Tellgmann, Gabriele: Messung der Reaktionsenthalpie von Teilreaktionen der visuellen Kaskade
Messung der Reaktionsenthalpie
von Teilreaktionen der visuellen Kaskade
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer.nat.)

im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Phys. Gabriele Tellgmann , geb. Weiss,
geb. am 31.07.1969 in Hermannstadt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekanin der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. V. Bonacic-Koutecky

Gutachter:
Prof. Dr. Alfred Blume
Prof. Dr. Andreas Herrmann
Prof: Dr. Klaus-Peter Hofmann

Tag der mündlichen Prüfung: 31.08.1998

Zusammenfassung

Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen weiteren Schritt zur Aufklärung der visuellen Kaskade beizutragen. Erstmals konnten die Enthalpieänderungen für den G-Protein-Zyklus und dessen Teilreaktionen im Titrationskalorimeter am rekonstituierten System bestimmt werden.

Der G-Protein-Zyklus

Der Photorezeptor Rhodopsin katalysiert in seinem lichtaktivierten Zustand (R*) die Aktivierung des G-Proteins Transducin (Gt) durch Austausch von GDP gegen GTP in der Nukleotidbindungstasche von Transducin. Durch die intrinsische GTPase des G-Proteins, wird GTP hydrolysiert und Gt kehrt in den inaktiven Zustand zurück. Die Titration von GTP zum Komplex aus lichtaktiviertem Rhodopsin und Transducin (R*G-Komplex) ergab für den gesamten G-Protein-Zyklus eine Reaktionsenthalpie von - 4.6 ± 0.8 kcal pro Mol GTP. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den in der Literatur aufgeführten Werten für die Reaktionsenthalpie der Hydrolyse von ATP zu ADP (- 4.9 kcal/Mol; Gajewski et al., 1986 [ 22 ]).

Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus

Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus waren nicht direkt durch Titrationsexperimente zugänglich. Durch Variation der Konzentrationen der einzelnen Reaktionspartner konnten jedoch die unterschiedlichen Phasen des Wärmesignals zu Teilschritten des Zyklus zugeordnet und deren Reaktionsenthalpien bestimmt werden.

Die Reaktionsenthalpie des gesamten Zyklus wird nur von der Energieabgabe des GTP bestimmt, dabei wird die Energie des GTP jedoch nicht vollständig bei der Hydrolyse des Transducin-gebundenen GTP zu GDP frei. Die Differenz zwischen der Gesamtenthalpieänderung und der Wärme, die bei Hydrolyse von Gt-gebundenem GTP frei wird, liegt in einer höheren inneren Energie von Transducin in der GTP-bindenden Konformation als im GDP-bindenden Zustand.


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteMessung der Reaktionsenthalpie von Teilreaktionen der visuellen Kaskade
1 Einleitung
1.1.Die visuelle Kaskade
1.2.Vergleich mit der GTPase des Ras-Proteins
1.3.Die visuelle Kaskade in der Kalorimetrie
1.4.Ziel der vorliegenden Arbeit
1.5.Thermodynamische Grundlagen
2 Material und Methoden
2.1.Präparationen
2.1.1.Stäbchenaußensegmente
2.1.2.Gewaschene Diskmembranen
2.1.3.Opsin
2.1.4.Phosphoryliertes Rhodopsin
2.1.5.Transducin
2.1.6.Untereinheiten des Transducins
2.1.7.Arrestin
2.1.8.Phosphodiesterase
2.2.Methoden
2.2.1.Das Titrationskalorimeter
2.2.2.Das Fluoreszenzspektrometer
2.3.Konzeption eines Experiments und Probenvorbereitung
2.4.Vorversuche
3 Der gesamte G-Protein-Zyklus
3.1.Titration von GTP zum R*G-Komplex
3.2.Enthalpieänderung des G-Protein-Zyklus
3.3.Vergleich mit der GTPase des Ras-Proteins
3.4.Variation der GTP-Konzentration
3.4.1.Doppelinjektionsprotokoll
3.5.Variation der G-Protein-Konzentration
3.6.Temperaturabhängigkeit der Enthalpieänderung des
4 Teilreaktionen im G-Protein-Zyklus
4.1.Komplexbildung
4.1.1.Titration von Rhodopsin zu G-Protein
4.1.2.Variation der Rhodopsinkonzentration
4.1.3.Variation der Gbetagamma-Konzentration
4.2.Komplexdissoziation
4.2.1.Betrachtung des exothermen Peaks des Wärmesignals
4.2.2.Messungen mit GTPgS
4.2.3.Einfluß des MI-MII-Gleichgewichtes auf das Wärmesignal
4.3.Die Hydrolysereaktion von GGTP zu GGDP
5 Kalorimetrische Untersuchung von weiteren Teilreaktionen der visuellen Kaskade
5.1.Bindung von Arrestin an phosphoryliertes Rhodopsin
5.2.Der G-Protein-Zyklus im Beisein von Phosphodiesterase
6 Diskussion
6.1.Der gesamte G-Protein-Zyklus
6.1.1.Berücksichtigung der Protonierungswärme des Puffers
6.2.Teilreaktionen
6.2.1.Komplexbildung
6.2.2.Komplexdissoziation
6.2.3.Die Hydrolysereaktion von GGTP zu GGDP
6.2.4.Bindung von Arrestin an phosphoryliertes Rhodopsin
6.2.5.Einfluß von PDE auf den G-Protein-Zyklus
6.3.Grenzen der Anwendbarkeit des Titrationskalorimeters
6.4.Ausblick
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 : Zusammenfassung der DSC-Untersuchungen zur thermischen Stabilität von
Rhodopsin bzw. Opsin
Tabelle 2 : Zusammenfassung der kalorimetrisch bestimmten Enthalpieänderungen
für einzelneSchritte in der visuellen Kaskade
Tabelle 3 : Zusammenfassung der ermittelten Aktivierungsenergien für Teilschritte
der visuellen Kaskade
Tabelle 4 : Zusammenstellung der Enthalpieänderung durch Protonierung für verschiedene
Puffer
Tabelle 5: Zusammenstellung der gemessenen und um die Wärme der Pufferprotonierung korrigierten Werte für die Enthalpieänderung des G-Protein-Zyklus
Die Werte für DeltaHobs und DeltaHp ergeben sich als Mittelwerte und Standardabweichung aus n Messungen zu je 10 Injektionen. Für DeltaHges ist der wahrscheinlichste Fehler angegeben
Tabelle 6: Vergleich von DeltaH der GTPase von Transducin und Ras-Protein bei 20 °C
Tabelle 7: Auswertung des exothermen Peaks in BTP- und Phosphatpuffer
Tabelle 8:Temperaturabhängigkeit der verwendeten Puffer
Tabelle 9: Enthalpieänderung DeltaH durch Hydrolyse von ATP zu ADP

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: A Schema der Stäbchenzelle
Im Außensegment befinden sich stapelförmig angeordnete, scheibenförmigeVesikel, die sogenannten Disks, während das Innensegment die für den Metabolismus der Zelle notwendigen Bestandteile enthält.
B chematische Darstellung eines Disks
Der Photorezeptor Rhodopsin (R), ein integrales Membranprotein, registriert den Lichtreiz und leitet ihn an den Transmitter Transducin (Gt) weiter. Über den Effektor, die cGMP-Phosphodiesterase (PDE), wird das Signal an den cGMP-abhängigen Kationenkanal (Ch) in der Membran des Außensegmentes übergeben. Mit abnehmender cGMP-Konzentration schließen sich die Kanäle und es kommt zur Hyperpolarisation an der Membran. Dies ist das eigentliche elektrische Signal.
C Schematische Darstellung von Rhodopsin
Rhodopsin ist ein 7-Helix-Rezeptor, bestehend aus sieben alpha-helikalen Bereichen (A-G), welche die Membran durchziehen. Sie sind sowohl auf der intradiskalen als auch auf der zytoplasmatischen Seite durch Peptidabschnitte, sogenannte Loops verbunden.
Abbildung 1-2: A Schematische Darstellung der visuellen Kaskade (aus Hofmann und Heck 1996)
RK Rhodopsinkinase, Rp phosphoryliertes Rhodopsin, A Arrestin, RDH Retinoldehydrogenase, Op phosphoryliertes Opsin, Ch Kationenkanal, E Na/Ca- Austauscher, GC Guanylatcyklase. Zur Erläuterung siehe Text.
B chematische Darstellung des G-Protein-Zyklus der visuellen Kaskade
Lichtaktiviertes Rhodopsin (R*) bindet an Transducin (GGDP). Hierdurch wird die Nukleotidbindungstasche des G-Proteins geöffnet; das im inaktiven Zustand von Gt gebundene GDP wird frei und es bildet sich der stabile R*Gempty-Komplex. Durch Aufnahme von GTP wird Transducin in seinen aktiven Zu- stand (GGTP) überführt. Die folgende Hydrolysereaktion des gebundenen GTP zu GDP bewirkt die Rückkehr von Gt in den inak tiven Ausgangszustand. Im Inneren des Kreises ist die Protonenaufnahme oder Abgabe der jeweiligen Schritte dargestellt.
Abbildung 1-3 : Schematische Darstellung des GDP/GTP-Zyklus beim Ras-Protein
Der Übergang vom inaktiven RasGDP- zum aktiven RasGTP-Zustand wird durch den
Austauschfaktor (GEF) beschleunigt. Im aktiven Zustand kann das Ras-Protein mit verschiedenen Effektoren wechselwirken. Die intrinsische Deaktivierung des Proteins
durch Hydrolyse ist sehr langsam und wird durch ein sogenanntes GAP-Protein beschleunigt.
Abbildung 2-1: Schematische Darstellung der Meßeinheit des Kalorimeters
Die zwei identischen scheibenförmigen Zellen, Referenz- bzw. Probenzelle befinden sich
in einer isothermen Ummantelung und sind über lange dünne Röhren zugänglich. Die
Temperaturdifferenz DeltaT zwischen den beiden Zellen wird ständig kontrolliert. Im Falle
einer Reaktion wird die Veränderung der Wärme durch einen zu DeltaT proportionalen Regel-
strom, welcher der Probenzelle zugeführt wird, ausgeglichen.
Abbildung 2-2: Skizze des Aufbaus des Fluoreszenzspektrometers
Das Licht einer Xenonhochdrucklampe wird über einen Monochromator, der die Anregungswellenlänge bestimmt auf die Probe geleitet. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird über einen weiteren Monochromator auf einen Photomultiplier geschickt. Die Verwendung eines Referenzdetektors ermöglicht die Korrektur des Fluoreszenzsignals bezüglich Schwankungen der Lampenleistung.
S Spiegel, Sp Spalt, G Gitter, R Referenzdetektor, P Probe, H Halbdurchlässiger Spiegel
Abbildung 2-4: Konzentrationsabhängigkeit des Verdünnungsartefaktes
Injektionen von je 5 µl GTP-Lösung in BTP-Puffer wurden zu BTP-Puffer gegeben:
Ausgangskonzentration der GTP-Lösung: 3 mM (a), 2 mM (b), 1.5 mM (c), 1 mM (d) und 0.5 mM (e). Für die folgenden Experimente wurde eine Ausgangskonzentration von 1 mM für die GTP-Lösung gewählt.
Abbildung 2-5: Darstellung der Protonierungswärme in Abhängigkeit vom Puffer bei 10 °C
A Titration von 5 µl einer 1 mM HCl-Lösung zu Phosphatpuffer (a) und zu BTP-Puffer (b)
Gemessene Wärme pro Mol HCl aufgetragen gegen die Nummer der Injektionen für
Phosphatpuffer (a) und BTP-Puffer (b)
Durch Integration des Wärmesignals über die Dauer der Reaktion, die durch eine Injektion ausgelöst wird, erhält man die Wärmeänderung, die durch diese Injektion bewirkt wurde. Sie entspricht der Fläche unter dem Signal (in der Vergrößerung schraffiert dargestellt).
Abbildung 3-1: Darstellung einer Messung des G-Protein-Zyklus und der zugehörigen Kontrollen
Pro Injektion wurden jeweils 5 µl einer 0.8 mM GTP-Lösung (angesetzt in BTP-Puffer, pH 7.5) zugespritzt, entsprechend einer Konzentration von 3 µM GTP in der Meßzelle.
Die Spuren a - c zeigen Kontrollexperimente:
a. Titration von GTP zu BTP-Puffer zeigt keine Reaktion. Man beobachtet eine sehr geringe
Wärme, hervorgerufen durch Mischung und Verdünnung der Reaktanden.
b. Zugabe von GTP zu 1 µM Transducin zeigt keine Reaktion
c. Gibt man GTP zu belichtetem Rhodopsin (1 µM) in Abwesenheit von Transducin, ist
ebenfalls keine Reaktion zu erkennen.
Spur d zeigt die Titration von GTP zum R*G-Komplex (1µM R* und 1 µM Gt). Der Verlauf der Wärmeabgabe ist sehr komplex und nicht durch eine einzige Reaktion zu beschreiben. Wie in der Vergrößerung der ersten Injektion von Spur d zu erkennen ist, lassen sich verschiedene Phasen der Reaktion unterscheiden. Sie sind durch gestrichelte Linien markiert und mit I, II und III bezeichnet.
Die Messungen wurden bei 10 °C durchgeführt.
Abbildung 3-2: Messung des G-Protein-Zyklus in verschiedenen Puffern
A Titration einer GTP-Lösung (3 µM GTP pro Injektion) zu 1µM Transducin und 10 µM Rhodopsin durchgeführt bei 10 °C in Phosphatpuffer (a) und in BTP-Puffer (b). Die abgegebene Wärme ist im phosphatgepufferten System geringer als in BTP-Puffer. Die Gesamtdauer der Injektionen ist gleich, jedoch ist der zeitliche Verlauf des Wärmesignals unterschiedlich. Kurve a zeigt eine ausgeprägte Phase von nahezu konstanter Wärmeabgabe, Kurve b zeigt einen endothermen Anteil in der Schlußphase des Signals.
B Berechnung der Enthalpieänderung durch Integration der Fläche unter dem Wärmesignal einer Injektion in Phosphatpuffer (a) und in BTP-Puffer (b). Die gemessene Änderung der Gesamtenthalpie ist in Phosphatpuffer geringer. Die durch die einzelnen Injektionen hervorgerufene Wärme ist jeweils für einen Puffer konstant. Für die korrekte Berechnung der Enthalpieänderungen unter Berücksichtigung der Protonenbilanz gilt:
Abbildung 3-3: Enthalpieänderung unter Berücksichtigung der Pufferprotonierun
Bei Auftragung der beobachteten Enthalpieänderung DeltaHobs gegen die Protonierungswärme
des Puffers DeltaHp, läßt sich aus der Steigung der Regressionsgeraden die Menge an abge-
gebenen Protonen in Mol ermitteln. Aus dem y-Achsenabschnitt liest man die protonenkor-
rigierte Enthalpieänderung der Reaktion ab.
Abbildung 3-4: Vergleich der GTPase von Transducin und Ras-Protein
a. Die obere Spur zeigt eine Messung im visuellen System. Dabei wurden zu 1µM Rhodopsin und 1 µM Transducin 1.8 µM GTP, 3.5 µM GTP und 5.6 µM GTP gegeben. Mit zunehmender GTP-Konzentration zeichnet sich die ‘Plateauphase’ der Wärmeabgabe deutlicher ab.
b. Die untere Spur zeigt die Messung der GTPase des Ras-Proteins. In der Meßzelle wurden 2.8 µM RasGDP, 3 µM GAP und 2.8 µM Cdc25 in Tris-Puffer vorgegeben. Die zu titrierte GTP-Konzentration betrug 1.8 µM (Inj. 1 und 4), 3.5 µM (Inj. 2 und 5) und 5.6 µM (Inj. 3 und 6). Die längere Reaktionsdauer bei der wiederholten Injektion ist bedingt durch die Anhäufung von GDP in der Probenzelle. Eine Veränderung des Verlaufs der Wärmeabgabe durch die Variation der GTP-Konzentration ist nicht zu erkennen. Auch die Unterscheidung verschiedener Phasen der Reaktion ist nicht möglich.
Die Messungen wurden bei 20 °C durchgeführt. In dem kleinen Schaubild ist die abgegebene Wärme in Abhängigkeit von der zutitrierten GTP-Konzentration aufgetragen. Die Ursprungsgerade zeigt, daß die Wärme nur durch GTP-induzierte Reaktionen hervorgerufen wird
Abbildung 3-5: Variation der GTP-Konzentration
A Titration verschiedener Volumina einer 1 mM GTP-Lösung zum R*G-Komplex (1 µM Gt, 10 µM Rhodopsin in WM): 3.5 µM GTP (Endkonzentration), 2.5 µM, 1 µM und 8.5 µM. Sowohl die Fläche unter der Meßkurve, als auch der Verlauf des Wärmesignals verän- dern sich mit der zugegebenen GTP-Menge. Mit zunehmender Konzentration wird mehr Wärme abgegeben und die zweite Phase der Injektion tritt deutlicher hervor. Die Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
B Das Schaubild zeigt die Abhängigkeit der freigewordenen Wärme bei Zugabe von GTP zum R*G-Komplex von der pro Injektion hinzutitrierten Konzentration. Es ist ein linearer Zusammenhang zu erkennen, der sich durch eine Ursprungsgerade beschreiben läßt.
Abbildung 3-6: Messung der Fluoreszenzänderung in Abhängigkeit der GTP-Konzentration
Zu 1 µM Rhodopsin und 1 µM Gt wurden 3.5 µM GTP, 1 µM GTP , 0.6 µM GTP und 3.5 µM GTPgammaS gegeben. Der steile Anstieg der Fluoreszenzintensität entspricht der Aktivierung von Transducin, die anschließende Phase konstanter Fluoreszenzintensität dem aktiven Zustand des G-Proteins. Die Dauer dieser Phase irung mit der einsetzenden Hydrolyse wird bei einem Gt zu GTP Verhältnis von 1:1 oder einem Überschuß an Tst abhängig von dem Verhältnis von Gt zu GTP in der Probe. Das Abklingen des Fluoreszenzsignals ist der Deaktivierung von Transducin durch die Hydrolyse des GTP zu GDP zuzuordnen. Durch die Überlagerung der Aktivieransducin das maximale Aktivierungsniveau nicht erreicht. Durch Zugabe von GTPgammaS zur Fluoreszenzprobe werden alle Transducinmoleküle in den aktiven Zustand versetzt und man erhält die maximal mögliche Fluoreszenzintensität der Probe. Das Experiment wurde bei 10 °C in BTP-Puffer durchgeführt
Abbildung 3-7: Vergleich von einmaliger und doppelter GTP-Zugabe
Die obere Kurve zeigt den typischen Verlauf des Wärmesignals bei Titration von GTP zum R*G-Komplex, während in der unteren Spur eine Doppelinjektion abgebildet ist. Hierbei wurde in der zweiten Phase des Wärmesignals eine weitere Injektion derselben Konzentration zugesetzt (3.5 µM GTP). In der Meßzelle wurde belichtetes Rhodopsin (10 µM) und Transducin (1 µM) vorgegeben. Die dargestellten Injektionen sind unmittelbar aufeinanderfolgende Titrationen zu derselben Probe. Bei der Doppelinjektion beobachtet man außerdem kleinen Peak (Einspritzartefakt) eine Absenkung des Niveaus und eine verlängerte Dauer der Wärmeabgabe. Die Fläche unter der Doppelkurve entspricht dem Doppelten der Fläche einer Einzelinjektion.#BRDie Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
Abbildung 3-8: Vergleich von Wärmesignal und Fluoreszenzsignal einer Doppelinjektion von GTP
Das Wärmesignal und das Fluoreszenzsignal wurden unter exakt gleichen Bedingungen an identischen Proben aufgenommen. Pro Injektion wurde je 3.5 µM GTP zu einer Probe aus 10 µM Rhodopsin und 1µM Transducin gegeben. Beide Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
a. Die obere Spur zeigt das Wärmesignal eines Experimentes, bei dem in der Schlußphase der Reaktion eine zusätzliche GTP-Injektion gegeben wurde (der Zeitpunkt der Zugabe ist durch einen Pfeil markiert). Der exotherme Peak des Signals ist bei der zweiten Injektion kleiner als bei der ersten. Das Niveau der Steady-State-Phase ist gleich.
b. Die untere Spur zeigt das gleiche Experiment, das zum Vergleich in der Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt wurde. Die erneute GTP-Zugabe in der abfallenden Phase des Signals bewirkt die Rückkehr des Systems in den Steady-State-Zustand.
Betrachtet man die zeitliche Dauer der Reaktionen, so ist in beiden Messungen der zweite Teil des Signals, nach der wiederholten Zugabe von GTP etwas länger, entsprechend dem Anteil von GTP aus der ersten Zugabe, der zum Zeitpunkt der Wiederholung noch nicht aufgearbeitet ist. Die Gesamtdauer der Signale ist in beiden Messungen gleich.
Abbildung 3-9: Variation der Transducinkonzentration
Zu einer Probe aus 1 µM R* und Transducin wurde GTP entsprechend einer Endkonzentration von 3 µM pro Injektion zugegeben. Die Gt-Konzentration wurde variiert: 2 µM (a), 1 µM (b) und 0.5 µM (c). Mit zunehmendem GTP-Überschuß bildet sich die Plateaupha se, die dem Steady-State-Zustand des Zyklus zugeordnet wird, deutlicher ab. Ferner ist eine Abhängigkeit des ersten Peaks des Wärmesignals von der Gt-Konzentration erkennbar; bei höheren Konzentrationen ist diese erste Phase stärker exotherm. (Die kleine Spitze, die auf der Flanke dieses Peaks sitzt ist dem Artefakt durch Einspritzen zuzuordnen.) Auch das Niveau der Steady-State-Phase verändert sich bei Variation der Transducinkonzentration, die Wärmeabgabe pro Zeiteinheit sinkt während dieser Phase mit abnehmender Gt-Konzentration.
Die Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
Abbildung 3-10: Untersuchung der Temperaturabhängigkeit des G-Protein-Zyklus
Injektionen zu je 3 µM GTP wurden zu 1µM R* und 1 µM Transducin titriert. Hierbei wurden verschiedene Messungen in BTP-Puffer bei pH 7.5 in Abhängigkeit von der Arbeitstemperatur des Kalorimeters durchgeführt (4 °C, 15 °C und 25 °C).
Während die freiwerdende Wärme unabhängig von der Temperatur ist, zeigen sich im Verlauf und der Dauer des Wärmesignals deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Messungen. Die erste Phase des Signals, der exotherme Peak ist für niedrigere Temperaturen deutlicher ausgeprägter. Die zweite Phase und auch die Dauer der Gesamtreaktion wird mit steigender Temperatur kürzer, jedoch verläuft die Reaktion auf einem Niveau höherer Wärmeabgabe.
Abbildung 4-1: Titration von R* zu Transducin zur Bestimmung der Enthalpieänderung bei Komplexbildung
Spur a zeigt das Kontrollexperiment, die Titration einer 200 µM Lösung von belichtetem Rhodopsin in WM zu BTP-Puffer. Spur b zeigt eine Messung, bei der 4 µM Transducin in der Meßzelle vorgelegt wurden. Die Endkonzentration von R* betrug in beiden Messungen 0.7 µM pro Injektion. Das Wärmesignal der Bindungsmessung unterscheidet sich nicht von der Kontrolle.
Die Experimente wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
Abbildung 4-2: Variation der Konzentration von Rhodopsin in WM
Je 3 µM GTP wurden pro Injektion zu 1 µM Transducin und verschiedenen Konzentrationen von Rhodopsin in gewaschenen Membranen titriert (10 µM Rhodopsin in WM in Spur a, 1 µM in Spur b und 0.1 µM in Spur c). Die erste Phase der Injektion ist sehr stark von der Rhodopsinkonzentration abhängig. Bei der Messung mit 10 µM Rhodopsin ist ein ausgeprägter exothermer Peak zu beobachten, der mit geringerer Konzentration abnimmt und bei Vorgabe von 0.1 µM Rhodopsin gar nicht zu erkennen ist. (Der kleine exotherme Peak unmittelbar nach dem Einspritzen in Spur c und die kleine Spitze auf der jeweils ersten Flanke bei Messung b sind dem Einspritzartefakt zuzuordnen.) Ferner ist in Abhängigkeit von der Rhodopsinkonzentration in der letzten Phase einer Injektion ein endothermer Anteil an der Enthalpieänderung zu erkennen (markiert durch ein gestrichelt gezeichnetes Quadrat). Die dargestellten Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer durchgeführt.
Abbildung 4-3: Veränderung des Wärmesignals des G-Protein-Zylus durch den Zerfall des aktiven Rhodopsins
Gezeigt sind drei Injektionen der gleichen Messung von jeweils 3 µM GTP zu 10 µM Rhodopsin in gewaschenen Membranen in Anwesenheit von 1 µM Transducin. Die Messung wurde in BTP-Puffer bei 10 °C durchgeführt. Dargestellt sind die 1. Injektion (ca. 15 min nach Einfüllen der Probe) (a), die 7. Injektion (nach ca. 2 Stunden) (b) und die 10. Injektion (nach etwa drei Stunden) (c). Die größte initiale Wärmeproduktion wird bei der ersten Injektion hervorgerufen. Der exotherme Charakter dieser Teilreaktion nimmt bei weiteren Injektionen ab. Die Schlußphase späterer Injektionen verläuft hingegen auf einem stärker exothermen Niveau, der endotherme Anteil, der in den ersten Injektionen auffällt verschwindet mit zunehmender Zeit.
Abbildung 4-4: Einfluß der Variation der WM-Konzentration auf das Fluoreszenzsignal
Die abgebildeten Spuren wurden unter Vorgabe von 1 µM Transducin und 10 µM WM (a), 1 µM WM (b) und 0.1 µM WM (c) aufgenommen. Die jeweils zugegebenen Injektionen entsprechen einer Endkonzentration von 3.5 µM GTP, 1 µM GTP und 0.6 µM GTP. Um die maximale Fluoreszenzänderung zu erhalten, wurde zum Ende der Messung jeweils 3.5 µM GTPgammaS zugegeben.
Mit abnehmender WM-Konzentration verlängert sich die Dauer der Gesamtreaktion. Bei der Vorgabe von 0.1 µM Rhodopsin wird das Niveau maximaler Fluoreszenzänderung nicht erreicht. In dem Inset der Abbildung ist die Abhängigkeit der Transducinaktivierung von der Membrankonzentration bei Zugabe von GTPgammaS vergößert dargestellt.
Die Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
Abbildung 4-5: Einfluß des Zerfalls von belichtetem Rhodopsin auf den exothermen Peak des Wärmesignals
a Dargestellt ist eine Messung des G-Protein-Zyklus, bei der GTP zu Transducin und Opsin
mit geringem Rhodopsinanteil titriert wurde. Bei der Präparation von Opsin aus Stäb-
chenaußensegmenten wurde so verfahren, daß ein geringer Anteil des Rhodopsins er-
halten blieb. Man erhält eine Probe mit hohem Membrananteil und geringer Rhodop-
sinkonzentration. (Probenzusammensetzung: ca. 5 % R* und 95 % Opsin bei einer Mem-
brankonzentration von 10 µM, 1 µM Transducin; pro Injektion wurden 3.5 µM GTP zuge-
geben. Meßbedingungen: BTP-Puffer pH 7.5, 10 °C)
b. Zu einer Probe aus 10 µM Rhodopsin in gewaschenen Membranen und 1 µM Transducin
wurden je 3.5 µM GTP gegeben (Meßbedingungen siehe a). Dargestellt sind die zweite
und dritte GTP-Injektion sowie die letzte Zugabe von GTP.
Die Messung mit geringem Rhodopsin- und hohem Opsinanteil (a) zeigt ein ähnliches Verhalten wie Messung (b) in einer der späteren Injektionen. Das Verschwinden des exothermen Peaks des Wärmesignals läßt sich damit zurückführen auf den Zerfall von R* im Laufe der Zeit.
Abbildung 4-6: Variation der Konzentration der betagamma-Untereinheit des Transducins
In der Meßzelle des Kalorimeters wurde eine Probe aus 10 µM Rhodopsin in WM, 1 µM Galpha und 3 µM Gbetagamma (a), 1 µM Gbetagamma (b), 0.5 µM Gbetagamma (c) bzw. 0.1 µM Gbetagamma (d) vorgegeben. Pro Injektion wurden jeweils 3.5 µM GTP zutitriert. Die Messungen wurden bei 10 °C in Phosphatpuffer durchgeführt.
Bei einem Verhältnis von Galpha zu Gbetagamma von 1:1 (b) sind die einzelnen Phasen des Wärmesignals am deutlichsten ausgebildet, während sowohl die Messung mit 3 µM Gbetagamma (a) als auch mit 0.5 µM Gbetagamma (c) eine Unterscheidung von zweiter und dritter Phase nicht zulassen. Der Verlauf des Signals ist bei diesen beiden Messungen sehr ähnlich, insbesondere ist der exotherme Peak in der ersten Phase des Wärmesignals kleiner als bei einem Konzentrationsverhältnis von Galpha zu Gbetagamma von 1:1. (Der kleine Peak unmittelbar nach der GTP-Zugabe in Spur a ist durch den Einspritzartefakt zu erklären.) Erläuterungen zu Spur d siehe Text.
Abbildung 4-7: Auswertung der ersten Phase des Wärmesignals des G-Protein-Zyklus
Die abgebildete Injektion entstammt einer Titration von 3.5 µM GTP zu 10 µM Rhodopsin und 1 µM Transducin, durchgeführt bei 10 °C in BTP-Puffer. Die schraffiert eingezeichnete Fläche entspricht der Wärme bei Dissoziation des R*G-Komplexes.
Abbildung 4-8: Messung der Dissoziationswärme des R*G-Komplexes bei Titration von GTPgammaS
a. Zu 10 µM Rhodopsin und 1 µM Transducin wurden pro Injektion je 3.5 µM GTPgammaS zuge-
geben. Die Messung wurde in BTP-Puffer bei 10 °C durchgeführt. Da Transducin durch
Zugabe von nichthydrolysierbarem GTPgammaS im aktiven Zustand blockiert wird, zeigt nur die
erste Injektion zeigt eine Reaktion. Der Zyklus wird hierdurch unterbrochen. Unter den ge-
ebenen Bedingungen liegt Transducin vollständig im aktiven Zustand vor und die ge-
messene Wärme entspricht der Enthalpieänderung durch Komplexdissoziation (DeltaHdiss). Der scheinbare Doppelpeak der ersten Injektion ist darauf zurückzuführen, daß der Ein-
spritzartefakt (erster Peak) dem eigentlichen Signal überlagert ist.
b. Gibt man Transducin gegenüber Rhodopsin im Überschuß vor (2 µM Gt, 0.1 µM Rho-
dopsin) so wird bei Zugabe von GTPgammaS (4.6 µM pro Injektion) sowohl die Dissoziation als
auch die Bildung des Komplexes induziert (Meßbedingungen: BTP-Puffer, 10 °C). Das
vorhandene Rhodopsin reicht nicht aus, um 2 µM Transducin auf einmal zu aktivieren.
Dadurch ist die Enthalpieänderung durch Komplexbildung (DeltaHb) derjenigen durch Dissoziation
überlagert.
Abbildung 4-9: Schema des Rhodopsinkreislaufs
Belichtetes Rhodopsin (R*) befindet sich in einem Gleichgewicht von Metarhodopsin I (MI) zu Metarhodopsin II (MII). Dieses Gleichgewicht ist abhängig von Temperatur und pH-Wert des umgebenden Mediums. Durch Bindung an Transducin wird das Gleichgewicht auf die Seite von MII verschoben, da nur die MII-Konformation Gt bindet. Nach der GTP-induzierten Komplexdissoziation wird sich das freigewordene Rhodopsin entsprechend den gegebenen Bedingungen wieder in einem Gleichgewicht zu MI einstellen. Diese Verschiebung des MII-MII-Gleichgewichtes sollte sich bei Messung der Enthalpieänderung von Komplexbildung und Dissoziation bemerkbar machen.
Abbildung 4-10: pH-Abhängigkeit des Wärmesignals des G-Protein-Zyklus
Zu 1 µM Transducin und 10 µM Rhodopsin wurden bei 10 °C jeweils 3.5 µM GTP titriert. Messung a wurde bei einem pH-Wert von 7.9 durchgeführt, Messung b bei pH 6.3. Spur a zeigt gegenüber Spur b einen weniger ausgeprägten exothermen Peak, jedoch einen größeren endothermen Anteil (grau unterlegt) in der dritten Phase der Wärmeabgabe. Die Unterschiede im Verlauf des Wärmesignals lassen sich für die Beobachtungen zur Komplexbildung (dritte Phase) durch eine Verschiebung des pH-abhängigen Gleichgewichtes von MI zu MII erklären.
Abbildung 5-1: Messung der Bindungsreaktion von Arrestin an phosphoryliertes Rhodopsin
Pro Injektion wurden jeweils 0.6 µM Arrestin zutitriert. Spur a und b zeigen Kontrollmessungen. In Spur a wurde Arrestin zu Puffer gegeben, in Spur b enthielt die vorgegebene Probe 1 µM Rhodopsin, an das keine Bindung erfolgen darf. Beide Reaktionen zeigen nur die Wärme, die durch Verdünnung oder Mischung hervorgerufen wird. In Spur c wurde 1 µM phosphoryliertes Rhodopsin vorgegeben. Das Wärmesignal unterscheidet sich nicht von den Kontrollmessungen. Das erwartete Verhalten für den Fall einer Bindung ist nicht zu erkennen. Die Messungen wurden bei 10 °C in einem Puffer aus 10 mM BTP (pH 7.5) und 50 mM NaCl durchgeführt.
Abbildung 5-2: Messung des G-Protein-Zyklus in Anwesenheit von Phosphodiesterase
Je 3 µM GTP wurden pro Injektion zu 1 µM Transducin und 10 µM Rhodopsin in WM (Spur a und b) bzw. 0.1 µM Rhodopsin in WM (Spur c und d) titriert. Bei den Messungen a und c wurden zusätzlich 0.3 µM PDE vorgegeben. Die Experimente wurden in BTP-Puffer bei pH 7.5 und 10 °C durchgeführt.
In den Wärmesignalen, die mit 0.1 µM WM aufgenommen wurden, bewirkt die Vorgabe von PDE keine Veränderung der freiwerdenden Wärme. Betrachtet man hingegen die Messungen mit 10 µM WM, so ist im Beisein von PDE (a) ist die Gesamtdauer des Wärmesignals verkürzt. Ferner ist der exotherme Peak, seiner maximalen Amplitude kleiner, als bei Messung des Zyklus ohne PDE-Vorgabe (b). Die zweite Phase der Wärmeabgabe ist in Spur a weniger deutlich ausgeprägt als in Spur b. Desgleichen ist kein auffälliger endothermer Anteil in der Schlußphase des Signals mit PDE-Vorgabe zu erkennen.

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