33

Kapitel 3. Der gesamte G-Protein-Zyklus

In diesem Kapitel werden die Meßergebnisse von Titrationskalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie dargestellt, die bei vollständigem Durchlaufen des G-Protein-Zyklus aufgenommen wurden. Eine Unterteilung des G-Protein-Zyklus in Teilschritte und die genauere Betrachtung der einzelnen Reaktionen wird in Kapitel 4 vorgenommen.

Zur Untersuchung des gesamten Zyklus wurde eine Probe aus Rhodopsin in gewaschenen Membranen und Transducin vorgegeben. Durch Belichtung dieser Probe vor dem Einfüllen in die Kalorimeterzelle bildet sich der stabile R*G-Komplex. Bei Zugabe von GTP zum Komplex wird die a-Untereinheit des Transducins aktiviert, was zur Dissoziation der Komplexbildung und zur Trennung von G- und G-Untereinheit führt. Im weiteren Verlauf hydrolysiert das GTP in der Nukleotidbindungstasche des G-Proteins zu GDP und deaktiviert so G Die G-und die G-Untereinheit reassoziieren anschließend wieder zum Holoprotein G_t, das erneut an das lichtaktivierte Rhodopsin bindet. Hiermit ist das System in den Ausgangszustand zurückgekehrt. Mit jeder neuen Injektion von GTP kann wieder der ganze Zyklus ausgelöst werden. Die Bindung von GTP an Transducin erfolgt stöchiometrisch im Verhältnis 1:1. Ist die zugegebene Konzentration an GTP höher als die vorgegebene Transducinkonzentration, so wird der Zyklus solange durchlaufen, bis das vorhandene GTP vollständig zu GDP hydrolysiert ist.

3.1. Titration von GTP zum R*G-Komplex

Zur Untersuchung des gesamten G-Protein-Zyklus wird in der Probenzelle des Kalorimeters Rhodopsin und Transducin vorgegeben und GTP dazutitriert. Abbildung 8 zeigt eine typische Messung des G-Protein-Zyklus (Spur d) und die zugehörigen Kontrollexperimente (Spuren a - c). Pro Injektion werden jeweils 5 µl einer 0.8 mM GTP-Lösung in BTP-Puffer (pH 7.5) zugespritzt. Dies entspricht einer Konzentration von 3 µM GTP in der Zelle. Spur a zeigt, daß bei Zugabe von GTP zu BTP-Puffer nur eine geringe Wärme frei wird, die auf Verdünnung und Mischung zurückzuführen ist. Ebensowenig ist bei Injektion von GTP zu 1 µM Transducin (Spur b) oder zu 1 µM aktiviertem Rhodopsin (Spur c) eine Reaktion zu sehen. Erst bei Vorgabe beider Proteine wird die Gesamtwärme des Zyklus frei (Spur d). In dieser Messung wurde ein Verhältnis von Rhodopsin zu G_t von 1:1 gewählt. Die zutitrierte Menge von GTP entspricht dem 3-fachen der Transducinkonzentration, so daß der Zyklus mehrfach durchlaufen werden muß, um das zugegebene GTP vollständig zu hydrolysieren. Das System befindet sich nach dem Verbrauch des zutitrierten GTP, d.h. nach der Hydrolyse wieder im Ausgangszustand. Eine weitere Injektion löst den gleichen Vorgang neu aus. Es ist folglich zu erwarten, daß die freigewordene

34

Wärme, repräsentiert durch die Fläche unter dem Wärmesignal (schraffiert gezeichnet), für alle Injektionen gleich bleibt. Dies wird durch die Messung bestätigt.

Abbildung 3-1: Darstellung einer Messung des G-Protein-Zyklus und der zugehörigen Kontrollen
Pro Injektion wurden jeweils 5 µl einer 0.8 mM GTP-Lösung (angesetzt in BTP-Puffer, pH 7.5) zugespritzt, entsprechend einer Konzentration von 3 µM GTP in der Meßzelle.
Die Spuren a - c zeigen Kontrollexperimente:
a. Titration von GTP zu BTP-Puffer zeigt keine Reaktion. Man beobachtet eine sehr geringe
Wärme, hervorgerufen durch Mischung und Verdünnung der Reaktanden.
b. Zugabe von GTP zu 1 µM Transducin zeigt keine Reaktion
c. Gibt man GTP zu belichtetem Rhodopsin (1 µM) in Abwesenheit von Transducin, ist
ebenfalls keine Reaktion zu erkennen.
Spur d zeigt die Titration von GTP zum R*G-Komplex (1µM R* und 1 µM G_t). Der Verlauf der Wärmeabgabe ist sehr komplex und nicht durch eine einzige Reaktion zu beschreiben. Wie in der Vergrößerung der ersten Injektion von Spur d zu erkennen ist, lassen sich verschiedene Phasen der Reaktion unterscheiden. Sie sind durch gestrichelte Linien markiert und mit I, II und III bezeichnet.
Die Messungen wurden bei 10 °C durchgeführt.

Der zeitliche Verlauf der freiwerdenden Wärme bei Zugabe von GTP zum R*G-Komplex läßt mehrere Phasen erkennen. Dies zeigt eine Vergrößerung der ersten Injektion der Meßkurve (d). Durch die gestrichelten Linien ist die Fläche in drei Bereiche unterteilt. Phase I zeigt eine

35

schnelle Reaktion, die sich in einem exothermen Peak widerspiegelt. Ihr folgt eine Phase (II) mit geringerer, nahezu konstanter Wärmeproduktion, die sich durch ein Plateau beschreiben läßt. Die mit III bezeichnete Phase zeigt das Ende der Reaktion, repräsentiert durch die Rückkehr des Wärmesignals zum Ausgangsniveau. Eine Zuordnung der einzelnen Phasen zu bestimmten Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus wird in Kapitel 4 vorgenommen.

3.2. Enthalpieänderung des G-Protein-Zyklus

Nach Messungen von Schleicher und Hofmann (1985) [ 70 ] wird bei der GTP-induzierten Dissoziation des R*G-Komplexes ein Proton frei. Ein weiteres Proton wird im nächsten Schritt des Zyklus, der Hydrolyse von GTP zu GDP abgegeben. Bei der Bildung des R*G-Komplexes hingegen wird ein H⁺ aus der wäßrigen Lösung aufgenommen (Schleicher und Hofmann, 1985) [ 70 ]. In der Bilanz wird beim Durchlaufen des ganzen Zyklus ein Proton abgegeben. Da die Protonierung des Puffer sich auf die gemessene Wärme auswirkt (siehe Kapitel 2.4), muß in einem Experiment, bei dem der ganze G-Protein-Zyklus durchlaufen wird, die Bilanz der Protonen berücksichtigt werden.

Mißt man den G-Protein-Zyklus in Phosphat- und BTP-Puffer, so werden sich die ermittelten Enthalpieänderungen um einen Betrag unterscheiden, welcher der Differenz der Protonierungswärmen der Puffer entspricht. Abbildung 9 A zeigt die Messung des G-Protein-Zyklus in Phosphatpuffer (a) und in BTP-Puffer (b). Pro Injektion wurde GTP entsprechend einer Endkonzentration von 3 µM zum R*G-Komplex titriert. Die Transducinkonzentration betrug 1 µM, Rhodopsin lag im Überschuß vor (10 µM). In Abbildung 9 A sind nur die ersten drei von insgesamt 10 Injektionen abgebildet. Die Messung in Phosphatpuffer weist eine geringere Wärmeabgabe pro Zeiteinheit auf, als das gleiche Experiment durchgeführt in BTP-Puffer. Bezüglich des zeitlichen Verlaufs der freiwerdenden Wärme, zeigen die Messungen in der ersten Phase des Signals eine sehr gute Übereinstimmung. In beiden Fällen ist eine schnelle exotherme Reaktion zu erkennen, deren Dauer nicht von der Verwendung verschiedener Puffer beeinflußt wird. Die zweite Phase der Wärmeabgabe zeichnet sich bei dem Experiment in Phosphatpuffer sehr viel deutlicher ab, als bei der Messung in BTP-Puffer. Während die Regelleistung in Kurve (a) annähernd konstant ist, beobachtet man bei Spur (b) eine sehr kurze Phase von linearer Verringerung der Wärmeabgabe bevor die dritte Phase einsetzt. In BTP-Puffer ist die dritte Phase gekennzeichnet durch einen geringen endothermen Anteil, der in Phosphatpuffer nicht erkennbar ist. Die Gesamtdauer der Reaktion ist in beiden Messungen gleich.

In Abbildung 9 B ist die Enthalpieänderung, die durch die einzelnen Injektionen hervorgerufen wird (die normierte Fläche unter der Meßkurve) für die gesamte in Abbildung 9 A dargestellte Messung in kcal pro Mol GTP angegeben. Die durch Rechtecke markierten Werte entsprechen

36

den Injektionen in Phosphatpuffer, während die Dreiecke die Titration in BTP-Puffer wiedergeben. Aus dem Schaubild geht hervor, daß die Flächen der einzelnen Injektionen für die jeweiligen Puffer konstant sind. Dies ist in Übereinstimmung damit, daß mit jeder Injektion der Zyklus neu ausgelöst wird. In Phosphatpuffer liegen die gemessenen Werte für die beobachtete Enthalpieänderung bei - 6.9 ± 0.4 kcal/Mol, in BTP-Puffer bei - 15.2 ± 0.7 kcal/Mol.

Abbildung 3-2: Messung des G-Protein-Zyklus in verschiedenen Puffern
A Titration einer GTP-Lösung (3 µM GTP pro Injektion) zu 1µM Transducin und 10 µM Rhodopsin durchgeführt bei 10 °C in Phosphatpuffer (a) und in BTP-Puffer (b). Die abgegebene Wärme ist im phosphatgepufferten System geringer als in BTP-Puffer. Die Gesamtdauer der Injektionen ist gleich, jedoch ist der zeitliche Verlauf des Wärmesignals unterschiedlich. Kurve a zeigt eine ausgeprägte Phase von nahezu konstanter Wärmeabgabe, Kurve b zeigt einen endothermen Anteil in der Schlußphase des Signals.
B Berechnung der Enthalpieänderung durch Integration der Fläche unter dem Wärmesignal einer Injektion in Phosphatpuffer (a) und in BTP-Puffer (b). Die gemessene Änderung der Gesamtenthalpie ist in Phosphatpuffer geringer. Die durch die einzelnen Injektionen hervorgerufene Wärme ist jeweils für einen Puffer konstant. Für die korrekte Berechnung der Enthalpieänderungen unter Berücksichtigung der Protonenbilanz gilt:

37

Dabei ist die beobachtete Enthalpieänderung ohne Berücksichtigung der Pufferprotonierung (wie sie in Abbildung 9 B dargestellt ist), H_p steht für die Wärme bei Aufnahme von Protonen durch den Puffer, wobei k die Menge der beteiligten Protonen in Mol angibt. H_ges ist die gesamte Enthalpieänderung des Zyklus, korrigiert um die Enthalpieänderung durch Pufferprotonierung.

Trägt man in einem Schaubild die beobachtete Enthalpieänderung H_obs gegen H_p auf, so läßt sich aus der Steigung der Regressionsgeraden die Menge der abgegebenen Protonen in Mol und aus dem y-Achsenabschnitt die Enthalpieänderung H_ges entnehmen (Abbildung 10). Hierbei ist der Wert für Phosphatpuffer als Rechteck, der für BTP-Puffer als Dreieck eingezeichnet. Die berechnete Regressionsgerade hat eine Steigung von k = 0.95. Das bedeutet, daß im Laufe eines Zyklus 0.95 Mol Protonen an die Umgebung (den Puffer) abgegeben werden. Die auf der y-Achse abgelesene Enthalpieänderung für den gesamten Zyklus beträgt - 4.9 kcal/Mol GTP.

Abbildung 3-3: Enthalpieänderung unter Berücksichtigung der Pufferprotonierun
Bei Auftragung der beobachteten Enthalpieänderung Hobs gegen die Protonierungswärme
des Puffers Hp, läßt sich aus der Steigung der Regressionsgeraden die Menge an abge-
gebenen Protonen in Mol ermitteln. Aus dem y-Achsenabschnitt liest man die protonenkor-
rigierte Enthalpieänderung der Reaktion ab.

Die folgende Tabelle (Tab. 5) stellt die gemessenen und korrigierten Werte zusammen. Bei der Korrektur der gemessenen Werte wurde angenommen, daß ein Mol Protonen pro Zyklus

38

frei wird. Die Werte für die Enthalpieänderung ohne Korrektur der Pufferprotonierung wurden als Mittelwert aus mehreren Messungen errechnet. Der angegebene Fehler entspricht der Standardabweichung. Für die korrigierte Gesamtenthalpieänderung wurde der wahrscheinlichste Fehler berechnet.

Tabelle 5: Zusammenstellung der gemessenen und um die Wärme der Pufferprotonierung korrigierten Werte für die Enthalpieänderung des G-Protein-Zyklus
Die Werte für Hobs und Hp ergeben sich als Mittelwerte und Standardabweichung aus n Messungen zu je 10 Injektionen. Für Hges ist der wahrscheinlichste Fehler angegeben

Betrachtete Reaktion	Hobs in kcal/Mol GTP	Hp in kcal/Mol H+	Hges in kcal/Mol GTP
R*G +GTP in BTP-Puffer	- 15.2 ± 0.7 n = 12	-10.8 ± 0.5 n = 6	- 4.4 ± 0.9
R*G + GTP in Phosphatpuffer	- 6.9 ± 0.4 n = 9	- 2.1 ± 0.5 n = 3	- 4.8 ± 0.6
aus der graphischen Auftragung ermittelter Wert für Hges: - 4.9 kcal/Mol GTP GTP

Diese Ergebnisse geben den Wert der Enthalpieänderung bei Durchlaufen des ganzen Zyklus an. Die Messungen in den verschiedenen Puffern sind nach Korrektur um die Protonierungswärme in sehr guter Übereinstimmung. Gemittelt über die gemessenen Werte in den beiden Puffern ergibt sich für die Enthalpieänderung durch GTP-Hydrolyse

Der angegebene Fehler ergibt sich als wahrscheinlichster Fehler aus den Werten der Tabelle.

3.3. Vergleich mit der GTPase des Ras-Proteins

Um einen Vergleichswert für die Wärme durch GTP-Hydrolyse außerhalb der visuellen Kaskasde zu bekommen, wurden kalorimetrische Messungen zur GTPase des Ras-Proteins durchgeführt. Dieses läßt sich wieTransducin durch Zugabe von GTP in seinen aktiven Zustand bringen. Die intrinsische GTPase Reaktion ist jedoch sehr langsam und muß durch ein GAP-Protein (GTPase activating protein) beschleunigt werden. Des weiteren ist ein Austauschfaktor nötig, der den Nukleotidaustausch von GDP zu GTP am Ras-Protein beschleunigt. Auch bei der GTPase des Ras-Proteins wird ein Zyklus von Reaktionen betrachtet, bei dem das System nach Verbrauch des zugegebenen GTP wieder in seinen Ausgangszustand zurückkehrt.

39

Die hier verwendeten Proben wurden von Christian Herrmann aus der Arbeitsgruppe von A. Wittinghofer am Max-Planck-Institut in Dortmund präpariert. Bei dem verwendeten Austauschfaktor handelt es sich um Cdc25, dessen katalytische Domäne, AS 976-1260 (siehe hierzu Jacquet et al., 1995 [ 38 ]), im Experiment eingesetzt wurde. Bei GAP wurde ebenfalls die katalytische Domäne, die AS 714-1047 (Gideon et al., 1992 [ 23 ]) verwendet. Die Konzentrationen von Austauschfaktor und GAP wurden so gewählt, daß die Zeitdauer der Reaktionen in dem Bereich liegt, der für Messungen im visuellen System typisch ist. Die Experimente wurden in Puffer T (20 mM Tris, pH 7.5 und 5 mM MgCl₂) bei 20 °C durchgeführt.

In Abbildung 11 ist die Messung der Hydrolyse des Ras-gebundenen GTP (Spur b) im Vergleich zur Hydrolyse des Transducin-gebundenen GTP dargestellt (Spur a). Verschiedene Konzentrationen von GTP wurden zu einer Probe aus 2.8 µM Ras_GDP, 3 µM GAP und 2.8 µM Cdc25 gegeben. Der Verlauf des Wärmesignals im Ras-System zeigt nicht die Komplexität, wie die Messungen zur visuellen Kaskade. Einzelne Phasen sind nicht zu unterscheiden. Auch durch die Variation der zugegebenen GTP-Menge wird die Form des Wärmesignals nicht beeinflußt. Die Verbreiterung des Signals mit zunehmender Zeit ist auf die Anhäufung von GDP nach mehreren Injektionen zurückzuführen, die den Ablauf des Zyklus verlangsamt (Herrmann, 1997 [ 29 ]). Dies hat jedoch keinen Einfluß auf die Fläche unter der Meßkurve und damit auf die abgegebene Wärme. Die Kontrollmessung, eine Zugabe von GTP zu Cdc25 und GAP, zeigt keine Reaktion. Eine genauere Untersuchung der Teilreaktionen bei der GTPase des Ras-Proteins ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht erfolgt.

Trägt man die gemessene Wärme bei der GTP-Hydrolyse des Ras-Proteins gegen die zutitrierte Konzentration von GTP auf (Inset in Abbildung 11), so ergibt sich, wie bei der Betrachtung der GTP-Hydrolyse von Transducin, eine lineare Funktion, die durch den Ursprung geht. Daraus folgt, daß in beiden Systemen die abgegebene Wärme nur durch GTP-induzierte Reaktionen erzeugt wird.

In einem Zyklus, der GTP verbraucht, müssen sich die aufgenommenen und abgegebenen Protonen der Teilreaktionen dahingehend ausgleichen, daß in der Bilanz ein Proton übrig bleibt, welches bei der Hydrolyse des GTP frei wird. Dies gilt auch für die GTPase des Ras-Proteins.

Die Meßergebnisse für die Enthalpieänderungen durch Hydrolyse von GTP durch Transducin und Ras-Protein sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Die Werte für H_obs und H_p ergeben sich jeweils als Mittelwert und Standardabweichung aus n Messungen zu je 10 Injektionen bei 20 °C. Als Fehler für H_ges wurde der wahrscheinlichste Fehler angenommen.

Die gute Übereinstimmung der Enthalpieänderungen in den beiden Systemen kann als Beweis dafür betrachtet werden, daß bei Durchlaufen des Zyklus der Unterschied zwischen dem Ausgangs- und Endzustand des jeweiligen Systems nur darin besteht, daß GTP verbraucht wurde.

40

Abbildung 3-4: Vergleich der GTPase von Transducin und Ras-Protein
a. Die obere Spur zeigt eine Messung im visuellen System. Dabei wurden zu 1µM Rhodopsin und 1 µM Transducin 1.8 µM GTP, 3.5 µM GTP und 5.6 µM GTP gegeben. Mit zunehmender GTP-Konzentration zeichnet sich die ‘Plateauphase’ der Wärmeabgabe deutlicher ab.
b. Die untere Spur zeigt die Messung der GTPase des Ras-Proteins. In der Meßzelle wurden 2.8 µM RasGDP, 3 µM GAP und 2.8 µM Cdc25 in Tris-Puffer vorgegeben. Die zu titrierte GTP-Konzentration betrug 1.8 µM (Inj. 1 und 4), 3.5 µM (Inj. 2 und 5) und 5.6 µM (Inj. 3 und 6). Die längere Reaktionsdauer bei der wiederholten Injektion ist bedingt durch die Anhäufung von GDP in der Probenzelle. Eine Veränderung des Verlaufs der Wärmeabgabe durch die Variation der GTP-Konzentration ist nicht zu erkennen. Auch die Unterscheidung verschiedener Phasen der Reaktion ist nicht möglich.
Die Messungen wurden bei 20 °C durchgeführt. In dem kleinen Schaubild ist die abgegebene Wärme in Abhängigkeit von der zutitrierten GTP-Konzentration aufgetragen. Die Ursprungsgerade zeigt, daß die Wärme nur durch GTP-induzierte Reaktionen hervorgerufen wird

Tabelle 6: Vergleich von H der GTPase von Transducin und Ras-Protein bei 20 °C

Betrachtete Reaktion	Hobs in kcal /Mol GTP	Hp in kcal/Mol H+	Hges in kcal/Mol GTP
GTPase des G-Protein-Zyklus	- 15.1 ± 0.5 n = 3	-10.5 ± 0.5 n = 2	-4.6 ± 0.7
GTPase des Ras-Proteins	- 14.7 ± 2.8 n = 3	-10.2 ± 0.8 n =2	-4.5 ± 2.9

41

3.4. Variation der GTP-Konzentration

In einem ersten Schritt zur Untersuchung und Interpretation der einzelnen Phasen des Zyklus wurde die zum R*G-Komplex titrierte GTP-Menge variiert. Betrachtet man den G-Protein-Zyklus aus Sicht der Enzymkinetik (Enzym: Transducin, Substrat: GTP, Rhodopsin ist der ‘essential activator’), so entspricht dies einer Variation des Substrates. Die Zugabe steigender GTP-Mengen bei gleichbleibender Konzentration von Transducin bewirkt eine Verlängerung der Gesamtreaktionszeit, da der Zyklus häufiger durchlaufen werden muß, um das zugegebene GTP zu hydrolysieren.

Die Variation des Substrates wurde zunächst mittels Titrationskalorimetrie untersucht, um den Einfluß auf die Enthalpieänderung festzustellen. Im Anschluß wurde das gleiche Experiment zur Kontrolle im Fluoreszenzspektrometer durchgeführt.

1. Kalorimetermessungen

Abbildung 12 A zeigt den Einfluß verschiedener GTP-Konzentrationen auf das Wärmesignal. Zu 1 µM Transducin und 10 µM Rhodopsin wurden 4 verschiedene Injektionen von GTP gegeben (GTP-Endkonzentration in der Meßzelle: 3.5 µM, 2.5 µM, 1 µM und 8.5 µM). Die Fläche unter dem Signal nimmt mit steigender GTP-Konzentration zu. Die einzelnen Phasen des Wärmesignals bilden sich in Abhängigkeit des G_t-GTP-Verhältnisses unterschiedlich ab. Im Falle des ‘single turns’, wenn G_t und GTP in gleicher Konzentration vorliegen, wird bereits bei einem Umlauf des Zyklus die gesamte GTP-Menge hydrolysiert. Die Unterscheidung verschiedener Teilschritte des Signals ist nicht möglich. Im ‘multi turn’, wenn GTP gegenüber Transducin im Überschuß vorliegt, treten die einzelnen Phasen deutlicher hervor. Insbesondere die zweite Phase ist umso ausgeprägter, je öfter das System den Zyklus durchlaufen muß. Sie wird dem ‘Steady-State’-Zustand des Zyklus zugeordnet. Während der Steady-State-Phase halten sich Bildung und Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes die Waage (hier entspricht das aktive G-Protein, G_GTP dem Enzym-Substrat-Komplex). Der Steady-State-Zustand ist nur für eine begrenzte Zeit stabil. Die Wärme, die während dieser Phase frei wird, entspricht der Summe der Wärmen aller Reaktionen, die zu dem betrachteten Zeitpunkt ablaufen.

In der ersten Phase des Wärmesignals einer Injektion beobachtet man einen exothermen Peak, welcher der Dissoziation des R*G-Komplexes zugeordnet wird. Diese Teilreaktion wird in einem späteren Kapitel genauer besprochen. Hier soll nur angemerkt werden, daß das Fehlen dieses Peaks bei der 4. Injektion von Abb. 12 A mit dem zeitlichen Zerfall des aktiven Rhodopsins zusammenhängt.

In Abb. 12 B ist die freigewordene Wärme gegen die pro Injektion hinzutitrierte Konzentration von GTP aufgetragen. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen der eingespritzten GTP-Menge und der freigewordenen Wärme. Die berechnete Regressionsgerade geht durch

den Ursprung, was darauf hindeutet, daß die Wärmeproduktion sich ausschließlich auf Reaktionen zurückführen läßt, die durch GTP induziert werden.

42

Abbildung 3-5: Variation der GTP-Konzentration
A Titration verschiedener Volumina einer 1 mM GTP-Lösung zum R*G-Komplex (1 µM Gt, 10 µM Rhodopsin in WM): 3.5 µM GTP (Endkonzentration), 2.5 µM, 1 µM und 8.5 µM. Sowohl die Fläche unter der Meßkurve, als auch der Verlauf des Wärmesignals verän- dern sich mit der zugegebenen GTP-Menge. Mit zunehmender Konzentration wird mehr Wärme abgegeben und die zweite Phase der Injektion tritt deutlicher hervor. Die Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
B Das Schaubild zeigt die Abhängigkeit der freigewordenen Wärme bei Zugabe von GTP zum R*G-Komplex von der pro Injektion hinzutitrierten Konzentration. Es ist ein linearer Zusammenhang zu erkennen, der sich durch eine Ursprungsgerade beschreiben läßt.

1. . Fluoreszenzmessungen

Durch die Änderung der intrinsischen Fluoreszenzintensität des Transducins beim Übergang in den aktiven Zustand erlaubt die Fluoreszenzmessung, den aktiven Zustand von G_t zeitabhängig zu beobachten. In vergleichenden Messungen von Kalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie wird die Kenntnis der Dauer des aktiven Zustandes des G-Proteins ausgenutzt, um die kalorimetrischen Daten zu interpretieren. Hierzu werden identische Proben verwendet.

Durch Zugabe von GTPgS im Überschuß werden zum Schluß der Messung sämtliche G-Proteine irreversibel aktiviert, was zu einer maximalen Fluoreszenzintesität führt. Die angegebenen Werte der relativen Fluoreszenzänderung beziehen sich auf diesen Wert.

43

Abbildung 13 zeigt die Messung der Fluoreszenzänderung in Abhängigkeit von unterschiedlichen zutitrierten GTP-Mengen. Zu 1 µM Transducin und 1 µM lichtaktiviertem Rhodopsin wurden nacheinander 3.5 µM GTP, 1 µM GTP, 0.6 µM GTP und 3.5 µM GTPgS zugegeben. Die Zeitpunkte der Nukleotidzugabe sind jeweils durch Pfeile markiert.

Abbildung 3-6: Messung der Fluoreszenzänderung in Abhängigkeit der GTP-Konzentration
Zu 1 µM Rhodopsin und 1 µM G_t wurden 3.5 µM GTP, 1 µM GTP , 0.6 µM GTP und 3.5 µM GTPS gegeben. Der steile Anstieg der Fluoreszenzintensität entspricht der Aktivierung von Transducin, die anschließende Phase konstanter Fluoreszenzintensität dem aktiven Zustand des G-Proteins. Die Dauer dieser Phase irung mit der einsetzenden Hydrolyse wird bei einem G_t zu GTP Verhältnis von 1:1 oder einem Überschuß an Tst abhängig von dem Verhältnis von G_t zu GTP in der Probe. Das Abklingen des Fluoreszenzsignals ist der Deaktivierung von Transducin durch die Hydrolyse des GTP zu GDP zuzuordnen. Durch die Überlagerung der Aktivieransducin das maximale Aktivierungsniveau nicht erreicht. Durch Zugabe von GTPS zur Fluoreszenzprobe werden alle Transducinmoleküle in den aktiven Zustand versetzt und man erhält die maximal mögliche Fluoreszenzintensität der Probe. Das Experiment wurde bei 10 °C in BTP-Puffer durchgeführt

Nach Zugabe von GTP zum R*G-Komplex, erfolgt ein steiler Anstieg der Fluoreszenzintensität, welcher der Aktivierung von Transducin entspricht. Es schließt sich eine Phase konstanter Fluoreszenzintensität an, deren Dauer von der GTP-Konzentration abhängt und die den aktiven Zustand von G_t widerspiegelt. Das Abklingen des Fluoreszenzsignals stellt die Deaktivierung von Transducin durch Hydrolyse des zugegebenen GTP zu GDP dar.

44

Verschiedene Konzentrationen von GTP zeigen unterschiedliche Signalverläufe. Liegt GTP gegenüber Transducin im Überschuß vor (1. Injektion), so ist die Plateauphase sehr ausgeprägt. Dies entspricht dem mehrfachen Durchlaufen des G-Protein-Zyklus (multi turn), bis das gesamte vorliegende GTP hydrolysiert ist. Unter Single-Turn-Bedingungen (2. Injektion) wird das maximale Aktivierungsniveau nicht erreicht. Dies liegt daran, daß die einsetzende Hydrolyse die Aktivierung überlagert. Ist in der Probe weniger GTP als Transducin vorhanden (3. Injektion), so bleibt ein Teil des G-Proteins inaktiv und die Amplitude des Signals erreicht nicht das Niveau der vollständigen Aktivierung. Durch Zugabe des nicht hydrolysierbaren GTPgS wird Transducin in seinem aktiven Zustand blockiert und das Fluoreszenzniveau bleibt konstant.

Die Beobachtungen der Fluoreszenzmessung stehen im Einklang mit der Betrachtung des Wärmesignals in Abhängigkeit von der GTP-Konzentration. Ein Überschuß von GTP führt zum mehrfachen Durchlaufen des Zyklus, was sich bei beiden Meßsignalen in einer Verlängerung der Plateauphase (des Steady-State-Zustandes) niederschlägt. Die Fluoreszenzmessungen sind damit ein weiterer Beweis der Zuordnung der Plateauphase des Wärmesignals zum Steady-State-Zustand des G-Protein-Zyklus.

Anhäufung von GDP

Aus der Literatur (Kahlert et al., 1990 [ 40 ]; Bruckert et al., 1992 [ 10 ]) ist bekannt, daß Transducin im GDP-bindenden Zustand, der Übergangszustand des R*G-Komplexes mit gebundenem GDP (R*G_GDP) und der nukleotidfreie R*G_empty-Komplex jeweils in einem GDP-abhängigen Gleichgewicht zu einander stehen:

In Anwesenheit hoher GDP-Konzentrationen verschiebt sich das Gleichgewicht zur Seite des dissoziierten Komplexes. Bei der Untersuchung der GTP-Abhängigkeit des G-Protein-Zyklus, muß daher auch die Auswirkung von GDP betrachtet werden, das sich im Laufe der Messung anhäuft. Um zu untersuchen, ob die zunehmende GDP-Konzentration das Wärmesignal oder das Fluoreszenzsignal einer GTP-Injektion beeinflußt, wurde neben dem R*G-Komplex 20 µM GDP in der Probe vorgelegt. (Diese Messungen sind nicht abgebildet.)

Sowohl in der Fluoreszenzmessung als auch im Wärmesignal ist kein Unterschied gegenüber einer Messung ohne GDP-Vorgabe zu erkennen. Der Einfluß von GDP auf die Komplexbildung muß folglich im Rahmen der verwendeten GTP- bzw. GDP-Konzentrationen in diesen Messungen nicht berücksichtigt werden.

45

3.4.1. Doppelinjektionsprotokoll

Aus Messungen der Enthalpie- und Fluoreszenzänderung des G-Protein-Zyklus in Abhängigkeit der GTP-Konzentration wurde die zweite Phase des Wärmesignals einer Injektion dem Steady-State-Zustand des Zyklus zugeordnet. Um weitere Informationen über den Momentanzustand des Zyklus zu bekommen, wurde während des Durchlaufens der Hydrolyse eine weitere GTP-Injektion zugegeben. Durch die zusätzliche GTP-Menge wird der Zustand des Systems zum Zeitpunkt des Einspritzens geprüft, indem die möglichen Teilreaktionen ausgelöst werden.

Zusätzliche GTP-Injektion in der Steady-State-Phase des Wärmesignals

Gibt man die zweite GTP-Injektion während der Steady-State-Phase des Wärmesignals zur Probe, so wird dadurch die zu hydrolysierende GTP-Menge in der Meßzelle erhöht. Dies hat keinen Einfluß auf die Komplexbildung oder -dissoziation, da nahezu alle Transducinmoleküle aktiviert sind und das System sich im Steady-State-Zustand befindet. Aufgrund der erhöhten GTP-Konzentration in der Probe muß der Zyklus jedoch häufiger durchlaufen werden. Die Gesamtdauer der Wärmeabgabe verlängert sich dadurch um einen Faktor, welcher der zusätzlichen GTP-Menge proportional ist. Eine Messung, die nach dem beschriebenen Protokoll durchgeführt wurde, ist in Abbildung 14 gezeigt.

Die obere Spur der Abbildung zeigt eine Injektion, bei der 3.5 µM GTP zu dem vorgegebenen Komplex aus 1 µM Transducin und 1 µM Rhodopsin titriert wurden. Die untere Spur zeigt die unmittelbar darauf folgende GTP-Injektion, bei der während der zweiten Phase des Wärmesignals noch einmal 3.5 µM GTP zugegeben wurden. Diese zusätzliche Injektion ruft einen sehr kleinen Peak hervor und bewirkt eine geringfügig höhere Wärmeabgabe in der darauffolgenden Plateauphase. Dieser kleine Peak ist auf den Einspritzartefakt zurückzuführen, der sich zur Wärmeproduktion der ersten Injektion addiert. Die Veränderung des Steady-State-Niveaus erklärt sich aus der erhöhten GTP-Konzentration. Das momentane Wärmesignal gibt an, wieviel Wärme pro Sekunde zu dem betrachteten Zeitpunkt frei wird. Da die Gesamt-Reaktionsrate (‘Overall’-Rate) des Zyklus durch die zusätzliche Injektion von GTP nur wenig beeinflußt wird, so wird eine höhere Wärmeabgabe dadurch erreicht, daß mehr Moleküle an dieser Wärme beteiligt sind. Damit gibt die Lage des Plateaus an, wieviele Moleküle sich im Steady-State-Zustand befinden. Bei zusätzlicher GTP-Zugabe muß folglich ein ‘exothermeres’ Niveau erreicht werden.

Wertet man die Fläche unter dem Signal der Doppelinjektion aus, so ergibt sich für die zweifache GTP-Menge die doppelte Wärmemenge. Dies entspricht der in Abbildung 12 B gezeigten linearen Abhängigkeit von abgegebener Wärme zu eingespritzter GTP-Konzentration.

Führt man das gleiche Experiment in der Fluoreszenzspektroskopie durch, so ist die Plateauphase des Signals, die dem aktiven Zustand des G-Proteins entspricht, im gleichen Maße verlängert, wie die GTP-Menge erhöht wurde. Auch hier ist aufgrund der GTP-Zugabe während

46

des Steady-State-Zustandes kein Einfluß auf die Aktivierung oder Deaktivierung von Transducin zu erkennen.

Abbildung 3-7: Vergleich von einmaliger und doppelter GTP-Zugabe
Die obere Kurve zeigt den typischen Verlauf des Wärmesignals bei Titration von GTP zum R*G-Komplex, während in der unteren Spur eine Doppelinjektion abgebildet ist. Hierbei wurde in der zweiten Phase des Wärmesignals eine weitere Injektion derselben Konzentration zugesetzt (3.5 µM GTP). In der Meßzelle wurde belichtetes Rhodopsin (10 µM) und Transducin (1 µM) vorgegeben. Die dargestellten Injektionen sind unmittelbar aufeinanderfolgende Titrationen zu derselben Probe. Bei der Doppelinjektion beobachtet man außerdem kleinen Peak (Einspritzartefakt) eine Absenkung des Niveaus und eine verlängerte Dauer der Wärmeabgabe. Die Fläche unter der Doppelkurve entspricht dem Doppelten der Fläche einer Einzelinjektion.#BRDie Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.

Zusätzliche GTP-Injektion in der Schlußphase des Wärmesignals

Um den momentanen Zustand des G-Protein-Zyklus in der dritten Phase des Wärmesignals zu überprüfen, wurde in einem weiteren Experiment die zweite GTP-Injektion während des Abklingens des Wärmesignals zugegeben. In dieser Phase ist ein Teil des G-Proteins bereits wieder in den inaktiven G_GDP-Zustand zurückgekehrt und hat mit belichtetem Rhodopsin den R*G-Komplex gebildet. Durch die erneute Zugabe von GTP kann der komplexgebundene Anteil von Transducin aktiviert und so der Zyklus wieder in den Steady-State-Zustand versetzt werden. Zum Zeitpunkt der zweiten Injektion liegt nur ein Teil des G_t in komplexgebundener Form vor. Daher muß die Komplexdissoziation, die dem exothermen Peak des Wärmesignals zugeordnet ist (siehe hierzu Kapitel 4.2) im Wärmesignal der zweiten Injektion eine kleinere Wärme bewir-

47

ken, als bei der ersten Injektion. Das Steady-State-Niveau der zweiten Injektion entspricht dem der ersten Injektion. In Abbildung 15 ist das beschriebene Experiment als Wärmesignal im Vergleich zu einem Fluoreszenzsignal dargestellt.

Abbildung 3-8: Vergleich von Wärmesignal und Fluoreszenzsignal einer Doppelinjektion von GTP
Das Wärmesignal und das Fluoreszenzsignal wurden unter exakt gleichen Bedingungen an identischen Proben aufgenommen. Pro Injektion wurde je 3.5 µM GTP zu einer Probe aus 10 µM Rhodopsin und 1µM Transducin gegeben. Beide Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.
a. Die obere Spur zeigt das Wärmesignal eines Experimentes, bei dem in der Schlußphase der Reaktion eine zusätzliche GTP-Injektion gegeben wurde (der Zeitpunkt der Zugabe ist durch einen Pfeil markiert). Der exotherme Peak des Signals ist bei der zweiten Injektion kleiner als bei der ersten. Das Niveau der Steady-State-Phase ist gleich.
b. Die untere Spur zeigt das gleiche Experiment, das zum Vergleich in der Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt wurde. Die erneute GTP-Zugabe in der abfallenden Phase des Signals bewirkt die Rückkehr des Systems in den Steady-State-Zustand.
Betrachtet man die zeitliche Dauer der Reaktionen, so ist in beiden Messungen der zweite Teil des Signals, nach der wiederholten Zugabe von GTP etwas länger, entsprechend dem Anteil von GTP aus der ersten Zugabe, der zum Zeitpunkt der Wiederholung noch nicht aufgearbeitet ist. Die Gesamtdauer der Signale ist in beiden Messungen gleich.

Spur a zeigt das Doppelinjektionsprotokoll für eine Messung des Titrationskalorimeters, in Spur b ist das beschriebene Protokoll in einer Fluoreszenzmessung angewendet worden. In beiden Messungen wurden Aliquots derselben Probe aus 10 µM Rhodopsin in WM und 1 µM G_t vor-

48

gelegt, die Messungen wurden gleichzeitig durchgeführt. Zugegeben wurden Injektionen, die einer Endkonzentration von 3.5 µM GTP entsprechen. Die Kalorimetermessung zeigt bei der zweiten Injektion einen kleineren exothermen Peak, entsprechend einer niedrigeren Komplexkonzentration als zum Zeitpunkt der ersten Injektion. Die Plateauphase verläuft bei beiden Injektionen auf dem gleichen Niveau. Hierbei ist die Dauer des Wärmesignals der zweiten Injektion in dem Maße verlängert, wie noch GTP zum Zeitpunkt der Zugabe der zweiten Injektion vorhanden ist. Wie auch bei dem vorangehenden Experiment, wird durch die zusätzliche GTP-Injektion die pro Mol GTP freiwerdende Wärme nicht beeinflußt.

Durch Vergleich des Wärmesignals mit der Fluoreszenzmessung erhält man Aufschluß darüber, welcher Prozentsatz von Transducin zu dem betrachteten Zeitpunkt noch aktiv ist. Wie bereits erläutert, entspricht das Signal der Fluoreszenzänderung der Menge an aktivem G-Protein. Das Plateau des Fluoreszenzsignals entspricht der vollständigen Aktivierung des vorhandenen Transducins. Zum Zeitpunkt der zweiten Injektion ist bereits ein Teil des G-Proteins inaktiv, erkennbar an dem Abfall des Signals. Durch die zweite GTP-Injektion wird erneut der ganze G-Protein-Vorrat in den aktiven Zustand versetzt. Dies ist an dem Plateau erkennbar. Die Bedeutung der Fluoreszenzmessung für den Vergleich zum Wärmesignal liegt darin, daß aus der Fluoreszenzmessung der Anteil an aktivem G_t zum Zeitpunkt der Zugabe der zweiten Injektion bestimmt werden kann.

Bei der betrachteten Messung sind zum Zeitpunkt der zweiten Injektion 60 % des G-Proteins noch im aktiven Zustand. 40 % des Transducins sind bereits in den inaktiven Zustand übergegangen. Der geringere Anteil an Transducin erklärt den gegenüber der ersten Injektion kleineren exothermen Peak der zweiten Injektion des Wärmesignals.

Eine Unterteilung der freigewordenen Wärme des Gesamtzyklus auf einzelne Teilreaktionen ist hierdurch jedoch nicht möglich, da mehrere Reaktionen überlagert sind. Durch den Vergleich zur Fluoreszenz gelingt es nicht, eine Phase des Zyklus isoliert zu betrachten.

3.5. Variation der G-Protein-Konzentration

In dem vorangehenden Kapitel wurde die Änderung des Verhältnisses von Transducin zu GTP durch Variation der GTP-Konzentration untersucht (Variation des Substrates). Hier soll nun der Einfluß der Veränderung der Transducin-Konzentration auf die Enthalpieänderung des G-Protein-Zyklus bei konstanter GTP-Konzentration betrachtet werden (Variation des Enzyms).

Abbildung 16 zeigt drei Messungen mit verschiedenen G_t--Konzentrationen. Zu einer Vorgabe von jeweils 1 µM belichtetem Rhodopsin und unterschiedlichen Konzentrationen von Transducin wurden Injektionen zu je 3 µM GTP gegeben. Die oberste Spur (a) wurde mit einem G_t zu GTP Verhältnis von 2:3 aufgenommen (2 µM G_t, 3 µM GTP), in Spur (b) betrug das Verhältnis

49

1:3 und in Spur (c) 1:6. Der Fall höchster Transducinkonzentration unterscheidet sich im Verlauf des Wärmesignals deutlich von den anderen Messungen. Im Gegensatz zu niedrigeren Konzentrationen ist hier eine Einteilung in verschiedene Phasen der Reaktion nicht möglich. Ferner ist die Gesamtdauer der Reaktion bei Vorgabe von 2 µM Transducin kürzer als bei den Messungen mit geringeren G_t-Konzentrationen. Mit zunehmendem GTP-Überschuß bildet sich die Plateauphase der Injektionen deutlicher aus. Dies ist konsistent mit der Zuordnung dieser Phase zum Steady-State-Zustand des Zyklus. Je weniger G-Protein vorhanden ist, desto öfter muß der Zyklus durchlaufen werden um die vorhandene GTP-Menge zu GDP zu hydrolysieren.

Abbildung 3-9: Variation der Transducinkonzentration
Zu einer Probe aus 1 µM R* und Transducin wurde GTP entsprechend einer Endkonzentration von 3 µM pro Injektion zugegeben. Die Gt-Konzentration wurde variiert: 2 µM (a), 1 µM (b) und 0.5 µM (c). Mit zunehmendem GTP-Überschuß bildet sich die Plateaupha se, die dem Steady-State-Zustand des Zyklus zugeordnet wird, deutlicher ab. Ferner ist eine Abhängigkeit des ersten Peaks des Wärmesignals von der Gt-Konzentration erkennbar; bei höheren Konzentrationen ist diese erste Phase stärker exotherm. (Die kleine Spitze, die auf der Flanke dieses Peaks sitzt ist dem Artefakt durch Einspritzen zuzuordnen.) Auch das Niveau der Steady-State-Phase verändert sich bei Variation der Transducinkonzentration, die Wärmeabgabe pro Zeiteinheit sinkt während dieser Phase mit abnehmender Gt-Konzentration.
Die Messungen wurden bei 10 °C in BTP-Puffer (pH 7.5) durchgeführt.

50

Das Niveau der Plateauphase ist abhängig von der Transducinkonzentration. Wie bereits erläutert, gibt die Lage der Plateauphase an, wieviele G_t-Moleküle sich im Steady-State-Zustand befinden. Diese Menge ist bei einem Überschuß an GTP limitiert durch die Menge an vorhandenem G_t. Folglich ist die Wärmeabgabe pro Zeiteinheit während des Steady-State-Zustandes bei niedrigerer Transducinkonzentration geringer.

Weiterhin ist zu beobachten, daß die erste Phase des Wärmesignals, der exotherme Peak, auch von der Konzentration des G-Proteins abhängt. Mit abnehmender Konzentration wird der Peak kleiner. Die einzelnen Flächen des Wärmesignals der verschiedenen Meßkurven sind gleich groß. Dies zeigt, daß die Wärmeproduktion des betrachteten Zyklus von der Transducinkonzentration unabhängig ist und ist somit ein weiterer Beweis dafür, daß die gemessene Wärme nur von der zugegebenen GTP-Menge abhängt.

3.6. Temperaturabhängigkeit der Enthalpieänderung des

G-Protein-Zyklus.

Um festzustellen, ob die Wärmeproduktion des G-Protein-Zyklus einer Temperaturabhängigkeit unterliegt, wurde die Zugabe von GTP zum R*G-Komplex bei verschiedenen Arbeitstemperaturen des Kalorimeters gemessen. Hierbei wurden GTP-Injektionen von je 3 µM zu 1 µM R* und 1 µM Transducin gegeben. Die Messungen wurden bei 4 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C und 25 °C durchgeführt. In Abbildung 17 sind die Ergebnisse für die Messungen bei 4 °C, 15 °C und 25 °C dargestellt. Messungen bei höheren Temperaturen konnten aufgrund der abnehmenden Stabilität der Proteine nicht durchgeführt werden.

Betrachtet man die Form der einzelnen Signale, so ist eine deutliche Veränderung des zeitlichen Verlaufs der Wärmeabgabe in Abhängigkeit von der Temperatur zu erkennen. Mit zunehmender Temperatur verkürzt sich die Gesamtdauer der Wärmeabgabe des Zyklus, und die einzelnen Phasen treten weniger stark hervor. Für die Messung bei 4 °C ist der erste exotherme Peak sehr deutlich ausgebildet. Ihm folgt eine ca. 15 minütige Phase geringer, konstanter Wärmeabgabe. Mit steigender Temperatur ist der exotherme Peak weniger ausgeprägt und die zweite Phase der Injektion verkürzt. Jedoch verlaufen die Injektionen bei höheren Temperaturen auf einem stärker exothermen Niveau. Die von der Meßkurve eingeschlossene Fläche und damit die insgesamt freiwerdende Wärme bleibt dabei unverändert. Dies zeigt, daß die Enthalpieänderung der GTP-Hydrolyse nicht temperaturabhängig ist.

Die kürzere Gesamtdauer des Zyklus bei höheren Temperaturen ist bedingt durch eine temperaturabhängige Veränderung der Reaktionsraten. Dies erlaubt eine Verknüpfung des Wärmesignals mit der Kinetik der Reaktion. Das Niveau größerer Wärmeabgabe, auf dem die Hydrolysereaktion bei höheren Temperaturen abläuft, kann als Maß für die ‘Overall’-Reaktionsrate an-

51

gesehen werden. Je höher die momentane Wärmeabgabe, desto schneller läuft die Reaktion ab, d.h. desto höher ist die Reaktionsrate.

Abbildung 3-10: Untersuchung der Temperaturabhängigkeit des G-Protein-Zyklus
Injektionen zu je 3 µM GTP wurden zu 1µM R* und 1 µM Transducin titriert. Hierbei wurden verschiedene Messungen in BTP-Puffer bei pH 7.5 in Abhängigkeit von der Arbeitstemperatur des Kalorimeters durchgeführt (4 °C, 15 °C und 25 °C).
Während die freiwerdende Wärme unabhängig von der Temperatur ist, zeigen sich im Verlauf und der Dauer des Wärmesignals deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Messungen. Die erste Phase des Signals, der exotherme Peak ist für niedrigere Temperaturen deutlicher ausgeprägter. Die zweite Phase und auch die Dauer der Gesamtreaktion wird mit steigender Temperatur kürzer, jedoch verläuft die Reaktion auf einem Niveau höherer Wärmeabgabe.

52

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.