typ1 und Typ2- Astrozyten Kv1.1 Kanälen zugeordnet ( Wang et al., 1992 ). Die n-Typ K+ Kanäle in Lymphozyten hingegen werden durch Kv1.3 Kanäle getragen ( Attali et al., 1992 ).


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Ebenfalls wurden in unterschiedlichen Expressionssystemen z.T. sehr unterschiedliche Ergebnisse erzielt. Zum Beispiel wurde in Xenopus Oozyten eine sehr hohe TEA-Sensitivität des Kv1.2 Kanals gemessen ( Stühmer et al., 1989 ), während bei Expression in Säugerzellen die Sensitivität gegenüber TEA um mehrere Zehnerpotenzen höher lag ( Grissmer et al., 1994 ).

Bei der Zuordnung des Stromes zu einem bestimmten Kanalmolekül müssen vor allem folgende Umstände mit berücksichtigt werden:

  1. Bildung von heteromeren Kv1 Komplexen
  2. Bindung von b-Untereinheiten
  3. Posttranlationale Regulationsmechanismen

5.7. Bildung von heteromeren Kv1 Kanälen

K+ Kanäle können innerhalb einer Familie heteromere Kanalmoleküle bilden ( Ruppersberg et al., 1990 ; Rudy et al., 1988 ). Das Vorkommen solcher heteromerer Kanäle in situ wurde durch Sheng ( Sheng et al., 1993 ) im Gehirn von Ratten erstmals gezeigt. Die Bildung von heteromeren Kv1.2/Kv1.4 Kanälen in Axonen und Nerventerminalen führt zur Ausbildung eines A-Typ-Stromes mit gemischten Eigenschaften.

Eine Reihe von heteromeren Kv1 Kanälen ist bereits beschrieben worden ( Lee et al., 1994 ; Lee et al., 1996 ). Die Rolle der Kv1.5 Untereinheit wurde jedoch in keiner der vorliegenden Arbeiten untersucht.

Ströme von heteromeren Kanälen können sich dramatisch von den Strömen der homomeren Kanäle unterscheiden ( Hopkins et al., 1994 ).

Bei den vorliegenden Untersuchungen waren aufgrund der immunozytochemischen Untersuchungen vor allem Kombinationen von heteromultimeren Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6 Kanälen zu erwarten.

In heteromeren Kanälen, die den Kv1.4 Kanal enthalten, sollte aufgrund der typischen N-Typ Inaktivierung dieses Kanals ein Teil des Stromes innerhalb kurzer Zeit inaktivieren. Die Zeitkonstante der Inaktivierung bei Oligodendrozyten-Vorläuferzellen liegt mit t= 34 ms weit über diesem Wert.

Kürzlich wurde beschrieben, daß die Expression von heteromeren Kv1.4/ Kv1.6 Kanälen zu einem Kanal mit langsamer Inaktivierung und Eigenschaften ähnlich dem homomeren Kv1.5 Kanal führt ( Roeper et al., 1998 ). Am C-Terminus des Kv1.6 Moleküls wurde eine sogenannte NIP-Domäne (N-type inactivation particle) gefunden, die den Inaktivierungs-Partikel des Kv1.4 Moleküls, der die schnelle N-Typ-Inaktivierung bewirkt, bindet.

5.8. Bindung von b-Untereinheiten

Mit spannungsabhängigen K+ Kanälen der Kv1 (Shaker) und Kv4 (Shal) Kanalfamilie können an der Zellinnenseite sog. b-Untereinheiten (Kvb1 und/oder Kvb2) assoziiert sein. Diese bewirken eine beschleunigte Inaktivierung des Stromes ( Rettig et al., 1994 ; Heinemann et al., 1996 ). Außerdem führt insbesondere die Assoziation der Kvb2-Untereinheit über Chaperon-artige Effekte zu einer verstärkten Expression der Kanäle ( Shi et al., 1996 ).

Koimmunopräzipationsstudien haben gezeigt, daß alle bekannten Kv1 Kanäle spezifisch mit den beiden bekannten b- Untereinheiten Kvb1 und Kvb2 interagieren können ( Nakahira et al., 1996 ; Rettig et al., 1994 ). Dabei zeigen die Kanäle Kv1.1 und Kv1.5 jedoch eine deutlich geringere Affinität zu den b-Untereinheiten.

Inaktivierungszeitkonstanten der gefundenen Ströme sind schneller, als es für die Kv1 Ströme ohne b-Untereinheiten beschrieben ist, jedoch ist die Inaktivierung viel langsamer als bei Assoziation von b-Untereinheiten zu erwarten. Dies wäre durch eine Überlagerung von sehr schnell inaktivierenden Kanälen (mit assoziierter b-Untereinheit) und langsam inaktivierenden Kanälen (ohne b-Untereinheit) zu erklären.


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5.9. Posttranslationale Regulationsmechanismen

Zusätzlich zu der quantitativen Regulation der mRNA- und Proteinkonzentration in der Zelle sind eine Reihe von weiteren Regulationsmechanismen für spannungsabhängige Kaliumkanäle beschrieben worden.

Durch die Bindung von b-Untereinheiten werden nicht nur die elektrophysiologischen Eigenschaften der Kv Kanäle verändert, sondern es kann auch die funktionale Expression der K+ Kanäle auf der Zellmembran erhöht werden ( Rettig et al., 1994 ; Nakahira et al., 1996 ; Shi et al., 1996 ). Ebenfalls ist ein Einfluß der RNA Konzentration auf elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften von Kv1 Kanälen beschrieben worden ( Moran et al., 1992 ; Honore et al., 1992 ). Als Mechanismus wird die Bildung von Kaliumkanal-Suprastrukturen (Ionenkanalclustern) vermutet ( Honore et al., 1992 ).

Außerdem sind direkte, posttranslationale Modifikationen der Kanäle zu vermuten. Attali et al., 1997 fanden in Experimenten mit kultivierten Oligodendrozyten sowie Oligodendrozytenvorläuferzellen, daß die im Western-Blot mit Kv1.5 bzw. Kv1.6 spezifischen Antikörpern erkannten Proteine eine sehr viel höhere Molmasse besaßen als nach der cDNA Sequenz zu erwarten. Dies läßt eine starke posttranslationale Modifikation der Proteine z.B. Glykosylierung und/oder Phosphorylierung vermuten. Dieses Phänomen wurde auch für andere Kv(1) Kanäle beobachtet (Scott et al., 1994; Veh et al., 1995 ).

Die Regulation von Ionenkanälen durch Phosphorylierung des Kanalproteins an den Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin ist von verschiedenen Autoren beschrieben worden ( Holmes et al., 1996 ; Levitan, 1985 ; Übersicht s. Levitan, 1994 ; Hemmings et al., 1989 in Neuronen). Im Kv1-Gen ist sowohl ein Tyrosin-Kinase-"Site" in der N-terminalen Region als auch ein PKC "Site" im zytoplasmatischen Loop zwischen der S4 und der S5-Region beschrieben worden ( Chandy und Gutman, 1995 ) und es wurden sowohl Proteinkinase C (PKC) ( Timpe und Fantl, 1994 ) als auch Proteinkinase A (PKA) abhängige ( Levin et al., 1995 ; Bosma et al., 1993 ) Mechanismen der Phosphorylierung von Kv1-Kanälen beschrieben. Timpe und Fantl ( Timpe und Fantl, 1994 ) zeigten, daß die Aktivierung der Rezeptoren für PDGF und FGF bei Expressionsexperimenten in Xenopus Oozyten innerhalb von ca. 20 min zu einer signifikanten Verringerung der Kaliumströme durch Kv1.5-Kanäle führt. Dabei spielt die Phosphorylierung durch die Proteinkinase C eine Rolle.

In allen Kv1-Genen befindet sich eine N-Glykosylierungssequenz im extrazellulären Loop zwischen den Transmembrandomänen S1 und S2.

Innerhalb sehr viel kürzerer Zeiten kann die Kanalaktivität u.a. durch Faktoren wie pH ( Deutsch und Lee, 1989 ), oxidativen Zustand der Zelle ("redox state") ( Ruppersberg et al., 1991 ) und Temperatur ( Lee und Deutsch, 1990 ) beeinflußt werden. Die Modulation der Kaliumkanalaktivität durch die Bindung von Kalziumionen an der intrazellulären Seite des Membranmoleküls (Übersicht s. Latorre et al., 1989) sowie durch Ionen wie Na+ (Loffler und Hunter, 1997, Howe et al., 1992) oder Protonen (Xu und Rozanski, 1997) sind bereits nachgewiesen worden.

5.10. Subzelluläre Verteilung von Kv1 Kanälen

Die überwiegende Mehrzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimiert das Kv1.5 Protein (99 %). Die immunozytochemischen Färbungen des Kv1.5 Kanals zeigen im Unterschied zu den anderen Kv-Färbungen ein gepunktetes Färbemuster (Abb. 17 C), das nicht nur bei allen Vorläuferzellen, sondern auch auf Astrozyten beobachtet wurde. Dieses Färbemuster läßt die Kanalexpression in Form von konzentrierten Ansammlungen einzelner Kanalkomplexe in der Zellmembran (sog. Cluster) vermuten.

Die Cluster-Bildung ist ein Phänomen, das in Neuronen schon seit langem beschrieben wurde. In myelinisierten Axonen ist die Expression von Natriumkanälen auf die Bereiche der Ranvierschen Schnürringe beschränkt (Waxman und Ritchie, 1993). An den Axonen von retinalen Ganglienzellen wurde gezeigt, daß die Expression der Kanäle in Clustern durch einen löslichen Faktor induziert wird (vermutlich ein Protein mit einer Molmasse größer als 10 kD), der von Oligodendrozyten sezerniert wird (Kaplan, Meyer et al., 1997). Auch für spannungsabhängige Kaliumkanäle wurde eine Konzentration in bestimmten funktionellen Domänen beschrieben (z.B. synaptische Terminalen: Wang et al., 1994, Ranviersche Schnürringe: Wang et al., 1993, postsynaptische Membran: Alonso und Widmer, 1997; Scannevin et al., 1996).

Die Anordnung von Kv1 Kanälen auf der Zellmembran in Clustern wird durch Proteine der PSD-95


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Familie von membran-assoziierten Guanylat-Kinasen vermittelt ( Kim et al., 1995 ; Kim und Sheng, 1996 ). Bis jetzt gibt es jedoch noch keine Untersuchungen über die Expression dieser Moleküle in Gliazellen.

Weitere Anhaltspunkte für eine inhomogene Verteilung der Kanalmoleküle auf der Zellmembran ergaben sich bei Untersuchungen im "cell-attached" Modus der Patch-clamp-Technik. In dem unter der Patchpipette befindlichen Membranstück von ca. 1 mm2 befanden sich häufig entweder keine aktiven Kanäle oder sehr viele (>10 Kanäle). Bei einer durchschnittlichen Gesamtzelleitfähigkeit von 15-17 nS (bei Aktivierung der "delayed rectifier" Ströme) sollten sich bei einer Einzelkanalleitfähigkeit von 20 pS (für Kv1 Kanäle) ( Chandy und Gutman, 1995 ) ca. 800 aktive Kanäle auf der gesamten Zellmembran befinden. Nimmt man eine spezifische Kapazität von 0,01 pF/mm2 an (wie allgemein für Zellmembranen angegeben, Sherman-Gold, 1993) ergibt sich bei einer gemessenen Kapazität von 8 pF eine Membranfläche von 800 mm2. Bei einer homogenen Verteilung der Kanäle sollte sich also in jedem "cell-attached" Patch von ca. 1mm2 Fläche ein aktiver Einzelkanal befinden.

Als Auswirkung einer möglichen Ausbildung von Kanalaggregaten auf der Zellmembran ist eine Veränderung der elektrophysioloischen und pharmakologischen Eigenschaften der aggregierten Kanäle möglich. Die Expression von Strömen mit veränderten Eigenschaften in Abhängigkeit von der mRNA Konzentration wurde bereits beschrieben ( Honore et al., 1992 ; Moran et al., 1992 ). In Expressionsexperimenten mit Xenopus Oozyten fanden Honore et al. ( Honore et al., 1992 ), daß die Injektion von geringen Mengen Kv1.3-mRNA zu schnell inaktivierenden Kaliumströmen mit einer hohen Sensitivität gegenüber dem Kaliumkanalblocker Charybdotoxin (CTX) führt, während bei Injektion derselben mRNA in hohen Konzentrationen ein nicht inaktivierender Kaliumstrom exprimiert wird, der nur eine geringe CTX-Sensitivität aufweist. Dieser Effekt wird durch die Zerstörung des Zytoskeletts unterdrückt. Anhand dieser Daten wird bei großen mRNA-Mengen die Bildung von Kaliumkanal-Suprastrukturen (Ionenkanal-Cluster) in Assoziation mit dem Zytoskelett vermutet, in denen sich die Eigenschaften der Kanäle verändern.

Kv1 Kanäle in Schwannzellen zeigen eine unterschiedliche subzelluläre Verteilung ( Mi et al., 1995 ). Kv1.5 wird in diesen Zellen vorwiegend an den Ranvierschen Schnürringen und an den Außenseiten der Myelinstapel exprimiert, Kv1.1 Kanäle dagegen wurden vorwiegend in den intrazellulären und perinuklären Kompartments gefunden ( Mi et al., 1995 ).

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Kv1.4 Molekülen vorwiegend in den Haupt-Ausläufern der Zellen beobachtet. Eine analoge subzelluläre Verteilung wurde auch in anderen Zellen beobachtet. Es ist gezeigt worden ( Sewing et al., 1996 ), daß Kv1.4 in vitro spezifisch in das basolaterale Kompartment von MDCK-Zellen transportiert wird, welches im allgemeinen als das Äquivalent des axonalen Kompartments in Neuronen angesehen wird.

5.11. Expression von diversen Kv1 Transkript-Kombinationen

Die Expression der Kv1-Transkripte wurde durch Einzelzell-RT-PCR-Analyse untersucht. Dabei wurde eine sehr heterogene Expression von Kv1 Transkripten gefunden. Es wurde gezeigt, daß in den meisten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen mehrere Kv1-Gene gleichzeitig aktiv sind. Dies stimmt mit Befunden von Attali et al. ( Attali et al., 1997 ) überein, die in Rattenoligodendrozyten die Expression von vier verschiedenen Kv1 Transkripten (Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6) fanden.

Die sehr heterogene Transkriptexpression zeigte keine Korrelation mit den elektrophysiologischen Eigenschaften der K+ Ströme. Es gibt offensichtlich auf der mRNA und Proteinebene unterschiedliche Regulationsmechanismen für Kv1 Kanäle.

5.12. Shaker- Kaliumkanal-Transkripte und -proteine werden auf unterschiedliche Weise reguliert

Die immunozytochemischen Untersuchungen sowie die Einzelzell-RT-PCR-Experimente zeigen Unterschiede in der Protein- und Transkriptexpression der Kv1 Kanäle.

Die relative Häufigkeit der Expression der unterschiedlichen Kv1 Transkripte und Proteine in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:


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Tabelle 4: Häufigkeit der Expression von Kv1 Transkripten bzw. Proteinen


Transkripthäufigkeit

-mRNA vorhanden-

Häufigkeit der Proteinexpression

-Anteil positiv gefärbter Zellen-

Kv1.1

5,9 % (n=17)

9,6 % (n= 1839)

Kv1.2

64,7 % (11/17, n=17)

0,9 % (n= 529)

Kv1.3

29,4 % (5/17)

1,0 % (n= 597)

Kv1.4

23,5 % (4/17)

84,6 % (n= 525)

Kv1.5

52,9 % (9/17)

98,6 % (n= 635)

Kv1.6

58,8 % (10/17)

99,3 % (n= 1055)

Die Transkripte der in der Mehrzahl der Zellen exprimierten Proteine (Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6) wurden nicht in allen Zellen nachgewiesen. Die Zahl der mRNA Kopien in der Zelle ist nicht sehr groß (ca. 10-100). Diese können durch eine Einzelzell-PCR nicht immer vollständig erfaßt werden (z.B. durch nicht vollständiges Ernten des Zytoplasmas).

Nicht alle exprimierten Transkripte wurden auch auf Proteinebene gefunden. Kv1.2 und Kv1.3 Transkripte wurden relativ häufig (65 % bzw. 30 % der Zellen) gefunden, das Protein wurde jedoch nicht exprimiert.

Über die Transkription der Kv1 Gene sowie die Stabilität der mRNA ist bisher wenig bekannt. Die kodierende Region der Kv1 Proteine ist ungefähr 1500 bis 2000 Basenpaare lang, die mRNAs können jedoch mit 11000 Baasenpaaren sehr viel länger sein ( Beckh und Pongs, 1990 , Chandy et al., 1990 ). Die nichtkodierenden Sequenzen sind bis jetzt nur im Kv1.4 Gen untersucht worden ( Wymore et al., 1996 ; Wymore et al., 1994 ). In diesen Bereichen wurden verschiedene Regulationselemente ( Chandy et al., 1990 ; Wymore et al., 1994 ) gefunden, die die mRNA-Stabilität verändern können (z.B. AUUA-Motive, die eine reduzierte mRNA Stabilität bewirken). Durch alternatives Splicing oder die Nutzung unterschiedlicher Transkriptionsstops können somit mRNAs entstehen, die mit unterschiedlicher Effektivität translatiert werden ( Wymore et al., 1996 ). In der 3' nichtkodierenden Region des Kv1.4-Gens befinden sich viele evolutionär konservierte AT-reiche Motive, die die mRNA-Stabilität, die Translation und den Transport vom Kern ins Zytoplasma regulieren können ( Duret et al., 1993 ). Da sich in der GC reichen Promotorregion zahlreiche potentielle Methylierungsstellen befinden, ist ebenfalls eine Inaktivierung der Genexpression durch Methylierung möglich ( Wymore et al., 1996 ). Die 5' nichtkodierende Region des Kv1.4-Gens enthält mehrere Translationsinitiationssequenzen ( Kozak, 1991 ).

Die Synthese von Kaliumkanalproteinen kann durch verschiedene Faktoren wie die Aktivierung von Wachstumsfaktorrezeptoren (PDGF: Timpe und Fantl, 1994 ) oder Veränderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration ( Jonas und Kaczmarek, 1996 ) reguliert werden.

Eine nicht übereinstimmende Regulation von mRNA und Protein wurde auch in anderen Zellsystemen beobachtet. So untersuchten Xu et al., 1996 in Herzmuskelzellen der Ratte die entwicklungsabhängige Regualtion von spannungsabhängigen K+ Kanälen und fanden eine z.T. gegenläufige Entwicklung der Protein- und RNA-Mengen. Die Kv2.1mRNA wird z.B. während der ersten 20 Tage nach Geburt stark hochreguliert, während die Proteinexpression verringert wird.

5.13. Funktionelle Rolle von Kv1 Kanälen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Setzt man Oligodendrozyten-Vorläuferzellen für längere Zeit Kaliumkanalblockern wie 4-AP oder TEA aus, so führt dies zu einer signifikanten Reduktion der Proliferationsrate dieser Zellen und zur Verhinderung der Ausdifferenzierung (auf den Stadium) der O4-positiven Vorläuferzellen ( Knutson et al., 1997 ). Als Mechanismus wird die Erhöhung der intrazellulären Natriumkonzentration durch die Aktivierung von Glutamatrezeptoren vermutet. Es wird vermutet, daß andere Signale, die die Proliferation von Vorläuferzellen beeinflussen, auf ähnliche Weise die Aktivität der Kaliumkanäle regulieren.


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Andererseits konnte in Rattenoligodendrozyten mit Antisense-Experimenten, die spezifisch die Expression des Kv1.5 Kanals hemmen, kein Einfluß auf die Proliferationsrate der Zellen festgestellt werden ( Attali et al., 1997 ).

5.14. Spannungsaktivierte K+ Kanäle werden durch die Aktivierung des GABAA-Rezeptors geblockt

Auswärts rektifizierende Kaliumkanäle von kultivierten Körnerzellen werden durch die Aktivierung des GABAA Rezeptors reguliert. In diesen Zellen führt die Rezeptoraktivierung nicht nur zur Aktivierung eines Chloridkanals, sondern ebenfalls zur Blockierung von K+ Strömen ( Labrakakis et al., 1997 ). Durch Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus konnte gezeigt werden, daß sowohl schnell inaktivierende A-Typ-Ströme als auch nicht inaktivierende Ströme vom delayed rectifier Typ durch GABA-Applikation gehemmt werden. Um die blockierten Kanäle weiter zu charakterisieren, wurden Einzelkanalexperimente im "cell-attached" Modus der Patch-Clamp-Technik durchgeführt. Dabei kann die Reaktion eines einzelnen K+ Kanals einer vollständig intakten Zelle bei Applikation von GABA beobachtet werden (s.Abb. 27). Da der auf diese Weise registrierte Kanal nicht direkt mit der GABA-haltigen Lösung in Kontakt kommt, ist eine Beteiligung von intrazellulären Mechanismen anzunehmen. Die Natur dieser Mechanismen ist derzeit noch unklar.

Analoge Mechanismen sind insbesondere für die Aktivierung von Rezeptoren für exzitatorische Neurotransmitter beschrieben worden, z.B. ist eine Blockierung von K+ Kanälen bei der Aktivierung des Kainatrezeptors in Bergmanngliazellen ( Müller et al., 1992 ) und in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen beschrieben worden ( Borges und Kettenmann, 1995 ). Als Mechanismus für die intrazelluläre Signalweiterleitung werden bei den Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Einstrom von Na+ Ionen durch das Rezeptormolekül ( Borges und Kettenmann, 1995 ) und bei Bergmanngliazellen der Einstrom von Ca2+ Ionen ( Müller et al., 1992 ) genannt. Da der GABAA-Rezeptor jedoch weder für Na+ noch für Ca2+ permeabel ist, sollte bei den untersuchten Zellen ein anderer Mechanismus zutreffend sein.

Ein Block von K+ Kanälen durch die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren ist auch in anderen Zellsystemen beschrieben worden, z.B. Bergmann Gliazellen des Kleinhirns ( Müller et al., 1994 ).

5.15. Die Blockade von K+ Kanälen verstärkt die Depolarisation

Im reifen ZNS wird GABA als der hauptsächliche inhibitorische Neurotransmitter angesehen, d.h. das postsynaptische Neuron reagiert auf die Ausschüttung von GABA mit einer Hyperpolarisation der Zellmembran. Für einige neonatale Neuronen ist jedoch auch eine depolarisierende Wirkung von GABA beschrieben worden. Die Art dieser Reaktion hängt von der intrazellulären Chloridkonzentration ab. Da im Ganzzellmodus der Patch-Clamp-Konfiguration die intrazelluläre Cl- Konzentration durch die Pipettenlösung vorgegeben ist, wurden Experimente im cell-attached Modus mit dem Ionophor Gramicidin in der Pipette durchgeführt, um zu testen, ob die Zelle bei der natürlich vorkommenden Chloridkonzentration depolarisiert oder hyperpolarisiert wird. Auch unter diesen Bedingungen führte die Applikation von GABA bei kultivierten Körnerzellen zu einer Depolarisierung des Ruhemembranpotentials. Die Depolarisation von Körnerzellen durch GABA wurde sowohl unter Kontrollbedingungen als auch in Anwesenheit des K+ Kanalblockers Ba2+ (10 mM) beobachtet, war jedoch in Abwesenheit des Blockers viel stärker. Aufgrund der K+ Verteilung (hohe intrazelluläre K+ Konzentration) und der fast ausschließlichen K+ Leitfähigkeit der Zellen ist nach der Nernst-Gleichung durch einen Ausstrom von K+ Ionen eine Verringerung des Ruhemembranpotentials zu erwarten.

Die Ergebnisse der elektrophysiologischen, pharmakologischen sowie molekularbiologischen Untersuchungen weisen darauf hin, daß die Kaliumkanäle auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen keine homogene Population bilden.

In Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit alle 6 bis jetzt bekannten Kv1 Transkripte sowie die Expression von 3 Kv1 Proteinen gefunden. Diese heterogene Kanalexpression führt jedoch nicht zu Unterschieden der elektrophysiologischen Parameter.

Die Aktivität von Kaliumkanälen hat einen Einfluß auf die Zellproliferation. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß diese Kanäle durch die Aktivierung von Neurotransmitterrezeptoren reguliert werden.


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