Schmidt, Kathrin: Charakterisierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle an glialen Vorläuferzellen der Maus

Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation im Fach Biophysik
Charakterisierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle an glialen Vorläuferzellen der Maus

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät Institut für Biologie

Dipl.-Biophys. Kathrin Schmidt geb. am 12.02.1970 in Berlin

Dekanin der Fakultät Prof. Dr. V. Bonacic-Koutecky

Gutachter:
Prof. Dr. H. Kettenmann
Prof. Dr. R. Veh
Priv. Doz. Dr. I. Bernhardt

eingereicht: 30.03.1998

Datum der Promotion: 16.10.1998

Zusammenfassung

Das Membranstrommuster von Oligodendrozyten verändert sich während der Entwicklung dieser zellen sehr stark. Während die Membranleitfähigkeit von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen von auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen geprägt ist, exprimieren reife Oligodendrozyten passive, nicht spannungsabhängige Kaliumkanäle. Die Aktivität dieser Kanäle beeinflußt die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von spannungsaktivierbaren Kaliumkanälen des Kv1-Typs (Shaker-Typ) in kultivierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen anhand der Transkriptexpression, der Expression von Kv1-Proteinen und der elektrophysiologischen und pharmakologischen Analyse der Membranströme untersucht.

Auf mRNA Ebene wurden unterschiediche Kombinationen von Kv1.1, Kv1.4; Kv1.5 und Kv1.6 Transkripten gefunden. Ebenfalls wurde in einigen Zellen eine signifikante Menge an Kv1.2 und Kv1.3 Transkripten gefunden. Die Heterogenität der Transkriptexpression konnte nicht mit Unterschieden in den elektrophysiologischen Eigenschaften korrelliert werden.

Die Expression der Kv1 Proteine wurde mit Hilfe von immunozytochemischen Färbungen mit spezifischen polyklonalen Antikörpern gegen die Kanäle Kv1.1 bis Kv1.6 untersucht. Alle Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimierten die Kanäle Kv1.4 (85% der Zellen), Kv1.5 (99 %) und Kv1.6 (99 %), Kv1.1 Proteine wurden von 10 % der Zellen gebildet.

Um den funktionellen Beitrag der Kv1 Kanäle zum Gesamtzellstrom zu bestimmen, wurde die Stromaktivierung und -inaktivierung sowie die Sensitivität der Ströme gegen die spezifischen Kaliumkanalblocker getestet. Dabei wurden durch TEA (1-100 mM), 4-AP (0,125-1 mM) und Chinidin (5-100 mM) jeweils ein großer Teil der Ströme gehemmt, durch CTX, DTX und MCDP wurde die Kanalaktivität nicht beeinflußt.

Um den Beitrag der Kanalproteine Kv1.4 bzw. Kv1.1 zu den elektrophysiologischen Eigenschaften des Gesamtzellstromes zu testen, wurden an einzelnen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen kombinierte elektrophysiologische Untersuchungen und immunozytochemische Färbungen durchgeführt. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Kv1./Kv1.4 positiven und Kv1.1/Kv1.4 negativen Zellen festgestellt werden.

Aus den Untersuchungen ergeben sich folgende Schlußfolgerungen:

  1. Oligodendrozyten exprimieren eine Vielzahl unterschiedlicher Kv1 Transkripte.
  2. Die überwiegende Mehrzahl der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen exprimieren die Kv1 Proteine Kv1.4, Kv1.5 und Kv1.6.
  3. Der Gesamtzellstrom kann vorwiegend durch Kv1.5 Kanäle oder durch eine Kombination von Kv1.4/Kv1.6 Kanälen sowie durch Mitglieder anderer Familien spannungsabhängiger Kaliumkanäle getragen werden.

Um zu untersuchen, ob spannungsabhängige Kaliumkanäle durch die Aktivierung von inhibitorischen Neurotransmitterrezeptoren beeinflußt werden, wurden kultivierte Körnerzellen als Modellsystem verwendet, da diese eine hohe Dichte an Kv Kanälen sowie an GABA Rezeptoren exprimieren. Im "cell-attached" Modus der Patch-Clamp-Technik wurde die Reaktion von einzelnen auswärts rektifizierenden Kaliumkanälen während der GABA-Antwort untersucht. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, daß die Öffnungswahrscheinlichkeit dieser Kanäle während der Reaktion der Zelle auf GABA stark zurückgeht. Da Oligodendrozyten-Vorläuferzellen ebenfalls GABAA-Rezeptoren exprimieren, ist anzunehmen, daß deren Aktivierung über einen analogen Mechanismus zur Blockierung von Kaliumkanälen führt.

Schlagwörter:
Oligodendrozyten, Kaliumkanal, Elektrophysiologie, Immunozytochemie

Abstract

The membrane current pattern of oligodendrocytes changes dramatically during cell development. In oligodendrocyte precursor cells the membrane conductance is dominated by outwardly rectifying potassium channels, mature oligodendrocytes on the other hand express passive, not voltage-gated potassium channels. The activity of these channels influences the proliferation and differentiation of the cells.

In the present work the expression of outwardly-rectifying potassium channels of the Kv1-type (Shaker-type) was analysed in oligodendrocyte precursor cells in culture. Expression of Kv1 transcripts, Kv1 proteins as well as electrophysiological and pharmacological properties of these channels were tested.

Different combinations of Kv1.1, Kv1.4, Kv1.5 and Kv1.6 transcripts were detected at mRNA level. In some cells also a significant amount of Kv1.2 and Kv1.3 transcripts was found. The heterogeneity of transcript expression could not be correlated with differences in electrophysiological properties.

The expression of Kv1 channel proteins was analysed using immunocytochemical stainings with specific monoclonal antibodies against the channel molecules Kv1.1 to Kv1.6. All oligodendrocyte precursor cells expressed the channel molecules Kv1.4 (85 % of the cells), Kv1.5 (99 %) and Kv1.6 (99 %), Kv1.1 proteins were detected in 10 % of the cells.

To find out the functional contribution of Kv1 channels to the whole-cell current of the cells the activation and inactivation characteristics as well as the sensitivity of the potassium current to different potassium channel specific antagonists was tested. Parts of the current were inhibited by TEA (1-100 mM), 4-AP (0,125-1 mM) and Chinidin (5-100 mM), CTX, DTX and MCDP had no effect on the channel activity.

To isolate the contribution of the channel molecules Kv1.1 and Kv1.4 the electrophysiological properties of the whole cell current electrophysiological analysis of single cells using whole-cell patch-clamp technique and immunocytochemical stainings were combined. With this method no significant differences between Kv1.1/Kv1.4-positive and Kv1.1/Kv1.4 negative cells could be detected.

From these findings the following conclusions could be drawn:

Oligodendrocyte precursors express various different Kv1 transcripts.

The majority of oligodendrocyte precursor cells expresses the Kv1 proteins Kv1.4, Kv1.5 and Kv1.6.

The total current (whole-cell current) most likely is carried through Kv1.5 channels or a combination of Kv1.4/Kv1.6 channels and probably another type of voltage-gated potassium channels.

To find out if voltage-gated potassium channels are related to the activation of inhibitory neurotransmitter receptors a model system of cultured granule cells was used. This cell type was selected because they are known to express a high density of Kv channels as well as GABAA receptors as well. The activity of single outwardly rectifying potassium channels was detected using the cell-attached mode of patch-clamp technique. With this method it could be demonstrated that the open probability of voltage-gated potassium channels is markedly decreased during GABAA response.

It could be concluded that the activation of GABAA receptors on oligodendrocyte precursor cells leads to the inhibition of potassium channels in the same way as in cultured granule cells.

Keywords:
oligodendrocytes, potassium channel, electrophysiology, immunocytochemistry


1


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteCharakterisierung spannungsabhängiger Kaliumkanäle an glialen Vorläuferzellen der Maus
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1.Oligodendrozyten sind die myelin-bildenden Zellen im ZNS
1.2.Oligodendrozyten entwickeln sich aus proliferierenden Vorläuferzellen in den subventrikulären Zonen
1.3.Die Entwicklung der Oligodendrozyten ist durch die Expression spezifischer Antigene gekennzeichnet
1.4.Oligodendrozytenvorläuferzellen exprimieren spannungsgesteuerte Ionenkanäle
1.5.Spannungsabhängige K+ Ströme
1.6.Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle sind heteromere Transmembranproteinkomplexe
1.7.Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle kodieren für eine Vielzahl unterschiedlicher Kaliumströme
1.8.Spannungsabhängige Kaliumkanäle regulieren wichtige Zellfunktionen
1.9.Gliale Neurotransmitterrezeptoren können Neuron/Glia-Interaktionen vermitteln
1.10.Kaliumkanäle werden durch die Aktivierung von Glutamatrezeptoren beeinflußt
1.11.Expression von inhibitorischen Neurotransmitterrezeptoren (GABA-Rezeptoren) in Oligodendrozyten/Oligodendrozytenvorläuferzellen
2 Zielstellung
3 Methoden
3.1.Zellkultur
3.1.1.Präparation der Oligodendrozytenkulturen
3.1.2.Präparation der Körnerzellkulturen
3.1.3.Medien
3.2.Elektrophysiologie
3.2.1.Methodik
3.2.2.Patch-Clamp Elektroden
3.2.3.Messplatz
3.2.4.Spannungssprungprotokolle
3.2.4.1.Erfassung der spannungsaktivierten Ströme (Spannungsprotokoll 1)
3.2.4.2.Erfassung der ligandenaktivierten Ströme (Spannungsprotokoll 2)
3.2.4.3.Erfassung von spannungsaktivierten Strömen, die spannungsabhängig inaktivieren (Spannungsprotokoll 3)
3.2.4.4.Messung der "Steady-state"-Inaktivierung von spannungsaktivierten Strömen (Spannungsprotokoll 4)
3.2.4.5.Spannungsrampen
3.2.5.Lösungen
3.2.6.Pharmakologie
3.3.Immunzytochemische Analyse der Kaliumkanäle und oligodendrozytenspezifischen Marker
3.4.Einzelzell-PCR
4 Ergebnisse
4.1.Shaker-Kaliumkanäle auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
4.1.1.Charakterisierung der Zellkultur
4.1.2.Eigenschaften der Auswärtsströme
4.1.3.Pharmakologie der K+-Auswärtsströme
4.1.4.Expression von Kv1 Proteinen
4.1.5.Expression von Kv1 Transkripten
4.1.6.Einfluß der Kv1.1 bzw. Kv1.4-Expression auf die elektrophysiologischen Eigenschaften
4.2.Rolle von Kaliumkanälen bei der Neurotransmitterantwort
4.2.1.Hemmung von auswärts rektifizierenden K+ Kanälen durch GABA
4.2.2.GABA blockiert die K+ Einzelkanalaktivität
5 Diskussion
5.1.Oligodendrozyten verfügen über ein heterogenes Repertoire von Kaliumkanälen
5.2.Expression von Kv1 Kaliumkanalproteinen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
5.3.Beitrag der Kv1 Kanäle zum Gesamtstrom
5.4.Einfluß der Kv1.1 bzw. Kv1.4 Expression auf die elektrophysiologischen Eigenschaften
5.5.Expression von weiteren spannungsregulierten K+ Kanälen
5.6.Pharmakologie der homomeren Kv1 Kanäle
5.7.Bildung von heteromeren Kv1 Kanälen
5.8.Bindung von b-Untereinheiten
5.9.Posttranslationale Regulationsmechanismen
5.10.Subzelluläre Verteilung von Kv1 Kanälen
5.11.Expression von diversen Kv1 Transkript-Kombinationen
5.12.Shaker- Kaliumkanal-Transkripte und -proteine werden auf unterschiedliche Weise reguliert
5.13.Funktionelle Rolle von Kv1 Kanälen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
5.14.Spannungsaktivierte K+ Kanäle werden durch die Aktivierung des GABAA-Rezeptors geblockt
5.15.Die Blockade von K+ Kanälen verstärkt die Depolarisation
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literatur
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Arten von spannungsabhängigen Kaliumkanalmolekülen
Tabelle 2: Anteile von Kv1 Transkripten in einzelnen Oligodendrozytenvorläuferzellen
Tabelle 3: Blockierbarkeit von homomeren Kv1 Kanälen durch spezifische K+ Kanalblocker
Tabelle 4: Häufigkeit der Expression von Kv1 Transkripten bzw. Proteinen

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Oligodendrozyten bilden die Myelinscheide von Axonen
Abbildung 2: Schema der Oligodendrozytenentwicklung
Abbildung 3: Am Ionentransport von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen beteiligte Membranproteine
Abbildung 4: Molekularer Aufbau von spannungsabhängigen Kaliumkanälen
Abbildung 5: Patch-Clamp-Konfigurationen nach Hamill et al., 1981.
Abbildung 6: Aufbau eines elektrophysiologischen Meßplatzes.
Abbildung 7: Spannungssprungprotokolle zur elektrophysiologischen Charakterisierung von Membranströmen mit der Patch-Clamp-Technik
Abbildung 8: Prinzip der immunzytochemischen Analyse mit der Avidin-Biotin-Technik.
Abbildung 9: Immunozytochemische Charakterisierung der Kultur anhand stadienspezifischer Antigene
Abbildung 10: Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung von kultivierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Maus
Abbildung 11: Block der K+ Auswärtsströme durch Tetraethylammonium (TEA)
Abbildung 12: Block der Auswärtsströme von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch 4-Aminopyridin (4-AP)
Abbildung 13: Geringe Konzentrationen von TEA und 4-AP hemmen eine Teilkomponente des Stromes
Abbildung 14: Blockierbarkeit der K+ Ströme durch a-Dendrotoxin (DTX), Charybdotoxin (CTX) und MCDP (mast cell degranulating peptide)
Abbildung 15: Block der Auswärtsströme von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch Chinindin
Abbildung 16: Expression der Kv1 Kaliumkanalmoleküle in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Maus
Abbildung 17: Lokalisation von Kv1.1 und Kv1.4 K+ Kanalmolekülen auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
Abbildung 18: Lokalisation von Kv1.5 und Kv1.6 K+ Kanalmolekülen auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
Abbildung 19: Keine Expression von Kv1.2 und Kv1.3 Proteinen auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
Abbildung 20: Analyse der Kv1-Transkriptexpression mit Hilfe der Einzelzell-PCR-Technik
Abbildung 21: Kv1 Transkriptexpression und Ganzzellstrommuster von einzelnen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen
Abbildung 22: Elektrophysiologische Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Vergleich zur Expression des Kv1.1-Proteins
Abbildung 23: Elektrophysiologische Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Vergleich zur Expression des Kv1.4-Proteins
Abbildung 24: Kultivierte Körnerzellen reagieren auf die Applikation von GABA (10-4 M) mit der Aktivierung eines Auswärtswärtsstromes von Cl- Ionen.
Abbildung 25: Der GABAA-Rezeptor-Agonist Muscimol reproduziert die durch GABA hervorgerufenen Effekte an kultivierten Körnerzellen
Abbildung 26: Die GABA-Antwort bei kultivierten Körnerzellen besteht aus zwei Komponenten.
Abbildung 27: Effekt von GABA auf den "delayed rectifier-" und den "A-Typ-" Strom bei Körnerzellen
Abbildung 28: GABA blockiert auswärts rektifizierende K+ Kanäle in der "cell-attached-" Konfiguration
Abbildung 29: Analyse des Stromrauschens während der Applikation von Muscimol (10-4 M)

[Titelseite] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [Bibliographie] [Danksagung] [Lebenslauf] [Selbständigkeitserklärung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Mar 1 12:22:43 1999