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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Isolierung von HSP25 aus EAT

Als Ausgangsmaterial für die Isolierung von HSP25 wurde die Bauchhöhlenflüssigkeit von 50 Balb-c Mäusen mit induziertem Ehrlich-Ascites-Karzinom (12 bis 15 Tage nach der Transplantation) verwendet (Bielka et al., 1994; Benndorf et al., 1988a). Die Aufreinigung des nativen Proteins erfolgte in mehreren Schritten mittels Zellaufschluß, Ammoniumsulfatfällung und Säulenchromatographie aus Ehrlich-Ascites-Tumorzellen. Zu allen Präparationsschritten wurden jeweils frisch Proteaseinhibitoren in folgenden Endkonzentrationen hinzugegeben: 1 µg/ml (0,15 µM) Aprotinin, 0,7 µg/ml (1 µM) Pepstatin A, 1 µg/ml (0,15 µM) Leupeptin, 35 µg/ml (200 µM) PMSF, 0,15 mg/ml (1 mM) Benzamidin. Alle Aufreinigungsschritte erfolgten bei 4°C. Die Elution der Proteine in den Chromatographie-Schritten wurde über die Extinktionen bei 280 nm verfolgt. Die ausgewählten Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE (siehe Kapitel 2.2) auf ihren Gehalt an HSP25 geprüft, wobei das rekombinante HSP25 als Referenz diente. Die Bestimmung der Proteinkonzentrationen der Proben in den verschiedenen Aufreinigungsstufen erfolgte nach der von Bradford (1976) beschriebenen Methode.

Die Größe und Form der Proteine bzw. Proteinkomplexe wurde an ausgewählten Fraktionen mittels Elektronenmikroskopie (siehe Kapitel 2.7) und analytischer Ultrazentrifugation (siehe Kapitel 2.8) überprüft.

2.1.1 Zellaufschluß

Die den Mäusen entnommene EAT-Flüssigkeit wurde in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung im Verhältnis von ca. 1:2 aufgenommen und die Ausbeute an Tumorzellen mit Hilfe einer Neugebauer-Zählkammer ermittelt. Dann wurden die Zellen 3 x mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, anschließend in Lösung A (10 mM HEPES, pH 7,4; 10 mM CH₃COOK; 1 mM (CH₃COO)₂Mg; 1 mM DTE; 0,2 mM PMSF; 0.1% Triton X-100) aufgenommen, 15 min quellen gelassen und nach Zugabe von 0,1 Teil Lösung B (2 M CH₃COOK; 50 mM MgCl₂) in einem eng sitzenden Teflon-Glas-Homogenisator aufgeschlossen. Das Homogenat wurde 20 min bei 10.000 g und 135 min bei 80.000 g zentrifugiert und bis zur weiteren Verarbeitung bei -70°C aufbewahrt.

2.1.2 Ammoniumsulfatfällung

Nach dem Auftauen von ca. 50 ml des Rohextraktes erfolgte eine vorsichtige Ammonium-Sulfat-Fällung bis zu einer Sättigung von 45%. Nach einer Präzipitationszeit von 30 min wurde der Niederschlag bei 15.000 g für 20 min abzentrifugiert, in Säulenpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 5 % Glycerin; 0.5 mM EDTA; 1 mM DTE; 1 mM Benzamidin) aufgenommen

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2.1.3 DEAE-Cellulose-Säule

Der Extrakt der Ammoniumsulfatfällung (ca. 30 ml) wurde auf eine mit Säulenpuffer äquilibrierte DEAE-Cellulose-Säule (2,5 x 23 cm; DE52 Whatman) gebracht und mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,25 M in Säulenpuffer von je 200 ml eluiert. Die HSP25-haltigen Fraktionen (6 ml-Fraktionen) wurden vereinigt, mit Hilfe eines Centricon Microconcentrators 10 (Amicon, Danvers, USA) aufkonzentriert und für die anschließende Hydroxylapatit-Chromatographie auf 15 mM Kaliumphosphat in Säulenpuffer eingestellt.

2.1.4 Hydroxylapatit-Säule

Der Pool der HSP25-haltigen Fraktionen aus der DEAE-Chromatographie wurde auf eine Hydroxylapatit-Säule (1,5 x 14 cm; Bio-Gel HT, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) gegeben, die gegen 50 mM K-Phosphat in Säulenpuffer äquilibriert war. Zur Elution der Proteine wurde nach dem Vorlauf ein linearer K-Phosphat-Gradient von 50 mM bis 250 mM in Säulenpuffer (in 5 ml) angelegt Unter diesen Bedingungen bindet das HSP25 nicht an die Säule und wird mit dem Waschpuffer eluiert. Die HSP25-haltigen Fraktionen wurden dann vereinigt, mit Hilfe eines Centricon Microconcentrators 10 (Amicon, Danvers, USA) aufkonzentriert und gegen den Säulenpuffer dialysiert.

2.1.5 Mono Q-Säule

Der letzte Chromatographieschritt erfolgte an einer mit Säulenpuffer äquilibrierten Mono Q HR 5/5 Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Nach dem Auftragen der Probe wurden die Proteine mit einem Gradienten von 0 bis 400 mM NaCl in Säulenpuffer eluiert. Das HSP25 löste sich im Bereich von etwa 100 bis 200 mM NaCl von der Säule.

2.1.6 Isolierung und Fraktionierung von HSP25-Spezies

Für die strukturelle Charakterisierung des nativen HSP25 wurde auf ein HSP25-Präparat zurückgegriffen, das im Labor von R. Benndorf (MDC, Berlin) nach einem sehr ähnlichen Aufreinigungsschema isoliert wurde, wie es hier dargestellt ist (Benndorf et al., 1994). Die dort nach der Säulenchromatographie erhaltenen Präparationen von HSP25 enthielten sowohl niedermolekulares Material als auch HSP25-Komplexe in verschiedenen Assoziationsstufen. Um die verschiedenen HSP25-Spezies voneinander zu trennen, wurden 750 µl der HSP25-haltigen Lösung über einem Kissen von 150 µl 30%iger Saccharose in Zentrifugations-Puffer

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2.2 HSP25-Expression in E.coli, Isolierung und in vitro-Phosphorylierung

Das rekombinante HSP25 der Maus und des Menschen sowie die Deletionsmutante HSP25C18 des murinen Proteins wurden unter der Kontrolle des T7 Promotors in E. coli BL21 (DE3) exprimiert wie bei Gaestel et al. (1989) beschrieben. Für die Mutagenese der Serine des menschlichen HSP25 wurde der QuickChange Site-Directed Mutagenese Kit (Stratagene, USA) mit den entsprechenden Oligonukleotiden verwendet. Die mutierten Klone wurden durch Expression in E. coli BL21 (DE3) und Sequenzierung identifiziert. Die rekombinanten Proteine wurden durch Ammoniumsulfat-Präzipitation und Chromatographie an einer DEAE-Sepharose CL6-6B-Säule (Phamarcia, Uppsala, Schweden) gereinigt. Die in vitro-Phosphorylierung von rekombinantem humanem HSP25 wurde mit Hilfe der MAPKAP-Kinase 2 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, USA) wie bei Stokoe et al. (1992) beschrieben, aber ohne die Verwendung von radioaktiv markiertem ATP, durchgeführt. Alle Arbeiten wurden im Labor von M. Gaestel (MDC, Berlin) durchgeführt. Die rekombinanten Proteine wurden mit freundlicherweise von ihm zur Verfügung gestellt.

2.3 Actin-Präparation und -Markierung

2.3.1 Präparation von Actin

Fibrilläres Actin (F-Actin) wurde mit geringen Änderungen nach der Methode von Pardee und Spudich (1982) aus Muskel-Aceton-Pulver von Kaninchen präpariert. Dabei erfolgten alle Schritte bis zur Ultrazentrifugation in Puffer A (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM CaCl₂; 0.2 mM Na₂ATP; 1 mM NaN₃). Tab. 2.1 gibt die einzelnen Schritte der Aufreinigung wieder, die alle im Eisbad bzw. bei 4°C durchgeführt wurden.

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Tab. 1: Aufreinigungsschritte bei der Actin-Präparation

	Schritt	Bedingungen	Zeit
1	Extraktion	rühren in 20 ml Puffer A/ g Muskel-Pulver	30 min
2	Separation des Extraktes	2.500 g -Zentrifugation	10 min
3	Reextraktion	in 20 ml Puffer A/ g Muskel-Pulver	30 min
4	Separation des Extraktes	2.500 g -Zentrifugation	10 min
5	Vereinigung der Überstände
6	Zentrifugation	25.000 g	25 min
7	Polymerisation des Überstandes	ad 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM Na2ATP	120 min
8	Salzwaschung	ad 600 mM KCl (unter Rühren)	30 min
9	Zentrifugation	100.000 g	100 min
10	Lösen der Pellets	Aufnehmen in 3 ml Puffer D/ g Muskel-Pulver	60 min
11	Dialyse	in 1 Liter Puffer D	3 x 12 h
12	Konz.-Bestimmung	Photometrisch bei 290 nm

Für die Depolymerisation des F-Aktins zu globulärem Actin (G-Actin) wurde dann 3 x für 12 Stunden gegen 1 Liter Puffer D dialysiert (2 mM Imidazol-HCl, pH 7.0; 0.1 mM CaCl₂; 0.2 mM Na₂ATP; 1 mM DTT; 1 mM NaN₃). Durch eine anschließende Zentrifugation für 2 h bei 150.000 g (TLA Rotor 100.3, Beckman, Palo Alto, USA) wurde das nicht depolymerisierte Actin abgetrennt und der Überstand mit dem G-Actin aufgehoben. Hiervon wurde unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 2.66 x 10⁴ M^-1cm^-1 bei 290 nm (Pollard, 1983; Houk, Jr. und Ue, 1974) photometrisch die Konzentration bestimmt. Außerdem wurden der S₂₀-Wert und das Molekulargewicht des G-Actins mittels der analytischen Ultrazentrifuge bestimmt, um die Reinheit und den Depolymerisationszustand des G-Actins zu kontrollieren. Das G-Actin wurde bei 4°C aufbewahrt und innerhalb von 1 Woche verwendet oder durch Salz- und ATP-Zugabe (KCl ad 50 mM; MgCl₂ ad 2 mM; Na₂ATP ad 1 mM) polymerisiert. Die Darstellung von G-Actin aus diesem F-Actin erfolgte durch einen erneuten Zyklus von Zentrifugation, Lösen des Pellets und Dialyse analog der Schritte 10 bis 12 bei der G-Actin-Aufreinigung (siehe Tab. 2.1).

2.3.2 Präparation von Fluoreszenz-markiertem Actin

Für die Darstellung von markiertem Actin für die fluoroszenzphotometrische Messung der Actinpolymerisation wurde zunächst frisch präpariertes F-Actin für 3 x 12 Stunden gegen Puffer C dialysiert (1 mM NaHCO₃, pH 7.6; 0.1 M KCl; 1 mM MgCl₂; 0.1 mM CaCl₂; 0.2 mM Na₂ATP; 1 mM NaN₃), da das Tris aus Puffer A die Konjugierungsreaktion mit dem Marker stören würde. Die Marker-Lösung wurde frisch hergestellt aus 500 µl Dioxan, 250 µl Aceton und 1,5 mg N-(1-Pyrenyl)jodacetamid (Molecular Probes, Eugene, USA). Das dialysierte F-Actin wurde auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt und für 20 h im Dunkeln bei 20°C mit 15 µl der Marker-Lösung pro ml Actin-Lösung inkubiert (Kouyama und Mihashi, 1981; Pardee und Spudich, 1982). Danach wurde der überschüssige Marker durch Zugabe von 1 % Zellulose (voräquilibriert in Puffer C) entfernt und das markierte F-

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2.3.3 Präparation von Actin-Keimen

Für die Polymerisationsmessungen wurden zur Auslösung der Polymerisationsreaktion Actin-Keime eingesetzt. Sie wurden durch die Polymerisation von unmarkiertem G-Actin (34,5 µM) in Puffer D durch die Zugabe von 0,1 Volumen einer 500 mM KCl- und einer 100 mM Imidazol-Lösung erzeugt. Diese Actinlösung wurde nach einem Tag auf 11,5 µM verdünnt und vor dem Gebrauch einige Stunden äquilibriert (Pollard, 1983).

2.4 Bestimmung des HSP25- und HSP70-Gehaltes in Gewebeproben

2.4.1 Gewebeaufarbeitung

Für die Bestimmung des Gehaltes an den beiden Streßproteinen HSP25 und HSP70 wurden je 3 Kontrolltiere und 3 Tiere verschiedener Ratten-Modelle für Hypertonie verwendet. Als Kontrollen dienten Tiere des Wistar-Kyoto oder Sprague-Dawley-Stammes. Als Hypertonie-Modelle wurden spontan hypertensive Ratten (SHRSP), transgene Ratten mit einem zusätzlichem Mäuse-Renin-2-Gen (TGR(mREN2)27) und Tiere mit einer experimentell induzierten Hypertonie untersucht. Alle Tiere wurden entsprechend den tierschutzrechtlichen Richtlinien gehalten und behandelt. Die spontan hypertensiven und transgenen Ratten wurden freundlicherweise von Dr. Bohlender (MDC, Berlin) zur Verfügung gestellt. Die experimentelle Hyertonie wurde durch das Abklemmen einer Nierenarterie nach der 2kidney-1clip-Methode (2K1C) induziert. Diese sogenannten Goldblatt-Operationen und die Kontrolle der Blutdruckwerte wurde im Labor von Prof. Haller (Franz-Volhard-Klinik, Berlin) von D. Dragun durchgeführt. Die Kontrolltiere wurden einer Scheinoperation unterzogen.

Die Ratten waren zum Zeitpunkt der Organentnahme ca. 7-9 Monate (SHRSP-Modell) bzw. 2 Monate (transgenes Modell) alt. Die operierten Tiere wurden nach 1 bzw. 4 Wochen untersucht. Dazu wurden die Tiere mit Barbiturat betäubt und auf der Bauchseite geöffnet. Die zu untersuchenden Organe wurden mit einer anatomischen Pinzette entnommen und in

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Die für die Western-Blot-Analyse bestimmten Gewebeproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Weiterverarbeitung bei -70°C aufbewahrt. Von den Proben wurde dann später im gefrorenen Zustand ein Stückchen abgeschnitten, ausgewogen und mit 10 µl Homogenisationspuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8; 4 % SDS; 10 % -ME; 20 % Glycerin) pro mg Feuchtgewicht in einem eng sitzenden Gewebe-Homogenisator mazeriert. Anschließend wurde das Homogenat für 3 min im Wasserbad gekocht und 5 min bei 10.000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde bis zum Auftragen auf die Elektrophorese eingefroren.

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2.4.2 Quantifizierung

Für die Auswertung wurden die Western-Blot-Membranen mittels eines Sharp JX 610-Flachbettscanners mit 300 dpi digitalisiert und die Bandenintensitäten mit Hilfe des Grafikprogrammes NIH-Image 1.55 ausgewertet. Für den Vergleich der aufgetragenen Gesamtproteinmenge wurden die Ponceau-gefärbten Blots ebenfalls gescannt, die Gesamtintensität der einzelnen Probenbanden miteinander verglichen und nach der Mittelwertbestimmung ein Korrekturfaktor für die aufgetragene Proteinmenge im Vergleich zu den anderen Proben desselben Blots bestimmt. Um diesen Faktor wurden dann die Werte für die Proteinbanden bei der anschließenden Auswertung korrigiert. Damit wurde sichergestellt, daß bei dem Vergleich der Proben die gleiche geblottete Gesamtproteinmenge zugrundegelegt wurde.

Um eine Quantifizierung des HSP25- und HSP70-Gehaltes der Gewebeproben zu ermöglichen, wurden bei der Elektrophorese jeweils 5 Standards unterschiedlicher Konzentration mit aufgetragen. Bei diesem internen Standard handelte es sich um einen Zellaufschluß von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen. In diesem sind in relativ großer Menge HSP25 und auch HSP70 enthalten. In einem Abgleich wurde zuvor der Standard gegen isoliertes rekombinantes HSP25 aufgetragen, von dem durch eine Aminosäureanalyse die genaue Konzentration bekannt war, so daß der Absolutgehalt an diesem Protein auch in den untersuchten Proben ermittelt werden konnte. Für HSP70 wurden nur relative Werte ermittelt

Die HSP-Konzentration der zu untersuchenden Proben lag im Bereich derjenigen des Standards. Bei jedem Blot wurde aus den gemessenen integrierten Pixelintensitäten der EAT-Standards eine Eichgerade erstellt und die relative Menge an HSP im Vergleich dazu ermittelt. Aufgrund der unterschiedlichen Molekulargewichte und damit deutlich getrennten Positionen auf den Western-Blots konnte der Gehalt an diesen beiden HSPs bei den jeweiligen Proben gleichzeitig bestimmt werden. Für HSP25 wurde er auf µg Protein/g Feuchtgewicht (FG) geeicht.

2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die elektrophoretische Proteinanalyse erfolgte nach der Methode von Laemmli (1970) in einer Bio-Rad-Mini-Protean Apparatur (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) über ein diskontinuierliches Polyacrylamid-Trenngel von 7,5-17 % Acrylamid unter einem 3% igem Sammelgel. Die Gelgröße betrug 7 x 8 cm bei einer Dicke von 1 mm. Die Gele wurden in einem BioRad Mini-Protean Gelgießstand mit Hilfe eines Gradientenmischers gegossen. Das Pipettierschema und die verwendeten Puffer für die Herstellung der Gele sind in Tab. 2.2 aufgeführt. Die Proteinproben wurden im Verhältnis 1:1 mit doppelt konzentriertem Probenpuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8; 4 % SDS; 10 % -ME; 20 % Glycerin; 0.005 % Bromphenolblau) gemischt, 5 min im Wasserbad gekocht und vor dem Auftragen auf das Gel kurz abzentrifugiert. Als Proteinstandard wurde eine Mischung aus Standardproteinen (Serva, Heidelberg) verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 bis 150 V für 1 bis 1,5 Stunden. Fixiert und gefärbt wurden die Gele in einer alkoholischen Coomassie-Brilliantblau (R-250)- Lösung.

Tab. 2: Pippetierschema für 10 SDS-Gradientengele bzw. 2 Sammelgele

	Gradientengele (7-17 %)		Sammelgele (3%)
	Lsg. A	Lsg. B
30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid	8750 µl		400 µl
30 % Acrylamid, 1,2 % Bisacrylamid		17500 µl
3 M Tris, pH 8,8	4375 µl	4375 µl
0,5 M Tris, pH 6,8			1000 µl
Glycerin		7000 µl
H2O	21700 µl	6000 µl	2600 µl
20 % SDS	175 µl	175 µl	20 µl
5 % Ammoniumpersulfat	175 µl	175 µl	150 µl
TEMED	8750 µl	8,75 µl	7 µl

Probenpuffer	Laufpuffer
62,5 mM Tris-HCl , pH 6,8	3,0 g/l Tris
2% SDS	14,4 g/l Glycin
5% -Mercaptoethanol	1,0 g/l SDS
10% Glycerin
0,005% Bromphenolblau

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2.6 Western-Blot

Die nach der SDS-PAGE erhaltenen, ungefärbten Gele wurden nach der Methode von Kyhse-Andersen (1984) in einer `semi-dry´ Fast-Blot-Apparatur im Sandwichverfahren zwischen je drei Lagen Blotpapier (Biometra Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) für 90 min bei einer Stromstärke von 0,8 mA/cm² auf eine Nitrocellulose-Membran (0,2 µm Porengröße) geblottet. Dabei wurde das Blotpapier als Pufferreservoir eingesetzt, indem es zuvor mit dem unteren (0.3 M Tris, pH 10.4; 20 % Ethanol) bzw. oberen Transferpuffer (0.025 M Tris, pH 9.4; 20 % Ethanol; 0.04 M -Amino-Capronsäure) getränkt wurde. Zur Kontrolle des Proteintransfers wurden die Membran nach dem Blotten mit Ponceau-Lösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) angefärbt.

Nach einer Block-Zeit von mind. 30 min in Blockmilch (5% Magermilchpulver in TBS: 20 mM Tris, pH 7.3; 150 mM NaCl) wurden die Membranen für zwei Stunden oder über Nacht mit dem primären Antikörper inkubiert. Für den Nachweis von HSP25 wurde dabei ein monospezifischer polyklonaler Kaninchen-anti-HSP25-Antikörper^<2> (1:5000) und für den Nachweis von HSP70 der monoklonale anti-HSP70-Antikörper BRM-22 (Sigma, Deisenhofen, 1:7000) verwendet. Anschließend wurden die Membranen zweimal mit TBS + 0,05 % Tween und dreimal mit TBS gewaschen und mit einem Alkalische-Phosphatase- (AP) konjugierten sekundären Antikörper (je nach primärem Antikörper entweder Anti-Kaninchen-IgG-AP- oder Anti-Maus-IgG-AP-Konjugat von Promega, Madison, USA) für 90 min in Blockmilch inkubiert. Nach erneutem Waschen mit TBS + 0,05 % Tween und TBS wurden die Membranen kurz mit H₂O und AP-Puffer (100 mM Tris, pH 9.5; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl₂) gespült und danach die Nachweisreaktion mit dem Alkalische-Phosphatase-Reagenz von Promega (Madison, USA) nach Anweisung des Herstellers durchgeführt. Die Farbreaktion wurde durch Spülen mit destilliertem Wasser gestoppt und die Membranen schließlich zwischen Filterpapier getrocknet.

2.7 Elektronenmikroskopie

Für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen kamen ein Philips EM400T (bei 80 kV Beschleunigungsspannung), ein Zeiss EM910 (bei 100 kV Beschleunigungsspannung) und ein Philips CM12 (bei 120 kV Beschleunigungsspannung) zum Einsatz. Alle Geräte sind mit Glühkathoden aus Wolfram als Elektronenquelle bestückt. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden bei einer Nominalvergrößerung von 50.000 oder 60.000 auf Kodak 4489 Film (Kodak, Leverkusen) aufgenommen und nach Angaben des Herstellers mit D19-Entwickler entwickelt.

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2.7.1 Negativkontrastierung

Bei der Negativkontrastierung handelt es sich um ein Verfahren zur Darstellung von Makromolekülen, bei dem die Moleküle in eine Lösung von stark streuenden Schwermetallsalzen eingebettet werden. Dadurch wird bei Bestrahlung mit Elektronen der Umriß des Partikels besonders deutlich und der Partikel selbst erscheint hell (`negativ kontrastiert´) im Vergleich zu seinem unmittelbaren Hintergrund. Die Proteinproben wurden auf eine Konzentration von ca. 100 µg/ml verdünnt und negativkontrastiert mit Hilfe der Doppelfilm-Technik mit 1 % Uranylformiat oder 2 % Uranylacetat (Behlke et al., 1991). Der pH der Kontrastierungslösungen wurde nicht korrigiert.

2.7.2 Bildverarbeitung

2.7.2.1 Digitalisierung der Negative

Die für die Strukturanalyse ausgewählten Negative wurden mit einem Datacopy 610F Densitometer mit integrierter Beleuchtung und einem linearen CCD-Chip digitalisiert. Das Scannen erfolgte bei einer Pixelgröße von 22,8 µm im Negativ. Dies entspricht bei einer Vergrößerung von 60.000 im Negativ einer Pixelgröße von 0.38 nm im Objekt. Für die Partikelgrößenauswertung wurden die Negative mit einem EMil Densitometer (Image Science, Berlin) mit einer Auflösung von 1 nm in der Probenebene digitalisiert.

2.7.2.2 Strukturanalyse

Die Arbeiten zur Bildanalyse der elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an VAX Workstations und IBM-PCs durchgeführt. Mit Hilfe des IMAGIC-5-Programmes (Image Science, Berlin) wurden zuerst iterativ ca. 3000 HSP25-Komplexe aus 25 eingescannten Bildern ausgesucht und die entsprechenden Bereiche als Einzelbilder in einer Datei gespeichert. Nach einer Band-Pass-Filterung (Frequenzen < 1/85 Å und > 1/15 Å wurden unterdrückt) erfolgte eine Normierung der Einzelbilder, um unterschiedliche Helligkeitsverteilungen innerhalb der Bilder auszugleichen. Anschließend wurden die Einzelbilder durch eine iterative Ausrichtung in Translationsebene auf der Basis einer rotationsgemittelten Referenz (erhalten aus der Summe des gesamten Datensatzes) zentriert. Dabei bedient man sich der sogenannten Kreuzkorrelationsfunktion (Saxton und Frank, 1977; van Heel et al., 1992), für die die Bilddaten fouriertransformiert werden. Über das sogenannte `Multi-Referenz-Alignment´ wurde durch den Einsatz mehrerer Referenzen berücksichtigt, daß die Moleküle in verschiedenen Projektionsrichtungen liegen können. Die Unterscheidung der unterschiedlichen räumlichen Orientierungen wurde mit Hilfe der Multivariaten Statistischen Analyse (MSA) durchgeführt. Dabei wird durch die Beschreibung der Pixel als Koordinatenachsen über eine Eigenvektor-Eigenwert-Analyse die Datenmenge erheblich

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2.7.2.3 Partikelgrößenanalyse

Zur Auswertung der Partikelgrößenverteilung wurde das analySIS Bildauswertungsprogramm (Soft Imaging System GmbH, Münster) verwendet. Dazu wurden die eingescannten Bilder zunächst einer Shading-Korrektur unterzogen, mit einem Median-Filter geglättet und unter Verwendung eines geeigneten Schwellenwertes binarisiert. Die Partikel innerhalb eines 1 µm² großen Bereiches wurden dann mit Hilfe eines Wasserscheiden-Algorithmus getrennt, anschließend detektiert und nach der Größe ihrer Fläche klassifiziert.

2.8 Hydrodynamische Methoden

Alle hydrodynamischen Untersuchungen erfolgten mit Hilfe analytischer Ultrazentrifugen vom Typ Model-E oder XL-A (Beckman, Palo Alto, USA) mit UV-Optik und photoelektrischem Scanner. Aus der wandernden Grenzschicht wurde der Sedimentationskoeffizient (s_20,W) und aus der Verbreiterung der Grenzschicht der Diffusionskoeffizient (D_20,W) ermittelt. Zusammen mit dem partiellen spezifischen Volumen (ermittelt aus der Aminosäurezusammensetzung und dem Inkrement der Aminosäuren) wurde die molekulare Masse (M) nach der Svedberg-Gleichung bestimmt

(Gleichung 1)

mit R = Gaskonstante, T = absolute Temperatur und = Dichte des Lösungsmittels.

Für die Analyse der HSP25-Komplexe wurde ein von 0,7447 ml/g verwendet (statt = 0,7326 für reines HSP25), da sie langkettige Fettsäuren enthalten (Oesterreich et al., 1991a). Die Sedimentations- und Diffusionskonstanten lassen außerdem die Bestimmung des Reibungsverhältnisses f/f₀ zu, das Hinweise zur Form der Komplexe liefert

(Gleichung 2)

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(Gleichung 3)

mit N_A = Avogadro-Zahl.

Die Sedimentations-Koeffizienten von HSP25-Komplexen (s_n) wurden aus den Sedimenta-tions-Koeffizienten der Monomere (s₁) und der Assoziationszahl (n) nach Gleichung 4 errechnet

(Gleichung 4)

Wenn die Assoziate Mitglieder einer polymer homologen Reihe sind, kann Gleichung 5 angewendet werden

(Gleichung 5)

in der die Werte der Konstanten k_s und a_s von der Natur des Lösungsmittels, der Konformation des polymeren Moleküls in dem Lösungsmittel und dem Grad der Durchdringung des Komplexes mit dem Lösungsmittel abhängen.

Für die Modell-abhängige Berechnung der hydrodynamischen Parameter der HSP25-Komplexe wurde das Programm HYDRO (Garcia de la Torre et al., 1994) eingesetzt. Die mit diesem Programm errechenbaren Konstanten basieren auf der vereinfachten Annahme einer kugelförmigen Gestalt der einzelnen Moleküle. Wenn deren Radien und kartesische Koordinaten sowie das Molekulargewicht, der Auftriebsterm, die Viskosität des Lösungsmittels und die Temperatur bekannt sind, können die Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten abgeschätzt werden. Durch Variationen in dem Arrangement der Kugeln wurde ein Modell abgeleitet, bei dem die theoretischen und experimentellen hydrodynamischen Daten gut übereinstimmten.

Die Ultrazentrifugen-Experimente wurden bei einer Protein-Konzentration von 0,4 mg/ml in Puffer H (2 mM Tris-HCl, pH 7,5; 20 mM NaCl; 1 mM MgCl₂; 0,2 mM Na₂ATP; 0,5 mM -ME) bei 20°C durchgeführt. Die Wanderung der Grenzschicht wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm aufgezeichnet. Die Rotorgeschwindigkeit betrug 6.000 U/min für die Diffusions- und 20.000, 30.000 oder 40.000 U/min für die Sedimentations-Experimente.

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2.9 Fluoreszenzspektroskopie

Actin kann durch eine Reaktion mit N-(1-Pyrenyl)-Jodacetamid an Cystein 374 mit Pyren markiert werden (Kouyama und Mihashi, 1981). Das Fluoreszenzspektrum von Pyrenyl-Actin ändert sich drastisch bei der Polymerisation von G-Actin zu F-Actin, so daß bei einer entsprechenden Wahl der Emissionswellenlänge ein bis zu 20-facher Anstieg im Fluoreszenz-Signal beobachtet werden kann (Cooper et al., 1983). Dies erlaubt eine ausgezeichnete Beobachtung der Polymerisations-Depolymerisations-Dynamik durch zeitaufgelöste Messungen der Fluoreszenz in einem Fluoreszenzphotometer. Alle Messungen wurden an einem Shimadzu RF5001PC Spectrofluorometer (Shimadzu Europa GmbH, Duisburg) mit temperaturkontrolliertem Küvettenhalter durchgeführt und mit der dazugehöriger Software im `Labtime´-Modul an einem PC aufgezeichnet.

Im Standard-Polymerisations-Assay wurden die Komponenten in einer Mikro-Fluoreszenz-küvette (Hellma, 3 x 3 x 6 mm) zu einem Gesamtvolumen von 60 µl vermischt. Wenn nicht anders erwähnt, wurden dabei zunächst 44 µl Puffer D in der Küvette vorgelegt, dann 5 µl Pyrenyl-Actin (Endkonzentration 2 µM) und verschiedene Mengen der zu testenden Substanz in 5 µl Puffer D hinzugegeben und für 3 min bei 25°C vorinkubiert. Der Start der Polymerisation wurde durch die Zugabe von 1 µl Actin-Keimen (Endkonzentration 0,2 µM) und 5 µl einer Salzlösung (600 mM KCl, 24 mM MgCl₂) ausgelöst. Die Aufzeichnung des Reaktionsverlaufes wurde nach gründlichem Mischen innerhalb von 10 Sekunden nach der Salzzugabe gestartet. Registriert wurde das emittierte Licht mit einem auf 407 nm eingestellten Filter (10 nm Fenster) nach einer Anregung bei 365 nm (5 nm Fenster) bei einem Meßabstand von 2 Sekunden über 10 min.

Für die Berechnung der Stöchiometrie der Hemmung wurden die Steigungen der Kurven während der ersten 5 Minuten (im linearen Bereich des Anstieges) anhand der linearen Regression ermittelt und in Prozent Hemmung der Actinpolymerisation im Vergleich zur Kontrolle umgerechnet.

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2.10 Peptid-Synthese

Alle Peptide wurden von der Firma BioTeZ, Berlin, bezogen. Sie wurden mit Hilfe der simultanen multiplen Festphasen-Peptidsynthese an einem PSSM-8 Automaten (Shimadzu, Kyoto, Japan) unter Verwendung der Fluorenyl-Methoxycarbonyl (FMOC)-Strategie nach Sheppard (Atherton und Sheppard, 1989) hergestellt. Die Peptide wurden mittels HPLC bis zu einer Reinheit von 85-95% aufgereinigt und an einem MALDI I Massenspektrometer (Kratos, Manchester, England) charakterisiert (Karas und Hillenkamp, 1988). Alle Peptid-Amide waren N-terminal acetyliert und lagen bei Lieferung als Lyophilisat vor. Sie wurden eingewogen und mit einer Soll-Konzentration von 2 mM in H₂O gelöst. Die genauen Konzentrationen dieser wäßrigen Peptid-Lösungen wurde mit Hilfe einer Aminosäureanalyse im Labor von B. Wittmann-Liebold (MDC, Berlin) durch G. Grelle bestimmt. Dazu wurden die Peptide zunächst in 6 N HCl mit 7% Thioglycolsäure als Additiv (Yokote et al., 1986) für 24 h bei 110°C einer Dampfphasen-Hydrolyse unterzogen (Meltzer et al., 1987). Die getrockneten Hydrolysate wurden anschließend in Natriumcitrat-Puffer (0,15 M, pH 2,2) aufgenommen. Die Trennung der einzelnen Aminosäuren mittels Kationentauscher-Säule, die anschließende Derivatisierung mit Orthophtaldialdehyd (OPA) und der Nachweis mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors erfolgte in einem Sykam-Analysator (Sykam, Gilching). Durch eine anschließende Aufnahme von Spektren im Ultraviolett- (UV) Bereich des Lichtes wurden außerdem die Extinktionskoeffizienten der Peptid-Lösungen bestimmt, um eine Kontrolle der Konzentrationen nach Verdünnungen oder erneuter Einwaage zu ermöglichen.

2.11 Peptid-Epitop-Scanning

Zellulose-gebundene Peptid-Bibliotheken (Peptidmembranen) von murinem HSP25 und humanem -Skelettmuskel-Actin wurden mit Hilfe der automatischen Spot-Synthese (Frank, 1992; Kramer et al., 1994) bei der Fa. Jerini BioTools GmbH (Berlin) synthetisiert. Die direkt an der Membran synthetisierten Peptide waren je 13 Aminosäure lang und überlappten mit der Sequenz des Folgepeptids an 11 Positionen. Daraus ergeben sich für HSP25 99 und für Actin 182 Punkte (Spots) auf den Peptidmembranen. Die Aminosäuresequenzen der einzelnen Peptide sind in Tab. 7.2 und 7.3 im Anhang aufgelistet. Für die Analyse der Bindungsaktivitäten wurden die Peptidmembranen für 150 min bei Raumtemperatur mit nativem HSP25 bzw. G-Actin (200 µg/ml) in Puffer S (20 mM Tris, pH 7.4; 5% Glycerin; 0.05 % Tween; 5 % Sucrose; 0.5 mM EDTA; 1 mM DTE; 1 mM Benzamidin; 1 x Blocking Reagenz (Genosys, England)) inkubiert. Anschließend wurden sie bei 4 °C zweimal kurz mit Puffer S gewaschen und die gebundenen Proteine direkt auf der Membran nachgewiesen. Für die Detektion von HSP25 wurde der monospezifische Kaninchen-anti-HSP25 Antikörper (1:1000, vgl. Kapitel 2.6) und für die Detektion von Actin ein Maus-anti-Actin-Antikörper (Clone C4, 1:100, Boehringer, Mannheim) eingesetzt. Der Nachweis der Proteine erfolgte mit

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2.12 Sequenzdaten

Alle Proteinsequenzen wurden der SwissProt Proteindatenbank entnommen. Computerunterstützte Alignierungen von Proteinsequenzen wurden mit Hilfe des Programms MSA (Lipman et al., 1989) oder FASTA (Pearson und Lipman, 1988) durchgeführt. Proteinparameter wie Aminosäurezusammensetzung oder theoretisches Molekulargewicht wurden mit dem Programm PROTPARAM berechnet. Auf alle Programme wurde über das WWW (World Wide Web) zugegriffen.

Fußnoten:
<2>	Präparation 569, freundlicherweise von J. Stahl, MDC, zur Verfügung gestellt.

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