1

Kapitel 1. Einleitung

Als Antwort auf eine Reihe von Störfaktoren reagieren Zellen mit der Umstellung ihres Stoffwechsels von der Synthese der Haushaltsproteine zur verstärkten Synthese von sogenannten Streßproteinen. Die ersten dieser Proteine wurden aufgrund ihrer spezifischen Expression nach Hitzeschock entdeckt und wurden deshalb Hitzeschockproteine (heat shock proteins, HSPs) genannt (Tissieres et al., 1974). Die Induktion der HSPs konnte in allen bisher untersuchten Organismen nachgewiesen werden, was für die universelle Bedeutung dieser Proteine bei der Reaktion von Zellen auf Streß spricht. Zu den Faktoren, die die Synthese von HSPs auslösen können, zählen neben dem Hitzeschock auch chemische Substanzen wie z.B. Arsenit, Ethanol oder Schwermetalle, physikalische Reize wie Druck und UV-Licht oder physiologischer Streß, wie er etwa bei Erkrankungen des Organismus durch Infektionen, Anoxie oder Ischämie verursacht wird (Hightower, 1991). Die Einteilung der Hitzeschockproteine erfolgt im allgemeinen nach ihren in der SDS-Elektrophorese ermittelten Molekulargewichten, und man unterteilt sie demnach in die Proteine der HSP110-, HSP90-, HSP70-, HSP60-, HSP40, HSP20- und HSP8.5-Familien, deren Mitglieder in den meisten Fällen im Laufe der Evolution stark konserviert blieben. Die Proteine der HSP20-Familie werden auch kleine Hitzeschockproteine genannt.

Ein Beleg für die Bedeutung der HSPs für den Zellstoffwechsel unter suboptimalen Bedingungen ist das Phänomen der erworbenen Thermotoleranz. Darunter versteht man die Fähigkeit von Zellen, durch die temporäre Synthese von HSPs nach einem milden Hitzeschock (bei etwa 5°C über der Normaltemperatur) einen nachfolgenden stärkeren und normalerweise tödlichen Hitzeschock (bei etwa 10°C über der Normaltemperatur) zu überleben. Die Bedeutung der HSPs für die Thermotoleranz bestätigen Transfektionsexperimente. So wurden z.B. Hamster- und Maus-Zellen, die nach einer Transfektion HSP25 überexprimierten, resistent gegen einen sonst letalen Hitzeschock (Landry et al., 1989). Ähnliches wurde für die HSPs mit 70 kDa und 104 kDa Molekulargewicht nachgewiesen (Li et al., 1991; Sanchez und Lindquist, 1990; Sanchez et al., 1992). Umgekehrt führte die kompetitive Hemmung der HSP70-Genaktivierung oder die Mikroinjektion von anti-HSP70-Antikörpern zu einer erhöhten Thermosensitivität bei Fibroblasten-Zellen (Johnston und Kucey, 1988; Riabowol et al., 1988).

Was passiert auf zellulärer Ebene bei Streß und wodurch kommt es zu dem protektiven Effekt der Hitzeschockproteine? Unter Streßbedingungen, z.B. bei einem Hitzeschock, kommt es zu einer verstärkten Ansammlung von denaturierten, also falsch gefalteten und inaktiven Proteinen (Hightower, 1980). Werden sehr viele der zelleigenen Proteine in dieser Weise geschädigt, kann die Zelle lebenswichtige Stoffwechselleistungen nicht mehr erbringen. Die Folgen sind irreparable Schäden, die letztendlich zum Absterben der Zelle führen. Daß es derartige Probleme bei der Faltung von Proteinen in vivo tatsächlich gibt, wurde mit der Entwicklung der Überexpressions-Technik deutlich, denn viele Proteine, die in einem prokaryontischem Gast-Organismus überexprimiert wurden, enden als große, unlösliche

2

Umfangreiche Untersuchungen der letzten Jahrzehnte belegen, daß HSPs nicht nur unter Streßbedingungen, sondern auch im normalen Zellstoffwechsel eine wichtige Rolle spielen (zusammenfassende Darstellungen finden sich bei Morimoto et al., 1994, und Hightower und Nover, 1991). Sie unterstützen z.B. die korrekte Faltung neu synthetisierter Proteine oder wirken an der Translokation von Proteinen zwischen verschiedenen Zellkompartimenten mit. Dazu binden sie an naszierende oder partiell entfaltete Proteine, verhindern deren Aggregation und Inaktivierung und unterstützen die korrekte Faltung bzw. Rückfaltung. Proteine, die dies leisten können, werden nach dem von Laskey et al. (1978) geprägten Begriff `molekulare Chaperone´ genannt (Ellis, 1990). Heute ist anerkannt, daß die Faltung in vivo generell begleitet wird von der Aktivität dieser `Faltungs-Helfer-Proteine´, die vorwiegend zur Klasse der Hitzeschockproteine gehören (Georgopoulos und Welch, 1993; Hendrick und Hartl, 1993). Die meisten der bisher identifizierten Proteine stammen aus der HSP60-, HSP70- oder HSP90-Familie. Eine Zusammenfassung der Funktionen der wichtigsten Chaperone bei der Proteinfaltung in der Zelle findet sich bei Gething und Sambrook (1992). Weitere inzwischen bekannte Funktionen von HSPs sind z.B. die Beteiligung am Proteinabbau, die durch das Ubiquitin (HSP8.5-Familie) vermittelt wird oder die spezifische Anbindung an Steroid-Hormon-Rezeptoren durch die Proteine der HSP90-Familie, die damit regulierende Aufgaben bei der Signaltransduktion übernehmen.

Chaperoneigenschaften wurden auch für die weit weniger gut untersuchten kleinen Hitzeschockproteine (kHSPs) beschrieben (Horwitz, 1992; Jakob et al., 1993). Sie bilden unter den Streßproteinen die Familie mit der strukturell größten Variabilität. So erstrecken sich ihre molekularen Massen von 16 kDa bei Bakterien bis zu 43 kDa bei Hefe (Ingolia und Craig, 1982; Caspers et al., 1995; Wotton et al., 1996) und in unterschiedlichen Organismen finden sich unterschiedlich viele Repräsentanten dieser Gruppe, von meist zweien bei Säugern bis zu über 30 in höheren Pflanzen (Vierling, 1991; Waters et al., 1996). Die N- und C-Termini der kHSPs variieren stark in ihrer Länge und Aminosäurezusammensetzung und sind damit hauptverantwortlich für die Vielfalt innerhalb dieser Gruppe. Sie flankieren eine evolutionär stark konservierte Region, die -Crystallin-Domäne, die ein gemeinsames Merkmal aller kleinen HSPs ist, und manchmal auch als Duplikat innerhalb eines Proteins vorliegt (Nene et al., 1986; de Jong et al., 1988). Namensgebend für diese Domäne ist das -Crystallin, ein Protein, das zusammen mit anderen Crystallinen ca. 90 % der Masse der löslichen Proteine der Augenlinse ausmacht und dort durch die Ausbildung hochgeordneter Proteinaggregate für die Stabilität und die lichtbrechenden Eigenschaften der Linse

3

Die Homologie zwischen den verschiedenen kHSPs beruht vor allem auf starken Ähnlichkeiten in der C-terminalen Hälfte der Proteine, die sich aus der ca. 100 Aminosäure langen -Crystallin-Domäne und einem kurzen, flexiblen C-terminalen Teil zusammensetzt. Die Funktion der konservierten -Crystallin-Domäne ist bisher nicht geklärt. Beteiligungen sowohl an der Chaperoneigenschaft (Takemoto et al., 1993; Mehlen et al., 1993) als auch an der Ausbildung der oligomeren Komplexe (Wistow, 1985) werden diskutiert. Der C-terminale Teil ist NMR-Untersuchungen am -Crystallin zufolge relativ unstrukturiert (Carver et al., 1995). Er unterliegt zahlreichen Modifikationen (Groenen et al., 1994) und scheint in nativen Oligomeren nicht an intra- oder intermolekularen Wechselwirkungen beteiligt zu sein (Carver et al., 1990; Le Breton und Carver, 1996). Der N-terminale Teil der kHSPs ist sehr variabel mit überwiegend hydrophobem Charakter. Für das HSP16-2 aus C. elegans konnte gezeigt werden, daß dieser Bereich für die Assemblierung der Untereinheiten notwendig ist (Leroux et al., 1997).

Auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen erscheinen die supramolekularen Komplexe der kHSPs meist als 10-18 nm große globuläre (Siezen et al., 1978a; Behlke et al., 1991) oder torus-ähnliche Strukturen (Longoni et al., 1990b). Aus Circular-Dichroismus- (CD) und Fouriertransformations-Infrarot- (FTIR) Spektroskopie ist bekannt, daß die vorherrschenden Sekundärstrukturelemente der kHSPs -Faltblätter sind und -Helices nur einen Anteil von etwa 5-15% ausmachen (Siezen und Argos, 1983; Lamba et al., 1993; Surewicz und Olesen, 1995; Surewicz et al., 1993; Merck et al., 1993; Siezen und Bindels, 1982). Die experimentellen Daten lassen für die Quartärstruktur der kHSPs eine Reihe von Möglichkeiten zu. Für die supramolekularen Komplexe von -Crystallin wurden unter

4

Der oligomere Status der kHSPs wird in vivo und in vitro von einer Reihe von Faktoren wie pH, Ionenstärke oder Temperatur beeinflußt (Siezen et al., 1980). Die Größe der Komplexe von kHSPs steigt nach einem Hitzeschock in Säugerzellen (Arrigo et al., 1988), Hühnerembryo-Fibroblasten (Collier et al., 1988) oder kultivierten Tomatenzellen (Nover et al., 1989) stark an. Nach einem Hitzeschock und anderen Streßformen kommt es außerdem zu einer Relokalisation der kleinen Hitzeschockproteine aus dem Zytoplasma in oder an den Zellkern (Arrigo et al., 1988; Collier und Schlesinger, 1986). Eine Variation in der Größe der Komplexe wurde auch in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand beobachtet (Kato et al., 1994; Mehlen und Arrigo, 1994). Dies deutet auf die Möglichkeit einer Regulation der supramolekularen Struktur von kHSPs durch posttranslationale Modifikation hin.

Die bei den kleinen HSPs am besten untersuchte Modifikation ist die Phosphorylierung. Sie wurde sowohl für das HSP25 der Ratte (Kim et al., 1984) als auch des Menschen (Arrigo und Welch, 1987) und der Maus (Benndorf et al., 1988a) sowie für B-Crystallin (Ito et al., 1997) beschrieben. Das HSP25 der Maus weist zwei Phosphorylierungsorte auf und liegt in EAT-Zellen in einer unphosphorylierten und mindestens zwei phosphorylierten Isoformen vor (Benndorf et al., 1988a). Das menschliche HSP25 besitzt zusätzlich einen dritten Phosphorylierungsort (Gaestel et al., 1991; Landry et al., 1992). Murines und humanes HSP25 weisen zwei Phosphorylierungsorte an homologen Stellen auf: Einen nahe des N-Terminus und einen N-terminal der -Crystallin-Domäne. Alle phosphorylierbaren Reste sind Serine und aus Sequenzvergleichen ergibt sich die Konsensussequenz RxxS als minimales Erkennungsmotiv für die verschiedenen Phosphorylierungsorte der kHSPs.

HSP25 wird nach Einwirkung verschiedener extrazellulärer Stimuli rasch phosphoryliert. Zu den Faktoren, die die Phosphorylierung von HSP25 induzieren können, gehören Phorbolester, ein Calcium-Ionophor (Kim et al., 1984; Welch, 1985), eine Reihe von mitogenen Signalen und Streßfaktoren (Arrigo und Landry, 1994 und darin zitierte Artikel), darunter auch oxidativer Streß (Mehlen et al., 1995b; Huot et al., 1996; Huot et al., 1997) und Streß durch Scherkräfte (Li et al., 1996). Demgegenüber sind Faktoren, die eine Phosphorylierung von B-Crystallin bewirken, noch größtenteils unbekannt (Voorter et al., 1989; Chiesa et al., 1987), doch oxidativer Streß scheint auch hier von Bedeutung zu sein (Wang et al., 1995).

Stokoe et al. (1992) konnten als verantwortliches Enzym für die Phosphorylierung von HSP25 die Mitogen-aktivierte Proteinkinase-aktivierte Proteinkinase 2 (MAPKAP-Kinase 2) identifizieren. Sie wird durch Hitzeschock aktiviert (Engel et al., 1995) und erkennt Phosphorylierungsorte der Sequenz LxRxxS (Stokoe et al., 1993). Inzwischen wurden weitere Kinasen beschrieben, die in der Lage sind, HSP25 zu phosphorylieren (Huot et al., 1995; Freshney et al., 1994; Hayess, 1996), und erst kürzlich wurde eine der MAPKAP-Kinase 2

5

Der Hauptaktivator der MAPKAP-Kinasen 2 und 3 ist die p38 MAP-Kinase (Rouse et al., 1994; Freshney et al., 1994). Diese Kinase gehört zur Superfamilie der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK oder MAP-Kinasen), zu der die extrazellulär regulierten Proteinkinasen (ERK), die c-jun N-terminalen Kinasen (JNK) und die p38-Kinasen (p38/RK, RK = reaktivierende Kinase) zählen. Jede der MAPK-Gruppen wird über mehr oder weniger separate Signaltranduktionswege reguliert und besitzt distinkte Substratspezifität (Waskiewicz und Cooper, 1995; Derijard et al., 1995). Zusammen sind die MAPKAP-Kinasen 2 und 3 für die Phosphorylierung von HSP25 in Folge der meisten oben genannten Stimulierungen verantwortlich. Damit steht HSP25 also am Ende der Streß-aktivierten Proteinkinase-Sinaltransduktionskaskade der p38/RK-Familie der MAP-Kinasen. Aktuelle Zusammenfassungen zum Aufbau und zur Regulation der durch Streß oder Mitogene aktivierten Proteinkinase-Kaskaden finden sich z.B. bei Kyriakis und Avruch (1996a; 1996b), Robinson und Cobb (1997), Cobb und Goldsmith (1995) oder Denhardt (1996).

Die Phosphorylierung von HSP25 spielt auch eine Rolle bei der erworbenen Thermotoleranz. Die Überexpression von HSP25 führt zur Toleranz gegenüber einem sonst letalen Hitzeschock (Landry et al., 1989; Knauf et al., 1992; Lavoie et al., 1993a). Mit der Überexpression einer Phosphorylierungs-inkompetenten Mutante konnte die Thermotoleranz jedoch nicht mehr induziert werden (Lavoie et al., 1995). Bei dieser Untersuchung ergab sich außerdem, daß das Mikrofilamentsystem der Zelle unter Streßbedingungen durch phosphorylierbares HSP25, nicht aber durch die nicht phosphorylierbare Mutante, stabilisiert wird. Damit liegt der Schluß nahe, daß die Schutzfunktion von HSP25 während eines Hitzeschocks in der Aufrechterhaltung des Actinfilament-Netzwerkes liegt und daß diese Funktion über die Phosphorylierung des Proteins reguliert wird. Diese Vermutung wurde noch bestärkt, da nach einer Behandlung der Zellen mit Cytochalasin D, einem starken Zytoskelett-Gift, nur das Wildtyp-HSP25 den Wiederaufbau der Actinfilamente beschleunigen konnte. Kürzlich konnten Huot et al. (1996) zeigen, daß in CCL39-Zellen überexprimiertes HSP25 die Zellen resistent macht gegen eine durch oxidativen Streß (H₂O₂ oder Menadion) induzierte Actinfilament-Fragmentierung. Auch hier blieben die Zellen, die die nicht phosphorylierbare Mutante überexprimierten, sensitiv gegenüber dem Streß. Die regulatorische Beziehung von HSP25 zum Actinnetzwerk der Zelle wird außerdem durch die Tatsache unterstrichen, daß einige Substanzen, die in der Lage sind, die HSP25-Phosphorylierung zu induzieren, auch die Organisation des Zytoskeletts beeinflussen, z.B. Hitzeschock (Glass et al., 1985; Welch und Suhan, 1985), Cisplatin (Oesterreich et al., 1991b) oder TNF (Camussi et al., 1991; Arrigo, 1990).

6

Die Regulation der schnellen und transienten Umschaltung von der Synthese der normalen Haushaltsproteine zur Produktion der HSPs nach Streß steht unter der Kontrolle spezifischer Transkriptionsfaktoren, den Hitzeschockfaktoren (HSF). Für HSP70 ist die Genregulation in ihren Grundzügen bekannt: Der Hitzeschockfaktor 1 (HSF1) wird konstitutiv exprimiert und liegt in ungestreßten Zellen in monomerer und inaktiver Form vor. Unter Streß kommt es zu einer Aktivierung des HSF1 durch eine Phosphorylierungs-abhängige Trimerisierung. Die aktive Form reichert sich anschließend im Zellkern an und bindet an spezifische Hitzeschock-elemente (HSEs) in der Promotorregion von hsp-Genen und stimuliert so deren Transkription. Die inaktive, monomere Form von HSF1 wird vermutlich durch eine Anbindung an HSP70 stabilisiert (Hilt und Wolf, 1996). Wenn durch Streß der Anteil an denaturierten Proteinen steigt (siehe oben), bindet HSP70 mit höherer Affinität an diese Proteine, um ihre Aggregation zu verhindern und die Rückfaltung in den nativen Zustand zu unterstützen. Dadurch wird in verstärktem Maße HSF1 frei, der nun die Aktivierung der Transkription von Hitzeschockproteinen bewirkt. Einen Überblick über die Transkriptionsregulation von Hitzeschockgenen geben Lis und Wu (1994). Die Regulation der Induktion von kHSPs ist nicht vollständig aufgeklärt. Es bestehen jedoch einige Unterschiede im Vergleich zu anderen HSPs bezüglich der Streß-induzierten Aktivierung der Transkription. So wird z.B. die Induktion von kHSPs schon bei etwas niedrigeren Temperaturen stimuliert als die von HSP70 (Yost et al., 1990). Auch eine verstärkte Synthese von HSP25 ohne Veränderungen bei der Transkription wurde beobachtet (Gotthardt et al., 1996). Außerdem wird die Regulation der Transkription von HSP25 nicht nur durch Hitzeschockfaktoren induziert, sondern korreliert auch mit dem Hormon-Level.

Das Gen für HSP25 beinhaltet drei Exons und zwei Introns und besitzt in seiner Promotorregion das typische Hitzeschockelement der Hitzeschockproteine. Daneben sind dort außerdem eine Reihe von Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren vorhanden, wie z.B. zwei TATA-Boxen, zwei SP1-Bindungselemente und ein halb-palindromisches

7

Außer in Tumoren werden kHSPs auch unter einer Reihe von anderen pathophysiologischen Bedingungen verstärkt exprimiert. 1989 belegten Iwaki et al., daß B-Crystallin ein Hauptbestandteil der Rosenthal-Fibern ist. Diese abnormalen Einschlüsse in Astrocyten sind ein charakteristisches Merkmal des Alexander-Sydroms. Später wurde nachgewiesen, daß dort ebenfalls HSP25 akkumuliert wird (Iwaki et al., 1993; Head et al., 1993). Auch bei anderen Erkrankungen des Nervensystems, wie Alzheimer (Shinohara et al., 1993; Renkawek et al., 1994a; Renkawek et al., 1994b), Chorea Huntington, Multipler Sklerose (Iwaki et al., 1992; van Noort et al., 1995) oder der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Renkawek et al., 1992) kommt es zur Anreicherung der beiden kHSPs. Das gemeinsame Kennzeichen dieser neurodegenerativen Erkrankungen ist die Ablagerung von fehlgefalteten Proteinen in Fibern, Einschlüssen oder Plaques im Nervensystem (Thomas et al., 1995). Dieses Phänomen könnte die Beteiligung von Hitzeschockproteinen bzw. Chaperonen erklären. Inzwischen ist eine verstärkte Expression auch bei nephrotischem Syndrom in den Glomeruli (Smoyer et al., 1996), bei cerebraler Ischämie im Gehirn (Wagstaff et al., 1996; Kato et al., 1995) und nach Myokard-Ischämie im Herzen (Chiesi et al., 1990) beobachtet worden.

Im Muskelgewebe, speziell im Herzmuskel, kommen HSP25 und B-Crystallin auch unter physiologischen Bedingungen in relativ großen Mengen vor (Bhat et al., 1991; Kato et al., 1992; Kato et al., 1991; Klemenz et al., 1993; Leach et al., 1994; Longoni et al., 1990a; Gernold et al., 1993). Erhöhte Konzentrationen an Hitzeschockproteinen im Myokard wurden mit einem Schutz vor den Folgen einer Ischämie/Reperfusion oder anderen Streßsituationen wie Hypoxie, ATP-Mangel oder Hypertonie in Verbindung gebracht (Zusammenfassungen bei Knowlton, 1995, und Mestril und Dillmann, 1995). Für HSP70 wurde eine kardioprotektive Wirkung sowohl nach Transfektionen in isolierten Herzmuskelzellen (Heads et al., 1994; Mestril et al., 1994) als auch bei transgenen Tieren beobachtet (Marber et al.,

8

Einer besonderen Belastung unterliegt das Herz bei chronisch erhöhtem Blutdruck, der Hypertonie. Für die Untersuchung der Hypertonie existieren verschiedene Tiermodelle, vor allem bei Ratten. Bei den sogenannten spontan hypertensiven Ratten (SHR) steigt mit zunehmendem Alter der Blutdruck stark an und führt im Falle der stroke-prone Züchtung (SHRSP) in den meisten Fällen zu einem Schlaganfall (stroke-prone = zum Schlaganfall neigend). Der Mechanismus der Ausbildung des Bluthochdruckes ist bei diesen Tieren nicht bekannt. In den 30er Jahren etablierte Harry Goldblatt ein experimentelles Modell zum renovaskulären Blut-hochdrucks. Dabei wird durch einen operativen Eingriff der Blutfluß in den Nieren eingeschränkt. Dadurch kommt es zu einer Steigerung in der Renin-Sekretion, der Plasma-Renin-Aktivität und der Produktion von systemischem Angiotensin II. Dies führt letztlich zu einem Anstieg des Blutdruckes in einem vergleichbaren Maße, wie dies bei der erworbenen Hypertonie der Fall ist. Ein weiteres Modell der Hypertonie repräsentieren die sogenannten TGR(mREN2)27-Ratten, denen das Mäuse-Renin-2-Gen eingeschleust wurde (Mullins et al., 1990). Bei diesen transgenen Tieren kommt es ebenfalls zu einer erhöhten Produktion von Renin und damit zur Ausbildung einer Hypertonie.

Die Ätiopathogenese der Hypertonie ist noch immer ungeklärt, aber es ist allgemein akzeptiert, daß die Krankheit aus dem Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren resultiert. So reagieren z.B. hypertone Ratten auf erhöhte Temperatur mit einer stärkeren Steigerung des Blutdruckes, als dies bei normotonen Ratten der Fall ist (Malo et al., 1988). Dies bestätigen auch Versuche mit kultivierten Kardiomyozyten und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) aus genetisch bedingt hypertonen Ratten. Ein Teil der Unterschiede im Blutdruck zwischen normotonen und hypertonen Tieren kann damit auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Hitzestreß zurückgeführt werden. Als Kandidatengene für diese Empfindlichkeit gegenüber Umweltreizen werden unter anderem die von Tumornekrosefaktor und HSPs genannt (Pravenec et al., 1991) Dementsprechend wurde eine erhöhte Akkumulation von HSP70-mRNA und HSP25-mRNA im Herzen, der Aorta und den Nieren von spontan hypertensiven Mäusen und in kultivierten SHR-VSM-Zellen beschrieben (Kunes et al., 1992; Hamet et al., 1990). Neuerdings konnte ein HSP25-Allel in F2-Kreuzungen von spontan hypertensiven Ratten auch mit einer linksventrikulären Hypertrophie assoziiert werden (Hamet et al., 1996). Als Basis der verstärkten Expression wird eine abnormale Aktivität des Hitzeschockfaktors oder ein genetischer Polymorphismus diskutiert (zusammengefaßt bei Hamet, 1995). Der Nachweis von Hitzeschockproteinen im Herzgewebe von normalen und hypertonen Tieren läßt Rückschlüsse auf eine eventuelle kardioprotektive Funktion der Proteine zu und kann dadurch für klinische Fragestellungen von großem Interesse sein.

9

1.1 Ziel der Arbeit

Ein allgemeines Kennzeichen aller kHSPs ist ihre Fähigkeit, hochmolekulare Komplexe auszubilden. Ohne ein genaues Bild von der Struktur der kleinen Hitzeschockproteinen und der Art und Weise, wie sie mit ihren Substraten wechselwirken, kann die Funktionsweise dieser sowohl unter physiologischen wie auch unter unphysiologischen Bedingungen wichtigen Proteine nicht verstanden werden. Trotz einiger Anstrengungen in den letzten Jahren gibt es noch keine konkrete Vorstellung über die dreidimensionale Struktur der Monomere und der supramolekularen Komplexe von HSP25, da bisher keine Kristallstrukturen von kHSPs vorhanden sind und sich die Komplexe aufgrund ihrer Größe für Kernspinresonanz-spektroskopische (NMR) Untersuchungen nicht eignen.

Da Voruntersuchungen Hinweise auf eine ringartige Organisation der Komplexe bei aus EAT-Zellen aufgereinigtem HSP25 gaben und sie sich damit grundlegend von den mehr globulären Komplexen des rekombinanten Proteins unterscheiden würden, sollten im Rahmen dieser Arbeit durch den kombinierten Einsatz elektronenmikroskopischer und hydrodynamischer Methoden neue Informationen über die Struktur der Komplexe gewonnen werden. Dafür war es notwendig, zunächst ein Protokoll zur schonenden Aufreinigung des Proteins zu erarbeiten, um eine homogene, native Fraktion zu gewinnen, die zur Strukturuntersuchung verwendet werden konnte. Aufgrund von Erfahrungen zum Vorkommen des Proteins waren Ehrlich-Ascites-Tumorenzellen die geeignete Quelle für diese Versuche. Um außerdem die Auswirkungen von Modifikationen auf den Assoziationsgrad der Komplexe studieren zu können, waren Untersuchungen zur Struktur der Komplexe von rekombinantem HSP25 sowie verschiedener Mutanten vorgesehen.

Aus einer Reihe von Untersuchungen ist bekannt, daß HSP25 mit Actin wechselwirkt. Dabei werden dem Protein sowohl stabilisierende Effekte auf das Zytoskelett in vivo als auch eine Hemmung der Actinpolymerisation in vitro zugeschrieben. Die Fähigkeit, die Actinpolymerisation zu hemmen, kann mit einem fluoreszenzspektroskopischen Ansatz und mit Hilfe der Elektronenmikroskopie getestet werden und ist offenbar auf monomeres nichtphosphoryliertes HSP25 beschränkt. Dies sollte durch die Verwendung von nativem und rekombinantem HSP25 sowie von HSP25-Mutanten verifiziert werden.

Welche Bereiche von HSP25 für die Interaktion mit dem Actin verantwortlich sind, ist noch ungeklärt. Eine Möglichkeit, etwas zur Klärung dieser Frage beizutragen, bestand in der Verwendung von HSP25-Peptiden, mit denen versucht werden sollte, die Hemmung der Actinpolymerisation nachzuvollziehen. Unter Einsatz der genannten Techniken war es das Ziel, die für die Actinpolymerisations-hemmende Funktion verantwortlichen Bereiche von HSP25 zu bestimmen und mögliche Regulationsmechanismen bei der Wechselwirkung mit Actin zu identifizieren. Hier bot sich außerdem die Verwendung von Peptiden mit Sequenzen aus anderen kleinen HSPs an, um mögliche Gründe für funktionelle Unterschiede bei der Wechselwirkung mit Actin herauszufinden. Mittels hydrodynamischer Methoden sollte die

10

Die Bedeutung von HSP25 als möglichem Regulator von Actin-gebundenen Funktionen der Zelle wird durch die Tatsache bestätigt, daß das Protein in - Actin-reichem - Muskelgewebe verstärkt vorzufinden ist. Dadurch bekommen kHSPs im kardiovaskulären System auch eine große medizinische Relevanz. Über die Rolle, die HSP25 dort spielt, ist allerdings nur wenig bekannt. Demgegenüber ist die protektive Bedeutung von HSP70 im Herzen gut dokumentiert. Da ein Zusammenspiel dieser beiden HSPs unter Streßbedingungen denkbar ist, sollte ein Teil der vorliegenden Arbeit der Analyse des Vorkommens von HSP25 und HSP70 im Herzen und in verschiedenen anderen Geweben unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen gewidmet werden. Eine verbreitete Erkrankung, bei der das Herz außerordentlich stark belastet wird, ist die Hypertonie. Gut geeignete Objekte für die Untersuchung dieser besonders für den Menschen bedeutungsvollen Erkrankung sind Ratten mit normalem und gesteigertem Blutdruck. Durch den parallelen Nachweis des Vorkommens von HSP25 und HSP70 in Geweben der in der Einleitung vorgestellten Modelle sollte Hinweisen 1.) auf eine eventuelle protektive Funktion der Proteine und 2.) auf eine mögliche gekoppelte Expression der beiden Proteine unter diesen pathophysiologischen Bedingungen nachgegangen werden. Durch die Quantifizierung der Menge an HSP25 in den Gewebeproben böte sich außerdem die Möglichkeit, die Ergebnisse mit den Daten aus anderen Untersuchungen zu vergleichen.

Fußnoten:
<1>	In dieser Arbeit werden die kleinen Hitzeschockproteine von Maus, Huhn oder Mensch als HSP25 bezeichnet. In einigen anderen Studien wird das menschlich kleine Hitzeschockprotein auch als HSP27 oder HSP28 bezeichnet.

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.