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Kapitel 1. Einleitung

Höhere Organismen wandeln äußere Reize, wie zum Beispiel Licht oder Schall, durch Sinneszellen in elektrische Signale um, die an nachgeschaltete Nervenzellen weitergeleitet werden. Ein weitverbreiteter Weg zur Übersetzung externer in interne Signale bedient sich eines Rezeptors, der den äußeren Reiz registriert und eines Transmitters, der den Reiz an einen Effektor weiterleitet. Durch die Hintereinanderschaltung dieser drei Komponenten in einer Kaskade läßt sich eine sehr effiziente Verstärkung des Signals erzielen, die es ermöglicht, selbst kleinste Reize, beispielsweise einzelne Lichtquanten, wahrzunehmen.

Die visuelle Kaskade im Stäbchenaußensegment von Wirbeltieren, über die ein Lichtreiz in ein elektrisches Signal umgewandelt wird, ist eines der biochemisch am besten untersuchten biologischen Systeme und dient allgemein als Modell für das Studium von Signaltransduktionsvorgängen. Bei der Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal, wird das eintreffende Photon von dem Photorezeptor Rhodopsin registriert und über ein Guaninnukleotid-bindendes Protein (G-Protein, Transducin) an den Effektor, die cGMP-Phosphodiesterase, weitergeleitet. Die visuelle Kaskade zeichnet sich gegenüber anderen biologischen Systemen, deren Signalumwandlung nach dem Rezeptor-Transmitter-Effektor Prinzip arbeitet dadurch aus, daß die beteiligten Proteine in ausreichender Menge zur Verfügung stehen und für biophysikalische und biochemische Untersuchungen leicht zugänglich sind.

Zum Verständnis der Wechselwirkungen der Komponenten der visuellen Kaskade ist die Kenntnis der thermodynamischen Parameter der einzelnen Reaktionen von entscheidender Bedeutung. Die Aufklärung dieser Zusammenhänge ist sehr komplex und durch kleine Reaktionswärmen zusätzlich erschwert. Bisher liegen daher keine Untersuchungen vor, die Aufschluß über Reaktionswärmen der Teilreaktionen bei der Signalumwandlung geben. Dies zu leisten ist die Motivation der vorliegenden Arbeit. Weiterentwickelte Präparationsmethoden und die Anwendung eines neuen, sehr empfindlichen Titrations-Mikro-Kalorimeters ermöglichen die Untersuchung bisher unzugänglicher Problemstellungen im Bereich kleiner Enthalpieänderungen in der visuellen Kaskade. Das konkrete Ziel ist die Aufklärung der Reaktionsenthalpien von Transducin in Wechselwirkung mit dem Rezeptor Rhodopsin (G-Protein-Zyklus).

Zunächst wird in einem einleitenden Kapitel ein Überblick über die visuelle Signaltransduktion und deren thermodynamische Untersuchung gegeben. Hierzu gehört neben der Beschreibung der einzelnen Komponenten der Kaskade und ihrem Zusammenwirken auch eine kurze Einführung in die Kalorimetrie und die Vorstellung der vor Beginn der Arbeit bekannten Ergebnisse

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zur Thermodynamik des Sehvorgangs. Im Anschluß gibt das Kapitel einen kurzen Abriß über die zum Verständnis nötigen thermodynamischen Grundlagen. Die Präparation der untersuchten Proteine sowie die Funktionsweise und Handhabung der Meßgeräte wird im Teil ‘Material und Methoden’ beschrieben. Der Ergebnisteil der Arbeit gliedert sich in drei Kapitel. Zunächst werden Experimente vorgestellt, die den G-Protein-Zyklus in seiner Gesamtheit untersuchen (Kapitel 3), gefolgt von Betrachtungen der einzelnen Teilreaktionen (Kapitel 4). Daran schließen sich die Ergebnisse von Experimenten an, die an Proteinen der visuellen Kaskade außerhalb des G-Protein-Zyklus durchgeführt wurden (Kapitel 5). Die Diskussion (Kapitel 6) stellt die Meßergebnisse in einen Zusammenhang, erläutert ihre Bedeutung und bespricht offene Fragen.

1.1. Die visuelle Kaskade

In der Netzhaut von Wirbeltieren gibt es zwei Arten von Photorezeptoren, Sehstäbchen und Sehzapfen. Die Sehzapfen befinden sich hauptsächlich im Zentrum des Scharfsehens, im sogenannten gelben Fleck, die Stäbchen verteilen sich über die restliche Fläche der Retina. Es gibt drei Typen von Zapfen, die ihr Absorptionsmaximum bei verschiedenen Wellenlängen haben und so die Unterscheidung von Farben ermöglichen. Stäbchen sind für die Hell-Dunkel-Adaptation des Auges zuständig. Sie reagieren langsamer als die Zapfen, weisen aber eine sehr viel größere Empfindlichkeit auf.

Die Stäbchenzelle setzt sich aus einem Außen- und einem Innensegment zusammen (Abb. 1.1 A), die durch ein dünnes Cilium verbunden sind. Im Innensegment finden sich diejenigen Bestandteile, die für den Metabolismus einer Zelle notwendig sind, wohingegen im Außensegment die Signaltransduktion des Lichtes abläuft. Das Außensegment besteht aus einem Stapel dichtgepackter, flacher Vesikel, den sogenannten Disks. Eine schematische Darstellung eines Disks und der wichtigsten Komponenten der Signaltransduktion ist in Abbildung 1.1 B gegeben.

Das einfallende Licht trifft auf den Photorezeptor Rhodopsin, ein integrales Membranprotein. In den Diskmembranen ist Rhodopsin in hoher Konzentration (ca. 30000 Moleküle/µm²) enthalten. Durch Bindung des belichteten Rezeptors, Rhodopsin (R*), an den Transmitter Transducin (G_t) wird das Signal zum Effektor, der cGMP Phosphodiesterase (PDE), weitergeleitet. Die aktive PDE spaltet cGMP zu 5’GMP. Das Absinken der cGMP-Konzentration in der Zelle führt zum Schließen der cGMP-regulierten Kationenkanäle in der Plasmamembran und somit zu einer Hyperpolarisation an der Membran. Dies ist das eigentliche elektrische Signal.

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Abbildung 1-1: A Schema der Stäbchenzelle
Im Außensegment befinden sich stapelförmig angeordnete, scheibenförmigeVesikel, die sogenannten Disks, während das Innensegment die für den Metabolismus der Zelle notwendigen Bestandteile enthält.
B chematische Darstellung eines Disks
Der Photorezeptor Rhodopsin (R), ein integrales Membranprotein, registriert den Lichtreiz und leitet ihn an den Transmitter Transducin (G_t) weiter. Über den Effektor, die cGMP-Phosphodiesterase (PDE), wird das Signal an den cGMP-abhängigen Kationenkanal (Ch) in der Membran des Außensegmentes übergeben. Mit abnehmender cGMP-Konzentration schließen sich die Kanäle und es kommt zur Hyperpolarisation an der Membran. Dies ist das eigentliche elektrische Signal.
C Schematische Darstellung von Rhodopsin
Rhodopsin ist ein 7-Helix-Rezeptor, bestehend aus sieben -helikalen Bereichen (A-G), welche die Membran durchziehen. Sie sind sowohl auf der intradiskalen als auch auf der zytoplasmatischen Seite durch Peptidabschnitte, sogenannte Loops verbunden.

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Rhodopsin

Der Photorezeptor Rhodopsin ist ein integrales Membranprotein (Molekulargewicht ~ 40 kDa) und gehört zur Familie der 7-Helix-Rezeptoren (siehe Abb. 1 C). Die einzelnen Helices, welche die Membran durchziehen, sind sowohl im intradiskalen Raum als auch im Zytoplasma durch Peptidabschnitte, die sogenannten Loops verbunden. Aufgrund einer Palmitoylierung von zwei nebeneinanderliegenden Cysteinen (Cys-322 und Cys-323) am C-terminalen Ende des Moleküls ist ein Teil des C-Terminus als weiterer Loop an der Diskmembran fixiert. An den Loops der zytoplasmatischen Seite finden die Wechselwirkungen des Rhodopsins mit anderen Proteinen statt.

Rhodopsin besteht aus dem Apo-Protein Opsin (348 Aminosäuren) und dem Chromophor 11-cis-Retinal, der sich im hydrophoben Inneren des Moleküls befindet. Das Retinal ist über eine Schiff-Base-Bindung an Lys-296 in der siebten Helix des Rhodopsins gebunden. Im Grundzustand wird die positiv geladene Schiff-Base von der negativ geladenen Aminosäure Glu-113 über elektrostatische Wechselwirkung stabilisiert (Sakmar et al. ,1989 [ 69 ]; Zhukovsky und Oprian, 1989[ 84 ]; Nathans, 1990 [ 61 ]; Lin et al., 1992 [ 50 ]). Bei Absorption eines Photons geht zunächst das gewinkelte 11-cis-Retinal in die gestreckte all-trans-Form über. Rhodopsin wird im Anschluß über mehrere Zwischenzustände aktiviert (Bathohodopsin, Lumirhodopsin, Metarhodopsin I (MI), Metarhodopsin II, (MII)) (Wald und Brown, 1958 [ 77 ], 1968 [ 78 ]; Yoshizawa und Shichida, 1982 [ 83 ]). Nach wenigen Millisekunden stellt sich ein Gleichgewicht zwischen MI und MII ein, dessen Lage sowohl vom pH-Wert als auch von der Temperatur abhängt (Matthews et al., 1963 [ 54 ]; Parkes und Liebman, 1984 [ 66 ]).

Beim Übergang von Meta-I- zu Meta-II-Rhodopsin, dem ersten gebleichten Zustand, wird die Schiff-Base deprotoniert, wobei es sich um eine Translokation des Protons innerhalb des Rhodopsins handelt (Ganter et al., 1989 [ ]). Nach einigen Minuten zerfällt MII zu Meta-Rhodopsin III bzw. Opsin und all-trans-Retinal. Das Absorptionsmaximum von Rhodopsin liegt bei 500 nm im Grundzustand und 380 nm in der gebleichten MII-Form.

Eine Deaktivierung des Rezeptors durch Zerfall wäre zu langsam, da die Lebensdauer von Metarhodopsin II im Bereich von einigen Minuten liegt. Die Abschaltung des aktiven Rhodopsins erfolgt durch Phosphorylierung über eine spezifische Kinase (Wilden et al., 1986 [ 80 ]). Vervollständigt wird die Deaktivierung durch die Bindung von Arrestin (Palczewski et al., 1992 [ 65 ]) an das phosphorylierte Rhodopsin. Arrestin bleibt an Rhodopsin gebunden, bis das all-trans-Retinal durch die Retinoldehydrogenase zu all-trans-Retinol reduziert ist. Dadurch dissoziiert Arrestin vom phosphorylierten Opsin (Hofmann et al., 1992 [ 33 ]). Phosphatase 2A dephosphoryliert Opsin (Fowles et al., 1989 [ 20 ]; Palczewski, 1989 [ 62 ]), das durch Regeneration mit 11-cis-Retinal wieder zu Rhodopsin wird (Bernstein et al., 1987 [ 5 ]; Jones et al., 1989 [ 39 ]).

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Abbildung 1-2: A Schematische Darstellung der visuellen Kaskade (aus Hofmann und Heck 1996)
RK Rhodopsinkinase, Rp phosphoryliertes Rhodopsin, A Arrestin, RDH Retinoldehydrogenase, Op phosphoryliertes Opsin, Ch Kationenkanal, E Na/Ca- Austauscher, GC Guanylatcyklase. Zur Erläuterung siehe Text.
B chematische Darstellung des G-Protein-Zyklus der visuellen Kaskade
Lichtaktiviertes Rhodopsin (R*) bindet an Transducin (G_GDP). Hierdurch wird die Nukleotidbindungstasche des G-Proteins geöffnet; das im inaktiven Zustand von G_t gebundene GDP wird frei und es bildet sich der stabile R*G_empty-Komplex. Durch Aufnahme von GTP wird Transducin in seinen aktiven Zu- stand (G_GTP) überführt. Die folgende Hydrolysereaktion des gebundenen GTP zu GDP bewirkt die Rückkehr von Gt in den inak tiven Ausgangszustand. Im Inneren des Kreises ist die Protonenaufnahme oder Abgabe der jeweiligen Schritte dargestellt.

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Transducin

Der Transmitter, der das Signal vom Rezeptor Rhodopsin zum Effektor, der cGMP-Phosphodiesterase weitergibt, ist Transducin, G_t. Transducin gehört der Familie der heterotrimeren G-Proteine an. Ein detaillierter Überblick hierzu findet sich bei Gilman, 1987 [ 24 ], Bourne et al. 1990 [ 8 ] und 1991 [ 9 ] oder bei Guderman et al., 1996 [ 25 ].

Transducin setzt sich aus der G-Untereinheit (39 kDa) und dem nichtdissoziierbaren Dimer aus G- und G-Untereinheit (G 35 kDa, G 5 kDa) zusammen und verfügt über GTPase-Aktivität. Die a-Untereinheit besitzt eine Nukleotidbindungsstelle, die GDP oder GTP binden kann. Hierbei stellt G_GTP den aktiven, G_GDP den inaktiven Zustand des Proteins dar.

Durch Bindung von G_t an aktiviertes Rhodopsin (R*) wird die Nukleotidbindungstasche der a-Untereinheit des Transducins geöffnet (Bennett und Dupont, 1985 [ 4 ]). Das im inaktiven Zustand von Transducin gebundene GDP kann dadurch mit der Außenphase equilibrieren und es bildet sich der Komplex aus Rhodopsin und Transducin (R*G-Komplex) mit leerer Nukleotidbindungstasche, der in Abwesenheit von GTP oder GDP stabil ist. In Anwesenheit von GTP bindet dieses an die G-Untereinheit und versetzt Transducin so in seinen aktiven Zustand. Diese Konformationsänderung von G führt zur Lösung der Komplexbindung sowie zur Trennung der G- und G-Untereinheiten. Hydrolyse des gebundenen GTP zu GDP führt die G-Untereinheit in den inaktiven Zustand zurück und ermöglicht dadurch die Reassoziation der Untereinheiten.

c-GMP-Phosphodiesterase

Der Effektor der visuellen Kaskade, die cGMP-Phosphodiesterase (PDE) besteht aus a-, b- und zwei g- Untereinheiten (Baehr et al., 1979 [ 3 ]). Partielle Aktivierung der PDE erfolgt durch stöchiometrische Bindung der freien G_GTP-Untereinheit an eine der beiden g-Untereinheiten (Hurley und Stryer, 1982 [ 37 ]). Zur vollständigen Aktivierung ist die Bindung von zwei G_GTP-Untereinheiten nötig. Die aktive Phosphodiesterase katalysiert die Hydrolyse von zytoplasmatischem cGMP zu 5’ GMP. cGMP bewirkt, daß im Dunkeln die cGMP-abhängigen Kanäle in der Zellmembran des Stäbchenaußensegments offen gehalten werden. Durch Hydrolyse nimmt die cGMP-Konzentration in der Zelle ab, was zum Schließen der Kanäle führt. Hierdurch ist der Strom von Na⁺- und Ca^2+-Ionen in einem Teil der Oberfläche der Zellmembran unterbrochen. Es kommt zu einer Hyperpolarisation an der Zellmembran. Dies ist das elektrische Signal der visuellen Kaskade. Die Guanylatzyklase, die von einem Ca²⁺-bindenden Protein aktiviert wird, synthetisiert cGMP und sorgt damit für die Erhöhung der cGMP-Konzentration und die Öffnung der Kanäle (siehe hierzu Koch 1994 [ 44 ]).

Wie später gezeigt wird, spielen bei kalorimetrischen Messungen die aus der wäßrigen Lösung aufgenommenen oder abgegebenen Protonen eine wichtige Rolle. Für den G-Protein-Zyklus (siehe Abb. 2 B) , der in der vorliegenden Arbeit genauer untersucht wird, sind die beteiligten Protonen im Inneren des Kreises der Abbildung dargestellt. Bei der Bildung des R*G-

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Komplexes wird ein Proton aufgenommen. Dies ist von Schleicher und Hofmann (1985 [ 70 ]) durch Messungen der blitzlichtinduzierten pH-Änderung gezeigt worden. Durch Messungen in Anwesenheit von GTP konnte indirekt gezeigt werden, daß bei der Dissoziation des Komplexes ein Proton frei wird (Schleicher und Hofmann, 1985 [ 70 ]). Ferner ergibt sich aus der Bilanz der Hydrolyse die Abgabe eines weiteren Protons an die Umgebung, es gilt:

1.2. Vergleich mit der GTPase des Ras-Proteins

Bindung und Hydrolyse von GTP spielen nicht nur bei der visuellen Signaltransduktion eine entscheidende Rolle, sondern auch bei einer Vielzahl weiterer zellulärer Prozesse, wie zum Beispiel dem Zellwachstum. In diesem Fall ist das GTP-bindende Protein das sogenannte p21^ras, ein 21 kDa Protein. Ein detaillierter Überblick über Ras- und Ras-verwandte-Proteine, deren Präparation sowie über den Stand der Forschung in diesem System findet sich bei Campbell-Burk und Carpenter (1995 ) [ ], Denhardt (1996) [ 16 ]und Herrmann und Nassar (1997) [ 28 ].

Um die Enthalpieänderung, die durch die Hydrolyse von GTP hervorgerufen wird außerhalb der visuellen Kaskade zu untersuchen, wurden einige Kontrollexperimente am Ras-Protein durchgeführt.

Bei den meisten G-Proteinen, so auch beim Ras-Protein, katalysiert ein Austauschfaktor (guanosine nucleotide exchange factor, GEF) den Übergang vom inaktiven GDP-bindenden Zustand zum aktiven GTP-bindenden Zustand. Die Hydrolyse des Ras-gebundenen GTP wird durch ein GTPase aktivierendes Protein (GAP) reguliert, welches die intrinsische GTPase-Rate des p21^ras stark erhöht. Im Ras_GTP-Zustand wird ein Effektor aktiviert (siehe hierzu Herrmann und Nassar 1997 [ 28 ]) , der das Signal zur nächsten Komponente der Kaskade weiterleitet. In Abbildung 3 ist der Zyklus des GDP-/GTP-Austauschs mit den beteiligten Komponenten schematisch dargestellt.

Beim Durchlaufen des GDP/GTP-Zyklus spielen die Raten der einzelnen Reaktionen eine sehr große Rolle für den richtigen zeitlichen Ablauf der Vorgänge in der Zelle. Je länger ein Protein im aktiven Zustand bleibt, desto länger wird das Signal weitergeleitet. Mutationen des Ras-Proteins senken dessen GTPase-Aktivität drastisch und führen so zu einem onkogenen Ras-Protein, das ein permanentes Wachstumssignal an die Zelle sendet.

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Abbildung 1-3 : Schematische Darstellung des GDP/GTP-Zyklus beim Ras-Protein
Der Übergang vom inaktiven RasGDP- zum aktiven RasGTP-Zustand wird durch den
Austauschfaktor (GEF) beschleunigt. Im aktiven Zustand kann das Ras-Protein mit verschiedenen Effektoren wechselwirken. Die intrinsische Deaktivierung des Proteins
durch Hydrolyse ist sehr langsam und wird durch ein sogenanntes GAP-Protein beschleunigt.

1.3. Die visuelle Kaskade in der Kalorimetrie

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Aufklärung der Enthalpieänderungen von Reaktionen der visuellen Signaltransduktion. Insbesondere soll der G-Protein-Zyklus der Sehkaskade untersucht werden. In diesem Kapitel werden die bisher bekannten, thermodynamischen Messungen zum Sehvorgang beschrieben und deren Ergebnisse zusammengestellt.

Untersuchungen zur thermischen Stabilität von Rhodopsin

Die meisten bisherigen Veröffentlichungen zur Kalorimetrie an Proteinen der visuellen Kaskade berichten über Untersuchungen zur thermischen Stabilität von Rhodopsin und Opsin, die mit Hilfe eines Wärmestrom-Differenz-Kalorimeters (Differential Scanning Calorimeter, DSC) durchgeführt wurden. Bei einer DSC-Messung wird die Wärme gemessen, die bei Aufheizen bzw. Abkühlen einer Probe freigesetzt oder aufgenommen wird. Das Ergebnis gibt Informationen über die Phasenübergänge einer Substanz. Bei der Anwendung der DSC auf Proteine, läßt sich die Temperatur finden, bei der das untersuchte Protein denaturiert. Die Wärmestrom-Differenz-Kalorimetrie läßt sich nur auf Reaktionen anwenden, die durch Veränderung der Temperatur ausgelöst werden. Reaktionen die durch Wechselwirkung von Proteinen hervorge-

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rufen werden, sind mit dieser Methode nicht zugänglich. Die Ergebnisse der Messungen, die mit DSC-Geräten an Rhodopsin und Opsin durchgeführt wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1 : Zusammenfassung der DSC-Untersuchungen zur thermischen Stabilität von
Rhodopsin bzw. Opsin

Betrachtetes Protein	Denaturierungstemperatur und gemessene Wärme	Literaturquelle
Rhodopsin pH 7.0 Rhodopsin pH 6.8 Rhodopsin pH 6.1 Rhodopsin pH 6.1	bei 72 °C bei 74 °C + 150 kcal/Mol bei 71.4 °C + 167 kcal/Mol bei 71.9 °C + 167 kcal/Mol	Miljanich et al., 1985 [ 57 ] Shnyrov et al., 1988 [ 73 ] McDowell et al., 1990 [ 55 ] Khan et al., 1991 [ 43 ]
Opsin pH 7.0 Opsin pH 6.8 Opsin pH 6.1 Opsin pH 6.1	bei 57 °C bei 59 °C + 117 kcal/Mol bei 55.3 °C + 124 kcal/Mol bei 55.9 °C +124 kcal/Mol	Miljanich et al., 1985 [ 57 ] Shnyrov et al., 1988 [ 73 ] McDowell et al., 1990 [ 55 ] Khan et al., 1991 [ 43 ]

Photokalorimetrie an der visuellen Kaskade

Weitere kalorimetrische Daten zur visuellen Kaskade (Cooper und Converse, 1976 [ 13 ]; Cooper, 1979 [ 14 ]; Cooper, 1981 [ 15 ]; Chabre und Vuong, 1992 [ 12 ]) wurden mit zwei verschiedenen Photokalorimetern aufgenommen. Das von Cooper verwendete Gerät war ein handelsübliches Kalorimeter der Firma LKB (Bromma, Schweden), welches zur Messung von photoneninduzierten Reaktionen umgebaut wurde. Chabre und Vuong setzten ein Filmkalorimeter ein, das in Eigenbauweise entstand (Vuong und Chabre, 1990 [ 75 ]).

Bei dem LKB-Batch-Kalorimeter handelt es sich um ein Gerät in Zwillingsbauweise (Probenzelle und Referenzzelle). Gemessen wird eine örtliche Temperaturdifferenz in ‘isoperiboler’ Betriebsart. Der Begriff isoperibol bedeutet gleichartige Umgebung und meint den Betrieb eines Kalorimeters bei konstanter Umgebungstemperatur und veränderlicher Temperatur des Meßsystems. Eine genauere Beschreibung dieses Kalorimeters findet sich bei Wadsö (1968) [ 82 ]. Cooper und Converse (1976) [ 13 ] beschreiben den Umbau des LKB-Batch Gerätes zum Photokalorimeter. Durch die Verwendung von Glasfasern, die das Licht in die Probenzelle führen, ist es möglich, die Enthalpieänderungen von photoneninduzierten Prozessen zu beobachten. Untersucht wurden Außensegmente der Sehstäbchen mit dem Ziel, die Wärme von Aktivierung und Zerfall des Rhodopsins zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Messungen bei tiefen Temperaturen (Cooper, 1979) [ 14 ] ermöglichten es, die Wärmeänderung für den Übergang von Rhodopsin nach Bathorhodopsin, einem Intermediat des Rhodopsins, zu bestimmen (siehe Tab. 2).

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1990 findet sich bei Vuong und Chabre die Beschreibung eines selbstkonstruierten Kalorimeters dessen Wärmesensor ein PVDF-Film (Poyvinylidendifluorid) ist. Temperaturänderungen führen zu Ladungsverschiebungen im Film, die einen Verschiebungsstrom erzeugen. Der Strom ist proportional zur Rate der Temperaturänderung. Dieser Eigenbau erlaubt die zeitabhängige Untersuchung von lichtgesteuerten Reaktionen, ist aber für die Betrachtung sehr langsamer Reaktionen ungeeignet, da adiabatische Betriebsbedingungen (kein Wärmeaustausch zwischen Meßsystem und Umgebung) nur für einen kurzen Zeitraum (80 sec) gewährleistet werden können.

Tabelle 2 faßt die kalorimetrisch gemessenen Werte für die Reaktionsenthalpie von Teilschritten der visuellen Kaskade zusammen. Da es sich nicht um Standardwerte der Enthalpieänderung handelt, sind die jeweiligen Meßbedingungen aufgeführt.

Tabelle 2 : Zusammenfassung der kalorimetrisch bestimmten Enthalpieänderungen
für einzelneSchritte in der visuellen Kaskade

Betrachtete Reaktion	gemessene Enthalpieänd. H in kcal/Mol	Literaturquelle
Rhodopsin ® MI pH 8, 3 °C	+ 16.8	Cooper & Converse, 1976 [ 13 ]
Rhodopsin ® MII pH 5.4, 3 °C	+ 27.0	Cooper & Converse, 1976 [ 13 ]
Rhodopsin ® Opsin + Retinal pH 5.4, 3 °C	+ 11.7	Cooper & Converse, 1976 [ 13 ]
MI ® Opsin + Retinal pH 8, 3 °C	+ 6	Cooper & Converse, 1976 [ 13 ]
MII ® Opsin + Retinal pH 5.4, 3 °C	-16	Cooper & Converse, 1976 [ 13 ]
MI ® MII pH 7, 3 °C	+ 10	Cooper & Converse, 1976 [ 13 ]
Rhodopsin ® Bathorhodopsin pH 7, -196 °C Rhodopsin ® Bathorhodopsin -196 °C	+ 34.7 + 30	Cooper, 1979 [ 14 ] Chabre & Vuong, 1992 [ 12 ]
Bathorhodopsin ® Meta II	- 15	Chabre & Vuong, 1992 [ 12 ]
Rhodopsin ® Lumirhodopsin pH 7.2, - 75 °C	+ 26.3	Cooper, 1981 [ 15 ]
R*GGTP ® R* + GGTP pH 7.5, 23 °C	- 3	Chabre & Vuong, 1992 [ 12 ]
GTP ® GDP + Pi pH 7.5, 23 °C	- 4	Chabre & Vuong, 1992 [ 12 ]

Aktivierungsenergien für Reaktionen der visuellen Kaskade

Die in Tabelle 1 und 2 vorgestellten Daten wurden an Proben aus Stäbchenaußensegmenten gemessen. Bisher sind am aus rekonstituierten System, das aus gereinigten Komponenten

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zusammengesetzt wurde nur Messungen zur Aktivierungsenergie durchgeführt worden. Hierbei wurden die Aktivierungsenergien aus den Reaktionsraten berechnet, die in Abhängigkeit von der Temperatur gemessen wurden. Tabelle 3 stellt die Ergebnisse zusammen.

Tabelle 3 : Zusammenfassung der ermittelten Aktivierungsenergien für Teilschritte
der visuellen Kaskade

Betrachtete Reaktion	Aktivierungs- energie in kcal/Mol	Literaturquelle
MI ® MIIa	+ 38	Arnis & Hofmann, 1993 [ 2 ]
MIIa ® MIIb	+ 14	Arnis & Hofmann, 1993 [ 2 ]
MII + GGDP ® MII·Gempty	+ 8.3	Kahlert & Hofmann, 1991 [ 41 ]
MII·Gempty ® MII + GGTP	+ 39	Kohl & Hofmann, 1987 [ 46 ] Kahlert & Hofmann, 1991 [ 41 ]
	Freie Aktivierungs- energie in kcal/Mol
MI ® MIIa pH 6.0, 5 °C pH 6.75, 5 °C pH 7.5, 5 °C	+ 16.0 + 13.6 + 12.6	Arnis & Hofmann, 1993 [ 2 ]
MIIa ® MIIb pH 6.0, 5 °C pH 6.75, 5 °C pH 7.5, 5 °C	+ 7.6 + 6.7 + 5.7	Arnis & Hofmann, 1993 [ 2 ]

1.4. Ziel der vorliegenden Arbeit

Die vorliegende Arbeit stellt Untersuchungen zur Messung der Reaktionsenthalpie am G-Protein-Zyklus der visuellen Kaskade vor. Das Ziel hierbei war, neben der Enthalpieänderung für den gesamten Zyklus, insbesondere die Reaktionswärmen der einzelnen Teilschritte zu ermitteln. Im Unterschied zu bisherigen kalorimetrischen Untersuchungen des G-Protein-Zyklus (Vuong und Chabre, 1990 [ 75 ],1991 [ 76 ]) wurde erstmalig ein rekonstituiertes System aus gewaschenen Diskmembranen und gereinigtem Transducin zugrunde gelegt. Dadurch konnten die Konzentrationen der beteiligten Proteine unabhängig voneinander variiert und Teilreaktionen separat betrachtet werden. Diese differenzierte Betrachtungsweise erlaubt es, Zusammenhänge zwischen den einzelnen Komponenten im G-Protein-Zyklus besser zu verstehen und Teilschritte zu isolieren.

Der methodische Fortschritt der Arbeit liegt in dem verwendeten Titrations- Mikro-Kalorimeter (genauere Beschreibung in Kapitel 2.2.1). Im Unterschied zu früheren Geräten (Überblick bei

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Langerman und Biltonen, 1979 [ 49 ]) ist die Empfindlichkeit dieses Kalorimeters sehr viel größer, so daß einerseits die Enthalpieänderungen genauer bestimmt werden können und andererseits auch sehr kleine, bisher unzugängliche, Reaktionswärmen meßbar sind.

Im Vergleich zu vorhergehenden kalorimetrischen Experimenten wurden in der vorliegenden Arbeit die meisten Messungen nach einem neuen Konzept durchgeführt. Durch die Titration einer Komponente wurde ein Zyklus von Reaktionen ausgelöst. Dabei ist das betrachtete System vor und nach Durchlaufen des Zyklus im gleichen Zustand und die Messung läßt sich an derselben Probe mehrmals wiederholen.

Ferner wurde im Unterschied zu bisher beschriebenen Experimenten unter Verwendung dieses Titrationskalorimeters, nicht nur die gemessene Wärme sondern auch der zeitliche Verlauf des Wärmesignals interpretiert. Die gezielte Variation der Konzentration der beteiligten Proteine verändert den Verlauf des Wärmesignals. Dies erlaubt eine Aussage über den Einfluß des jeweiligen Proteins auf den Gesamtzyklus.

1.5. Thermodynamische Grundlagen

Die thermodynamische Analyse eines biologischen Systems trägt zur Aufklärung von Zusammenhängen und Wechselwirkungen innerhalb des Systems bei. Sie gibt Aufschluß über die treibenden Kräfte der Reaktionen, indem untersucht wird, in welche Richtung eine Reaktion abläuft, ob sie spontan abläuft, wie hoch die Aktivierungsenergie ist und wo das Gleichgewicht der Reaktion liegt.

Thermodynamische Systeme werden in drei verschiedene Klassen eingeteilt; man unterscheidet offene, geschlossene und isolierte Systeme. Ein isoliertes System hat mit seiner Umgebung keinerlei Verbindung, es findet weder ein Austausch von Teilchen noch von Energie statt. Im Falle eines geschlossenen Systems ist ein Energieaustausch mit der Umgebung erlaubt, jedoch kein Teilchenaustausch, wohingegen bei einem offenen System sowohl Energie als auch Teichen ausgetauscht werden können. Des weiteren wird ein thermodynamisches System durch Angabe der voneinander unabhängigen makroskopischen Zustandsgrößen Druck p, Temperatur T, Volumen V charakterisiert. Um eine Beschreibung der mikroskopischen Zustände eines Systems zu erhalten, greift man auf Wahrscheinlichkeiten zurück. Hierbei wird ein thermodynamisches System als Gesamtheit von sehr vielen Teilchen betrachtet. Den möglichen Zuständen dieser Teilchen wird eine Wahrscheinlichkeit P zugeordnet. Der Logarithmus von P multipliziert mit der Boltzmann-Konstante k wird als Entropie S definiert

Eine Zustandsänderung des Systems läßt sich durch die Angabe der Zustandsgrößen des Ausgangs- und Endzustandes beschreiben (im folgenden mit den Indizes ‘Ausg’ und ‘End’ bezeichnet).

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Jedes thermodynamische System besitzt eine gewisse innere Energie U. Diese kann nur dadurch geändert werden, daß dem System von außen Energie zugeführt wird, bzw. das System Energie nach außen abgibt. Die zu- oder abgeführte Energie läßt sich aufteilen in Wärme Q und am System geleistete Arbeit W. Für die Änderung der inneren Energie gilt:

Dies entspricht der Aussage des ersten Hauptsatzes der Thermodynamik. In den meisten Fällen ist die am System geleistete Arbeit Volumenarbeit; hierfür gilt im Falle einer Kompression:

Um isobare Prozesse zu beschreiben, ist es günstiger, statt der inneren Energie die Enthalpie H des Systems zu betrachten. Die Enthalpie ist definiert als Summe aus innerer Energie U des Systems und der verrichteten Volumenarbeit

Damit ergibt sich bei konstantem Druck

q ist die Wärme normiert auf die Stoffmenge n. Die Enthalpieänderung entspricht der mit der Umgebung ausgetauschten Wärmemenge. Die bei den Experimenten im Kalorimeter gemessene Wärme Q entspricht dem Produkt aus H und Stoffmenge.

In der Mechanik spricht man vom stabilen Gleichgewicht eines Systems, wenn ein Minimum der potentiellen Energie vorliegt. In der Thermodynamik gibt es in Abhängigkeit von den verschiedenen Zustandsgrößen unterschiedliche Formulierungen für die Energie. Daraus ergeben sich verschiedene Funktionen (freie Enthalpie G, freie Energie F), deren Minimum im Einzelfall untersucht werden muß. Hier sollen nur für den Fall des verwendeten Kalorimeters kurz die nötigen Grundlagen erläutert werden.

Das in dieser Arbeit verwendete MCS-Titrationskalorimeter (siehe Kapitel 2.2.1) kann als geschlossenes System betrachtet werden. Die Meßeinheit (Meßzellen und Titrationsspritze) erlaubt keinen Austausch von Materie mit der Umgebung, Energieaustausch hingegen ist möglich. Aufgrund der isotherm-isobaren Betriebsweise des Kalorimeters, ist das Gleichgewicht des Systems bestimmt durch das Minimum der freien Enthalpie G. Die freie Enthalpie ist definiert als Differenz von Enthalpie und dem Produkt aus Temperatur und Entropie:

Aus der Differenz der freien Enthalpie von Ausgangs- und Endzustand lassen sich Aussagen über die treibenden Kräfte einer Reaktion treffen. Ist die freie Enthalpie des Ausgangszustandes größer als die des Endzustandes, also

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so läuft die Reaktion spontan ab. Man spricht im Falle von negativem von einer exergonischen Reaktion, für von einer endergonischen Reaktion. Hierbei ist zu beachten, daß aus einer Aussage über keine zwingenden Schlüsse über die Veränderung der Enthalpie oder Entropie einer Reaktion gezogen werden können. Es gilt:

Folglich sind Reaktionen denkbar, die spontan ablaufen und nur von einer Änderung der Entropie oder nur durch Wärmeabgabe getrieben sind. Eine Reaktion, bei der Wärme frei wird( ) bezeichnet man als exotherm, einen Vorgang mit

Häufig ist es einfacher, statt der energetischen Größen die Gleichgewichtskonstante zu bestimmen. Der Zusammenhang zwischen der Gleichgewichtskonstante K einer Reaktion und der Änderung der freien Enthalpie G unter chemischen Standardbedingungen (T = 298.15 K, p = 1 bar, Konzentrationen aller beteiligten Reaktionspartner 1 M) ist durch folgende Gleichung gegeben:

Hierbei ist R die Gaskonstante. Sind bei einer Reaktion Protonen beteiligt, so werden biochemische Standardbedingungen zugrunde gelegt. Hierbei gelten die obigen Bedingungen für Druck und Temperatur, nur die Konzentration der H⁺-Ionen wird zu 10^-7 M, entsprechend pH 7.0, angenommen. Die Angabe von DG für eine Konzentration von 1 M H⁺-Ionen wäre wenig sinnvoll, da bei pH 0 die meisten Proteine denaturiert vorliegen.

Im allgemeinen Fall beliebiger Konzentrationen der Reaktionspartner ist ein zusätzlicher Term zu berücksichtigen. Für eine Reaktion

ergibt sich für :

Aus der Temperaturabhängigkeit der Gleichgewichskonstanten läßt sich nach der van´t-Hoff-Gleichung die Standardreaktionsenthalpie berechnen:

Hierbei ist allerdings zu beachten, daß die kalorimetrisch gemessenen Werte nicht zwangsläufig mit den errechneten übereinstimmen (Fisher und Singh, 1995). Die Unterschiede liegen darin, daß die kalorimetrische Messung im Gegensatz zur Berechnung die Wärme sämtlicher beteiligten Effekte berücksichtigt (z. B. Reaktionen des Puffers oder Lösungsmittels, unbe-

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kannte Reaktionen, die Temperaturabhängigkeit von H). Tatsächlich weichen die berechneten Enthalpieänderung in sehr vielen Fällen signifikant von den kalorimetrisch ermittelten Werten ab (Naghibi et al., 1995 [ 60 ]; Liu und Sturtevant, 1995 [ 52 ]).

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